CN115023135B - 线粒体的冷冻保存剂与使用其的线粒体冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
一种冷冻保存剂，包含海藻糖、HEPES以及人类血清白蛋白，且此冷冻保存剂不包含氯化钾、氯化钠、乙二醇、乙二醇四乙酸以及乙二胺四乙酸。前述冷冻保存剂可用于线粒体的冷冻保存。
Description
技术领域
本发明是关于一种冷冻保存剂与冷冻保存方法，特别是一种冷冻保存剂与使用其的线粒体冷冻保存方法。
背景技术
线粒体(Mitochondria)是细胞内进行氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所。由于三磷酸腺苷为细胞活动的能量来源，所以线粒体又有“细胞能量工厂”之称。除了为细胞提供能量外，线粒体还参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长周期的能力。由于线粒体是人体中相当重要的胞器，一旦线粒体的功能出现问题，将导致如脑肌病与神经退化性疾病帕金森氏症等疾病的发生。
针对这些线粒体相关疾病，目前新兴的治疗方法包含线粒体移植。透过预先冷冻保存健康的线粒体，在日后发生线粒体相关疾病时，即可移植健康的线粒体至细胞中以取代有问题的线粒体，藉此改善线粒体相关疾病的症状。
由于线粒体为双层膜结构，较细胞来得脆弱，因此虽然已知有多种细胞的冷冻保存剂，但这些冷冻保存剂并不适合拿来冻存线粒体。为此，业界正积极开发线粒体专用的冷冻保存剂。然而，在进行线粒体冷冻保存的过程中，线粒体常常会出现肿胀甚至破损的状况，导致线粒体在解冻后无法发挥正常功能。因此，如何防止线粒体在冷冻保存过程中受损，已成为一个重要的课题。
发明内容
本发明是提供一种冷冻保存剂与使用其的线粒体冷冻保存方法，藉由使用此冷冻保存剂对线粒体进行冷冻保存，防止线粒体在冷冻保存过程中受损。
本发明一个实施例揭露一种冷冻保存剂，包含海藻糖(Trehalose)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)以及人类血清白蛋白(Human albumin protein)，且此冷冻保存剂不包含氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、乙二醇(ethylene glycol)、乙二醇四乙酸(EGTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
本发明另一实施例揭露一种冷冻保存剂，由海藻糖(Trehalose)、HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)以及人类血清白蛋白(Humanalbumin protein)所组成。
本发明一个实施例揭露一种线粒体冷冻保存方法，包含以下步骤：将冷冻保存剂与多个线粒体置入容器中；接着，将装有冷冻保存剂与线粒体的容器置入液氮中进行降温；接着，将装有冷冻保存剂与线粒体的容器自液氮中取出并置入冷冻设备中进行冷冻保存。
根据上述本发明所揭露的冷冻保存剂与使用其的线粒体冷冻保存方法，经冷冻保存的线粒体可维持较佳的结构完整性以及较佳的能量合成能力。如此一来，经冷冻保存的线粒体可维持较佳的功能，进而在后续使用上可取得较佳的效果。
以上的关于本揭露内容的说明及以下的实施方式的说明系用以示范与解释本发明的精神与原理，并且提供本发明的专利申请范围更进一步的解释。
附图说明
图1为本发明一个实施例的线粒体冷冻保存方法流程图。
图2为线粒体使用本发明实施例的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月再解冻后的电子显微镜照片。
图3为线粒体使用本发明比较例1的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月再解冻后的电子显微镜照片。
图4为线粒体使用本发明比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月再解冻后的电子显微镜照片。
图5为线粒体分别使用本发明实施例、比较例1与比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存1个月再解冻后的氧气消耗量示意图。
图6为线粒体分别使用本发明实施例、比较例1与比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月再解冻后的氧气消耗量示意图。
具体实施方式
以下在实施方式中详细叙述本发明的详细特征以及优点，其内容足以使任何熟习相关技艺者了解本发明的技术内容并据以实施，且根据本说明书所揭露的内容、权利要求书及附图，任何熟习相关技艺者可轻易地理解本发明相关的目的及优点。以下的实施例用于进一步详细说明本发明的观点，但非以任何观点限制本发明的范畴。
