CN110468049A - 用于制备干细胞球的装置、制备干细胞球的方法以及保存干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于制备干细胞球的装置、制备干细胞球的方法以及保存干细胞的方法,涉及干细胞保存和运输技术领域。本发明公开的用于制备干细胞球的装置,其包括:基板;基板上设置有培养室,每个培养室具有由对干细胞不亲和特性的材料制成的侧壁和底壁。采用该装置培养干细胞,可使干细胞成球,形成干细胞球;其该装置可以作为保存或运输干细胞的工具,使干细胞以球体形式在常温条件长时间保存和储运后仍具有较高的存活率和多能性。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞保存和运输技术领域,具体而言,涉及用于制备干细胞球的装置、制备干细胞球的方法以及保存干细胞的方法。
背景技术
哺乳动物细胞培养一般在加湿培养箱中进行,培养条件为37℃,5%CO2,20%O2和与之相适应的培养基。偏离这个标准条件可能改变细胞功能,甚至导致细胞异常或死亡。人胚干细胞(hESC)和诱导性多能干细胞(iPSC)及其子代甚至更容易受到不合适的培养条件的影响。当任何标准参数改变时,这些细胞容易发生自发分化,核型变化,脱落或死亡。
许多类型的细胞只能在冷藏或常温条件下短时间(1-2天)储存。本文中所述“常温条件(AC)”即指在密闭容器中常温下没有标准水平的CO2和O2,且没有更换培养基。在AC短时间储存后,细胞活力会显著降低。因此,细胞的长期储存和远程运输需要低温保存,这些要求限制了干细胞研究和治疗应用。尽管使用不便和成本高昂,冷冻保存一直是不可或缺的细胞储运方法,很少有人尝试改变或简化它。
近来兴起的细胞3D培养和打印也涉及常温下的细胞处理。该过程常常将分离的细胞和具有生物相容性的支持材料制成组织块用于再生医学中,但细胞活力的降低是对该过程及其随后移植的主要挑战。最近,Swioklo等人报道,在1.2%海藻酸钙中包裹人脂肪干细胞可以提高其在低温到常温(4℃-23℃)条件下保存72小时后的活力。然而,用海藻酸钙增加了干细胞治疗的安全性问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备干细胞球的装置,采用该装置培养干细胞,可使干细胞成球,形成干细胞球;其该装置可以作为保存或运输干细胞的工具,使干细胞以球体形式在常温条件长时间保存和储运后仍具有较高的存活率和多能性。
本发明的另一目的在于提供一种制备干细胞球的方法,采用该方法制备出干细胞球,且所制备出的干细胞球可在常温条件下长时间保存和储运后仍具有较高的存活率和多能性。
本发明的另一目的在于提供一种保存干细胞的方法,利用该方法将干细胞成球,以使干细胞以球体形式存在,使其能够在常温条件下可经长时间保存和运输,仍具有较高的存活率和多能性。
本发明是这样实现的:
一方面,本发明提供了一种用于制备干细胞球的装置,其包括:基板;所述基板上设置有培养室,每个所述培养室具有由对干细胞不亲和特性的材料制成的侧壁和底壁。
在干细胞培养的过程时,其周围的微环境对干细胞成球具有重要的影响,尤其是干细胞贴壁培养不利于成球。本发明提供的用于制备干细胞球的装置,其培养室具有由对干细胞不亲和特性的材料制成的侧壁和底壁。侧壁和底壁由对干细胞不亲和特性的材料制成,使得侧壁和底壁对干细胞不具有亲和特性,构成了对干细胞不亲和特性的微环境,防止干细胞贴壁培养,促进干细胞在增殖过程中成球聚集成团,形成干细胞球。
且该装置还可以作为保存或运输干细胞的工具,使干细胞以球体形式在常温条件长时间保存和储运后仍具有较高的存活率和多能性。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述材料包括但不限于赛璐珞、聚氯乙烯(Polyvinyl chloride,PVC)或天然树脂等材料。
