JP2023515749A - 培養乳製品産生のための生細胞構築物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

【概要】【解決手段】本発明は、乳腺細胞から培養乳製品をｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで産生するための生細胞構築物、乳腺細胞から単離された培養乳製品を産生する方法、単離された培養乳製品を産生するためのバイオリアクタ、および培養乳製品に関する。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、２０２０年１月８日出願の米国仮出願第６２／９５８，４０７号、および２０２０年１２月１０日出願の米国仮出願第６３／１９９，１６４号に基づく優先権の利益を主張するものであり、それぞれの内容は全体を参照することで本明細書に引用される。

本発明の分野
本発明は、培養した乳腺細胞から培養乳製品をｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで産生するための生細胞構築物、およびその使用方法に関する。

乳は、乳児期中、および一生を通じてヒトの食生活における必需食料品である。米国小児科学会と世界保健機関は、乳児に対し生後６か月間は母乳育児のみ行うことを推奨している。乳児期以降の乳製品の消費は、ヒトの栄養の根幹をなすものであり、世界中で７００億ドル産業に相当する。しかし、泌乳は、生理的に労力を要し多大な代謝が求められるプロセスであって、母乳育児を行う母親に対し生物学的および実際的な困難を提示しかねないものであるため、乳産生は、農業上の観点から環境、社会、および動物福祉に対する影響に関連付けられている。

乳腺細胞培養物を用いて食物を産生する可能性は、近年では多大な関心を集めており、培養筋肉および脂肪細胞から肉製品や魚介類製品を作り出す先駆けとなる成功例がいくつか存在する（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｔｒｅｎｄｓ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．７８：１５５－１６６）。加えて、微生物発現系を用いた卵タンパクおよび乳タンパクの産生を商業化するための取り組みが進められている。しかし、このような発酵を用いたプロセスは、個々の成分に対する遺伝子組換え型の発現と精製に左右されるものであり、乳または乳製品の分子プロファイルを完全に再現することはできない。

本発明は、培養した乳腺細胞から培養乳製品をｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで産生するための生細胞構築物、およびその使用方法を提供することで、当該技術分野における欠点を解消する。

本明細書中のある実施形態では、（ａ）外面、内腔／基底室を画定する内面、および内面から外面まで延在する複数の孔を有する三次元足場と、（ｂ）三次元足場の外面に配置されるマトリクス材料と、（ｃ）内腔／基底室内に配置されるとともに内部表面と流体接触状態にある培養培地と、（ｄ）マトリクス材料に配置された分極化乳腺細胞の最低７０％コンフルエントな単層であって、乳腺細胞が、生きた初代乳腺上皮細胞、生きた乳腺筋上皮細胞、生きた乳腺前駆細胞、生きた不死化乳腺上皮細胞、生きた不死化乳腺筋上皮細胞、および生きた不死化乳腺前駆細胞からなる群から選択される、単層とを含む生細胞構築物が、開示される。いくつかの実施形態では、分極化乳腺細胞は、頂端面と基底面を含む。いくつかの実施形態では、分極化乳腺細胞の基底面は、培養培地と流体接触状態にある。いくつかの実施形態では、分極化乳腺細胞の最低７０％、最低８０％、最低９０％、最低９５％、最低９９％、または１００％が、同じ配向で分極化される。いくつかの実施形態では、分極化乳腺細胞の単層は、最低７０％コンフルエント、最低８０％コンフルエント、最低９０％コンフルエント、最低９５％コンフルエント、最低９９％コンフルエント、または１００％コンフルエントである。いくつかの実施形態では、分極化乳腺細胞は、構成上活性なプロラクチン受容体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、炭素源、化学緩衝系、１または複数の必須アミノ酸、１または複数のビタミン、および／あるいは補助因子、ならびに１または複数の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、プロラクチンをさらに含む。いくつかの実施形態では、マトリクス材料は、１または複数の細胞外マトリクスタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、三次元足場は、天然ポリマー、生体適合性合成ポリマー、合成ペプチド、前述のいずれかに由来する複合体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。いくつかの実施形態では、天然ポリマーは、コラーゲン、キトサン、セルロース、アガロース、アルギネート、ゼラチン、エラスチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、および／またはヒアルロン酸である。いくつかの実施形態では、生体適合性合成ポリマーは、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン共酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、および／またはポリエチレングリコールである。

本明細書中のある実施形態では、乳腺細胞から単離された培養乳製品を産生する方法であって、（ａ）培養乳製品を産生する条件下、生細胞構築物をバイオリアクタ中で培養する工程であって、生細胞構築物が、（ｉ）外面、内腔／基底室を画定する内面、および内面から外面まで延在する複数の孔を有する三次元足場、（ｉｉ）三次元足場の外面に配置されるマトリクス材料、（ｉｉｉ）内腔／基底室内に配置されるとともに内部表面と流体接触状態にある培養培地、ならびに（ｉｖ）マトリクス材料に配置された分極化乳腺細胞の最低７０％コンフルエントな単層であって、乳腺細胞が、生きた初代乳腺上皮細胞、生きた乳腺筋上皮細胞、生きた乳腺前駆細胞、生きた不死化乳腺上皮細胞、生きた不死化乳腺筋上皮細胞、および生きた不死化乳腺前駆細胞からなる群から選択される、単層を含む、工程と、（ｂ）培養乳製品を単離する工程とを含む方法が、開示される。いくつかの実施形態では、分極化乳腺細胞は、頂端面と基底面を含む。いくつかの実施形態では、分極化乳腺細胞の基底面は、培養培地と流体接触状態にある。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、密閉型バイオリアクタである。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、生細胞構築物の内腔／基底室から実質的に単離される頂端区画を含む。いくつかの実施形態では、頂端区画は、乳腺細胞の頂端面と流体接触状態にある。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、乳腺細胞の頂端面から頂端区画へと分泌される。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養乳製品と実質的に接触しない。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総細胞密度は、最低１０^１１である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低１．５ｍ^２である。いくつかの実施形態では、培養培地は、炭素源、化学緩衝系、１または複数の必須アミノ酸、１または複数のビタミン、および／あるいは補助因子、ならびに１または複数の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、マトリクス材料は、１または複数の細胞外マトリクスタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、足場は、天然ポリマー、生体適合性合成ポリマー、合成ペプチド、前述のいずれかに由来する複合体、またはそれらのあらゆる組合せを含む。いくつかの実施形態では、天然ポリマーは、コラーゲン、キトサン、セルロース、アガロース、アルギネート、ゼラチン、エラスチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、および／またはヒアルロン酸である。いくつかの実施形態では、生体適合性合成ポリマーは、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン共酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、および／またはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、培養する工程は、約２７℃～約３９℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、培養する工程は、約３０℃～約３７℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、培養する工程は、約４％～約６％の大気中ＣＯ_２濃度で実施される。いくつかの実施形態では、培養する工程は、約５％の大気中ＣＯ_２濃度で実施される。

本明細書中のある実施形態では、バイオリアクタであって、（ａ）培養乳製品を含む頂端区画と、（ｂ）（ｉ）外面、内腔／基底室を画定する内面、および内面から外面まで延在する複数の孔を有する三次元足場、（ｉｉ）三次元足場の外面に配置されるマトリクス材料、（ｉｉｉ）内腔／基底室内に配置されるとともに内部表面と流体接触状態にある培養培地、ならびに（ｉｖ）マトリクス材料に配置された分極化乳腺細胞の最低７０％コンフルエントな単層であって、乳腺細胞が、生きた初代乳腺上皮細胞、生きた乳腺筋上皮細胞、生きた乳腺前駆細胞、生きた不死化乳腺上皮細胞、生きた不死化乳腺筋上皮細胞、および生きた不死化乳腺前駆細胞からなる群から選択される、単層を含む少なくとも１個の生細胞構築物とを含み、乳腺細胞の頂端面が頂端区画と流体接触状態にある、バイオリアクタが、開示される。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総細胞密度は、最低１０^１１である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低１．５ｍ^２である。

本明細書中のある実施形態では、細胞の供給および培養乳製品の分泌を区画化する、乳腺細胞を含む生細胞構築物が開示される。

本明細書中のある実施形態では、頂面および底面を有する足場と、足場の頂面にある（ａ）生きた初代乳腺上皮細胞、（ｂ）生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団、ならびに／または（ｃ）生きた不死化乳腺上皮細胞からなる連続単層とを含む生細胞構築物であって、（ａ）生きた初代乳腺上皮細胞、（ｂ）生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団、ならびに／または（ｃ）不死化乳腺上皮細胞からなる連続単層は、頂端面と基底面を有しており（例えば、細胞が、分極化されコンフルエントな細胞単層を形成する）、生細胞構築物は、（ａ）生きた初代乳腺上皮細胞、（ｂ）生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団、ならびに／または（ｃ）不死化乳腺上皮細胞からなる連続単層の頂端面より上にあり隣接している頂端区画、ならびに足場の底面より下にあり隣接する基底区画を含む、生細胞構築物が開示される。

本明細書中のある実施形態では、培養下で乳を産生する方法であって、本発明の生細胞構築物を培養することで、培養下で乳を産生する工程を含む方法が、開示される。

本明細書中のある実施形態では、培養下で乳を産生するための生細胞構築物を作製する方法であって、（ａ）初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を、乳腺組織（例えば、乳房組織、乳腺（ｕｄｄｅｒ）組織、乳頭組織）、生検試料、または生の母乳に由来する乳腺外植片から単離して、単離した乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞を産生する工程と、（ｂ）単離した初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞を培養して、初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団を産生する工程と、（ｃ）（ｂ）の混合集団を、上面および下面を有する足場上で栽培して（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）、混合集団の初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞の分極化され連続的（すなわちコンフルエント）な単層を足場の上面に産生することで、培養下で乳を産生するための生細胞構築物を産生する工程であって、分極化され連続的な単層は頂端面と基底面を含む、工程とを含む方法が、開示される。

本明細書中のある実施形態では、培養下で乳を産生するための生細胞構築物を作製する方法であって、（ａ）初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を、乳腺組織（例えば、乳房組織、乳腺組織、乳頭組織）、生検試料、または生の母乳に由来する乳腺外植片から単離して、単離した乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を産生する工程と、（ｂ）単離した初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を培養して、初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団を産生する工程と、（ｃ）初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞が混合された集団を選別して、初代乳腺上皮細胞の集団を産生する工程と、（ｄ）初代乳腺上皮細胞の集団を、上面および下面を有する足場上で栽培して、初代乳腺上皮細胞の分極化され連続的（すなわちコンフルエント）な単層を足場の上面に産生することで、培養下で乳を産生するための生細胞構築物を産生する工程であって、分極化され連続的な単層は頂端面と基底面を含む、工程とを含む方法が、開示される。

本明細書中のある実施形態では、培養下で乳を産生するための生細胞構築物を作製する方法であって、（ａ）不死化乳腺上皮細胞を培養して、不死化乳腺上皮細胞の数を増加させる工程と、（ｂ）（ａ）の不死化乳腺上皮細胞を、上面および下面を有する足場上で栽培して、不死化乳腺上皮細胞の分極化され連続的（すなわちコンフルエント）な単層を足場の上面に産生することで、培養下で乳を産生するための生細胞構築物を産生する工程であって、分極化され連続的な単層は頂端面と基底面を含む、工程とを含む方法が、開示される。

本明細書中のある実施形態では、培養下で乳を産生する方法であって、（ａ）上面および下面を含むとともに、生きた乳腺上皮細胞の連続的（すなわちコンフルエント）な分極化単層、生きた乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団の連続的な分極化単層、ならびに／または頂端面と基底面を有する生きた不死化乳腺上皮細胞の連続的な分極化単層を含む足場であって、生きた乳腺上皮細胞の連続的な分極化単層、生きた乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団の連続的な分極化単層、ならびに／または生きた不死化乳腺上皮細胞の連続的な分極化単層は、足場の上面に位置する、足場と、（ｂ）基底区画および頂端区画であって、足場の下面は基底区画に隣接しており、生きた初代乳腺上皮細胞の単層、生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団の単層、ならびに／または生きた不死化乳腺上皮細胞の単層における頂端面は、頂端区画に隣接しており、生きた初代乳腺上皮細胞の単層、生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団の単層における生きた初代乳腺上皮細胞、または不死化乳腺上皮細胞の単層は、その頂端面を通って頂端区画へと乳を分泌する、基底区画および頂端区画とを含む生細胞構築物を培養することで、培養下で乳を産生する工程を含む方法が、開示される。

