CN110072992A - 哺乳动物细胞冷冻保存液 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供能够将哺乳动物细胞冷冻保存、并在融化后有效地抑制细胞死亡的细胞冷冻保存液及哺乳动物细胞施予用液、使用了所述细胞冷冻保存液的哺乳动物细胞的冷冻保存方法。将含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或者它们的盐、4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或者它们的盐、和DMSO或甘油的等渗液作为哺乳动物细胞冷冻保存液或哺乳动物细胞施予用液，将哺乳动物细胞冷冻保存于所述细胞冷冻保存液中时，较之以往的哺乳动物细胞冷冻保存液而言，能够有效地抑制融化后的细胞死亡。

Description

哺乳动物细胞冷冻保存液
技术领域
本发明涉及：包含含有2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或者它们的盐(以下有时也称为“海藻糖类”)、4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或者它们的盐(以下有时也称为“葡聚糖类”)、和二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide；以下称为“DMSO”)或甘油(glycerol)的等渗液的哺乳动物细胞冷冻保存液及哺乳动物细胞施予用液；包括将哺乳动物细胞冷冻保存于上述哺乳动物细胞冷冻保存液中的步骤的哺乳动物细胞的冷冻保存方法。
背景技术
细胞的冷冻保存作为细胞生物学的研究中必不可少的技术正被广泛利用。近年来，细胞冷冻保存技术不限于仅全世界的细胞库中各种株化细胞的保存，也应用于以畜牧业界的品种保存、家畜增产为目的的精子、卵子、或受精卵的冷冻保存、生殖医疗中的生殖细胞的冷冻保存等。
胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES细胞)、诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell，iPS细胞)等多能干细胞是具有无限的增殖能力和分化为多种组织细胞的多分化能力的细胞。人多能干细胞被期待利用其性质而应用于再生医疗，为了实现这一点，必须确立优质的细胞冷冻技术、即在解冻后保障高细胞存活率、未分化性的细胞冷冻技术。
细胞的冷冻保存方法一般可大致分为缓慢冷冻法和急速冷冻法(玻璃化法)。缓慢冷冻法是将细胞悬浮于含有甘油、DMSO、角蛋白水解物、水解明胶、血清、血清白蛋白等作为冷冻保护剂的冷冻保存液(专利文献1～5)中，使温度每1分钟下降1℃左右从而缓缓冷冻的方法。通过缓慢地冷却，细胞内的水分子与冷冻保护剂置换而进行脱水，细胞内、细胞周边部的冰晶的成长被抑制，防止细胞膜及细胞内结构的损伤、蛋白质的变性及断裂(非专利文献1)。最近，已明确除了冷冻保存胚胎的情况以外，在冷冻保存通常的细胞的情况下，即使不使用程序冷冻仪严密地控制温度调节，使用泡沫苯乙烯箱、市售的细胞冷冻箱也能够缓慢地进行冷冻。上述方法由于简便，因此也被称为简易缓慢冷冻法，正广泛用于实验室、细胞库等。
另一方面，玻璃化法是为了抑制由冷冻导致生成细胞内外的冰晶而通过急速冷却而冷冻成玻璃状的方法。玻璃化法的技术开发自1937年被报道至实用化为止耗费了较长时间，在1985年开发了使用含有冷冻保护剂(其包含高浓度的DMSO、乙酰胺、丙二醇、及聚乙二醇)的玻璃化保存液的方法。通过开发该方法，小鼠早期胚胎的冷冻保存、就缓慢冷冻法而言是困难的牛胚胎、猪胚胎的冷冻保存成为可能。目前，以胚胎库为代表的多数机构中正使用玻璃化法。
最近，积极地进行了人ES细胞、iPS细胞的冷冻保存液的开发、冷冻保存方法的改良。例如，公开了将人ES细胞悬浮于含有5％的DMSO、10％胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)、及10％乙二醇(EG)的冷冻保存液中，使用简易缓慢冷冻法进行冷冻保存时，融化后的细胞存活率升高(非专利文献2)。另外，公开了将人ES细胞、iPS细胞悬浮于冷冻保存液(STEM-CELLBANKER[日本全药工业公司制])中，使用简易缓慢冷冻法进行冷冻保存时，融化后的细胞存活率升高(非专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003/064634号小册子
专利文献2：日本特开平6-46840号公报
专利文献3：日本特开平7-255469号公报
专利文献4：日本特开平8-325101号公报