赛璐珞、聚氯乙烯和天然树脂对干细胞均不具有亲和特性,培养室的侧壁和底壁采用这些材料制成,均可以形成对干细胞不具有亲和特性的微环境,促进干细胞的增殖过程中成球,形成干细胞球。
优选的,在本发明的一些实施方案中,采用聚氯乙烯制成培养室的侧壁和底壁,可以进一步促进干细胞的增殖过程中成球,形成干细胞球,提高其成球能力。
当然,在本发明的一些实施方案中,也可以是整个装置采用对干细胞不亲和特性的材料(例如赛璐珞、聚氯乙烯、天然树脂等材料)制成,相应的,培养室的侧壁和底壁也是由相应的对干细胞不亲和特性的材料制成,同样也能够构成促进干细胞成球、形成对干细胞球的不亲和特性的微环境。
其中,天然树脂包括但不限于松香、琥珀或虫胶等材料,这些物质对干细胞均不具有亲和特性。
当然,在本发明的一些实施方案中,也可以是在培养室的侧壁和底壁表面涂覆由对干细胞不亲和特性的材料制成的膜,这种结构设计方式也能够形成对干细胞球的不亲和特性的微环境,防止其贴壁生长,促进其在生殖过程中成球,这种结构设计也属于本发明的保护范围。
总之,只要是采用对干细胞均不具有亲和特性的材料甚至是低吸附特异性的材料例如琼脂糖等构成具有对干细胞球的不亲和特性的微环境的容器例如培养瓶、腔体或室等均属于本发明的保护范围。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述培养室的底壁具有凹槽。
当干细胞在逐渐聚集成球的过程中,由于重力等因素,其会下沉接触到底壁,通过底部多个凹槽的设计,使得干细胞得以均匀的分布,形成大小均匀的球体,这样即可以通过调整干细胞灌注时的细胞密度,达到控制干细胞球大小的目的。
没有凹槽的情况下,也能形成干细胞球,但通过凹槽的设计可以使得干细胞球的大小更均匀。
凹槽的形状可以根据具体情况设置,优选的,所述凹槽呈半圆U型、圆锥V型或四面倒金字塔型。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述凹槽的深度为0.8-1.2mm,优选的,所述凹槽的深度为1mm。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述培养室的数量为多个;
优选的,所述培养室的数量为9个;
优选的,9个所述培养室以3×3的方式均匀间隔地排列所述基板上;
优选的,任意相邻两个培养室之间的间距为0.25-0.35cm;
优选的,每个所述培养室呈立方体结构,其长度为1.4-1.6cm、宽度为1.4-1.6cm、深度为0.4-0.6cm。
另一方面,本发明提供了制备干细胞球的方法,其包括:将干细胞悬液置于如上所述的装置中的培养室中进行悬浮培养。
将干细胞和培养液置于如上所述的装置中的培养室中进行悬浮培养,一方面利用培养室对干细胞不亲和的特性,防止其贴壁生长,促进其成球;另一方面,利用干细胞表面高表达细胞粘附因子N/E-Cadherin,使干细胞自发聚集形成干细胞团块,形成干细胞球。
采用该方法且所制备出的干细胞球可在常温条件下长时间保存和储运后仍具有较高的存活率和多能性。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,上述干细胞为单细胞悬液。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述干细胞在所述培养室中培养的密度为0.5-2×106个/ml,培养时间为24-48小时。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述培养液含有:DMEM低糖培养基、18-22%胎牛血清或者DMEM血清替代物、0.8-1.2%非必需氨基酸以及4.8-5.2%L-谷氨酰胺。