本明細書中のある実施形態では、修飾された初代乳腺上皮細胞または不死化乳腺上皮細胞を産生する方法であって、細胞に、（ａ）修飾された細胞内シグナル伝達ドメインを含むプロラクチン受容体をコードするポリヌクレオチドであって、任意選択でプロラクチン受容体は、中にあるエクソン１０の１５４位がエクソン１１の３’配列にスプライスされているトランケーションを含む、ポリヌクレオチド、（ｂ）リガンドに結合するキメラプロラクチン受容体をコードするポリヌクレオチドであって、プロラクチンが無い状態で乳の合成を活性化可能であるポリヌクレオチド、（ｃ）構造上または条件付きで活性なプロラクチン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、任意選択で、アミノ酸９～１８７の欠失を含む構造上活性なヒトプロラクチン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｄ）（ｉ）ＳＴＡＴ５チロシンキナーゼドメインに融合されるＪＡＫ２チロシンキナーゼドメインおよび／または（ｉｉ）ＪＡＫ２チロシンキナーゼドメインに融合されるプロラクチン受容体細胞内ドメインを含むプロラクチン受容体の修飾（組換え）エフェクタをコードするポリヌクレオチド、（ｅ）概日関連遺伝子ＰＥＲ２（周期的概日タンパク質ホモログ２）への機能突然変異の損失、ならびに／あるいは（ｆ）１または複数のグルコース輸送体遺伝子ＧＬＵＴ１および／またはＧＬＵＴ１２をコードするポリヌクレオチドを導入することで、修飾された初代乳腺上皮細胞または不死化乳腺上皮細胞における細胞の単層の基底面における栄養取込み速度を向上させる工程を含む、方法が開示される。

区画化培養装置中でコンフルエントな単層として成長させた乳腺上皮細胞から栄養用途の乳を回収する一例を示す図であり、上記装置中では、新鮮な培地または再利用培地が基底区画に設けられ、乳は頂端区画から回収される。ＴＥＥＲは経上皮電気抵抗である。 足場の基底面に固定された乳腺上皮細胞のコンフルエントな単層全体における分極化された栄養素吸収と乳分泌の一例を示す図である。 区画化された栄養素吸収と乳分泌のための表面積を、乳腺上皮細胞のコンフルエントな単層により増大させる、マイクロパターニングされた足場の一例を示す図である。 毛細管束として表す中空繊維バイオリアクタ（上部）に関する３つの例を示す図であり、このバイオリアクタは、毛細管の外表面（上部と左下部）または内表面（右下部）のいずれかに並ぶ乳腺上皮細胞を支持することで、指向的で区画化された栄養素吸収と乳分泌を提供することができる。 三次元生細胞構築物の断面を例示する図である。生細胞構築物は、内腔／基底室を画定する内面と外面とを有する足場で構成される。内腔／基底室は、細胞培養培地を含む。マトリクス材料は、足場の外面の上部に静置されている。足場の内面から外面には孔が通っており、この孔により、細胞培地は、マトリクス材料上に配置された細胞単層における細胞の基底面と接触可能となる。 培養乳製品を産生するためのバイオリアクタを例示する図である。バイオリアクタは、生細胞構築物と頂端室で構成されている。生細胞構築物は、内腔／基底室を画定する内面と外面とを有する足場で構成される。内腔は細胞培養培地を含む。マトリクス材料は、足場の外面の上部に静置されている。足場の内面から外面には孔が通っており、この孔により、細胞培地は、マトリクス材料上に配置された細胞単層における細胞の基底面と接触可能となる。細胞単層における細胞の頂端面は、乳／培養乳製品を頂端室へと分泌する。頂端室および内腔／基底室は、細胞単層により隔てられる。 生細胞構築物を例示する図である。生細胞構築物は、内腔／基底室を画定する内面と外面とを有する足場で構成される。内腔／基底室は、細胞培養培地を含む。マトリクス材料は、足場の外面の上部に静置されている。足場の内面から外面には孔が通っており、この孔により、細胞培地は、マトリクス材料上に配置された細胞単層における細胞の基底面と接触可能となる。

乳は、哺乳動物の乳腺で産生される栄養豊富な液状食物である。乳は、乳児期の哺乳動物（母乳で育てられるヒトを含む）が他の種類の食物を消化可能となるまでの主要な栄養源である。ヒトの乳は、単なる栄養素ではない。むしろヒトの乳には、乳児の生存と健康に重大な役割を持つ生体作用型性質を伴う様々な因子が含まれる。天然の乳には、タンパク質、脂質、多糖、乳糖を含む他の多くの主要栄養素が含まれている。乳の消費は、全体的に異なる２つのタイプ、すなわち乳児期の哺乳動物すべての天然栄養源と食物製品において生じる。

ほぼすべての哺乳動物では、乳は、授乳により直接、または、貯蔵して後に消費させることになる乳を出すことにより乳児に与えられる。哺乳動物由来の初期の乳には、新生児を保護する抗体のほか、栄養素と成長因子が含まれている。母乳は、均一、不変、一定である工場製産物ではなく、遺伝子型、表現型、および食事（ｄｉｅｔｓ）が著しく異なる女性により産生される生物学的産物である。この複雑さに加え、母乳の組成は、母体、乳児、および環境といった無数の因子による影響を受ける。ヒトの乳には、タンパク質、炭水化物、脂質、脂肪酸、ミネラル、およびビタミンが豊富であるが、その疾患に対抗する潜在性の大半は、過量の抗体、白血球、ホルモン、抗菌ペプチド、サイトカイン、ケモカイン、および他の生物活性因子から生じる。

培養下の乳腺上皮細胞（ＭＥＣ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで観察されたものと同様の組織化と挙動を呈することが既に実証されている（Ａｒｅｖａｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３１０（５） ：Ｃ３４８－３ ５６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８２（ｌ）：ｅ６５）。Ａｒｅｖａｌｏらにおいては、ＭＥＣ集団の特定のバイオマーカーが、付着２－Ｄプレート、超低付着面３Ｄマイクロプレート、およびＭａｔｒｉｇｅｌで覆われた３Ｄプレート上で培養した不死化ウシ乳腺上皮細胞（ＢＭＥ－ＵＶ１）と不死化ウシ乳腺肺胞細胞（ＭＡＣ－Ｔ）に検出された。加えて、Ｃｈｅｎらには、ゼラチンスポンジおよびマトリゲルマトリクス上で３Ｄオルガノイド培養液を用いて、ヒト乳房組織および次世代マンモスフェアからヒト初代乳房上皮幹／前駆細胞を単離して培養するためのプロトコルが、詳述されている。しかし、ＡｒｅｖａｌｏもＣｈｅｎも、これらＭＥＣ培養液からの乳産生を刺激しようとはしなかった。

具体的には、培養ウシ乳腺上皮細胞は、適切な細胞外マトリクス上で成長させてプロラクチンで刺激すると、特定の乳成分を分泌可能な構造へと分極化されて、組織化される（Ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ＆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ １０：１４１－１４５）。Ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄらにおいては、ウシＭＥＣが分極化され、マンモスフェアが形成された。培養液からカゼインとブチロフィリンが単離された。しかし細胞は、一方向へと均一に分極化しなかった。Ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄらでは、乳タンパク質は細胞間に分布され、マンモスフェア全体に分散したことが注記されている。均一な分極配向が欠如していたことから、Ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄは、分泌タンパク質を培養培地から単離する必要があった。

さらに、Ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄらに使用されたものなど、ｉｎ ｖｉｔｒｏの二次元モデルでは、表面積と体積の比は低かった（低密度フォーマット）。細胞付着に利用可能な表面積により、成長可能な細胞の数が制限されてしまう。

中空繊維バイオリアクタなど、高密度フォーマットでマウス乳腺上皮細胞を培養しようとした唯一把握されている試みでは、培養乳製品の産生と抽出に必要な区画化を達成できなかった（Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４０：６７２－６８０）。Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎらにおいて、ＣＯＭＭＡ－ＩＤ（不死化マウス乳腺上皮細胞株）の成長、長期的な機能分化発現、および代謝が、２つの異なる系、すなわち拡張バッチ培養と中空繊維リアクタ培養を対象に調べられた。Ｃｏｓｔａｒ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）ポリカーボネート膜細胞培養インサート上に蒔いたＣＯＭＭＡ－１Ｄを使用して、Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎらは、頂端側と基底側との間に障壁を形成して代謝を分極化させることが可能であるコンフルエントな単層を作り出し、これによりグルコースとラクテートの勾配を維持した。しかし、中空繊維バイオリアクタ培養を用いても、Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎらは、基底区画と頂端区画の分離を達成できなかった。さらに、栄養取込みが中空繊維培養下で分極化されたかどうかは判定されなかった（Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９２）。重要なことに、これまでの研究では、高密度で三次元の、区画化を施した形で、ヒトまたは他の栄養関連種から乳腺上皮細胞を培養することはできなかった。

本明細書中のある実施形態では、生細胞構築物、生細胞構築物を作製する方法、ならびに培養した乳腺細胞から培養乳製品をｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで産生するために生細胞構築物を使用する方法が開示される。

本明細書は、本発明が実施され得る異なるすべての方法、または本発明に追加してもよい特徴すべてに関する詳細なカタログとなることを意図したものではない。例えば、一実施形態について例示される特徴は他の実施形態に組み込まれてよく、特定の実施形態について例示される特徴は、その実施形態から削除されてもよい。加えて、本明細書に示唆される様々な実施形態に対する多数の変形と追加は、本発明から逸脱しない本開示に照らして当業者に明白となるであろう。したがって、以下の詳述は、本発明の一部の特定の実施形態を例示することを意図したものであり、それらのすべての順列、組合せ、および変形を網羅的に特定するものではない。

文脈に特に明示されていない限り、本明細書に記載の様々な特徴をあらゆる組合せで使用可能であることが、具体的に意図される。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のあらゆる特徴またはその組合せは、除外することも省略することもできる。本明細書中で複合体が成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むことが述べられているかどうかを例示するために、Ａ、Ｂ、またはＣのいずれか、あるいはそれらの組合せは、単独で、またはあらゆる組合せで省略することも破棄することもできることが、具体的に意図される。

定義
本発明の明細書および添付の特許請求の範囲に使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な定めのない限り、複数形も含むことが意図される。

本明細書で使用するとき、「および／または」は、列記された関連項目のうち１または複数に起こり得るあらゆる組合せのほか、代替的に（「または」）で解釈されたときの組合せの欠如を表すとともに、それらを包含するものである。

さらに、本明細書に記載のあらゆる特徴またはその組合せは、除外することも省略することもできる。

本明細書で使用される「約」という用語は、化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能値を表すとき、特定された量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または±０．１％の変動を含むことが意図される。

別段の定めのない限り、本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の記述に使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することを目的としたものであり、実施形態の限定を意図したものではない。

ヌクレオチド配列は、特に別段の指示がない限り、本明細書中では左から右へと５’～３’方向で一本鎖のみにより提示される。ヌクレオチドとアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－１ＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する様式、または３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２と確立された使用法の両方に従い（アミノ酸に関する）一文字コードまたは三文字コードのいずれかにより、本明細書中で表される。

別段の指示がある場合を除き、当業者に知られる標準方法は、組換えおよび合成のポリペプチド、抗体、またはその抗原結合フラグメントの産生、核酸配列の操作、形質転換細胞の産生、ウイルスベクター構築物の構築、および一過的かつ安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞に使用されてよい。かかる技法は、当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