专利文献5：日本特开2002-233356号公报
非专利文献
非专利文献1：J.R.Dobrinsky,Theriogenology,45,17-26(1996)
非专利文献2：Y.S.Ha等，Human Reprod.,20,1779-1785(2005)
非专利文献3：F.Holm等，Human Reprod.,25,1271-1279(2010)
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于，提供能够将哺乳动物细胞冷冻保存、并在融化后有效地抑制细胞死亡的细胞冷冻保存液及哺乳动物细胞施予用液、使用了该细胞冷冻保存液的哺乳动物细胞的冷冻保存方法。
用于解决课题的手段
本申请的发明人在为了解决上述课题而反复深入研究的过程中，发现将哺乳动物细胞冷冻保存于向等渗液中添加DMSO或甘油、进而添加海藻糖类及葡聚糖类以使其分别为2.0～6.0(w/v)％及4.0～7.0(w/v)％而成的溶液中时，较之以往的哺乳动物细胞冷冻保存液而言，能够有效地抑制融化后的细胞死亡，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
〔1〕哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，其包含等渗液，所述等渗液含有：
2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或者它们的盐；
4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或者它们的盐；和
DMSO或甘油。
〔2〕如上述〔1〕所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。
〔3〕如上述〔2〕所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。
〔4〕如上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，DMSO或甘油为1.0～15(v/v)％的DMSO。
〔5〕如上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，等渗液为乳酸林格液。
〔6〕哺乳动物细胞施予用液，其特征在于，其包含上述〔1〕～〔5〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液。
〔7〕如上述〔6〕所述的哺乳动物细胞施予用液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。
〔8〕如上述〔7〕所述的哺乳动物细胞施予用液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。
〔9〕哺乳动物细胞的冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻保存方法包括将哺乳动物细胞冷冻保存于上述〔1〕～〔5〕中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液中的步骤。
〔10〕如上述〔9〕所述的冷冻保存方法，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。
〔11〕如上述〔10〕所述的冷冻保存方法，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。
作为本发明的其他实施方式，可举出：用于冷冻保存哺乳动物细胞的、海藻糖类与葡聚糖类与DMSO或甘油与等渗液的组合；海藻糖类与葡聚糖类与DMSO或甘油与等渗液的组合的用于制备哺乳动物细胞冷冻保存液的用途。
发明效果
根据本发明，较之以往的哺乳动物细胞冷冻保存液而言，能够有效地抑制将经冷冻保存的哺乳动物细胞融化时的细胞死亡，因此，能够提供再生医疗中的优质的含移植用细胞的溶液。
具体实施方式
本发明的哺乳动物细胞冷冻保存液是限于“用于冷冻保存哺乳动物细胞”的用途的、包含等渗液(以下有时也称为“本申请的冷冻保存液”)的液体，所述等渗液含有：海藻糖类；葡聚糖类；和，DMSO及/或甘油。