DMEM低糖培养基是指含1.5g/L左右的葡萄糖的DMEM培养基。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,所述干细胞为由人多能干细胞株分化而成的间充质干细胞株或由成体组织分离来的间充质干细胞。
优选的,在本发明的一些实施方案中,所述成体组织包括但不限于骨髓,脂肪和脐带血。
再一方面,本发明提供了一种保存干细胞的方法,其包括:将干细胞悬液置于如上所述的装置中的培养室中进行悬浮培养以使干细胞成球;
用铝箔塑封所述装置中的培养室。
该保存干细胞的方法可直接将装置在常温下存储和运输。干细胞球在10天之内维持90%以上活率并保证优异的生物功能。
需要说明的是,如果是培养瓶,则可以直接旋紧瓶盖。然后在常温下存储和运输。
进一步地,在本发明的一些实施方案中,往培养室中添加干细胞培养基填充至培养室90%的体积,在无菌条件下用铝箔塑封所述装置中的培养室。
利用该保存方法将干细胞成球,以使干细胞以球体形式存在,使其能够在常温条件下可经长时间保存和运输,仍具有较高的存活率和多能性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1中的MSC形成球体后在常温(AC)条件下放置7天的细胞存活检测结果;
图2为本发明实验例1中的MSC形成球状体后在常温(AC)条件下放置7天的形态检测结果;
图3为本发明实验例1中的MSC形成球状体后在常温(AC)条件下放置7天和9天后的存活率;
图4为本发明实验例1中的MSC形成球状体后在常温(AC)条件下放置7天的膜联蛋白(AnnexinV)和死细胞标记物(PI)的流式细胞术测定结果;
图5为本发明实验例2中的MSC形成球状体后在常温(AC)条件下放置7天的形态学和生物学特征检测结果;
图6为为本发明实验例2中的MSC形成球状体后在常温(AC)条件下放置7天后的免疫应答和调节作用的检测结果;
图7为本发明实施例1中的用于制备干细胞球的装置的立体结构示意图;
图8为本发明实施例1中的用于制备干细胞球的装置的培养室的结构示意图;
图9为本发明实施例1中的用于制备干细胞球的装置的培养室的底壁的结构示意图;
图10为本发明实施例1中的用于制备干细胞球的装置的剖面结构示意图;
图11为本发明实施例1中的用于制备干细胞球的装置的培养室灌注单细胞悬液时的结构示意图;
图12为本发明实施例1中的用于制备干细胞球的装置的在干细胞球形成时的结构示意图;
图13为本发明实施例1中的用于制备干细胞球的装置的表面塑封密封膜时的结构示意图;
图14为本发明实施例2中的用于制备干细胞球的培养瓶的水平放置状态下的结构示意图;
图15为本发明实施例2中的用于制备干细胞球的培养瓶的竖直放置状态下的结构示意图;
图16为本发明实施例1提供的用于制备干细胞球的装置和实施例2提供的用于制备干细胞球的培养瓶的使用方式参考说明流程示意图。
图标:10-用于制备干细胞球的装置;11-基板;12-培养室;13-侧壁;14-底壁;15-凹槽;16-密封膜;20-单细胞悬液;21-干细胞球;22-培养瓶;23-瓶体;24-瓶口。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
如图7-图10所示,本实施例提供的用于制备干细胞球的装置10,其包括:由对干细胞不亲和特性的材料聚氯乙烯制成的基板11。
基板11上设置有培养室12,每个培养室12具有侧壁13和底壁14(参考图7和图8)。
底壁14具有多个凹槽15,本实施例中,凹槽15呈倒金字塔型(参考图7、图8、图9)。
本实施例中,培养室12的个数及其尺寸和凹槽的尺寸参考如下参数设计:
