CN107306936B - 一种常温条件下保存运输干细胞的方法及其所使用的基质 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在常温下对干细胞进行保存和运输的方法，并提供用于保证其存活率和生物活性能量基质。所述方法包括在三维悬浮条件下利用干细胞自身特性将其团块化，使其自然降低增支和代谢速率，可以在常温条件下保证其存活率和生物活性长达7‑10天。本发明方法简单可靠，价格低廉，稳定高效，安全性高，可以大规模的在常温条件下制备，保存，运输和使用干细胞，无需任何温度维持设备、筛选和纯化步骤，即可发挥干细胞的组织再生，免疫调节等生物功能，直接用于干细胞生物和医疗科学研究，免疫性疾病和等应用需求。

Description

一种常温条件下保存运输干细胞的方法及其所使用的基质

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体地说，涉及在常温条件下将能聚集成团的细胞包括干细胞保存，运输和使用，并保证其存活率和生物活性的方法。

背景技术

细胞是生命的基本单位，人体即是由200多种细胞组成的，例如心肌细胞，血细胞和干细胞。干细胞是拥有自我更新和分化能力的细胞。例如间充质干细胞是一种来自中胚层的细胞，广泛存在于骨髓，脂肪，结缔组织，脐带和胎盘等成体和胎儿组织中。间充质干细胞具有自我更新功能并且能够在特定条件下分化成为骨，软骨，肌肉，脂肪，甚至神经和肝细胞等。另外，间充质干细胞还有低免疫原性，可以调节免疫和滋养其它细胞。间充质干细胞目前已被广泛应用于临床实验治疗自身免疫性疾病（如红斑狼疮，多发性硬化和类风湿性关节炎等），移植物抗宿主病，肝病和神经退行性疾病（如帕金森氏病和阿尔斯海默病）等，并取得显著疗效。间充质干细胞可以从骨髓，脐带，脂肪和牙髓等组织中提取，也可以由多能干细胞直接分化而来。这两种方法都依赖高标准实验室的特定设备（如万级超净台，恒温恒湿培养箱和各种高纯气体及培养箱）来制备，维持和质量控制。而这些条件并不是普通医疗机构所能满足的。所以，用于治疗的干细胞产品常常需要在生产机构和医疗机构之间跨越一定的地理范围进行长时间的运输。

来自哺乳类包括人类的细胞必须培养在保证37oC恒温以及适宜的湿度，氧气和二氧化碳浓度的培养箱中。若长时间（比如超过24小时）暴露在大气温度和湿度以及不适宜的氧气和二氧化碳浓度，这些细胞会逐渐失去功能和活性，最终死亡。故此，对于超过24小时的长度运输，往往需要将细胞铺满在培养瓶中并充满培养基，将该培养瓶置于37oC恒温手提箱或者常温下贴身运输。但是这种方式有多重问题：

1.运输的细胞量有限。

2.容易造成细胞的活性降低和逐渐死亡。

3.消耗大量昂贵的培养基，例如充满一个25毫升的培养瓶约需要35毫升培养基。

故此，上述方法常常只用于短途运输小量细胞。细胞的长途运输通常需要冷冻递送，即先将细胞冻存于冷冻管中，将该冷冻管置于干冰盒或液氮制冷后的冷冻罐中输送至目的地后，再解冻复苏数天，在细胞恢复活力后才能使用。运输途中每隔限定时间还需要添加干冰，费用十分昂贵。并且冷冻设备也很难搭乘飞机和高铁等交通工具，过海关需要繁杂的手续和证明材料。一旦在路途中干冰消耗殆尽或冷冻罐升温细胞将会冻融而迅速死亡。因此，开发一种可以将细胞在常温下储存和运输的方法将极大地简化细胞运输，促进细胞的科研和临床应用。

近来，有研究者将脂肪来源的干细胞包裹在海藻糖中运输，这种方法可以在72小时内保证干细胞的活力在70%左右。但是这种方法的不便之处在于，首先需要制备天然来源的海藻糖，并将其按照特定的比例混合，在一定的条件下制备成型。在运输结束使用该细胞时，还需要经过数个步骤的处理，将海藻糖这种异类添加剂去除并纯化干细胞和恢复其活性。故此，该方法繁琐，耗时，而且细胞活力低，维持时间段。