作为上述等渗液，只要是利用钠离子、钾离子、钙离子等对盐浓度、糖浓度等进行调节以使得与体液、细胞液的渗透压几乎相同的等渗液即可，没有特别限定，具体而言，可举出生理盐水、具有缓冲效果的生理盐水(磷酸缓冲生理盐水[Phosphate bufferedsaline；PBS]、Tris缓冲生理盐水[Tris Buffered Saline；TBS]、HEPES缓冲生理盐水等)、林格液、乳酸林格液、乙酸林格液、碳酸氢盐林格液、5％葡萄糖水溶液、动物细胞培养用基础培养基(DMEM、EMEM、RPMI-1640、α-MEM、F-12、F-10、M-199等)、等渗剂(葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、乳糖、氯化钠等)等，其中，优选乳酸林格液。等渗液可以是市售的，也可以是自行制备的。作为市售的等渗液，可举出大塚生食注(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制)(生理盐水溶液)、林格液“OTSUKA”(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制)(林格液)、Lactec(注册商标)Injection(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制)(乳酸林格液)、乳酸林格液“KS”(共立制药公司制)(乳酸林格液)、Veen-F输注液(兴和创药公司制)(乙酸林格液)、大塚糖液5％(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制)(5％葡萄糖水溶液)、BICANATE输注液(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制)(碳酸氢盐林格液)。本说明书中所谓“等渗”是指渗透压为250～380mOsm/L的范围内。
作为上述海藻糖类中的海藻糖，除了作为两分子α-葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖类的α,α-海藻糖以外，还可举出作为α-葡萄糖和β-葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖类的α,β-海藻糖、作为两分子β-葡萄糖以1,1-糖苷键键合而成的二糖类的β,β-海藻糖，其中，优选α,α-海藻糖。上述海藻糖可以通过化学合成、利用微生物的生产、利用酶的生产等任意已知的方法来制造，也可以使用市售品。例如，可以举出α,α-海藻糖(株式会社林原公司制)、α,α-海藻糖(和光纯药公司制)等市售品。
作为上述海藻糖类中的海藻糖衍生物，只要是在二糖类的海藻糖上键合有1个或多个糖单元的糖基海藻糖类即可，没有特别限定，糖基海藻糖类包括葡糖基海藻糖、麦芽糖基海藻糖、麦芽三糖基海藻糖(Maltotriosyltrehalose)等。
作为上述海藻糖类中的海藻糖、其衍生物的盐，可举出例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐等酸加成盐，钠盐、钾盐、钙盐等金属盐，铵盐、烷基铵盐等。需要说明的是，上述盐在使用时以溶液的形式来使用，其作用优选与使用海藻糖的情况效果相同。上述盐类也可以形成水合物或溶剂合物，此外，可以单独使用任一种或适当地组合使用两种以上。
作为上述葡聚糖类中的葡聚糖，只要是由D-葡萄糖形成的多糖(C6H10O5)n、且以α1→6键为主链即可，没有特别限定，作为葡聚糖的重均分子量(Mw)，可举出例如葡聚糖40(Mw＝40000)、葡聚糖70(Mw＝70000)等。上述葡聚糖可以通过化学合成、利用微生物的生产、利用酶的生产等任意已知方法来制造，也可以使用市售品。例如，可举出葡聚糖40(东京化成工业公司制)、葡聚糖70(东京化成工业公司制)等市售品。
作为上述葡聚糖类中的葡聚糖衍生物，包括硫酸葡聚糖、羧基化葡聚糖、二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖等。
作为上述葡聚糖类中的葡聚糖、其衍生物的盐，可举出例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐等酸加成盐，钠盐、钾盐、钙盐等金属盐，铵盐、烷基铵盐等。需要说明的是，上述盐在使用时以溶液的形式来使用，其作用优选与使用葡聚糖的情况效果相同。上述盐类也可以形成水合物或溶剂合物，此外，可以单独使用任一种或适当地组合使用两种以上。
作为本申请的冷冻保存液中的海藻糖类的浓度，只要为2.0～6.0(w/v)％的范围内即可，可举出例如2.0～5.6(w/v)％、2.0～5.2(w/v)％、2.0～4.8(w/v)％、2.0～4.4(w/v)％、2.0～4.0(w/v)％、2.0～3.6(w/v)％、2.0～3.2(w/v)％、2.0～3.0(w/v)％、2.4～6.0(w/v)％、2.8～6.0(w/v)％、3.2～6.0(w/v)％、3.6～6.0(w/v)％、4.0～6.0(w/v)％、4.4～6.0(w/v)％、4.8～6.0(w/v)％、5.0～6.0(w/v)％、2.4～6.0(w/v)％、2.4～5.6(w/v)％、2.4～5.2(w/v)％、2.4～4.8(w/v)％、2.4～4.4(w/v)％、2.4～4.0(w/v)％、2.4～3.6(w/v)％、2.4～3.2(w/v)％、2.4～3.0(w/v)％，优选为2.4～3.0(w/v)％。