本明細書で使用するとき、移行句「～から本質的になる」は、列記した材料または工程、ならびに特許請求された発明の基本的かつ新規な特性に物質的に影響を及ぼさないものを包含するものと解釈されたい。このため、「～から本質的になる」という用語は、本明細書で使用するとき、「～を含む」と等価であると解釈してはならない。

本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」という用語は、別段の指示がない限り、ペプチドとタンパク質の両方を包含するが、いかなる特定のアミノ酸長または三次構造も必要とするものではない。

「分極化された」という用語は、細胞および／またはその単層に関して本明細書で使用するとき、異なり得る細胞の２つの別個の表面、例えば頂端面と基底面が存在する細胞の空間的状態を表す。いくつかの実施形態では、分極化細胞の別個の表面は、異なる表面および／または膜貫通受容体および／または他の構造を含む。いくつかの実施形態では、連続単層中の個々の分極化細胞は、同様に配向された頂端面と基底面を有する。いくつかの実施形態では、連続単層中の個々の分極化細胞は、個々の細胞間での交差伝達を可能にするとともに頂端区画と基底区画の分離（例えば、区画化）を生じさせる、個々の細胞間の伝達構造（例えば、密着結合）を有する。

本明細書で使用するとき、「頂端面」は、外部環境に面しているか、腔もしくは室、例えば、内部器官の腔に向かう細胞の表面を意味する。乳腺上皮細胞に関して、培養乳製品が分泌される表面は、頂端面である。

本明細書で使用するとき、「基底面」は、表面、例えばバイオリアクタのマトリクスと接触状態にある細胞の表面を意味する。

本明細書で使用するとき、「バイオリアクタ」は、本明細書に記載の乳腺細胞から本明細書に記載の培養乳製品の産生を可能にする生物学的に活性な環境を支持するデバイスまたはシステムを意味する。

本明細書で使用するとき、「乳原性」という用語は、乳の産生および／または分泌の刺激能を表す。遺伝子またはタンパク質（例えば、プロラクチン）は、あらゆる他の天然および／または合成産物がそうであるように、乳原性の場合がある。いくつかの実施形態では、乳原性培養培地は、プロラクチンを含むことで、培養培地に接触する細胞による乳の産生を刺激する。

本明細書で使用するとき、「食品グレード」は、例えば米国食品医薬品局が定めた標準により規制されるように、消費（例えば、ヒトおよび／または他の動物による消費）において毒性がなく安全であると認められる材料を表す。

いくつかの実施形態では、初代乳腺上皮細胞（例えば、単離された生きた初代乳腺上皮細胞由来の初代乳腺上皮細胞、ならびに／あるいは生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞が混合された集団由来の初代乳腺上皮細胞）または不死化乳腺上皮細胞により産生される乳は、細胞の頂端面を通り頂端区画へと分泌される。いくつかの実施形態では、基底区画は培養培地を含み、培養培地は、生きた初代乳腺上皮細胞、生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団、ならびに／または不死化乳腺上皮細胞における基底面と接触状態にある。

生細胞構築物
本明細書中のある実施形態では、培養下で乳を産生するための生細胞構築物であって、（ａ）生きた初代乳腺上皮細胞、（ｂ）生きた乳腺筋上皮細胞、（ｃ）生きた乳腺前駆細胞、および／または（ｄ）生きた不死化乳腺上皮細胞からなる群から選択される生きた乳腺細胞の連続単層を含む生細胞構築物が、開示される。

いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、乳を産生する乳腺上皮細胞、収縮性筋上皮細胞、および／または、乳腺上皮細胞と収縮性乳腺筋上皮細胞の両方を生じさせることが可能な前駆細胞を含む。乳腺上皮細胞が、乳を産生する唯一の細胞である。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、乳腺上皮細胞、初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞を含む。

いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、哺乳動物の乳房組織、乳腺組織、および／または乳頭組織に由来する。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、あらゆる哺乳動物、例えば霊長類（例えば、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、サル（例えば、旧世界サル、新世界サル）、キツネザル、ヒト）、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、オックス（例えば、Ｂｏｓ ｓｐｐ．）、ブタ、シカ、ジャコウジカ、ジャコウウシ（ｂｏｖｉｄ）、クジラ、イルカ、カバ、ゾウ、サイ、キリン、シマウマ、ライオン、チーター、トラ、パンダ、レッサーパンダ、カワウソに由来する。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、絶滅危惧種、例えば絶滅危機にある哺乳動物に由来する。いくつかの実施形態では、乳腺細胞はヒト由来である。いくつかの実施形態では、乳腺細胞はウシ（例えば乳牛（ｃｏｗ））由来である。

いくつかの実施形態では、生きた乳腺細胞の連続単層は、乳腺の組織生検から生じる母乳由来幹細胞または乳房幹細胞から派生したものである。母乳の上皮成分には、成熟上皮細胞だけでなく、培養下にあるその前駆細胞および幹細胞も含まれる。母乳由来幹細胞の亜集団は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）において典型的なものに類似する、非常に高度な多系列の潜在性を呈する。乳房幹細胞は、乳腺の組織生検から生じ、最終的に分化されたＭＥＣを含む場合もある。母乳由来幹細胞と、乳腺の組織生検から生じる乳房幹細胞は、ともにＭＥＣまたは筋上皮細胞を生じさせることが可能な多能性細胞である。

いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低５０％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低５５％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低６０％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低６５％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低７０％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低７５％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低８０％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低８５％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低９０％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低９５％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞培養物の乳腺細胞の最低１００％が、分極化される。いくつかの実施形態では、生細胞構築物の乳腺細胞のほぼすべてが、分極化される（すなわち、頂端面および基底面を有する）。いくつかの実施形態では、生細胞構築物の乳腺細胞のほぼすべてが分極化され、分極化細胞のほぼすべてが同じ方向に配向される。例えば、いくつかの実施形態では、乳腺細胞のほぼすべてが頂端面と基底面を有しており、乳腺細胞のほぼすべてにおける頂端面は同じ方向に配向され、乳腺細胞のほぼすべてにおける基底面は同じ方向に配向される。

いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞の単層は、足場にわたり最低７０％のコンフルエンスを有する。いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞の単層は、足場にわたり最低約７５％のコンフルエンスを有する。いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞の単層は、足場にわたり最低約８０％のコンフルエンスを有する。いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞の単層は、足場にわたり最低約８５％のコンフルエンスを有する。いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞の単層は、足場にわたり最低約９０％のコンフルエンスを有する。いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞の単層は、足場にわたり最低約９５％のコンフルエンスを有する。いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞の単層は、足場にわたり最低約９９％のコンフルエンスを有する。いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞の単層は、足場にわたり１００％のコンフルエンスを有する。

乳腺細胞に対する遺伝子修飾
いくつかの実施形態では、分極化乳腺細胞は、構成上活性なプロラクチン受容体タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、構成上活性なヒトプロラクチン受容体タンパク質を含む。初代乳腺上皮細胞または不死化乳腺上皮細胞が構成上活性なプロラクチン受容体を含む場合、培養培地にプロラクチンは含まれない。

いくつかの実施形態では、構造上活性なヒトプロラクチン受容体タンパク質は、アミノ酸９～１８７の欠失を含み、この番号付けは、配列番号１として特定したヒトプロラクチン受容体の参照アミノ酸配列に基づく。

配列番号１：ヒトプロラクチン受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ３２０３２．１）

いくつかの実施形態では、構造上活性なヒトプロラクチン受容体タンパク質は、次のアミノ酸：ＶＦＴＬＬＬＦＬＮＴＣＬＬＮＧＱＬＰＰＧＫＰＥＩＦＫＣＲＳＰＮＫＥＴＦＴＣＷＷＲＰＧＴＤＧＧＬＰＴＮＹＳＬＴＹＨＲＥＧＥＴＬＭＨＥＣＰＤＹＩＴＧＧＰＮＳＣＨＦＧＫＱＹＴＳＭＷＲＴＹＩＭＭＶＮＡＴＮＱＭＧＳＳＦＳＤＥＬＹＶＤＶＴＹＩＶＱＰＤＰＰＬＥＬＡＶＥＶＫＱＰＥＤＲＫＰＹＬＷＩＫＷＳＰＰＴＬＩＤＬＫＴＧＷＦＴＬＬＹＥＩＲＬＫＰＥＫＡＡ（例えば、配列番号１のアミノ酸９位～１８７位）の欠失を含む。

いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、概日関連遺伝子ＰＥＲ２に導入された機能突然変異の損失を含む。いくつかの実施形態では、概日関連遺伝子ＰＥＲ２に導入された機能突然変異の損失は、培養乳成分の合成の増加を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＥＲ２遺伝子中の機能突然変異の損失は、ＰＥＲ２中の３４８位～４３４位の８７－アミノ酸欠失を含み、この番号付けは、配列番号２として特定したヒトＰＥＲ２の参照アミノ酸配列に基づく。

配列番号２：ヒト周期的概日タンパク質ホモログ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ０２２８１７）

いくつかの実施形態では、ＰＥＲ２に導入された機能突然変異の損失は、次のアミノ酸：ＣＬＦＱＤＶＤＥＲＡＶＰＬＬＧＹＬＰＱＤＬＩＥＴＰＶＬＶＱＬＨＰＳＤＲＰＬＭＬＡＩＨＫＫＩＬＱＳＧＧＱＰＦＤＹＳＰＩＲＦＲＡＲＮＧＥＹＩＴＬＤＴＳＷＳＳＦＩＮＰＷＳＲＫＩＳＦＩＩＧＲＨＫＶ（例えば、配列番号２のアミノ酸３４８位～４３４位）の欠失を含む。

いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、修飾細胞内シグナル伝達ドメインを含むプロラクチン受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、概日関連遺伝子ＰＥＲ２に導入された機能突然変異の損失は、個々の培養乳成分の合成の増加を促進する。いくつかの実施形態では、プロラクチン受容体は、エクソン１０の１５４位がエクソン１１の３’配列にスプライスされているトランケーションを含む。いくつかの実施形態では、プロラクチン受容体は、配列番号３に記載の配列を含む。

配列番号３：プロラクチン受容体のヒトアイソフォーム４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ４１６６１９；Ｔｒｏｔｔ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ３Ｑ（ｌ）：３１－４７）

いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、プロラクチンタンパク質の修飾（例えば、組換え）エフェクタをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プロラクチンタンパク質の修飾エフェクタは、ヤヌスキナーゼ－２（ＪＡＫ２）チロシンキナーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、修飾エフェクタは、シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）チロシンキナーゼドメインに融合されたＪＡＫ２チロシンキナーゼドメイン（例えば、ＳＴＡＴ５チロシンキナーゼドメインをコードするポリヌクレオチドの３’末端に連結されたＪＡＫ２チロシンキナーゼドメインをコードするポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、プロラクチンタンパク質の修飾エフェクタは、個々の培養乳成分の合成の増加を促進する。いくつかの実施形態では、修飾エフェクタは、配列番号４に記載の配列を有する。太字のアミノ酸は、参照ヒトＪＡＫ２アミノ酸配列のアミノ酸７５７位～１１２９位のＪＡＫ２キナーゼドメインに相当する。

配列番号４：ＪＡＫ２ヒトチロシン―タンパク質キナーゼのアミノ酸７５７位～１１２９位に３’末端にて融合されたＳＴＡ５Ａヒトシグナル伝達兼転写活性化因子５Ａ

いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、不死化される。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）をコードする１または複数の核酸を含む。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ｐ１６（サイクリン依存性キナーゼ４の阻害剤）（ｐ１６（ＩＮＫ４））に対する小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および細胞周期エントリと増殖性代謝のマスターレギュレータ（ｃ－ＭＹＣ）を含む。