培养室的个数为9个,以3×3的方式均匀间隔地排列所述基板上;培养室的侧壁高度(即深度,不含凹槽的深度)为0.5cm左右,培养室之间的间距为0.3cm左右,培养室的长和宽均为1.5cm左右;
凹槽15的深度为1mm左右;倒金字塔型的凹槽15的长和宽均为15mm左右。
需要说明的是,在其他的实施例中,培养室的个数及其尺寸和凹槽的尺寸均可以根据实际需求进行设计。
此外,还需要说明的是,在其他的实施例中,凹槽的形状也可以是呈半圆U型或圆锥V型或者是平底型(即截面呈倒梯形)
采用本实施例的装置制备干细胞球的方法,具体如下:
将人间充质干细胞(MSC)和培养液混合而成单细胞悬液20灌注于该装置中的培养室12中进行悬浮培养(参考图11),控制干细胞在培养室中培养的密度为1×106个/ml,培养36小时。这样利用聚氯乙烯不对细胞亲和的特性,形成干细胞的3D悬浮培养条件,利用干细胞表面高表达细胞粘附因子N/E-Cadherin,使干细胞在凹槽中自发沉淀,聚合形成干细胞球21(参考图12)。
干细胞球收集后可以直接使用或者用胰蛋白酶消化成单细胞后使用。
其中,培养液含有:DMEM低糖培养基、20%胎牛血清、1%非必需氨基酸以及5%L-谷氨酰胺。
需要说明的是,在其他的实施例中,干细胞可以是由人多能干细胞株分化而成的间充质干细胞株或由成体组织分离来的间充质干细胞。该成体组织包括但不限于骨髓,脂肪和脐带血等。
此外,该装置可以作为保存或运输干细胞的工具,其使用流程可参考图16,例如在灌注干细胞悬液后用密封膜16例如铝箔或者塑料膜对基板11表面塑封(参考图13),进而使干细胞以球体形式在常温条件下长时间(例如7~10天)保存和储运,其仍具有较高的存活率和多能性。在使用时用酶消化成单细胞后用于血管注射、直接注射或再次进行细胞培养等。
实施例2
本实施例提供的用于制备干细胞球的培养瓶22,其由实施例1提供的基板11封装在瓶体23中构成,该培养瓶22包括瓶体23和瓶口24,瓶口24与瓶体23内的腔室相通。瓶体23整体呈方形结构,瓶体23由对干细胞不亲和特性的材料聚氯乙烯制成。瓶体23的六个侧壁中的一个侧壁由实施例1中的基板11构成,瓶口24开设在另外五个侧壁中的任意一个侧壁上。与实施例1不同的是,本实施例所用的基板11上的培养室数量为一个,瓶体23内的腔室即为培养室。
当然,在其他的实施例中,瓶体23内可以以层叠的方式设置多层基板,可以在预设的空间内提高制备干细胞球的数量,当然基板层数可根据实际情况设置。
本实施例提供的用于制备干细胞球的培养瓶不仅具有实施例1的效果,将其用于保存或运输干细胞更具有便捷性和安全性。其使用方式可参考图16,在灌注干细胞悬液后将瓶口密封,并将其平放(参考图14),即使得基板所在的平面与水平面大致保持平行,以使干细胞充分沉积在基本上的凹槽内制备细胞球,进而使干细胞以球体形式在常温条件下长时间(例如7~10天)保存和储运。使用时,可将培养瓶竖直放置(参考图15),基板上的细胞球可以汇聚在培养瓶底部,以便于收集,然后合适的工具例如注射器将其从瓶口取出干细胞球,用于后续步骤使用。
实验例1
1.采用AO/PI染色法检测MSC形成球体后在常温(AC)条件下放置后的细胞存活情况实验方法:
取MSC,采用实施例1的方法使其形成球体(Sp),并转入离心管中,于常温条件下放置7天,相应的球状体细胞命名为EMSCSp-AC/D7,然后将EMSCSp-AC/D7消化成单细胞并通过AO/PI染色进行活/死细胞检测;
将EMSCSp-AC/D7消化成单细胞重新铺回培养皿中以再次形成单层细胞,随后在正常条件下放置7天,相应的细胞命名为EMSCSp-AC/D7-ML,然后直接用AP/PI染色进行活/死细胞检测;
以在6孔板中保持单层(ML)培养的EMSC作为对照,于常温条件下放置7天,所得细胞命名为EMSCML-AC/D7,然后直接用AI/PO染色进行活/死细胞检测;
结果如图1所示。