作为本申请的冷冻保存液中的葡聚糖类的浓度，只要为4.0～7.0(w/v)％的范围内即可，可举出例如4.0～6.6(w/v)％、4.0～6.2(w/v)％、4.0～5.8(w/v)％、4.0～5.4(w/v)％、4.0～5.0(w/v)％、4.4～7.0(w/v)％、4.8～7.0(w/v)％、5.2～7.0(w/v)％、5.6～7.0(w/v)％、6.0～7.0(w/v)％，优选为4.0～5.0(w/v)％。
本申请的冷冻保存液中的DMSO的浓度通常为0.1(v/v)％以上，优选为0.3(v/v)％以上，更优选为0.6(v/v)％以上，进一步优选为1.0(v/v)％以上，另外，从避免细胞毒性的观点考虑，通常为30(v/v)％以下，优选为25(v/v)％以下，更优选为20(v/v)％以下，进一步优选为15(v/v)％以下。因此，作为本申请的冷冻保存液中的DMSO的浓度，通常为0.1～30(v/v)％的范围内，优选为0.3～25(v/v)％，更优选为0.6～20(v/v)％，进一步优选为1.0～15(v/v)％。DMSO可通过化学合成来制造，也可使用市售品。例如，可举出和光纯药工业公司制、Nacalai Tesque公司制等的市售品。
本申请的冷冻保存液中的甘油的浓度通常为0.1(v/v)％以上，优选为0.3(v/v)％以上，更优选为0.6(v/v)％以上，进一步优选为1.0(v/v)％以上，另外，考虑制备本申请的冷冻保存液的容易程度，通常为50(v/v)％以下，优选为40(v/v)％以下，更优选为30(v/v)％以下，进一步优选为20(v/v)％以下。因此，作为本申请的冷冻保存液中的甘油的浓度，通常为0.1～50(v/v)％的范围内，优选为0.3～45(v/v)％，更优选为0.6～30(v/v)％，进一步优选为1.0～20(v/v)％。甘油可通过化学合成来制造，也可使用市售品。例如，可举出和光纯药工业公司制、Nacalai Tesque公司制等的市售品。
本申请的冷冻保存液含有海藻糖类、葡聚糖类、DMSO及/或甘油(以下将它们统称为“本申请的冷冻保护成分”)作为能够将哺乳动物细胞冷冻保存、并抑制在之后融化时的细胞死亡的有效成分(冷冻保护成分)。可使用台盼蓝(Trypan Blue)染色法、TUNEL法、Nexin法、FLICA法等能够检测细胞死亡的已知方法来确认本申请的冷冻保存液能够将哺乳动物细胞冷冻保存、并抑制在之后融化时的细胞死亡。
作为本申请的冷冻保存液中的任选成分，可举出本申请的冷冻保护成分以外的冷冻保护成分(例如，乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、丝胶蛋白、低聚异麦芽糖)、等渗剂(例如，葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、乳糖、氯化钠等)、螯合剂(例如，EDTA、EGTA、柠檬酸、水杨酸盐)、助溶剂、保存剂、抗氧化剂、氨基酸(例如，脯氨酸、谷氨酰胺)等。本说明书中所谓“任选成分”，表示可含有也可不含有的成分。
另外，本申请的冷冻保存液不含人、牛等来源的血清或来自血清的成分(例如，白蛋白)。
本发明的哺乳动物细胞施予用液是限于“用于将哺乳动物细胞施予至哺乳动物”的用途的本申请的冷冻保存液、即、限于“用于冷冻保存哺乳动物细胞”的用途、及“用于将哺乳动物细胞施予至哺乳动物”的用途的、含有海藻糖类、葡聚糖类、和DMSO及/或甘油的等渗液。本申请的冷冻保存液(优选几乎不含或完全不含上述血清或来自血清的成分)即使直接施予至哺乳动物的生物体内(例如静脉施予)也不会对哺乳动物的生物体造成不良影响。因此，本申请的冷冻保存液(优选几乎不含或完全不含上述血清或来自血清的成分)可有利地用作“用于在将哺乳动物细胞冷冻保存、融化后，将哺乳动物细胞施予(例如静脉施予)至哺乳动物的”液体。
作为本发明的哺乳动物细胞的冷冻保存方法，只要包括将哺乳动物细胞冷冻保存于本申请的冷冻保存液中的步骤、即、将含有哺乳动物细胞的本申请的冷冻保存液进行冷冻保存的步骤即可，没有特别限定，可以是缓慢冷冻法，也可以是急速冷冻法(玻璃化法)。作为所述缓慢冷冻法，可举出例如将含有哺乳动物细胞的本申请的冷冻保存液在低温冰箱、超低温冰箱(通常为-20℃～-150℃的范围内)中冷冻、然后在液氮(通常为-150℃～-196℃的范围内)中保存的方法。作为上述急速冷冻法，可举出例如将哺乳动物细胞悬浮于本申请的冷冻保存液中后根据需要移至管内、在液氮(通常为-150℃～-196℃的范围内)中急速冷冻、保存的方法。将哺乳动物细胞冷冻保存、然后融化时的细胞存活率有时根据哺乳动物细胞种类的不同而不同。因此，优选根据作为冷冻保存对象的细胞来选择冷冻融化后的细胞存活率更高的冷冻保存方法。