本发明提供一种在常温下将细胞进行保存及运输的方法。本发明方法不同于以往的任何方法，利用细胞自身聚集成团的特性，降低其增殖和代谢速率，可以在常温条件下保存7-10天之久而维持细胞的活力和生物活性不变。整个储存和运输过程无需维持特定的温度，湿度和气体浓度。无后续分离和纯化细胞的必要。满足不同密度和不同规模的细胞的储存和运输。本发明可以直接应用于细胞尤其是干细胞的科学研究和应用，具有可观的科学和社会经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种在常温条件下对干细胞进行保存和运输并可以高效保证其存活率和生物活性地方法。

为了实现本发明目的，具体包括以下四个步骤：

步骤一，干细胞团块形成步骤，首先制备悬浮培养液，利用干细胞具有形成球状体的性能，在悬浮培养条件下，使干细胞自发聚集，形成团块，团块形成后，由于细胞接触抑制原理，在细胞高密度的团块中干细胞自然的降低其增殖和新陈代谢速率，达到了降低耗氧量和消耗营养物质的目的；

步骤二，干细胞团块培养步骤，制备活性能量液体培养基质，将已形成的干细胞团块悬浮于所述的活性能量液体培养基质中形成干细胞团块制品，所说的活性能量培养基可以保证干细胞团块的最基本的能量，营养维持需要和适宜的酸碱度，并可以减少在运输途中应对颠簸造成的应力损伤；

步骤三，干细胞团块制品封装运输步骤，为使干细胞在常温条件下满足长途运输的需要，所述的干细胞团块制品被封装至塑料容器以实现高密度大规模的运输，经过封装后的干细胞制品在整个运输过程无需特定的温度和气体维持设备，在常温条件下即可实现运输；

步骤四：干细胞团块基质去除步骤，在细胞运输到目的地（如医院，科研院所等）后，通过离心装置可以除去基质，实现干细胞和所述培养基质的分离，收集到的干细胞在7天内具有超过90%的存活率和完全的生物功能，可以直接运用。

优选地，在所述的干细胞团块化形成步骤，所述的干细胞团块形成可以采用U/V型超低吸附培养板或者悬滴法，根据不同的干细胞数目制备不同大小规格的细胞团块，形成干细胞均匀球体；

优选的，干细胞团块的球体大小的直径介于50微米－500微米。

优选的，干细胞团块形成方法采用超低吸附培养板或者玻璃培养瓶时，直接将干细胞以高密度的条件下直接铺于板中或培养皿中低速搅拌，使其自发形成大小不一的团块。干细胞团块化通常需要在37度培养箱（5%二氧化碳和大于80%的湿度）中培养24小时完成。

优选地，在所述干细胞团块培养步骤，所述的干细胞活性能量液体培养基质为液体基质和增粘剂混和制成。。液体基质为任何种类细胞培养基，含有基础的养分和酸碱平衡系统，优选为干细胞培养基，成分包括DMEM低糖培养基，20%血清替代物（knock out ofserum replement），1% 非必需氨基酸，5% L－谷氨酰胺。所述增粘剂为食用级添加剂，可以提高液体的粘稠度，优选为甲基纤维素（Methylcellulose），优选使用浓度为0.2%－0.5%.食用级增粘剂，不会产生生物毒性，可代谢，无残留，安全性高，使用方便，可以使干细胞团块在运输途中减少颠簸造成的应力损伤。

优选地，在所述的干细胞封装运输步骤中，所述的将干细胞团块制品封装保存的塑料密封容器为聚乙烯、聚丙烯或密胺等原料制成塑料容器，所述的干细胞的封装密度为100万－1000万细胞每毫升的保存基质。封装时避免混入气体产生气泡。在运输途中，只需将细胞容器置于常温下即可，温度范围为10度－35度，避免强光照射。

优选地，在所述的干细胞团块基质去除步骤，当采用本方法运输的干细胞团块制品被运输到目的地后，可以将干细胞团块应用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞重新置于37度培养箱中恢复增殖；或不消化，直接铺板，间充质干细胞团块可以自我解散，贴壁生长；或将其离心，去除保存基质，直接应用于组织再生移植或者免疫治疗。