本发明一个实施例的冷冻保存剂包含体积摩尔浓度为150至300mM的海藻糖(Trehalose)、体积摩尔浓度为10至20mM的HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)以及重量百分浓度为0.1％至1％的人类血清白蛋白(Human albumin protein)；此冷冻保存剂中不包含氯化钾(KCl)、乙二醇(ethyleneglycol)、乙二醇四乙酸(EGTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。换句话说，本发明一个实施例的冷冻保存剂中包含海藻糖、HEPES及人类血清白蛋白；海藻糖在冷冻保存剂中的体积摩尔浓度为150至300mM；HEPES在冷冻保存剂中的体积摩尔浓度为10至20mM；人类血清白蛋白在冷冻保存剂中的重量百分浓度为0.1％至1％；此冷冻保存剂中不包含氯化钾(KCl)、乙二醇(ethylene glycol)、乙二醇四乙酸(EGTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。冷冻保存剂可用于线粒体的冷冻保存，例如可用于冷冻保存人类细胞的线粒体。在一个实施例中，此冷冻保存剂中不包含氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、乙二醇、乙二醇四乙酸(EGTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
进行冷冻保存的过程中，冷冻保存剂中的海藻糖保护线粒体膜，维持线粒体膜的完整性，以及维持线粒体膜的正常功能。冷冻保存剂中的HEPES具有缓冲冷冻保存剂的酸碱度的功效，且HEPES亦具有使冷冻保存剂为线粒体的等张溶液的功效。冷冻保存剂中的人类血清白蛋白亦具有使冷冻保存剂的渗透压与线粒体的渗透压保持恒定的功效。
在惯用的冷冻保存剂中，氯化钾具有用于调整冷冻保存剂为线粒体的pH缓冲溶液和等张溶液的功效。在惯用的冷冻保存剂中，乙二醇四乙酸(EGTA)与乙二胺四乙酸(EDTA)具有捕捉细胞破损时释放出的钙离子的功效，藉此避免大量钙离子进入线粒体内导致线粒体膜通透性改变，造成线粒体肿胀甚至破损。
然而，相较于惯用的冷冻保存剂，本发明一个实施例的冷冻保存剂中并不包含氯化钾、乙二醇、乙二醇四乙酸(EGTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。在未含有氯化钾、乙二醇、乙二醇四乙酸(EGTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)的情况下，使用本发明一个实施例的冷冻保存剂进行冷冻保存的线粒体，仍可维持较佳的结构完整性以及较佳的能量合成能力。如此一来，经冷冻保存的线粒体可维持较佳的功能，进而在后续使用上可取得较佳的效果。
于本发明另一实施例揭露一种冷冻保存剂，由体积摩尔浓度为150至300mM的海藻糖(Trehalose)、体积摩尔浓度为10至20mM的HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)以及重量百分浓度为0.1％至1％的人类血清白蛋白(Human albumin protein)所组成。换句话说，本发明另一实施例的冷冻保存剂由海藻糖、HEPES及人类血清白蛋白所组成；海藻糖在冷冻保存剂中的体积摩尔浓度为150至300mM；HEPES在冷冻保存剂中的体积摩尔浓度为10至20mM；人类血清白蛋白在冷冻保存剂中的重量百分浓度为0.1％至1％。本实施例中各组成成分的功效以及冷冻保存剂用于冷冻保存线粒体的效果如前一实施例中所述，在此便不再赘述。
于本发明前述二实施例中，海藻糖的体积摩尔浓度为150至300mM，较佳为200至300mM，更佳为250至300mM。HEPES的体积摩尔浓度为10至20mM，较佳为10至16mM，更佳为10至13mM。人类血清白蛋白的重量百分浓度为0.1％至1％，较佳为0.1％至0.7％，更佳为0.1％至0.3％。
于本发明其他实施例中，海藻糖与HEPES的体积摩尔浓度的比值(海藻糖/HEPES)为13至17，较佳为14至16，更加为15。
于本发明前述实施例中的冷冻保存剂呈液态的水溶液而可被直接使用，且使用的溶剂为去离子水，但不以此为限。于本发明另外的其他实施例中，冷冻保存剂呈固态，欲使用固态的冷冻保存剂时须先以纯水(例如去离子水)或细胞可接受的其他溶剂将固态的冷冻保存剂调配成液态的冷冻保存剂。固态的冷冻保存剂中，干燥的海藻糖、干燥的HEPES与干燥的人类血清蛋白的重量比为92.42～112.96∶2.14～2.62∶0.9～1.1，较佳的重量比为102.69∶2.38∶1。