いくつかの実施形態では、上記方法は、細胞に、（ａ）修飾された細胞内シグナル伝達ドメインを含むプロラクチン受容体をコードするポリヌクレオチドであって、任意選択でプロラクチン受容体は、中にあるエクソン１０の１５４位がエクソン１１の３’配列にスプライスされているトランケーションを含む、ポリヌクレオチド、（ｂ）リガンドに結合するキメラプロラクチン受容体をコードするポリヌクレオチドであって、プロラクチンが無い状態で乳の合成を活性化可能であるポリヌクレオチド、（ｃ）構造上または条件付きで活性なプロラクチン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、任意選択で、アミノ酸９～１８７の欠失（例えば、アミノ酸９～１８７の欠失であり、番号付けは、配列番号１として特定したヒトプロラクチンタンパク質の参照アミノ酸配列に基づく）を含む構造上活性なヒトプロラクチン受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｄ）（ｉ）任意選択でシグナル伝達兼転写活性化因子－５（ＳＴＡＴ５）チロシンキナーゼドメインに融合されるヤヌスキナーゼ－２（ＪＡＫ２）チロシンキナーゼドメイン（ＳＴＡＴ５チロシンキナーゼドメインをコードするポリヌクレオチドの３’末端に連結されるＪＡＫ２チロシンキナーゼドメインをコードするポリヌクレオチド）および／または（ｉｉ）ＪＡＫ２チロシンキナーゼドメインに融合されるプロラクチン受容体細胞内ドメインを含むプロラクチンタンパク質の修飾（組換え）エフェクタをコードするポリヌクレオチド、（ｅ）概日関連遺伝子ＰＥＲ２（周期的概日タンパク質ホモログ２）への機能突然変異の損失、ならびに／あるいは（ｆ）１または複数のグルコース輸送体遺伝子ＧＬＵＴ１および／またはＧＬＵＴ１２をコードするポリヌクレオチドを導入することで、単層の基底面における栄養取込み速度を向上させる工程を含む。

足場
いくつかの実施形態では、生細胞構築物は、頂面／外面および底面／内面を有する足場をさらに含む。いくつかの実施形態では、足場は、二次元表面または三次元表面（例えば、マイクロパターニングされた三次元表面、および／または束へとアセンブルされる円筒状構造）である。二次元表面足場の非限定的な例は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）フィルタである。いくつかの実施形態では、足場は、三次元表面である。マイクロパターニングされた三次元表面の非限定的な例として、微細構造バイオリアクタ、脱細胞組織（例えば、脱細胞乳腺組織、または脱細胞植物組織）、生物材料もしくは生体適合性材料によるキャスティングまたは三次元印刷により作り出されるマイクロパターニングされた足場、テクスチャ表面が挙げられる。いくつかの実施形態では、足場は、セルロースナノファイバ、および／または束へとアセンブル可能な円筒状構造（例えば、中空繊維バイオリアクタ）にエレクトロスピニングを行うことにより産生される。いくつかの実施形態では、足場は多孔質である。いくつかの実施形態では、足場は３Ｄ足場である。いくつかの実施形態では、三次元足場は、密閉された中空内腔／中心腔を有するあらゆる構造である。いくつかの実施形態では、三次元足場は、１または複数の表面と結合して、密閉された内部室／基底区画を形成する。例えば、足場は、バイオリアクタの１または複数の壁と結合して、内部室／基底区画を形成することができる。いくつかの実施形態では、足場は、中空繊維バイオリアクタである。いくつかの実施形態では、３Ｄ足場は、中心腔が足場の内面により画定される管である。いくつかの実施形態では、３Ｄ足場は、中心腔が足場の内面により画定される中空の球である。

腸吸収の試験におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養法では、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ（登録商標）などの二次元表面足場は、腸血液関門を刺激するための頂端空間と側底空間の両方を設けるとともに、薬物と栄養素の能動的かつ受動的な輸送を可能にすることから、長きにわたり標準として使用されている。しかし、平坦な支持体に蒔いた細胞は、部分的に３－Ｄ細胞外微小環境の表現が乏しいことに起因して、細胞に対し著しく異なる表現型をｉｎ ｖｉｖｏで提示する。

三次元足場により、乳腺細胞（例えば、ＭＥＣ）は、すべての三次元で成長し、その周囲と相互作用することが可能となる。２Ｄ環境とは異なり、３Ｄ細胞培養では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞は、あらゆる方向に成長し、ｉｎ ｖｉｖｏの乳腺環境に近似することが可能になる。さらに、３Ｄ足場により、より大きな表面積で細胞の培養、代謝、およびガス交換が可能となるのに加えて、必要な区画化が可能となり、すなわち、培養乳製品が一方の区画へと分泌されると同時に、細胞培養培地が別の区画にて乳腺細胞と接触することが可能になる。現時点で、３Ｄ表面上で乳腺上皮細胞を用いた基底細胞表面および頂端細胞表面の分極化分離を伴うコンフルエントな単層は、達成されていない（Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９２）。

いくつかの実施形態では、足場は多孔質である。いくつかの実施形態では、足場は細胞培地に対して透過性であり、このため細胞培地は細胞単層の細胞と接触することが可能になる。いくつかの実施形態では、足場には、細胞培地が細胞単層の細胞の基底表面に接触するのを可能にする、少なくとも１個の孔が通される。

いくつかの実施形態では、足場の頂面／外面は、マトリクス材料で覆われている。いくつかの実施形態では、マトリクスは、１または複数の細胞外マトリクスタンパク質で構成される。細胞外マトリクスタンパク質の非限定的な例として、コラーゲン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、および／またはフィブロネクチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、足場は、天然ポリマー、生体適合性合成ポリマー、合成ペプチド、および／またはそれらのあらゆる組合せに由来する複合体を含む。いくつかの実施形態では、本発明に有用な天然ポリマーとして、コラーゲン、キトサン、セルロース、アガロース、アルギネート、ゼラチン、エラスチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、および／またはヒアルロン酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、本発明に有用な生体適合性合成ポリマーとして、セルロース、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン共酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、および／またはポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、足場の頂部は、ラミニンおよびコラーゲンで覆われている。

いくつかの実施形態では、マトリクス材料は多孔質である。いくつかの実施形態では、マトリクス材料は細胞培地に対して透過性であり、これにより細胞培地は細胞単層の細胞と接触可能になる。いくつかの実施形態では、マトリクス材料には、細胞培地が細胞単層における細胞の基底表面に接触するのを可能にする少なくとも１個の孔が通されている。

いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約０．１μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約０．２μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約０．３μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約０．４μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約０．５μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約０．６μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約０．７μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約０．８μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約０．９μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．０μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．１μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．２μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．３μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．４μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．５μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．６μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．７μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．８μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約１．９μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．０μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．１μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．３μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．４μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．６μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．７μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．８μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約２．９μｍである。いくつかの実施形態では、足場および／またはマトリクス材料の孔径は、最低約３．０μｍである。

いくつかの実施形態では、生細胞構築物は、頂面／外面および底面／内面を有する足場と、足場の頂面にある（ａ）生きた初代乳腺上皮細胞、（ｂ）生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団、ならびに／または（ｃ）生きた不死化乳腺上皮細胞からなる連続単層とを含み、（ａ）生きた初代乳腺上皮細胞、（ｂ）生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団、ならびに／または（ｃ）生きた不死化乳腺上皮細胞からなる連続単層は、頂端面と基底面（例えば、細胞が、分極化されコンフルエントな細胞単層を形成する）を有しており、生細胞構築物は、（ａ）生きた初代乳腺上皮細胞、（ｂ）生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団、ならびに／または（ｃ）生きた不死化乳腺上皮細胞からなる連続単層の頂端面より上にあり隣接している頂端区画、ならびに足場の底面より下にあり隣接する基底区画を含む。

バイオリアクタ
本明細書中のある実施形態では、バイオリアクタであって、（ａ）培養乳製品を含む頂端区画と、（ｂ）（ｉ）外面、内腔／基底室を画定する内面、および内面から外面まで延在する複数の孔を有する三次元足場、（ｉｉ）三次元足場の外面に配置されるマトリクス材料、（ｉｉｉ）内腔／基底室内に配置されるとともに内部表面と流体接触状態にある培養培地、ならびに（ｉｖ）マトリクス材料に配置された分極化乳腺細胞の最低７０％コンフルエントな単層であって、乳腺細胞が、生きた初代乳腺上皮細胞、生きた乳腺筋上皮細胞、生きた乳腺前駆細胞、生きた不死化乳腺上皮細胞、生きた不死化乳腺筋上皮細胞、および生きた不死化乳腺前駆細胞からなる群から選択される、単層を含む少なくとも１個の生細胞構築物とを含み、乳腺細胞の頂端面が頂端区画と流体接触状態にある、バイオリアクタが、開示される。

いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、密閉型バイオリアクタである。いくつかの実施形態では、頂端室は、内腔／基底室から実質的に単離される。

中空繊維バイオリアクタは、本明細書に開示される方法に使用するための例示的なバイオリアクタである。中空繊維バイオリアクタは、細胞がｉｎ ｖｉｖｏで成長する環境にかなり近似する高密度の連続灌流培養システムである。このシステムは、入口ポートおよび出口ポートに適合するカートリッジシェル内で平行配列にある数千の半透過性３Ｄ足場（すなわち、中空繊維）からなる。これらの繊維束は、各端部にて詰められる（ｐｏｔｔｅｄ）か密封され、そうすることで、カートリッジの端部に入る液体はすべて、必然的に繊維の内部を流れることとなる。細胞は、概して余剰毛細管空間（ＥＣＳ）中のカートリッジ内で繊維の外に播種される。

中空繊維細胞培養物は、次の３つの根本的な特徴により他の方法でも分化される。（１）細胞は、プラスチック皿、マイクロキャリア、または他の不透過性支持体ではなく、ｉｎ ｖｉｖｏで多孔質マトリクスに結合される、（２）支持体マトリクスから切り離された分子量を制御することができる、および（３）非常に高い表面積対体積比（１ｍＬにつき１５０ｃｍ^２以上）により宿主細胞の有効な成長における代謝物質およびガス交換のための大きな区域が提供される。

バイオリアクタ構造は、栄養素、ガス、および他の基本的な培地成分のほか、細胞廃棄物の透過を可能にするが細胞は透過しない繊維マトリクスを提供し、そこで細胞は増幅可能となる。中空繊維バイオリアクタ技術は、中空繊維を利用して細胞成長室と培地流との間に半透過性の障壁を作製することにより高密度の細胞増幅を得るのに使用されている。この設計により得られる表面積は広いため、この繊維を培養基質として使用することで多数の細胞の産生が可能となる。バイオリアクタ内の三次元環境で成長する細胞は、中空繊維を通って灌流させた新鮮な培地に浸される。

腸のトポグラフィを再現するために、Ｃｏｓｔｅｌｌｏらは、マイクロモールディングを介して両方の多孔質絨毛足場を包含可能な３－Ｄプリントバイオリアクタを開発した（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７（１２５１５）：１－１０）。この幾何学的で複雑に成形された足場により、流体流によって生理学的に関連する剪断応力に腸上皮細胞がさらされるように、先端空間と側底空間が分離された（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１７）。同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養下、腸様環境を模倣した環境での長期培養は、Ｍｏｒａｄａらにより中空繊維バイオリアクタを用いて行われ、このバイオリアクタにより、２つの制御された別々の環境（二相性）が基底層から酸素と栄養素を宿主細胞に提供することが可能となり、同時に低酸素で栄養素が豊富な環境を頂端面に発達させることが可能となった（Ｍｏｒａｄａ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ２６：２１－２９）。

中空繊維バイオリアクタを構成するに際して、細胞の拡張に関連する目標に応じて変動し得る設計面での考慮事項とパラメータが存在する。かかる設計面での考慮事項の１つは、繊維壁の孔径である。孔径は、全体として栄養素を細胞に渡すことを可能にし、廃棄物を運び去り、細胞に所望の生成物（成長因子など）を提供し、細胞から所望の生成物を除去し、かつ細胞に到達するのを妨げ（ｐｒｅｓｅｎｔ）得る特定の因子を排除するよう設計される。したがって、繊維壁の孔径は、どの構成要素が繊維壁を通過するかを修正するように変動可能である。例えば、孔径は、上皮成長因子や血小板由来成長因子を含むがこれらに限定されない成長因子を含む、大きなタンパク質性分子の通過を可能とすることができる。当業者は、繊維壁を通過して細胞に到達するか細胞から材料を運ぶことが望ましい成分に応じて、孔径をどのように変化させるかを理解するであろう。