图1显示了MSC形成球体后在常温(AC)条件下放置7天的存活情况;
图1中:
A为间充质干细胞正常培养条件下形态,比例尺:400微米:
B为常温放置处理方式
C为常温放置处理不同时间形态,比例尺:400微米:
D为经过常温处理后细胞存活率和形态检测,比例尺:400微米,其中,a为EMSCML-AC/D7的染色结果,b为EMSCSp-AC/D7的染色结果,c为EMSCSp-AC/D7-ML。
从图1中结果可以看出,MSC形成球体在常温(AC)条件下放置7天后的EMSCSp-AC/D7的绿色荧光点明显更多,说明其活细胞数量更多(图1-D),表明干细胞以球体形式存在或保存具有更长的存活时间。
2.MSC球状体的形态检测
取MSC,采用实施例1的方法使其形成MSC球体,于常温(AC)条件下放置7天,采用H&E染色检测培养前后的球体形态,结果如图2所示。
根据图2结果可以看出,在常温(AC)条件下放置7天后的MSC球体形态结构完整,与培养的MSC球体形态无明显差异。
3.检测MSC球状体在常温(AC)条件下放置7天和9天后的存活率
取MSC,采用实施例1的方法使其形成MSC球体,于常温(AC)条件下培养9天,分别在第7天和第9天取样,采用流式细胞术测定活细胞(AO+/PI-)的比率;分别设置球体组、对照组、解离组和平面组;
球体组:取MSC,采用实施例1的方法使其形成MSC球体,于常温(AC)条件下培养9天,分别在第7天和第9天取样,采用流式细胞术测定活细胞(AO+/PI-)的比率;
对照组:正常培养条件下的间充质干细胞存活率测定;
解离组:将来自正常培养条件下的间充质干细胞消化成单细胞后常温放置处理的存活率测定;
平面组:将来自正常培养条件下的间充质干细胞按图1B(6-孔板)方式直接常温放置处理的存活率测定;
结果如图3所示,图中:数据以平均值±标准方差(n=3)表示,**:t检验P<0.01。
从图3结果可以看出,无论是常温放置7天还是9天,球体组的间充质干细胞都具有明显高于其他组的细胞存活率。
4.检测MSC的细胞早期调亡标记物即膜联蛋白(AnnexinV)和死细胞标记物(PI);
设置球体组、对照组和平面组;
球体组:取MSC,采用实施例1的方法使其形成MSC球体,于常温(AC)条件下放置7天,通过流式细胞术测定其EMSC上的膜联蛋白(AnnexinV)和死细胞标记物(PI);
对照组:正常培养条件下的间充质干细胞存活率测定;
平面组:将来自正常培养条件下的间充质干细胞按图1B(6-孔板)方式直接常温放置处理的存活率测定。
检测结果如图4所示,可以看出,球体组的膜联蛋白(AnnexinV)和死细胞标记物(PI)的含量较少,说明球体组细胞在常温放置处理时细胞死亡率低于平面组。
实验例2
MSCSp-AC-ML细胞保留MSC的形态学和生物学特征。
图5显示了MSCSp-AC-ML细胞保留MSC的形态学和生物学特征。(A)在具有或不具有球体形成和AC暴露的MSC球体的冷冻切片中对CD902和CD44(红色)的免疫染色。细胞核用DAPI(蓝色)复染。比例尺:100微米。CD90和CD44双阳性细胞在流式细胞术图中显示为具有蓝色同种型对照的红色点。(B)比较AC恢复的MSC样品(EMSCSp-AC/D7-ML和BMSCSp-AC/D7-ML)与其相应的同胞对照(保持在正常单层培养物中)之间的基于微阵列的基因表达谱。R2代表相关系数。
实验例3
将由根据实施例1的方法制得的EMSC球体放置7天后回收,检测其免疫应答和调节作用以及对小鼠淋巴细胞的增殖影响情况。
1.采用RT-PCR分析使用或者不用20ng/mlIFNγ处理24小时后的EMSCsibling、EMSCsp-AC/D7-ML、BMSCsibling、BMSCsp-AC/D7-ML的代表性炎症基因(IDO、PDL1、CXCL10、CCL2、IL6、IL8)的表达情况,结果如图6中的A和B所示,