接下来说明本发明一个实施例的线粒体冷冻保存方法，请参照图1。图1为本发明一个实施例的线粒体冷冻保存方法流程图。本发明一个实施例的线粒体冷冻保存方法例如为用于冷冻保存人类细胞的线粒体。本发明一个实施例的线粒体冷冻保存方法包含以下步骤。
首先，对容器进行预冷(S101)。
详细来说，将容器放入液氮中20至40秒进行预冷。容器例如为试管或离心管。
接着，将冷冻保存剂与线粒体置入容器中(S102)。
详细来说，先将已预冷的容器在室温下回温5至15秒，再将前述本发明的冷冻保存剂与线粒体直接置入容器的底部。将冷冻保存剂与线粒体置入容器中后，可轻敲容器使冷冻保存剂与线粒体集中至容器底部，避免线粒体残留在容器内壁面。残留在容器内壁面而未浸于冷冻保存剂中的线粒体，在冷冻保存过程中因未受到冷冻保存剂保护而容易肿胀或破损。
接着，将装有冷冻保存剂与线粒体的容器置入液氮中进行降温(S103)。
详细来说，将装有冷冻保存剂与线粒体的容器置入液氮中5至15秒进行降温，使容器中的冷冻保存剂与线粒体呈冻结状态。
接着，将装有冷冻保存剂与线粒体的容器自液氮中取出并置入冷冻设备中进行冷冻保存(S104)。
详细来说，将装有冷冻保存剂与线粒体的容器自液氮中取出并置入冷冻设备中，于-70至-90摄氏度的温度进行冷冻保存。
欲解冻冷冻保存的线粒体时，将装有冻结状态的冷冻保存剂与线粒体的容器自冷冻设备中取出后，置入25至35摄氏度的水中轻轻摇晃45至65秒进行解冻。待容器中的冷冻保存剂与线粒体完全解冻后，将装有冷冻保存剂与线粒体的容器插入碎冰中，使线粒体保持在摄氏4至10度以备后续使用。后续使用例如为将线粒体用于线粒体移植以治疗线粒体相关疾病。
使用本发明一个实施例的线粒体冷冻保存方法，经冷冻保存的线粒体在解冻后仍可维持较佳的结构完整性以及较佳的能量合成能力。如此一来，经冷冻保存的线粒体可维持较佳的功能，进而在后续使用上可取得较佳的效果。
以下藉由实验说明本发明所揭露的冷冻保存剂与使用其的线粒体冷冻保存方法可使经冷冻保存的线粒体维持较佳的结构完整性以及较佳的能量合成能力。
于本发明的线粒体冷冻保存实验中，使用的线粒体取自人类的干细胞。干细胞的准备方式为于烧瓶(flask)中，以含有重量百分浓度为10％的胎牛血清(FBS)的培养基培养168个小时后，供后续使用，其中干细胞可以是胚胎干细胞、诱导型干细胞、羊膜间叶干细胞、胎盘间叶干细胞、绒毛膜间叶干细胞、脐带间叶干细胞、脂肪间叶干细胞、骨髓间叶干细胞或其它来源的成体干细胞。
实验用线粒体的准备步骤如下所述。首先，自培养脂肪间叶干细胞的培养皿中取出大约108至109个脂肪间叶干细胞。接着，将取出的脂肪间叶干细胞与线粒体蛋白分离缓冲液(Mitochondria Isolation Buffer，Ibc：225mM甘露醇(mannitol)、75mM蔗糖(Sucrose)、30mM Tris-HCl、pH7.4)装入试管中，并利用gentleMACS公司的解离器(Dissociator)均质化试管中的脂肪间叶干细胞与缓冲液。接着，将打破的脂肪间叶干细胞放入体积百分浓度30％的Percoll层析液中，并以95000g超高速离心30分钟后除去沉淀物，再以13000g高速离心10分钟，以分离出沉淀的线粒体。接着，以线粒体蛋白分离缓冲液浸润清洗分离出的线粒体，以便供后续实验使用。
线粒体进行冷冻保存的方法如下所述。首先，将离心管放入液氮中预冷30秒。接着，将离心管自液氮中取出并于室温下回温10秒。接着，将先前自干细胞中分离出的线粒体300微克(μg)以及冷冻保存剂60微升(μL)直接置入离心管底部的容置空间中。接着，轻敲离心管以确保线粒体与冷冻保存剂均集中在离心管底部。接着，将装有线粒体与冷冻保存剂的离心管放入液氮中并静置10秒钟，使线粒体与冷冻保存剂进入冷冻状态。最后，将装有冷冻状态的线粒体与冷冻保存剂的离心管放入内部温度为摄氏-80度的冰箱中进行冷冻保存。
前述线粒体进行冷冻保存的方法中使用的冷冻保存剂分别为本发明的实施例、比较例1与比较例2的冷冻保存剂。本发明的实施例、比较例1与比较例2的冷冻保存剂的组成如表一所示。
表一
| 实施例 | 比较例1 | 比较例2 | |
| 海藻糖 | 300mM | 300mM | 300mM |
| HEPES | 10mM | 10mM | - |
| 人类血清白蛋白 | 0.1wt％ | 0.1wt％ | 0.1wt％ |
| 氯化钾 | - | 10mM | - |
| EGTA | - | 1mM | - |
| EDTA | - | 1mM | - |