本发明的另一目的是提供一种在常温条件下对干细胞进行保存和运输并可以高效保证其存活率和生物活性地的活性能量基质，所述的活性能量基质，基质为液体基质和增粘剂混和制成。液体基质为任何种类细胞培养基，含有基础的养分和酸碱平衡系统，优选为干细胞培养基，成分包括DMEM低糖培养基，20%血清替代物（knock out of serumreplement），1% 非必需氨基酸，5% L－谷氨酰胺。所述增粘剂为食用级添加剂，可以提高液体的粘稠度，优选为甲基纤维素（Methylcellulose），优选使用浓度为0.2%－0.5%.食用级增粘剂，不会产生生物毒性，可代谢，无残留，安全性高，使用方便，可以使干细胞团块在运输途中减少颠簸造成的应力损伤。

本发明的有益效果是依本方法常温存储7天的间充质干细胞在恢复常规培养条件后仍具有一下特征和活性：

1.和普通培养的间充质干细胞相比，有相似的生长速率，更低的老化程度和相似的生物功能，包括定向分化为各种组织（骨，软骨和脂肪）的能力和免疫调节功能。

2.在体外实验中与普通培养的间充质干细胞一样具有抑制淋巴细胞增殖的能力。

3.在由化学物质导致的两种小鼠肠炎实验模型中，能有效保护肠道损伤和体重削减；病检显示移植细胞可以迁移到受损的肠道组织中，抑制炎性反应并促进受损肠壁的组织再生。

本发明提供的方法不仅可以应用在间充质干细胞（骨髓来源和多能干细胞分化来源）上，也可以直接应用在多能干细胞和其他干细胞种类上，例如脂肪干细胞，肌肉干细胞和神经干细胞等，但依不同细胞其储存培养基各异，储存时间也可能长短不一。本发明提供的方法和基质可以保证干细胞在常温条件下7-10天后的存活率高达90%，在恢复常规培养条件后，其仍具有和正常对照细胞相似的生长速率，更低的老化程度和相似的生物功能，包括定向分化为各种组织（骨，软骨和脂肪）的能力和免疫调节功能，在体外实验中与对照细胞具有相似的抑制淋巴细胞增殖的能力，并且在由化学物质导致的两种小鼠肠炎实验模型中，有效的保护了肠道损伤和体重削减。病理切片证明，直接应用本发明方法在常温下保存7天的间充质干细胞可以迁移到受损的肠道组织中，抑制炎性反应并促进受损肠壁的组织再生。本发明方法不仅可以应用在间充质干细胞（骨髓来源和多能干细胞分化来源）上，也可以直接应用在多能干细胞和神经前体细胞上。多能干细胞运用本发明方法在常温下保存4天后仍具有85%的存活率，正常的染色体组，正常的细胞周期，表观遗传特征和多向分化潜能，恢复正常培养后其细胞周期和多向分化潜能与普通培养的人多能干细胞没有差别。神经前体细胞多能干细胞运用本发明方法在常温下保存6天后仍具有与对照组相似的形态，功能和表观遗传特征。本发明方法简单可靠，价格低廉，稳定高效，安全性高，可以直接用于干细胞生物和医疗科学研究，免疫性疾病和退行性疾病的细胞治疗，组织器官损伤的细胞移植以及药物筛选的应用需求，推广使用后具有可观的社会经济效益。

1．

附图说明

图1为实施例一的间充质干细胞聚集成球后在常温条件（AC）下可维持高存活率的图示,其中，

附图1A 所示为来自人胚干细胞的间充质干细胞（EMSC）AC耐受实验流程。单层培养的EMSC和 EMSC球均在AC下放置7天，分别命名为 (EMSCML-AC/D7 和EMSCSp-AC/D7)。细胞球离散后利用AO/PI测定细胞存活率或者直接铺回平面培养(EMSCSp-AC/D7-ML) 。AC下单层培养的EMSCML-AC/D7作为阴性对照。标尺: 400 微米。

附图1B 的图示为经过或没有经过AC的干细胞球切片及H&E染色。标尺: 200微米.