作为上述哺乳动物细胞，除了再生医疗等中经由血管施予的哺乳动物干细胞以外，可举出经静脉施予至I型糖尿病患者的哺乳动物胰岛细胞、经静脉施予至癌症患者的哺乳动物的树突状细胞、自然杀伤细胞、αβT细胞、γδT细胞、细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlymphocyte；CTL)等。本说明书中，作为哺乳动物，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类，兔等兔形目，猪、牛、山羊、马、绵羊等有蹄目，狗、猫等食肉目，人、猴、猕猴、食蟹猴、狨猴、猩猩(orangutanan)、黑猩猩等灵长类等，其中，可合适地举出小鼠、猪、人。
另外，上述“干细胞”是指具有自我复制能力及分化·增殖能力的未成熟的细胞。干细胞根据分化能力包括多能干细胞(pluripotent stem cell)、专能干细胞(multipotent stem cell)、单能干细胞(unipotent stem cell)等亚群。所谓多能干细胞，是指虽然其自身不能形成为个体、但具有能分化成构成生物体的所有组织和细胞的能力的细胞。所谓专能干细胞，是指虽不能分化成所有种类、但具有能分化成多种组织、细胞的能力的细胞。所谓单能干细胞，是指具有能分化成特定的组织和细胞的能力的细胞。
作为多能干细胞，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、EG细胞、iPS细胞等。ES细胞可以通过将内部细胞块于饲养细胞(feeder cell)上或含有LIF的培养基中进行培养来制备。ES细胞的制造方法已记载于例如WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等中。EG细胞可以通过将原始生殖细胞于含有mSCF、LIF及bFGF的培养基中进行培养来制备(Cell,70:841-847,1992)。iPS细胞可以通过向体细胞(例如成纤维细胞、皮肤细胞等)中导入Oct3/4、Sox2及Klf4(根据需要还可导入c-Myc或n-Myc)等重编程因子(Reprogramming factor)来制备(Cell,126:p.663-676,2006；Nature,448:p.313-317,2007；Nat Biotechno1,26；p,101-106,2008；Cel1 131:p.861-872,2007；Science,318:p.1917-1920,2007；Cell Stem Cells 1:p.55-70,2007；Nat Biotechnol,25:p.1177-1181,2007；Nature,448:p.318-324,2007；Cell Stem Cells 2:p.10-12,2008；Nature451:p.141-146,2008；Science,318:p.1917-1920,2007)。另外，通过对体细胞的细胞核进行核移植而制备的早期胚胎进行培养而建立的干细胞作为多能干细胞也是优选的(Nature,385,810(1997)；Science,280,1256(1998)；Nature Biotechnology,17,456(1999)；Nature,394,369(1998)；Nature Genetics,22,127(1999)；Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,96,14984(1999))、Rideout III等，(Nature Genetics,24,109(2000))。
作为专能干细胞，可举出能分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等细胞的间充质干细胞；能分化成白细胞、红细胞、血小板等血细胞系细胞的造血干细胞；能分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等细胞的神经干细胞；骨髓干细胞、生殖干细胞等成体干细胞；等等。专能干细胞优选为间充质干细胞。所谓间充质干细胞，是指能分化成成骨细胞、成软骨细胞及成脂肪细胞中的全部或几种的干细胞。专能干细胞可以通过本身已知的方法从生物体分离。例如，间充质干细胞可采用已知的一般性方法从哺乳动物的骨髓、脂肪组织、末梢血、脐带血等中采集。另外，可通过骨髓穿刺后的造血干细胞等的培养、传代来分离人间充质干细胞(Journal of Autoimmunity,30(2008)163-171)。专能干细胞也可通过将上述多能干细胞于合适的诱导条件下进行培养来获得。间充质干细胞优选为人脂肪来源间充质干细胞。