いくつかの実施形態では、孔径は、約０．２μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約０．１μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約０．２μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約０．３μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約０．４μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約０．５μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約０．６μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約０．７μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約０．８μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約０．９μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．０μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．１μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．２μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．３μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．４μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．５μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．６μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．７μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．８μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約１．９μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．０μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．１μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．２μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．３μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．４μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．５μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．６μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．７μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．８μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約２．９μｍである。いくつかの実施形態では、孔径は、約３．０μｍである。

生細胞構築物の作製方法
本明細書中のある実施形態では、培養乳製品を産生するための生細胞構築物を作製する方法が開示される。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を、乳腺組織（例えば、乳房組織、乳腺組織、乳頭組織）、生検試料、または生の母乳に由来する乳腺外植片から単離して、単離した乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を産生する工程と、（ｂ）単離した初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を培養して、初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団を産生する工程と、（ｃ）（ｂ）の混合集団を、上面および下面を有する足場上で栽培して、混合集団の初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞の分極化された単層を足場の上面に産生することで、培養乳製品を産生するための生細胞構築物を産生する工程であって、分極化された単層は頂端面と基底面を含む、工程とを含む。

いくつかの実施形態では、上記方法は、（ａ）初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を、乳腺組織（例えば、乳房組織、乳腺組織、乳頭組織）、生検試料、または生の母乳に由来する乳腺外植片から単離して、単離した乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を産生する工程と、（ｂ）単離した初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞を培養して、初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団を産生する工程と、（ｃ）初代乳腺上皮細胞、筋上皮細胞、および／または乳腺前駆細胞が混合された集団を選別して（例えば、初代乳腺上皮細胞を選択して）、初代乳腺上皮細胞の集団を産生する工程と、（ｄ）初代乳腺上皮細胞の集団を、上面および下面を有する足場上で栽培して、初代乳腺上皮細胞の分極化された単層を足場の上面に産生することで、培養液乳製品を産生するための生細胞構築物を産生する工程であって、分極化された単層は頂端面と基底面を含む、工程とを含む。

いくつかの実施形態では、上記方法は、（ａ）不死化乳腺上皮細胞を培養して、不死化乳腺上皮細胞の数を増加させる工程と、（ｂ）（ａ）の不死化乳腺上皮細胞を、上面および下面を有する足場上で栽培して、不死化乳腺上皮細胞の分極化された単層を足場の上面に産生することで、培養乳製品を産生するための生細胞構築物を産生する工程であって、分極化された単層は頂端面と基底面を含む、工程とを含む。

いくつかの実施形態では、生細胞構築物を得るために乳腺細胞を培養および／または栽培することは、約３５℃～約３９℃の温度（例えば、約３５℃、３５．５℃、３６℃、３６．５℃、３７℃、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、または約３９℃、あるいはその中のいずれかの値または範囲、例えば、約３５℃～約３８℃、約３６℃～約３９℃、約３６．５℃～約３９℃、約３６．５℃～約３７．５℃、または約３６．５℃～約３８℃の温度）で実施される。いくつかの実施形態では、培養および／または栽培することは、約３７℃の温度で実施される。

いくつかの実施形態では、生細胞構築物を得るために乳腺細胞を培養および／または栽培することは、約４％～約６％の大気中ＣＯ_２濃度で実施され、例えば、大気中ＣＯ_２濃度は、約４％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５％、５．２５％、５．５％、５．７５％、または６％、あるいはその中のいずれかの値または範囲、例えば、約４％～約５．５％、約４．５％～約６％、約４．５％～約５．５％、または約５％～約６％である。いくつかの実施形態では、培養および／または栽培することは、約５％の大気中ＣＯ_２濃度で実施される。

いくつかの実施形態では、生細胞構築物を得るために乳腺細胞を培養および／または栽培することは、ほぼ毎日～約１０日ごと（例えば、１日ごと、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、７日ごと、８日ごと、９日ごと、１０日ごと、またはその中のいずれかの値または範囲、例えば、ほぼ毎日～３日ごと、約３日ごと～１０日ごと、約２日ごと～５日ごと）に交換される培養培地を培養および／または栽培することを含む。いくつかの実施形態では、培養および／または栽培することは、ほぼ毎日～約数時間から約１０日毎、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間ごと～約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日ごと、あるいはその中のいずれかの値または範囲で交換される培養培地を培養することをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、培養および／または栽培することは、約１２時間ごと～約１０日ごと、約１０時間ごと～約５日ごと、または約５時間ごと～約３日ごとに交換される培養培地を培養および／または栽培することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、生細胞構築物は、冷凍庫または液体窒素中で貯蔵される。貯蔵温度は、所望の貯蔵期間に依存する。例えば、冷凍庫の温度（例えば、約０℃～約－８０℃以下の温度、例えば約０℃、－１０℃、－２０℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１００℃、あるいはその中のいずれかの値または範囲での貯蔵）は、細胞が６か月以内（例えば、１、２、３、４、５、または６か月以内）に使用されることになっている場合に使用され得る。例えば、液体窒素は、長期間の貯蔵（例えば、６か月以上、例えば６、７、８、９、１０、１１、または１２か月、あるいは１、２、３、４、５、６年以上の貯蔵）のために―１００℃以下（例えば、約－１００℃、－１１０℃、－１２０℃、－１３０、－１４０、－１５０、－１６０、－１７０、－１８０、－１９０℃、－２００℃以下）の温度で使用されてよい。

いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、蛍光活性化細胞選別、磁気活性化細胞選別、および／またはマイクロ流体細胞選別により単離かつ選別される。

基礎培養培地および乳原性培地
いくつかの実施形態では、培養培地は、炭素源、化学緩衝系、１または複数の必須アミノ酸、１または複数のビタミン、および／あるいは補助因子、ならびに１または複数の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、炭素源、化学緩衝系、１または複数の必須アミノ酸、１または複数のビタミン、および／あるいは補助因子、ならびに／あるいは１または複数の無機塩は、食品グレードのものである。

いくつかの実施形態では、培養培地は、乳原性培養培地である。いくつかの実施形態では、培養培地は、プロラクチン（例えば、哺乳動物プロラクチン、例えばヒトプロラクチン）、リノール酸、α－リノール酸、エストロゲン、および／またはプロゲステロンをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／Ｌ、例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎｇ／ｍＬ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量で、プロラクチンを含む（あるいはプロラクチンが添加される）。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約２０ｎｇ／ｍＬ～約１９５ｎｇ／Ｌ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１７５ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／Ｌ、または約７５ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／Ｌの量で、プロラクチンを含む（あるいはプロラクチンが添加される）。いくつかの実施形態では、培養培地は、効率を改善するために、インスリン、上皮成長因子、および／またはヒドロコルチゾンを含むがこれらに限定されない他の因子をさらに含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの量（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、または培養培地の約１、２、３、４、５、もしくは６ｇ／Ｌ～約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５ｇ／Ｌの量で、炭素源を含む。炭素源の非限定的な例としてグルコースおよび／またはピルベートが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌの培養培地、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量で、グルコースを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約６ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約１０．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約１１．５ｇ／Ｌ、または約２ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの量でグルコースを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約１、２、３、もしくは４ｇ／Ｌ～約５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ｇ／Ｌ、または約１、２、３、４、５、もしくは６ｇ／Ｌ～約７、８、９、１０、１１、もしくは１２ｇ／Ｌの量で、グルコースを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、例えば約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でピルベートを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約５ｇ／Ｌ～約１４．５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約７．５ｇ／Ｌ～約１０．５ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ～約１４．５ｇ／Ｌ、または約８ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの量でピルベートを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約５、６、７、もしくは８ｇ／Ｌ～約９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５ｇ／Ｌ、または約５、６、７、８、９、もしくは１０ｇ／Ｌ～約１１、１２、１３、１４、もしくは１５ｇ／Ｌの量でピルベートを含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ（例えば、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、または４ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、または約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）の量で化学緩衝系を含む。いくつかの実施形態では、化学緩衝系として、重炭酸ナトリウムおよび／または４－（２－ヒドロキシエチル）－ｌ－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ、例えば、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、または４ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量で重炭酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約３．７５ｇ／Ｌ、約１．２５ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約３ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ、または約２ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌの量で重炭酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約１１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１２．５ｍＭ～約２２．５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０．７５ｍＭ、または約１０ｍＭ～約２０ｍＭの量でＨＥＰＥＳを含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ（例えば、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、または約０．５、１、１．５、２ｍＭ～約２．５、３、３．５、４、４．５、もしくは５ｍＭの量で、１または複数の必須アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、１または複数の必須アミノ酸は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、および／またはアルギニンである。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、例えば、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量で、アルギニンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．５ｍＭ～約４．７５ｍＭ、約２ｍＭ～約３．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約３．５ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、または約３．５ｍＭ～約５ｍＭの量で必須アミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０１μＭ～約５０μＭ（約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、４９．０２５、４９．０５、４９．０７５、または５０μＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、あるいは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、３、４、５、６μＭ、または約０．０２、０．０２５、０．０５、０．０７５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０μＭ～約１２．５、１５、１７．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、４９．０２５、４９．０５、４９．０７５、もしくは５０μＭの量で、１もしくは複数のビタミンおよび／または補助因子を含む。いくつかの実施形態では、１もしくは複数のビタミンおよび／または補助因子として、チアミンおよび／またはリボフラビンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０２５μＭ～約５０μＭ、例えば、約０．０２５、０．０５、０．０７５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、４９．０２５、４９．０５、４９．０７５、または５０μＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でチアミンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０２５μＭ～約４５．０７５μＭ、約１μＭ～約４０μＭ、約５μＭ～約３５．０７５μＭ、約１０μＭ～約５０μＭ、または約０．０５μＭ～約４５．５μＭの量でチアミンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０１μＭ～約３μＭ、例えば、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３μＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でリボフラビンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０１μＭ～約２．０５μＭ、約１μＭ～約２．９５μＭ、約０．０５μＭ～約３μＭ、約０．０８μＭ～約１．５５μＭ、または約０．０５μＭ～約２．９μＭの量でリボフラビンを含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１００ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌ（例えば、約１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ｍｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、または培養培地の約１００ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌ（例えば、約１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ｍｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）の量で、１または複数の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、１または複数の無機塩として、カルシウムおよび／またはマグネシウムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１００ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌ、例えば、約１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ｍｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でカルシウムを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１００ｍｇ／Ｌ～約１２５ｍｇ／Ｌ、約１０５ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌ、約１２０ｍｇ／Ｌ～約１３０ｍｇ／Ｌ、または約１００ｍｇ／Ｌ～約１４５ｍｇ／Ｌの量でアルギニンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０１ｍＭ～約１ｍＭ、例えば、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、または１ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でマグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０５ｍＭ～約１ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約０．７８ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１ｍＭ、約０．０３ｍＭ～約０．７５ｍＭ、または約０．２５ｍＭ～約０．９５ｍＭの量でマグネシウムを含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌの量（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、または培養培地の約１、２、３、４、５、もしくは６ｇ／Ｌ～約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５ｇ／Ｌの量で、炭素源を含む。いくつかの実施形態では、炭素源として、グルコースおよび／またはピルベートが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌの培養培地、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量で、グルコースを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約６ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ～約１２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約１０．５ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約１１．５ｇ／Ｌ、または約２ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの量でグルコースを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約５ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、例えば約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でピルベートを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約５ｇ／Ｌ～約１４．５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌ、約７．５ｇ／Ｌ～約１０．５ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ～約１４．５ｇ／Ｌ、または約８ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌの量でピルベートを含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ（例えば、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、または４ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、または約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）の量で化学緩衝系を含む。いくつかの実施形態では、化学緩衝系として、重炭酸ナトリウムおよび／またはＨＥＰＥＳが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ、例えば、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、または４ｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量で重炭酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１ｇ／Ｌ～約３．７５ｇ／Ｌ、約１．２５ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ～約３ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ、または約２ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌの量で重炭酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でＨＥＰＥＳを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１２．５ｍＭ～約２２．５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０．７５ｍＭ、または約１０ｍＭ～約２０ｍＭの量でＨＥＰＥＳを含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ（例えば、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、または約０．５、１、１．５、２ｍＭ～約２．５、３、３．５、４、４．５、もしくは５ｍＭの量で、１または複数の必須アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、１または複数の必須アミノ酸は、アルギニンおよび／またはシステインである。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、例えば、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量で、アルギニンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．５ｍＭ～約４．７５ｍＭ、約２ｍＭ～約３．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約３．５ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、または約３．５ｍＭ～約５ｍＭの量でアルギニンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、例えば、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量で、システインを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．５ｍＭ～約４．７５ｍＭ、約２ｍＭ～約３．５ｍＭ、約０．５ｍＭ～約３．５ｍＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、または約３．５ｍＭ～約５ｍＭの量でシステインを含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０１μＭ～約５０μＭ（約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、４９．０２５、４９．０５、４９．０７５、または５０μＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、あるいは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、３、４、５、６μＭ、または約０．０２、０．０２５、０．０５、０．０７５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０μＭ～約１２．５、１５、１７．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、４９．０２５、４９．０５、４９．０７５、もしくは５０μＭの量で、１もしくは複数のビタミンおよび／または補助因子を含む。いくつかの実施形態では、１もしくは複数のビタミンおよび／または補助因子として、チアミンおよび／またはリボフラビンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０２５μＭ～約５０μＭ、例えば、０．０２５、０．０５、０．０７５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、４９．０２５、４９．０５、４９．０７５、または５０μＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でチアミンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０２５μＭ～約４５．０７５μＭ、約１μＭ～約４０μＭ、約５μＭ～約３５．０７５μＭ、約１０μＭ～約５０μＭ、または約０．０５μＭ～約４５．５μＭの量でチアミンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０１μＭ～約３μＭ、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３μＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でリボフラビンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０１μＭ～約２．０５μＭ、約１μＭ～約２．９５μＭ、約０．０５μＭ～約３μＭ、約０．０８μＭ～約１．５５μＭ、または約０．０５μＭ～約２．９μＭの量でリボフラビンを含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１００ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌ（例えば、約１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ｍｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）、または培養培地の約１００ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌ（例えば、約１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ｍｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲）の量で、１または複数の無機塩を含む。いくつかの実施形態では、例示的な１または複数の無機塩は、カルシウムおよび／またはマグネシウムである。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１００ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌ、例えば、約１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０ｍｇ／Ｌ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でカルシウムを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約１００ｍｇ／Ｌ～約１２５ｍｇ／Ｌ、約１０５ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌ、約１２０ｍｇ／Ｌ～約１３０ｍｇ／Ｌ、または約１００ｍｇ／Ｌ～約１４５ｍｇ／Ｌの量でアルギニンを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０１ｍＭ～約１ｍＭ、例えば、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、または１ｍＭ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量でマグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、約０．０５ｍＭ～約１ｍＭ、約０．０１ｍＭ～約０．７８ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１ｍＭ、約０．０３ｍＭ～約０．７５ｍＭ、または約０．２５ｍＭ～約０．９５ｍＭの量でマグネシウムを含む。