解冻经冷冻保存的线粒体以供后续使用的解冻方法如下所述。首先，自冰箱中取出装有冷冻状态的线粒体与冷冻保存剂的离心管，并立即以摄氏30度的温水对装有冷冻状态的线粒体与冷冻保存剂的离心管进行温水浴，在温水浴的过程中轻轻摇晃离心管55秒。接着，待离心管中的线粒体与冷冻保存剂完全解冻后，将离心管插入碎冰中以待后续使用。
接下来，使用电子显微镜观察使用本发明实施例、比较例1与比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月的线粒体，在解冻后的结构完整性。已解冻的线粒体自离心管中被取出后，先以磷酸缓冲生理食盐水(Phosphate buffered saline，PBS)进行清洗，再被制成电子显微镜观察用的试片，以便进行观察。
电子显微镜观察结果如图2至图4所示。图2为线粒体使用本发明实施例的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月再解冻后的电子显微镜照片。图3为线粒体使用本发明比较例1的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月再解冻后的电子显微镜照片。图4为线粒体使用本发明比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月再解冻
后的电子显微镜照片。观察图2至图4中的线粒体可发现，图2中未破损的线粒体数量最多，未破损的线粒体的平均直径最小，且线粒体内膜的嵴(Mitochondrial cristae)可清楚的被观察到。相较之下，图3中未破损的线粒体数量较少，且未破损的线粒体的平均直径较大；图4中未破损的线粒体数量最少，且未破损的线粒体的平均直径最大。因此，由图2至图4可知，本发明实施例的冷冻保存剂虽然不含有氯化钾、EGTA或EDTA，但使用实施例进行冷冻保存的线粒体在解冻后仍保持良好的结构完整性，并未因缺乏氯化钾、EGTA或EDTA而具有较高的平均直径以及较差的结构完整性。
接下来，使用海马生物能量测定仪检测使用本发明实施例、比较例1与比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存1个月与3个月的线粒体在解冻后的能量合成能力。已解冻的线粒体自离心管中被取出后，先以磷酸缓冲生理食盐水(Phosphate buffered saline，PBS)进行清洗，再以海马生物能量测定仪进行检测。
海马生物能量测定仪的测量原理与流程如下。首先，将以PBS清洗后的线粒体20微克与分析用培养基置入分析用孔盘中。接着，监测孔中的基础耗氧量。接着，加入二磷酸腺苷(ADP)至孔中以作为线粒体后续合成三磷酸腺苷(ATP)的原料，此时测得的耗氧量即为线粒体合成三磷酸腺苷的耗氧量。接着，加入三磷酸腺苷合成酶抑制剂至孔中以抑制粒线体产生三磷酸腺苷(ATP)，以得到三磷酸腺苷合成耗氧量。三磷酸腺苷合成酶抑制剂例如为寡霉素(Oligomycin)。接着，加入适当浓度的抗耦合剂至孔中，在不破坏线粒体内膜的电子传递链的情况下，让线粒体以极限状况空转以评估线粒体内膜的电子传递链的耗氧能力。抗耦合剂例如为碳酰氰4-(三氟甲氧基)苯腙(Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone；FCCP)。最后，加入电子传递链抑制剂至孔中以完全关闭线粒体的耗氧量，藉此确认测量的背景值。电子传递链抑制剂例如为鱼藤酮(Rotenone)、抗霉素A(Antimycin A)或两者的组合。
海马生物能量测定仪的测量结果如表二、图5及图6所示。图5为线粒体分别使用本发明实施例、比较例1与比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存1个月再解冻后的氧气消耗量示意图。图6为线粒体分别使用本发明实施例、比较例1与比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月再解冻后的氧气消耗量示意图。
表二
如表二与图5所示，使用实施例的冷冻保存剂进行冷冻保存1个月的线粒体相较于使用比较例1与比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存1个月的线粒体，在解冻后整体的耗氧量较高，且具有明显较高的合成ATP耗氧量以及电子传递链耗氧能力。由此可知，使用实施例的冷冻保存剂进行冷冻保存1个月的线粒体在解冻后，具有较佳的健康状态与较佳的工作能力。如表二与图6所示，使用实施例的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月的线粒体相较于使用比较例1与比较例2的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月的线粒体，在解冻后整体的耗氧量较高，且具有较高的合成ATP耗氧量以及电子传递链耗氧能力。由此可知，使用实施例的冷冻保存剂进行冷冻保存3个月的线粒体在解冻后，具有较佳的健康状态与较佳的工作能力。