作为保存于本申请的冷冻保存液中的哺乳动物细胞，可举出黏附性的细胞。本说明书中，所谓“黏附性”细胞，是指可通过黏附于支持物上来进行生存、增殖、物质生产的支持物依赖性细胞。作为黏附性干细胞，可举出多能干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞、生殖干细胞等。黏附性干细胞优选为间充质干细胞。
保存于本申请的冷冻保存液中的哺乳动物细胞(群)可以是从生物体内分离得到的，也可以是在体外传代培养得到的，优选经过分离或纯化。本说明书中，所谓“分离或纯化”，是指施行将除目标成分以外的成分除去的操作。经分离或纯化的哺乳动物细胞的纯度(相对于总细胞数而言的、哺乳动物干细胞数等目标细胞的比例)通常为30％以上，优选为50％以上，更优选为70％以上，进一步优选为90％以上(例如100％)。
保存于本申请的冷冻保存液中的哺乳动物细胞(群)优选为单一细胞(单个细胞，single cell)状态。本说明书中，所谓“单一细胞状态”，是指未与其他细胞聚集成块(即，未凝集的状态)。单一细胞状态的哺乳动物细胞可以通过用胰蛋白酶/EDTA等对经体外培养的哺乳动物细胞进行酶处理后、通过吹吸(pipetting)或轻拍(tapping)等该技术领域中已知的方法将细胞悬浮来制备。哺乳动物细胞中含有的单一细胞状态的哺乳动物细胞的比例通常为70％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为99％以上(例如100％)。单一细胞状态的细胞的比例可如下进行确定：将哺乳动物细胞分散于PBS中，于显微镜下对其进行观察，调查随机选择的多个(例如1000个)细胞是否凝集。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。需要说明的是，以下的实施例中，有时出于方便起见，将含有3(w/v)％海藻糖及5(w/v)％葡聚糖40的乳酸林格液称为“TDR液”。
实施例1
1.确认本申请的冷冻保存液作为哺乳动物细胞冷冻保存液是有用的
为了确认本申请的冷冻保存液作为哺乳动物细胞冷冻保存液是有用的，将哺乳动物细胞冷冻保存于DMSO或甘油与TDR液形成的混合液中，分析融化后的细胞存活率。
1-1材料及方法
[哺乳动物细胞]
试验使用了以下的表1中记载的人脂肪来源间充质干细胞(hAD-MSC；HumanAdipose derived Mesenchymal Stem Cell)。
[表1]
供体年龄、性别、来源 38岁、女性、脂肪
供体数 1
批号 0000421627
购买时的传代次数 1次
保存方法 在液氮中保存
供给源 Lonza Walkersville,Inc.
代理店 Lonza Japan Ltd
[TDR液]
TDR液使用海藻糖(株式会社林原公司制)、低分子葡聚糖L输注液(含有10[w/v]％葡聚糖的Lactec Injection)(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制)、及LactecInjection(Otsuka Pharmaceutial Factory,Inc.制)制备。
[哺乳动物细胞的培养]
hAD-MSC按照常规方法进行培养。即，将hAD-MSC置入添加了含有人脂肪来源干细胞添加因子套装(Lonza Walkersville,Inc.制，PT-4503)的ADSC-BM(脂肪来源干细胞基础培养基，Adipose Derived Stem Cell Basal Medium)(Lonza Walkersville,Inc.制，PT-3273)(以下简称为“培养液”)的75cm2烧瓶中，在CO2培养箱(37℃条件下)内进行传代培养。另外，每3天更换培养液。
[含有哺乳动物细胞的冷冻保存液的制备及冷冻]
含有哺乳动物细胞的冷冻保存液的制备及冷冻按照以下〔1〕～〔12〕的步骤实施。
步骤〔1〕，将小型培养箱(personal incubator)预先加温至37±2℃。
步骤〔2〕，将培养有hAD-MSC的75cm2烧瓶从CO2培养箱中取出。
步骤〔3〕，在倒置显微镜下观察细胞的状态，使用约90％(80～100％)会合状态的细胞。
步骤〔4〕，抽吸培养液，向各75cm2烧瓶中分别添加8mL的PBS(-)。