附图1C所示为干细胞球和离散的干细胞悬液（EMSCDISSOC）在AC下放置7天和9天的存活率。**P < 0.01 为显著性差异。

附图1D 的图示为利用细胞表面凋亡标记物（Annexin V+）和核标记物（ PI+）检测干细胞球和单层培养干细胞在AC下的凋亡情况。

图2 在常温条件（AC）下保存7天的间充质干细胞球对大肠炎小鼠仍有疗效的图示，其中，

附图2A-2C 所示为 在AC下以细胞球形式保存7天后重新恢复单层培养的骨髓间充质干细胞（BMSC）（BMSCSp-AC/D7-ML）与正常培养的同株骨髓间充质干细胞（BMSCsibling）均能抑制由 DSS诱导的C57BL/6 大肠炎。附图2A为大肠炎小鼠的体重变化。* P < 0.05。

附图2B 和附图2C 病患小鼠的直肠长度与病理组织学评分。P < 0.05 在(B)标为a, b, 和 c，在附图2C标为 *。

附图2D-2F 所示为BMSCSp-AC/D7-ML与BMSCsibling均能抑制由三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的Balb/c小鼠大肠炎。附图2D为大肠炎小鼠的体重变化。*P < 0.05, **P <0.01。

附图2E和2F病患小鼠的直肠长度与病理组织学评分。 P < 0.05 在(E)标为 a,b, 和 c，在附图2F标为 *。

附图2G所示为在AC下保存7天后的EMSC球直接注入Balb/c小鼠腹腔内，可以显著减轻由 TNBS诱导的大肠炎导致的体重减轻。单层培养的同株干细胞EMSCSibling和 PBS作为对照。

附图2H在AC下保存7天后的EMSC球释放单个细胞(见绿色萤光蛋白GFP阳性细胞)迁移到肠上皮并促进局部细胞增殖（见红色的Ki-67阳性 细胞）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来解释本发明的发明内容，本发明所采用的实施例仅用于解释本发明的

内容，并不用于限制本发明。

实施例一

本发明提供了一种在常温条件下的干细胞保存和运输方法，其特征在于所述的方法包括以下四个步骤；步骤一，干细胞团块形成步骤，制备悬浮培养液，在悬浮培养条件下，使干细胞自发聚集，形成团块；步骤二，干细胞团块培养步骤，制备活性能量液体培养基质，将步骤一形成的干细胞团块置于所述活性能量液体培养基质中形成干细胞团块制品；步骤三，干细胞团块制品封装运输步骤，在常温条件将所述的干细胞团块制品封装塑料容器中以实现高密度大规模的运输；步骤四,干细胞团块基质去除步骤，在细胞运输到目的地后，通过消化法、自然法或离心法去除基质，实现干细胞所述培养基质的分离。具体的，将结合附图1将对间充质干细胞聚集成球状后在室温下保存7天仍具有高活率进行说明。

实验采用间充质干细胞两株（一株由人胚干细胞株CT3细胞分化而来，另一株由捐赠的人骨髓分离而来）用于验证实验。两株细胞均生长于正常的细胞培养环境（37摄氏度，5%二氧化碳，90%湿度）至大约80%融合度即可进行实验，具体的实验步骤如下：

步骤一：在间充质干细胞团块形成步骤，制备干细胞悬浮培养液，在悬浮培养条件下，使干细胞自发聚集，形成团块；

步骤二：干细胞团块培养步骤，制备活性能量液体培养基质，将步骤一形成的干细胞团块置于所述活性能量液体培养基质中形成干细胞团块制品，包括以下子步骤：

1.将细胞取出，去除培养基，用生理盐水（PBS）清洗2遍；

2.用0.05%胰蛋白酶消化3分钟；

3.制备活性能量培养基质做为间充质干细胞培养基质，本实验中的活性能量培养基质的百分比构成为：低糖DMEM，20%血清，1%非必需氨基酸，5%L-谷氨酰胺，混匀后离心收集细胞；