いくつかの実施形態では、炭素源、化学緩衝系、１または複数の必須アミノ酸、１または複数のビタミン、および／あるいは補助因子、ならびに／あるいは１または複数の無機塩は、食品グレードのものである。

いくつかの実施形態では、培養培地は乳原性培養培地であり、例えば、培養培地はプロラクチン（例えば、哺乳動物プロラクチン、例えばヒトプロラクチン）をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／Ｌ、例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎｇ／ｍＬ、あるいはその中のいずれかの値または範囲の量で、プロラクチンを含む（あるいはプロラクチンが添加される）。いくつかの実施形態では、培養培地は、培養培地の約２０ｎｇ／ｍＬ～約１９５ｎｇ／Ｌ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ～約１７５ｎｇ／ｍＬ、約４５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／Ｌ、または約７５ｎｇ／ｍＬ～約１９０ｎｇ／Ｌの量で、プロラクチンを含む（あるいはプロラクチンが添加される）。いくつかの実施形態では、上記方法は、培養培地にプロラクチンを添加することで乳汁原性培養培地を提供する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロラクチンは、組換えプロラクチン（例えば、プロラクチン遺伝子の１７９位のセリン残基とアスパルテートとの置換を含むプロラクチン（Ｓ１７９Ｄ）、例えばＳ１７９Ｄ－プロラクチン）を発現する微生物細胞および／またはヒト細胞により産生される。いくつかの実施形態では、培養培地にプロラクチンを添加することは、プロラクチンを発現かつ分泌する細胞を培養することにより培養培地を調整すること、および、プロラクチンを含む調整培養培地を初代乳腺上皮細胞の基底面、混合集団の単層の基底面、または生きた不死化乳腺上皮細胞の単層の基底面に適用することを含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、効率を改善するために、インスリン、上皮成長因子、および／またはヒドロコルチゾンを含むがこれらに限定されない他の因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、例えば効率を改善するために、他の因子（例えば、インスリン、上皮性成長因子、および／またはヒドロコルチゾン）を培養培地に適用する工程をさらに含む。

培養乳製品の産生方法
本明細書中のある実施形態では、培養乳製品を製造する方法が開示される。いくつかの実施形態では、上記方法は、本明細書に開示される生細胞構築物を、基底区画と頂端区画とを含むバイオリアクタ中で培養する工程を含み、基底区画は培養培地を含み、乳腺細胞は培養乳製品を頂端区画内に分泌する。

いくつかの実施形態では、生細胞構築物は、上面および下面を含む足場、生きた初代乳腺上皮細胞の分極化単層、生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団の分極化された連続単層、ならびに／または頂端面および基底面を有する生きた不死化乳腺上皮細胞の分極化された連続単層を含み、生きた初代乳腺上皮細胞の分極化された連続単層、生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団の分極化された連続単層、ならびに／または生きた不死化乳腺上皮細胞の分極化された連続単層は、足場の上面に位置する。

いくつかの実施形態では、足場の下面は、基底区画に隣接している。いくつかの実施形態では、生きた初代乳腺上皮細胞の分極化された連続単層、生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団の分極化された連続単層、ならびに／または生きた不死化乳腺上皮細胞の分極化された連続単層の頂端面は、頂端区画に隣接している。いくつかの実施形態では、生きた初代乳腺上皮細胞の分極化された連続単層、生きた初代乳腺上皮細胞、乳腺筋上皮細胞、および乳腺前駆細胞が混合された集団の分極化された連続単層の生きた初代乳腺上皮細胞、または不死化乳腺上皮細胞の分極化された連続単層は、その頂端面を介して頂端区画に乳を分泌することで、培養下で乳を産生する。

いくつかの実施形態では、乳腺上皮細胞の分極化単層は、頂端区画と基底区画とを分割する障壁を形成し、乳腺細胞の基底面は足場に付着し、頂端面は頂端区画の方へと配向される。

いくつかの実施形態では、基底区画は、足場の下面に隣接している。いくつかの実施形態では、基底区画は、乳腺上皮細胞の分極化単層（例えば、初代乳腺上皮細胞の分極化単層、混合集団の分極化単層、または生きた不死化乳腺上皮細胞の分極化単層）の基底面と流体接触状態にある培養培地を含む。

いくつかの実施形態では、培養培地は、炭素源、化学緩衝系、１または複数の必須アミノ酸、１または複数のビタミン、および／あるいは補助因子、ならびに１または複数の無機塩を含む。

いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、単層の頂端面に隣接する頂端区画を含む。いくつかの実施形態では、頂端区画は、足場の上面に隣接している。

いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、最低１０^１１の乳腺細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、最低１０^１２の乳腺細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、最低１０^１３の乳腺細胞である。

いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、１００μｍ^２につき約２０～５５の細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、１００μｍ^２につき約２０の細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、１００μｍ^２につき２５の細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、１００μｍ^２につき約３０の細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、１００μｍ^２につき約３５の細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、１００μｍ^２につき約４０の細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、１００μｍ^２につき約４５の細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、１００μｍ^２につき約５０の細胞である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ中の乳腺細胞の総細胞密度は、１００μｍ^２につき約５５の細胞である。

いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約１．５ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約２ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約２．５ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約３ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約４ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約５ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約１０ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約１５ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約２０ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約２５ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約５０ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約１００ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約２５０ｍ^２である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積は、最低約５００ｍ^２である。

いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、温度を約２７℃～約３９℃（例えば、約２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３５℃、３５．５℃、３６℃、３６．５℃、３７℃、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、または約３９℃、あるいはその中のいずれかの値または範囲、例えば、約２７℃～約３８℃、約３６℃～約３９℃、約３６．５℃～約３９℃、約３６．５℃～約３７．５℃、または約３６．５℃～約３８℃）に維持する。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、温度を約３７℃に維持する。

いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、約４％～約６％の大気中ＣＯ_２濃度を有し、例えば、大気中ＣＯ_２濃度は、約４％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５％、５．２５％、５．５％、５．７５％、または６％、あるいはその中のいずれかの値または範囲、例えば、約４％～約５．５％、約４．５％～約６％、約４．５％～約５．５％、または約５％～約６％である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、約５％の大気中ＣＯ_２濃度を有する。

いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、約４％～約６％の大気中ＣＯ_２濃度を有し、例えば、大気中ＣＯ_２濃度は、約４％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５％、５．２５％、５．５％、５．７５％、または６％、あるいはその中のいずれかの値または範囲、例えば、約４％～約５．５％、約４．５％～約６％、約４．５％～約５．５％、または約５％～約６％である。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、約５％の大気中ＣＯ_２濃度を有する。

いくつかの実施形態では、上記方法は、溶存したＯ_２とＣＯ_２の濃度をモニタリングする工程を含む。いくつかの実施形態では、溶存したＯ_２の濃度は、約１０％～約２５％の間、またはその中のいずれかの値または範囲（例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５％）に維持される。例えば、いくつかの実施形態では、溶存したＯ_２の濃度は、約１２％～約２５％の間、約１５％～約２２％の間、約１０％～約２０％の間、約１５％、約２０％、または約２２％に維持される。いくつかの実施形態では、ＣＯ_２濃度は、約４％～約６％の間に維持され、例えば、ＣＯ_２濃度は、約４％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５％、５．２５％、５．５％、５．７５％、または６％、あるいはその中のいずれかの値または範囲、例えば、約４％～約５．５％、約４．５％～約６％、約４．５％～約５．５％、または約５％～約６％である。いくつかの実施形態では、ＣＯ_２濃度は、約５％に維持される。

いくつかの実施形態では、培養培地は、ほぼ毎日～約１０日ごと（例えば、１日ごと、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、７日ごと、８日ごと、９日ごと、１０日ごと、またはその中のいずれかの値または範囲、例えば、ほぼ毎日～３日ごと、約３日ごと～１０日ごと、約２日ごと～５日ごと）に交換される。いくつかの実施形態では、培養培地は、ほぼ毎日～約数時間から約１０日毎、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間ごと～約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日ごと、あるいはその中のいずれかの値または範囲で交換される。例えば、いくつかの実施形態では、培養培地は、約１２時間ごと～約１０日ごと、約１０時間ごと～約５日ごと、または約５時間ごと～約３日ごとに交換される。

いくつかの実施形態では、上記方法は、培養培地および／または乳汁原性培養培地中のグルコース濃度および／またはグルコース消費速度をモニタリングする工程を含む。いくつかの実施形態では、プロラクチンは、培養培地中のグルコース消費速度が定常状態であるときに添加される。