步骤〔5〕，抽吸PBS(-)后。向烧瓶中分别添加4mL胰蛋白酶/EDTA(CC-5012，LonzaWalkersville,Inc.制)，在小型培养箱中在37±2℃条件下孵育5分钟。
步骤〔6〕，一边在倒置显微镜下观察，一边缓缓摇动直到90％左右的细胞剥离。
步骤〔7〕，为了终止胰蛋白酶反应，分别加入8mL胰蛋白酶中和液(TNS；CC-5002，Lonza Walkersville,Inc.制)，通过吹吸将细胞剥离，移至50mL的离心管中。
步骤〔8〕，离心(离心机的设定条件：210×g，离心时间为5分钟，20℃)处理后，除去上清液，添加规定量(每个75cm2烧瓶为2mL)的PBS(-)，将细胞悬浮。
步骤〔9〕，从细胞悬浮液中分取一部分(20μL)，与20μL的台盼蓝染色液(Gibco公司制)混合，使用细胞计数盘计数细胞总数及死亡细胞数。需要说明的是，使用细胞计数盘，将1处细胞计数部的四角的细胞计数室区域的细胞总数作为计数细胞数。
步骤〔10〕，使用Finnpipette移液器(100-1000μL)将残留的细胞悬浮液以规定量分别分注至15mL透明聚丙烯离心管中，以210×g、5分钟、25℃进行离心处理。
步骤〔11〕，除去上清液，将细胞以成为3.0×106个细胞/mL的方式悬浮于各种细胞冷冻保存液(含有0、0.5、1.0、2.0、5.0、或10(v/v)％的DMSO(和光纯药工业公司制)或10(v/v)％甘油(和光纯药工业公司制)的TDR液、或STEM-CELLBANKER[日本全药工业公司制])中。
步骤〔12〕，向专用的小瓶中分别分注1mL细胞悬浮液，置入BICELL冷冻处理容器(Nihon Freezer Co.,Ltd.制)，于-80℃将细胞冷冻(3小时以上)，然后迅速移至液氮罐中。
[评价法]
将含有哺乳动物细胞的冷冻保存液冷冻融化后，按照以下的步骤〔1〕～〔6〕评价活细胞率及细胞增殖率。
步骤〔1〕，将恒温槽设定为37℃，预先进行加温。
步骤〔2〕，向就培养而言所必需的个数的75cm2烧瓶中添加培养液，在CO2培养箱内静置30分以上，使其平衡。
步骤〔3〕，从液氮罐中取出包含经冷冻的细胞的小瓶，立刻移至设定为37℃的恒温槽中，一边轻轻搅拌，一边融化。
步骤〔4〕，缓缓地搅拌(吹吸5次)，在细胞悬浮的状态下，将一部分(20μL)分取至预先添加有20μL台盼蓝染色液的1.5mL微量管中。将与台盼蓝染色液混合后的细胞悬浮液分取至细胞计数盘，通过计数细胞总数及台盼蓝阳性细胞(死亡细胞)数，算出刚刚冷冻融化后的细胞存活率(表2[n＝1]及表4[n＝3])。
步骤〔5〕，使用残留的细胞悬浮液，以成为3.0×106个细胞/mL的方式接种至预先准备的包含培养液的75cm2烧瓶中，在CO2培养箱内进行培养。另外，一部分残留的细胞悬浮液在于25℃静置6小时及24小时后，按照上述[含有哺乳动物细胞的冷冻保存液的制备及冷冻]的项目中记载的步骤〔9〕，计数细胞总数及死亡细胞数，由此算出在冷冻融化后于25℃静置6小时及24小时时的细胞存活率(表5[n＝3]及表6[n＝3])。
步骤〔6〕，在培养后第1、3、5、及第7天，按照上述[含有哺乳动物细胞的冷冻保存液的制备及冷冻]的项目中记载的步骤〔1〕～〔9〕，将细胞回收后，通过对细胞总数进行计数，算出在冷冻融化后培养1、3、5、及7天时的细胞增加率(表3[n＝2]及表7[n＝3])。
1-2结果
首先，对添加至TDR液的DMSO的浓度进行了研究。结果，将细胞冷冻保存于含有1.0～10％的DMSO的TDR液中时，刚刚融化后的细胞存活率(表2)、细胞增殖率(表3)均较高。根据这些结果，在以下的实验中，添加至TDR液的DMSO的浓度固定为10％。
然后，实施与作为现有细胞冷冻保存液的STEM-CELLBANKER(日本全药工业公司制)的比较实验。结果，将细胞冷冻保存于含有10％的DMSO的TDR液中时的刚刚融化后的细胞存活率显示与STEM-CELLBANKER同等水平的高值(表4)。另外，在将细胞冷冻保存于含有10％的DMSO的TDR液中的情况下，在冷冻融化后于25℃静置6小时及24小时时的细胞存活率高于将细胞冷冻保存于STEM-CELLBANKER中的情况(表5及6)。此外，使用了代替DMSO而将甘油添加至TDR液得到的细胞冷冻保存液的情况下，得到了同样的效果(表5及6)。需要说明的是，将DMSO或甘油与TDR液混合后，海藻糖浓度为2.7％，葡聚糖浓度为4.5％。另一方面，将细胞冷冻保存于含有10％的DMSO或10％甘油的TDR液中时的细胞增殖效率显示与STEM-CELLBANKER同等水平的高值(表7)。
以上的结果表明，将哺乳动物细胞冷冻保存于含有2.7％左右(2.0～6.0％)的海藻糖及4.5％左右(4.0～7.0％)的葡聚糖、和DMSO、甘油的等渗液中时，能够得到与使用了现有哺乳动物细胞冷冻保存液(STEM-CELLBANKER)的情况同等程度的增殖效率，并且能够得到冷冻融化后的细胞存活率较之使用了现有哺乳动物细胞冷冻保存液(STEM-CELLBANKER)的情况而言更高的优异效果。