4.再混匀于新鲜培养基中，调整细胞浓度至每毫升8×105个细胞；

5.利用悬滴法制备干细胞球，每滴25微升按阵列均匀滴于10CM培养皿中；

6.将盖好的培养皿放入培养箱，在正常细胞培养环境下培养48小时；

7.加入10毫升培养基混匀所有悬滴并收集悬液，于1000 rpm离心3分钟，去除上清；

8.将细胞球混悬在新鲜培养基中，调整细胞密度为每毫升500万细胞。

然后进入步骤三：干细胞团块制品封装运输步骤：

将细胞球悬液加入1.5毫升塑料离心管中，加入新鲜培养基至管口，石蜡膜封口，避光保存，

记为第0天，室温下（18-25度）保存7天；之后，进入步骤四：干细胞团块基质去除步骤，并对干细胞活性进行检测，包括以下子步骤：

1.在封装后的第7天，收集细胞球悬液于15毫升塑料离心管中，于1000 rpm离心3分钟去除上清，即对干细胞团块进行去除基质，PBS清洗2遍；

2.用0.05%胰蛋白酶消化3分钟；

3.用间充质干细胞培养基重悬细胞，铺板于培养皿后返回培养箱正常培养环境下单层培养；

4.收集的细胞球也可重悬后继续培养，用于实验检测，动物实验或临床应用。

如附图1所示，间充质干细胞聚集成球后在常温条件（AC）下可维持高存活率的图示，其中：

附图1A 所示为来自人胚干细胞的间充质干细胞（EMSC）AC耐受实验流程。单层培养的EMSC和 EMSC球均在AC下放置7天，分别命名为 (EMSCML-AC/D7 和EMSCSp-AC/D7)。细胞球离散后利用AO/PI测定细胞存活率或者直接铺回平面培养(EMSCSp-AC/D7-ML) 。AC下单层培养的EMSCML-AC/D7作为阴性对照。标尺: 400 微米。

附图1B 的图示为经过或没有经过AC的干细胞球切片及H&E染色。标尺: 200微米.

附图1C所示为干细胞球和离散的干细胞悬液（EMSCDISSOC）在AC下放置7天和9天的存活率。**P < 0.01 为显著性差异。

附图1D 的图示为利用细胞表面凋亡标记物（Annexin V+）和核标记物（ PI+）检测干细胞球和单层培养干细胞在AC下的凋亡情况。

实验结果表明两株间充质干细胞利用此方法室温保存均可维持90%以上的存活率和正常的细胞形态。整个过程如附图1所示。

实施例二

本实施例将对应用本发明的方法对间充质干细胞球在室温下保存7天后对结肠炎小鼠仍有疗效进行说明。

将例1中的间充质干细胞球在室温下保存7日后对6-8周龄小鼠进行实验。利用硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的结肠炎模型在雌性C57BL/6小鼠上进行实验。实验步骤如下：

1.在饮用水中掺入2％（w/v）DSS（分子量36,000-50,000，MP Biomedical）7天让小鼠饮用。

2.将间充质干细胞球重悬在PBS中，获得相当于1×106个细胞／100微升的浓度。

3.在DSS处理开始后的第1和2天，使用带有21号针头的注射器给每只小鼠腹腔（i.p.）注射100微升的间充质干细胞球悬液（无球体解离）或PBS（作为阴性对照）。

4.每天监测动物症状和体征包括体重减轻，直肠出血和粪便稠度等。

5.所有小鼠在实验开始后第14天CO2麻醉后断颈处死。从每只小鼠切下结肠，测量其长度。

6.用PBS冲洗结肠，然后将其浸泡在4％多聚甲醛中于4℃固定24小时。

7.将结肠的远端部分包埋在石蜡中并切成5微米厚度。将切片安装到载玻片上，用苏木精和曙红（H＆E）染色，并在Olympus CKX41显微镜上拍照。

8.基於所涉及的面积的百分比和隐窝损失，上皮的侵蚀以及其它参数计算结肠切片的组织学评分。

如附图2中各在常温条件（AC）下保存7天的间充质干细胞球对大肠炎小鼠仍有疗效。气质，附图2A-2C 所示为 在AC下以细胞球形式保存7天后重新恢复单层培养的骨髓间充质干细胞（BMSC）（BMSCSp-AC/D7-ML）与正常培养的同株骨髓间充质干细胞（BMSCsibling）均能抑制由 DSS诱导的C57BL/6 大肠炎。(A) 大肠炎小鼠的体重变化。* P< 0.05。(B and C) 病患小鼠的直肠长度与病理组织学评分。P < 0.05 在(B)标为 a, b,和 c，在(C)标为 *。

附图2D-2F 所示为BMSCSp-AC/D7-ML与BMSCsibling均能抑制由三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的Balb/c小鼠大肠炎。(D)大肠炎小鼠的体重变化。*P < 0.05, **P < 0.01。(E和F)病患小鼠的直肠长度与病理组织学评分。 P < 0.05 在(E)标为 a, b, 和 c，在(F)标为 *。

附图2G所示为在AC下保存7天后的EMSC球直接注入Balb/c小鼠腹腔内，可以显著减轻由 TNBS诱导的大肠炎导致的体重减轻。单层培养的同株干细胞EMSCSibling和 PBS作为对照。