由表二、图5及图6可知，使用实施例的冷冻保存剂进行冷冻保存的线粒体，在解冻后具有较佳的能量合成能力。如此一来，使用实施例的冷冻保存剂进行冷冻保存的线粒体，在解冻后具有应用于线粒体移植治疗的潜力。
根据上述本发明所揭露的冷冻保存剂与使用其的线粒体冷冻保存方法，经冷冻保存的线粒体可维持较佳的结构完整性以及较佳的能量合成能力。如此一来，经冷冻保存的线粒体可维持较佳的功能，进而在后续使用上可取得较佳的效果。
Claims (9)
1.一种线粒体的冷冻保存剂在制备用于冷冻保存人类细胞的线粒体的制剂中的用途，所述线粒体的冷冻保存剂包含：
海藻糖；
HEPES；以及
人类血清白蛋白；
其中，所述线粒体的冷冻保存剂不包含氯化钾、氯化钠、乙二醇、乙二醇四乙酸以及乙二胺四乙酸，
其中，海藻糖的体积摩尔浓度为150至300mM，HEPES的体积摩尔浓度为10至20mM，以及人类血清白蛋白的重量百分浓度为0.1％至1％。
2.一种线粒体的冷冻保存剂在制备用于冷冻保存人类细胞的线粒体的制剂中的用途，所述线粒体的冷冻保存剂由海藻糖、HEPES以及人类血清白蛋白所组成，其中，海藻糖的体积摩尔浓度为150至300mM，HEPES的体积摩尔浓度为10至20mM，以及人类血清白蛋白的重量百分浓度为0.1％至1％。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中海藻糖、HEPES与人类血清蛋白的重量比为92.42～112.96∶2.14～2.62∶0.9～1.1。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中海藻糖的体积摩尔浓度为300mM。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中HEPES的体积摩尔浓度为10mM。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中人类血清白蛋白的重量百分浓度为0.1％。
7.一种线粒体冷冻保存方法，包含：
将线粒体的冷冻保存剂与多个线粒体置入同一容器中；
将装有所述线粒体的冷冻保存剂与所述线粒体的所述容器置入液氮中进行降温；以及
将装有所述线粒体的冷冻保存剂与所述线粒体的所述容器自液氮中取出并置入冷冻设备中进行冷冻保存，
其中，所述线粒体的冷冻保存剂包含：
海藻糖；
HEPES；以及
人类血清白蛋白；
其中，所述线粒体的冷冻保存剂不包含氯化钾、氯化钠、乙二醇、乙二醇四乙酸以及乙二胺四乙酸，
其中，海藻糖的体积摩尔浓度为150至300mM，HEPES的体积摩尔浓度为10至20mM，以及人类血清白蛋白的重量百分浓度为0.1％至1％。
8.一种线粒体冷冻保存方法，包含：
将线粒体的冷冻保存剂与多个线粒体置入同一容器中；
将装有所述线粒体的冷冻保存剂与所述线粒体的所述容器置入液氮中进行降温；以及
将装有所述线粒体的冷冻保存剂与所述线粒体的所述容器自液氮中取出并置入冷冻设备中进行冷冻保存，
其中，所述线粒体的冷冻保存剂由海藻糖、HEPES以及人类血清白蛋白所组成，其中，海藻糖的体积摩尔浓度为150至300mM，HEPES的体积摩尔浓度为10至20mM，以及人类血清白蛋白的重量百分浓度为0.1％至1％。
9.如权利要求7或8所述的线粒体冷冻保存方法，进一步包含于将所述线粒体的冷冻保存剂与所述线粒体置入所述容器中的步骤前，对所述容器进行预冷。
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| Title |
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| Mitochondria frozen with trehalose retain a number of biological functions and preserve outer membrane integrity;Yamaguchi R et al,;Cell Death Differ;参见全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115023135A (zh) | 2022-09-06 |
| WO2021168764A1 (zh) | 2021-09-02 |
| US20230003625A1 (en) | 2023-01-05 |
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Legal Events
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