从图6的A和B可以看出,EMSC sp-AC/D7和BMSC sp-AC/D7均具有较好的免疫应答效果。
2.检测EMSC sp-AC/D7对小鼠淋巴细胞的增殖影响情况
使用CSFE稀释法检测EMSC sp-AC/D7-ML、EMSCsibling、BMSCsibling、BMSCsp-AC/D7ML以不同比例和小鼠淋巴细胞混合后对小鼠淋巴细胞增殖的影响情况,结果图6中的C和D所示(图C中:1:20代表培养体系中EMSC sp-AC/D7或EMSCsibling与小鼠淋巴细胞数量的比率,数据以平均值±SD(n=3)表示)。
从图6中的C和D可以看出,EMSC sp-AC/D7和BMSCsp-AC/D7在1:80的条件下具有较高的抑制率。
综上,本发明的研究显示干细胞成球后也可耐受低温(例如室温),比单层培养的细胞活力更高。在常温下储存7-9天后单层MSC大部分死亡,而MSC球仍保持非常高的活力。当在常温条件下储存4天后,单层ESC早已死亡,而球体形式ESC球仍保持高活力。
MSC在动物模型和临床试验中已被证明可有效治疗许多自身免疫性疾病,炎症和退行性疾病。经过常温保存的MSC作为细胞球活分离成单细胞后注射对小鼠结肠炎模型仍有疗效。因此,本发明的研究结果对在常温下保存干细胞具有重要意义,并有助于其基础研究、大规模生产和远程运输用于临床治疗。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于制备干细胞球的装置,其特征在于,其包括:基板;所述基板上设置有培养室,每个所述培养室具有由对干细胞不亲和特性的材料制成的侧壁和底壁。
2.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述材料为赛璐珞、聚氯乙烯或天然树脂。
3.根据权利要求1或2所述的装置,其特征在于,所述培养室的底壁具有多个凹槽,优选的,所述凹槽呈半圆U型、圆锥V型
或倒金字塔型。
4.根据权利要求3所述的装置,其特征在于,所述凹槽的深度为0.8-1.2mm,优选的,所述凹槽的深度为1mm。
5.根据权利要求1或2所述的装置,其特征在于,所述培养室的数量为多个;
优选的,所述培养室的数量为9个;
优选的,9个所述培养室以3×3的方式均匀间隔地排列所述基板上;
优选的,任意相邻两个培养室之间的间距为0.25-0.35cm;
优选的,每个所述培养室呈立方体结构,其长度为1.4-1.6cm、宽度为1.4-1.6cm、深度为0.4-0.6cm。
6.一种制备干细胞球的方法,其特征在于,其包括:将干细胞和培养液置于权利要求1-5中任一项所述的装置中的培养室中进行悬浮培养。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述干细胞在所述培养室中培养的密度为0.5-2×106个/ml,培养时间为24-48小时。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述培养液含有:DMEM低糖培养基、18-22%胎牛血清或者血清替代物、0.8-1.2%非必需氨基酸以及4.8-5.2%L-谷氨酰胺。
9.根据权利要求7-8任一项所述的方法,其特征在于,所述干细胞为由人多能干细胞株分化而成的间充质干细胞株或由成体组织分离来的间充质干细胞;
优选的,所述成体组织为骨髓,脂肪或脐带血。
10.一种保存干细胞的方法,其特征在于,其包括:将干细胞悬液置于权利要求1-5中任一项所述的装置中的培养室中进行悬浮培养以使干细胞成球;
用铝箔塑封所述装置中的培养室。
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