附图2H在AC下保存7天后的EMSC球释放单个细胞(见绿色萤光蛋白GFP阳性细胞)迁移到肠上皮并促进局部细胞增殖（见红色的Ki-67阳性 细胞）。

实验结果表明，具体结果如图2所示，经过室温保存过的间充质干细胞球腹腔注射后能有效保护结肠炎小鼠的肠道损伤和体重削减。病理切片证明，注射后的间充质干细胞可以迁移到受损的肠道组织中，抑制炎性反应并促进受损肠壁的组织再生。

Claims (9)

1.一种在常温条件下的干细胞保存和运输方法，其特征在于，所述方法包括以下四个步骤；

步骤一，干细胞团块形成步骤，制备悬浮培养液，在悬浮培养条件下，使干细胞自发聚集，形成团块；

步骤二，干细胞团块培养步骤，制备活性能量液体培养基质，将步骤一形成的干细胞团块置于所述活性能量液体培养基质中形成干细胞团块制品；

步骤三，干细胞团块制品封装运输步骤，在常温条件将所述干细胞团块制品封装塑料容器中以实现高密度大规模的运输；

步骤四,干细胞团块基质去除步骤，在干细胞团块制品运输到目的地后，通过消化法、自然法或离心法去除活性能量液体培养基质，实现干细胞与所述活性能量液体培养基质的分离；

所述的方法可应用于间充质干细胞和多能干细胞，其中，所述的间充质干细胞包括多能干细胞分化来源、骨髓或其它成体组织来源；

所述的活性能量液体培养基质为液体基质添加增粘剂混合制成，所述的活性能量基质的成分包括DMEM低糖培养基，20%血清替代物，1% 非必需氨基酸，5% L－谷氨酰胺，所述的增粘剂为食用级添加剂。

2.根据权利要求1所述的干细胞保存和运输方法，其特征在于，在所述的干细胞团块形成步骤，所述的干细胞团块形成采用U/V型超低吸附培养板或者悬滴法，根据不同的间充质干细胞数目制备不同大小规格的细胞团块，形成干细胞均匀球体。

3.根据权利要求2所述的干细胞保存和运输方法，其特征在于所述的干细胞均匀球体大小介于50微米－500微米。

4.根据权利要求2所述的干细胞保存和运输方法，其特征在于，在所述的干细胞团块形成步骤，所述干细胞团块形成直接利用超低吸附培养板或者玻璃培养瓶形成，直接将干细胞以高密度的条件下直接铺于板中或培养瓶中低速搅拌，使其自发形成大小不一的团块。

5.根据权利要求 1所述的干细胞保存和运输方法，其特征在于，在所述的干细胞培养步骤，所述的干细胞团块化通常需要在37度、5%二氧化碳和大于80%的湿度培养箱中培养24－48小时形成或在20-37度条件下自发形成。

6.根据权利要求1所述的干细胞保存和运输方法，其特征在于，所述的活性能量基质所包含的增粘剂为甲基纤维素，浓度为0.2%－0.5%。

7.根据权利要求 1所述的干细胞保存和运输方法，其特征在于，在所述的干细胞团块制品运输步骤，将干细胞团块封装保存于密封容器中，所述的密封容器包括聚乙烯、聚丙烯或密胺原料制成的塑料容器，干细胞的封装密度为100万－1000万细胞每毫升。

8.根据权利要求 1所述的干细胞保存和运输方法，其特征在于，在所述的干细胞团块基质去除步骤，所述的基质去除方法可采取消化法、自然法或离心法中任一种，其中，所述的消化法为用0.25%胰蛋白酶将干细胞团块消化成单细胞，再将该单细胞重新置于37度培养箱中恢复增殖；所述的自然法是指不使用消化蛋白酶，直接铺板，间充质干细胞团块自我解散，贴壁生长；所述的离心法是将干细胞团块离心，去除保存基质，直接应用于组织再生移植或者免疫治。

9.一种用于权利要求1所述的常温条件下对干细胞保存和运输方法的基质，其特征在于，所述的基质为活性能量基质，能使干细胞在常温条件下保存和运输，所述的活性能量基质为液体基质添加增粘剂混合制成，液体基质为任何种类细胞培养基，所述的活性能量基质包括低糖培养基，20%血清替代物，1% 非必需氨基酸，5% L－谷氨酰胺。

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