いくつかの実施形態では、上記方法は、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を適用して上皮細胞の単層の維持を測定する工程をさらに含む。ＴＥＥＲは、２つの区画中の流体（例えば、培地）間（例えば、頂端区画と基底区画との間）の電圧差を測定し、両区画間の障壁が完全性を喪失している場合、２つの区画中の流体は混ざり合う場合がある。流体が混合されると、電圧差は減少するか排除されることとなる。電圧差は、障壁が無傷であることを示す。いくつかの実施形態では、ＴＥＥＲによる電圧損失の検出時に、足場（例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）フィルタ、微細構造化バイオリアクタ、脱細胞組織、中空繊維バイオリアクタなど）に追加の細胞が再び接種され、障壁（例えば、単層）を再確立してから培養乳製品の産生（例えば、乳産生）を再開することが可能となる。

いくつかの実施形態では、上記方法は、頂端区画から培養乳製品を回収して培養乳製品を産生する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、回収は、ポートを介して、重力を介して、および／またはバキューム（ｖａｃｕｕｍ）を介して行われる。いくつかの実施形態では、バキュームは、ポートに取り付けられる。

いくつかの実施形態では、上記方法は、回収された培養乳製品を冷凍して冷凍培養乳製品を産生する工程、および／または回収された培養乳製品を凍結乾燥して凍結乾燥培養乳製品を産生する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態では、上記方法は、回収された培養乳製品、冷凍培養乳製品、および／または凍結乾燥培養乳製品を容器に入れて包装する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態では、上記方法は、回収された培養乳製品から１または複数の成分を抽出する工程をさらに含む。回収された培養乳製品から抽出される成分の非限定的な例として、乳タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、および／またはミネラル含有量が挙げられる。いくつかの実施形態では、回収された培養乳製品から抽出される成分は、凍結乾燥または濃縮培養乳製品成分生成物を産生するために、凍結乾燥および／または濃縮される。いくつかの実施形態では、回収された培養乳製品から抽出される成分は、例えば、膜濾過および／または逆浸透により濃縮される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥または濃縮培養乳製品成分製品は、容器に入れて包装され、任意選択でこの容器は、滅菌グレードおよび／または食品グレードの容器である。いくつかの実施形態では、容器は真空封止される。いくつかの実施形態では、容器は、キャニスタ、アジャー（ａｊａｒ）、ボトル、バッグ、箱、またはパウチである。

培養乳製品
本明細書中の実施形態では、培養乳製品が開示される。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、標準化された滅菌培養乳製品である。いくつかの実施形態では、培養乳製品は栄養用途のためのものである。

いくつかの実施形態では、培養乳製品は、本明細書に開示されるいずれかの方法により産生される。

母乳には、低濃度であるが測定可能な濃度の環境汚染物質、製造産業により生じる健康を害する化学物質、および環境中に広く拡散している製造産物（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が含まれる。環境汚染物質は、その一部が母乳中で分泌される。母乳中の汚染物質レベルは母体中の汚染物質レベルを反映するため、暴露レベルのモニタリングに理想的である。有毒な環境汚染物質は、授乳により母親から乳児に移行するおそれがある。残留性有機汚染物質（ＰＯＰ）は、脂肪組織に生物蓄積して持続的で有毒な身体負担を生じさせる安定した親油性化学物質のファミリーである。母乳育児は、ヒトの生涯において最初の段階にＰＯＰへの重要な暴露源をもたらすが、その作用は不明である。

いくつかの実施形態では、培養乳製品は、１または複数の環境汚染物質を含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、残留性有機汚染物質（ＰＯＰ）を含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、ポリ塩化ジベンゾ－ｐ－ジオキシン（ＰＣＤＤ）、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、および、ＤＤＴなどの殺虫剤を含まないか、実質的に含まない。

環境に散在する水銀、鉛、ヒ素、カドミウム、ニッケル、クロム、コバルト、亜鉛、およびその他生じ得る有毒金属といった重金属にも、ヒトの乳に蓄積すると知られる生物蓄積性特徴があることから、授乳中の乳児に対する懸念とされている。母乳中の金属は、外因性源、すなわち、汚染空気、食物、および飲料水を介した取り込みや、必須の微量元素との内因性放出から生じる。例えば、鉛と水銀は、ヒトの食物連鎖で均等に散在しており、これらの胎児発育に対する影響は、母親の食事と栄養状態によって大きく決定される。有毒金属への曝露は、濃度が少量で曝露が短くても公衆衛生上重大な影響を及ぼし、これら金属はヒトに対し依然として有毒である。授乳中の乳児は、最も感受性が高い期間に有毒な金属にさらされるおそれがある。授乳中の乳児は、母乳を介して通常より過剰量の重金属にさらされ、この曝露により乳児の健康に影響が及ぶおそれがある。特に幼児の場合、これらの曝露は、発達中の中枢神経系に悪影響を及ぼし、認知能力に対し生涯にわたる欠陥を残すおそれがある。

いくつかの実施形態では、培養乳製品は、ヒ素、鉛、カドミウム、ニッケル、水銀、クロム、コバルト、亜鉛などの１または複数の重金属を含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、ヒ素を含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、鉛を含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、カドミウムを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、ニッケルを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、水銀を含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、クロムを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、コバルトを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、亜鉛を含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、ヒ素、鉛、カドミウム、ニッケル、水銀、クロム、コバルト、および亜鉛を含まないか、実質的に含まない。

外来性アレルゲンタンパク質は、内因性ヒト乳タンパク質との区別が困難な可能性がある。ヒトの乳にアレルゲンが検出される可能性のある食物タンパク質として、鶏卵やピーナツのタンパク質が挙げられる。米国では、深刻な食物アレルギー反応の大半に起因する８つの主要な食物アレルゲンが存在し、これらはビッグ８（ｂｉｇ ８）として知られている。ビッグ８は、牛乳、卵、魚、甲殻類、木の実、落花生、小麦、大豆のアレルゲンで構成されている。卵アレルギーを引き起こすと知られるタンパク質として、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミンが挙げられる。落花生タンパク質として、アラチン６、アラチン３、コナラチン、主アレルゲンＡｒａｈ１、アラチンＡｒａｈ２が挙げられる。母体における乳への食品タンパク輸送の例としては、卵を１日１個消費すると、ヒトの乳中の鶏卵アレルゲンオボアルブミン（ＯＶＡ）濃度は、卵を食べない母親に比べて高くなることが示されている。

いくつかの実施形態では、培養乳製品は、１または複数の食物アレルゲンを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、卵、魚、甲殻類、木の実、落花生、小麦、および大豆のアレルゲンを含まないか、または実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、卵アレルゲンを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、魚アレルゲンを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、甲殻類アレルゲンを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、木の実アレルゲンを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、落花生アレルゲンを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、小麦アレルゲンを含まないか、実質的に含まない。いくつかの実施形態では、培養乳製品は、大豆アレルゲンを含まないか、実質的に含まない。

いくつかの実施形態では、培養乳製品は、アラチン６、アラチン３、コナラチン、Ａｒａｈ１、およびＡｒａｈ２を含まないか、または実質的に含まない。

いくつかの実施形態では、培養乳製品は、オボアルブミン（ＯＶＡ）を含まないか、実質的に含まない。

これまで本発明を説明してきたが、以下の実施例にも同じ内容がより詳しく説明されることになる。この実施例は、例示目的のためだけに本明細書に含まれるものであり、本発明を限定するようには意図されていない。

実施例１：
乳の回収用に設計した細胞培養系は、細胞へ栄養素を提供する培地に乳がさらされないように、生成物の区画化された分泌を支持する必要がある。体内で、乳を産生する上皮細胞は、乳腺の内部表面に連続的な単層として並んでいる。この単層は、基礎をなす基底膜に基底面が付着されていながら、乳が頂端面から分泌され、搾乳中または授乳中に除去されるまで腺または腺胞の腔区画に貯蔵されるように配向される。細胞の側面に沿った密着結合は、基礎をなす組織と腺胞区画にある乳との間に障壁を確保する。このため、ｉｎ ｖｉｖｏで乳腺組織は、乳分泌が区画化されるように配置され、乳腺上皮細胞自体は界面を確立して、栄養素の方向性吸収と乳分泌を維持する。

本開示は、体外で成長した乳腺上皮細胞から乳を採取するのに使用される乳腺の区画化能を再現する細胞培養装置を記載する。かかる装置は、２つの区画間の界面にて乳腺細胞の増殖を支持する足場を含むことができ、その結果、上皮単層により、栄養培地と分泌乳との間に物理的境界が設けられる。足場は、成長のための表面を提供するのに加えて、細胞の分極化を誘導するとともに吸収および分泌の方向性を確保する空間キューを提供する。本発明は、栄養用途の乳の産生と回収のための区画化細胞培養装置での乳腺上皮細胞の調製、栽培、および刺激を記載する（例えば、図１）。

乳腺上皮細胞の調製：切除された乳腺組織（例えば、乳房、乳腺、乳頭）、生検試料、または生の母乳の外科的外植片から、乳腺上皮細胞を得る。全体として、乳腺組織の外科的切除の後、脂肪または間質組織をすべて滅菌条件下、手作業で除去し、残りの乳腺組織は、既知組成栄養培地中で調製したコラゲナーゼおよび／またはヒアルロニダーゼで酵素消化し、この培地は、「一般に安全と認められる」（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ：ＧＲＡＳ）成分で構成されなければならない。試料は優しく撹拌しながら３７℃に維持する。消化後、遠心分離により、または試料を滅菌ナイロン細胞ストレーナに注いで通貨させることにより、単一細胞またはオルガノイドの懸濁液を回収する。次いで、適切な細胞外マトリクス成分（例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン）で被覆した組織培養プレートに細胞懸濁液を移す。

あるいは、外植片の試験片は、例えば滅菌メスで刻むことにより小片へと処理されてもよい。この組織片を、適切な細胞外マトリクスで被覆されたゼラチンスポンジまたはプラスチック組織培養プレートなどの適切な表面に播種する。

播種した細胞は、３７℃、湿式インキュベータの中、５％ＣＯ_２の雰囲気で維持する。インキュベーション中、培地は約１～３日ごとに交換し、後の処理に十分な生存可能細胞数を達成するまで細胞を継代培養する。後の処理としては、液体窒素中での貯蔵の準備；ＳＶ４０、ＴＥＲＴ、または老化に関連する他の遺伝子の安定遺伝子導入による不死化細胞株の発達；例えば蛍光活性化細胞選別による乳腺上皮細胞型、筋上皮細胞型、および幹／前駆細胞型の単離；ならびに／あるいはヒトが消費する乳の産生と回収のための区画化組織培養装置への導入が挙げられる。

乳産生のための乳腺上皮細胞の栽培。栄養用途の乳を、上述のように単離した乳腺上皮細胞から産生し、栄養培地と生成物との分離が維持されるように区画化分泌を支持する形で培養する。この系は、乳が中に分泌される頂端区画と栄養培地が全体に設けられる基底区画との間の界面に位置する適切な足場に蒔いたときに、頂端－基底極性を持つ連続単層を乳腺上皮細胞が確立する能力に依存する（例えば、図２を参照）。例えばこれらの特性を裏付けるために、組織培養プレートに配置するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）フィルタ、ならびに中空繊維または微細構造化足場をベースとするバイオリアクタを使用する。

乳腺上皮細胞の単離と拡張の後、食品グレードの成分で構成される既知組成栄養培地に乳腺上皮細胞を懸濁し、コラーゲン、ラミニン、および／またはフィブロネクチンなどの細胞外マトリクスタンパク質の混合物を事前に被覆した培養装置に接種させる。この細胞培養装置は、栄養素の区画化された吸収、および分極化されたコンフルエントな上皮単層からの生成物の分泌を可能にする、あらゆる設計である。例として、中空繊維バイオリアクタや、微細構造化足場バイオリアクタが挙げられる（例えば、それぞれ図３と図４を参照）。代案としては、脱細胞化乳腺の足場としての調製、ｉｎ ｖｉｔｒｏで機能的な器官を産生するための幹細胞の再移入、ヒドロゲルマトリクスまたは懸濁液のいずれかで成長する乳腺上皮細胞オルガノイドまたは「マンモスフェア」の内腔からの乳の回収など、他の三次元組織培養方法が挙げられる。