[表2]
DMSO浓度(％) 存活率(％)
0 81
0.5 89
1.0 91
2.0 96
5.0 96
10 95
[表3]
表中的数值(细胞数)表示为使用各浓度的DMSO保存的细胞中、以刚刚(冷冻)融化后的细胞数作为100时的相对值。
[表4]
表中的数值表示刚刚冷冻融化后的细胞存活率(％)。
[表5]
表中的数值表示在冷冻融化后于25℃静置6小时时的细胞存活率(％)。
[表6]
表中的数值表示在冷冻融化后于25℃静置24小时时的细胞存活率(％)。
[表7]
表中的数值(细胞数)表示为各种细胞冷冻保存液中、将接种时(刚刚冷冻融化后)的细胞数作为100时的相对值。另外，第1天～第7天的值为平均值±标准偏差(SD)。
实施例2
2.并用海藻糖及葡聚糖带来的冷冻保护效果、以及哺乳动物细胞冷冻保存液中的海藻糖及葡聚糖浓度的研究
为了研究并用海藻糖及葡聚糖带来的冷冻保护效果、以及哺乳动物细胞冷冻保存液中的海藻糖及葡聚糖浓度，按照实施例1中记载的方法，制备含有3％的海藻糖、及0～10％的葡聚糖的乳酸林格液与10％的DMSO形成的混合液(表8)、含有0～10％的海藻糖、及5％的葡聚糖的乳酸林格液与10％的DMSO形成的混合液(表9)，将hAD-MSC冷冻保存于这些混合液中，算出融化后的细胞存活率(表8及9)。
结果显示，较之单独使用海藻糖或葡聚糖的情况而言，并用海藻糖及葡聚糖的情况下，冷冻融化后的细胞存活率升高。另外，显示出若海藻糖及葡聚糖的浓度分别为至少0.9％，则9成以上的细胞存活(表8及9)。
[表8]
表中的海藻糖及葡聚糖浓度表示DMSO混合前的浓度(％)，括号内示出了DMSO混合后的浓度(％)。另外，表中的存活率表示刚刚冷冻融化后的细胞存活率(平均值±标准偏差[SD]，n＝3)(％)。
[表9]
表中的海藻糖及葡聚糖浓度表示DMSO混合前的浓度(％)，括号内示出了DMSO混合后的浓度(％)。另外，表中的存活率表示刚刚冷冻融化后的细胞存活率(平均值±标准偏差[SD]，n＝3)(％)。
产业上的可利用性
根据本发明，能够有效地抑制将经冷冻保存的哺乳动物细胞融化时的细胞死亡，因此在再生医疗等中的移植医疗领域、癌症治疗领域是有用的。

Claims (11)

1.哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，其包含等渗液，所述等渗液含有：
2.0～6.0(w/v)％的海藻糖或其衍生物或者它们的盐；
4.0～7.0(w/v)％的葡聚糖或其衍生物或者它们的盐；和
二甲基亚砜或甘油。
2.如权利要求1所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。
3.如权利要求2所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。
4.如权利要求1～3中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，二甲基亚砜或甘油为1.0～15(v/v)％的二甲基亚砜。
5.如权利要求1～4中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液，其特征在于，等渗液为乳酸林格液。
6.哺乳动物细胞施予用液，其特征在于，其包含权利要求1～5中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液。
7.如权利要求6所述的哺乳动物细胞施予用液，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。
8.如权利要求7所述的哺乳动物细胞施予用液，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。
9.哺乳动物细胞的冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻保存方法包括将哺乳动物细胞冷冻保存于权利要求1～5中任一项所述的哺乳动物细胞冷冻保存液中的步骤。
10.如权利要求9所述的冷冻保存方法，其特征在于，哺乳动物细胞为哺乳动物间充质干细胞。
11.如权利要求10所述的冷冻保存方法，其特征在于，哺乳动物间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。
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