装置は、約５％ＣＯ_２の湿気雰囲気で温度を約３７℃に維持する密封式ハウジングを備えている。グルコースの取込みをモニタリングして、細胞がバイオリアクタ内で増殖するときの培養物の成長を評価する。グルコース消費の安定化は、接触が阻害されたコンフルエントな状態に細胞が到達していることを示す。経上皮電気抵抗を使用して単層の完全性を確保する。センサにより、培地の複数の位置に溶存したＯ_２およびＣＯ_２の濃度をモニタリングする。コンピュータポンプにより、栄養素送達の平衡を維持する速度でバイオリアクタを介して培地を循環させ、アンモニアやラクテートなどの代謝廃棄物を除去する。培地は、上記系を通じて、乳酸補充・適応技術（Ｆｒｅｕｎｄ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．１９（２））を使用して、またはゼオライトパックの室に通すことにより廃棄物を除去した後、再利用可能となる。

乳産生の刺激。Ｉｎ ｖｉｖｏおよび培養乳腺上皮細胞での乳の産生と分泌は、プロラクチンにより刺激される。培養下でプロラクチンは、栄養培地中、泌乳中に体内に観察される濃度に近い濃度、例えば約２０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬで外因的に供給可能である。精製プロラクチンは市販で入手可能である。しかし、プロラクチンを提供するか泌乳を刺激する代替的な方法が利用されており、微生物または乳腺細胞培養物からの組換えタンパク質の発現と精製が挙げられる。あるいは、プロラクチンを発現かつ分泌する細胞を培養することにより調製した調整培地を乳腺上皮細胞培養物に適用し、泌乳を刺激することができる。バイオリアクタは、プロラクチンを発現する細胞の培養液を通る培地、または他の主要な培地補足物を調整してから、これを前述の区画化培養装置中で成長する乳腺細胞にさらすように、一連で設定可能である。

乳産生を上方調節する、および／または外因性プロラクチンの使用を控える他の手法として、（ａ）プロラクチンの翻訳後修飾を標的とする構築物の発現、（ｂ）プロラクチン受容体の代替的なアイソタイプの発現、（ｃ）細胞外ドメインが異なるリガンドの結合部位と交換されるキメラプロラクチン受容体の発現、（ｄ）構造上または条件付きで活性なプロラクチン受容体、またはＳＴＡＴ５やＡｋｔなどその下流エフェクタの修飾変形をコードする遺伝子の導入、（ｅ）ＰＥＲ２概日遺伝子のノックアウトまたは修飾、ならびに／あるいは（ｆ）乳腺上皮単層の基底面における栄養素取込み速度の上昇を目的とする分子手法など、乳腺上皮細胞の表面上でプロラクチンをその受容体に結合させることにより調節されるシグナル伝達経路の分子操作が挙げられる。

乳の回収。分泌乳は、例えば、培養装置の頂端区画内に設置されたポートを介して、連続的または間隔を置いて回収される。バキュームをポートに適用することで回収が容易になるほか、さらなる産生の刺激に寄与する。回収した乳は、滅菌容器に入れて包装され、流通用に密封され、貯蔵用に冷凍または凍結乾燥され、あるいは特定成分の抽出のために処理される。

本発明は、栄養用途の乳産生のための乳腺上皮細胞培養物を提供する。本方法は、ヒトの母乳に加えて、例えば、ヒトによる消費または獣医学的使用のために他の哺乳動物種から乳を産生するのに使用されてよい。これまで体外で乳を産生できなかったため、この技術は、既存の製品に対して代替的な産生様式を提供することに加えて、新規な商業上の目的をももたらす場合がある。この技術の商業的開発における社会的および経済的効果は大きく、広範囲に及ぶ。培養した細胞からヒト母乳を産生することで、食料不足の地域社会における乳児の栄養失調に対処する手段を提供し、母乳を与えられない未熟児に必須栄養素を提供し、かつ、乳児用調製乳の利便性とともに最適な栄養素を乳児に提供する新たな選択肢を母親に提供することができる。牛乳やヤギ乳の産生により、動物農業における環境、社会、および動物福祉に対する影響を少なくする機会が得られる。本明細書で記載するプロセスは、細胞農業の新興分野における重大な隔たりに対処するとともに、ヒトの最も基本的な栄養源に対する生物学的および文化的な関わりを損なうことなく、ヒトへの食糧供給を劇的に改善する機会を導入するものである。

前述の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は、好ましい実施形態を参照して詳しく説明されてきたが、以下の特許請求の範囲に記載かつ定義される本発明の範囲と趣旨の中には変形と修正が存在する。

Claims (34)

1. （ａ）外面、内腔／基底室を画定する内面、および前記内面から前記外面まで延在する複数の孔を有する三次元足場と、
   （ｂ）前記三次元足場の前記外面に配置されるマトリクス材料と、
   （ｃ）前記内腔／基底室内に配置されるとともに内部表面と流体接触状態にある培養培地と、
   （ｄ）前記マトリクス材料に配置された分極化乳腺細胞の最低７０％コンフルエントな単層であって、前記乳腺細胞が、生きた初代乳腺上皮細胞、生きた乳腺筋上皮細胞、生きた乳腺前駆細胞、生きた不死化乳腺上皮細胞、生きた不死化乳腺筋上皮細胞、および生きた不死化乳腺前駆細胞からなる群から選択される、単層と
   を含む生細胞構築物。
2. 前記分極化乳腺細胞が、頂端面と基底面を含む、請求項１に記載の生細胞構築物。
3. 前記分極化乳腺細胞の前記基底面が、前記培養培地と流体接触状態にある、請求項２に記載の生細胞構築物。
4. 前記分極化乳腺細胞の最低７０％、最低８０％、最低９０％、最低９５％、最低９９％、または１００％が、同じ配向で分極化される、請求項１に記載の生細胞構築物。
5. 分極化乳腺細胞の前記単層が、最低７０％コンフルエント、最低８０％コンフルエント、最低９０％コンフルエント、最低９５％コンフルエント、最低９９％コンフルエント、または１００％コンフルエントである、請求項１に記載生細胞構築物。
6. 前記分極化乳腺細胞が、構成上活性なプロラクチン受容体タンパク質を含む、請求項１に記載の生細胞構築物。
7. 前記培養培地が、炭素源、化学緩衝系、１または複数の必須アミノ酸、１または複数のビタミンおよび／または補助因子、ならびに１または複数の無機塩を含む、請求項１に記載の生細胞構築物。
8. 前記培養培地がプロラクチンをさらに含む、請求項７に記載の生細胞構築物。
9. 前記マトリクス材料が、１または複数の細胞外マトリクスタンパク質を含む、請求項１に記載の生細胞構築物。
10. 前記三次元足場が、天然ポリマー、生体適合性合成ポリマー、合成ペプチド、前述のいずれかに由来する複合体、またはそれらのあらゆる組合せを含む、請求項１に記載の生細胞構築物。
11. 前記天然ポリマーが、コラーゲン、キトサン、セルロース、アガロース、アルギネート、ゼラチン、エラスチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、および／またはヒアルロン酸である、請求項１０に記載の生細胞構築物。
12. 前記生体適合性合成ポリマーが、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン共酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、および／またはポリエチレングリコールである、請求項１０に記載の生細胞構築物。
13. 乳腺細胞から単離された培養乳製品を産生する方法であって、
    （ａ）前記培養乳製品を産生する条件下、生細胞構築物をバイオリアクタ中で培養する工程であって、前記生細胞構築物が、
    （ｉ）外面、内腔／基底室を画定する内面、および前記内面から前記外面まで延在する複数の孔を有する三次元足場、
    （ｉｉ）前記三次元足場の前記外面に配置されるマトリクス材料、
    （ｉｉｉ）前記内腔／基底室内に配置されるとともに内部表面と流体接触状態にある培養培地、ならびに
    （ｉｖ）前記マトリクス材料に配置された分極化乳腺細胞の最低７０％コンフルエントな単層であって、前記乳腺細胞が、生きた初代乳腺上皮細胞、生きた乳腺筋上皮細胞、生きた乳腺前駆細胞、生きた不死化乳腺上皮細胞、生きた不死化乳腺筋上皮細胞、および生きた不死化乳腺前駆細胞からなる群から選択される、単層
    を含む、工程と、
    （ｂ）培養乳製品を単離する工程と
    を含む方法。
14. 前記分極化乳腺細胞が、頂端面と基底面を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記乳腺細胞の前記基底面が前記培養培地と流体接触状態にある、請求項１４に記載の方法。
16. 前記バイオリアクタが密閉型バイオリアクタである、請求項１３に記載の方法。
17. 前記バイオリアクタが、前記生細胞構築物の内腔／基底室から実質的に単離された頂端区画を含む、請求項１４に記載の方法。
18. 前記頂端区画が、前記乳腺細胞の前記頂端面と流体接触状態にある、請求項１７に記載の方法。
19. 前記培養乳製品が、前記乳腺細胞の前記頂端面から前記頂端区画へと分泌される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記培養培地が、前記培養乳製品と実質的に接触していない、請求項１７に記載の方法。
21. 前記バイオリアクタ内の乳腺細胞の総細胞密度が、最低１０^１１である、請求項１３に記載の方法。
22. 前記バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積が、最低１．５ｍ^２である、請求項１３に記載の方法。
23. 前記培養培地が、炭素源、化学緩衝系、１または複数の必須アミノ酸、１または複数のビタミンおよび／または補助因子、ならびに１または複数の無機塩を含む、請求項１３に記載の方法。
24. 前記マトリクス材料が、１または複数の細胞外マトリクスタンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
25. 前記足場が、天然ポリマー、生体適合性合成ポリマー、合成ペプチド、前述のいずれかに由来する複合体、またはそれらのあらゆる組合せを含む、請求項１３に記載の方法。
26. 前記天然ポリマーが、コラーゲン、キトサン、セルロース、アガロース、アルギネート、ゼラチン、エラスチン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、および／またはヒアルロン酸である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記生体適合性合成ポリマーが、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン共酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、および／またはポリエチレングリコールである、請求項２５に記載の方法。
28. 前記培養する工程が、約２７℃～約３９℃の温度で行われる、請求項１３に記載の方法。
29. 前記培養する工程が、約３０℃～約３７℃の温度で行われる、請求項２８に記載の方法。
30. 前記培養する工程が、約４％～約６％の大気中ＣＯ_２濃度で行われる、請求項１３に記載の方法。
31. 前記培養する工程が、約５％の大気中ＣＯ_２濃度で行われる、請求項３０に記載の方法。
32. バイオリアクタであって、
    （ａ）培養乳製品を含む頂端区画と、
    （ｂ）少なくとも１個の生細胞構築物であって、
    （ｉ）外面、内腔／基底室を画定する内面、および前記内面から前記外面まで延在する複数の孔を有する三次元足場、
    （ｉｉ）前記三次元足場の前記外面に配置されるマトリクス材料、
    （ｉｉｉ）前記内腔／基底室内に配置されるとともに内部表面と流体接触状態にある培養培地、ならびに
    （ｉｖ）前記マトリクス材料に配置された分極化乳腺細胞の最低７０％コンフルエントな単層であって、前記乳腺細胞が、生きた初代乳腺上皮細胞、生きた乳腺筋上皮細胞、生きた乳腺前駆細胞、生きた不死化乳腺上皮細胞、生きた不死化乳腺筋上皮細胞、および生きた不死化乳腺前駆細胞からなる群から選択される、単層
    を含む生細胞構築物と
    を含み、前記分極化乳腺細胞の前記頂端面は、前記頂端区画と流体接触状態にある、バイオリアクタ。
33. 前記バイオリアクタ内の乳腺細胞の総細胞密度が、最低１０^１１である、請求項３２に記載のバイオリアクタ。
34. 前記バイオリアクタ内の乳腺細胞の総表面積が、最低１．５ｍ^２である、請求項３２に記載のバイオリアクタ。

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