RU2506309C2 - Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей - Google Patents
Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей Download PDFInfo
- Publication number
- RU2506309C2 RU2506309C2 RU2012109240/10A RU2012109240A RU2506309C2 RU 2506309 C2 RU2506309 C2 RU 2506309C2 RU 2012109240/10 A RU2012109240/10 A RU 2012109240/10A RU 2012109240 A RU2012109240 A RU 2012109240A RU 2506309 C2 RU2506309 C2 RU 2506309C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- myoblasts
- biomass
- myostatin
- medium
- Prior art date
Links
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title abstract description 8
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 title 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 43
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 26
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 16
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 102000004472 Myostatin Human genes 0.000 claims abstract 7
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 claims abstract 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 27
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 12
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 abstract description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 25
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 14
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010014612 Follistatin Proteins 0.000 description 4
- 102000016970 Follistatin Human genes 0.000 description 4
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 3
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 2
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000020995 raw meat Nutrition 0.000 description 2
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 description 2
- 231100000456 subacute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 2
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 2
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 2
- 208000008918 voyeurism Diseases 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin Chemical compound O1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2OC2=C1C=C(Cl)C(Cl)=C2 HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001428407 Ceramium Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206581 Gracilaria Species 0.000 description 1
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 1
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 1
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 1
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000008622 extracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 1
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 1
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000009548 growth disturbance Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003137 locomotive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006742 locomotor activity Effects 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 230000037257 muscle growth Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 244000144985 peep Species 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области клеточной технологии, биотехнологии, пищевой промышленности. Предложен способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов, где в качестве культивируемых клеток используют иммортализованные миобласты животного, клетки выращивают с использованием питательной среды с белками неживотного происхождения, а также содержащей гемоглобин, при этом клетки поддерживают в пролиферативном состоянии с помощью факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов для образования биомассы, а затем вызывают дифференцировку миобластов в миоциты путем удаления из среды факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов, а в случае нормальных по экспрессии миостатина клеток в среду добавляют ингибитор миостатина. Способ может быть использован в пищевой промышленности для создания безопасных мясных пищевых продуктов в масштабных количествах с уменьшенным временем создания таких продуктов. 5 з.п. ф-лы, 3 табл., 9 пр.
Description
Изобретение относится к области клеточной технологии, биотехнологии и пищевой промышленности, а именно связано с разработкой способа культивирования мышечных клеток in vitro для создания биомассы, используемой для пищевых целей.
Возможность выращивания выделенных из животных тканей, в том числе мышечной, доказана успешными экспериментами, проводимыми с начала 20 века. Однако на данный момент удается выращивать мышечную ткань лишь в небольших количествах [Edelman et al., 2005]. Более того, клеточные технологии ориентированы на создание именно органов, в медицинских целях. Такой подход требует создание сложной конструкции из различных тканей, обеспечивающей дальнейшее длительное выживание клеток и нормальное функционирование органа. Создание же технологии производства мышечных клеток для использования в пищевых целях является более простой задачей.
На данный момент существует 2 подробно описанных подхода к созданию «культивируемого мяса» [Boland et al., 2003, Zandonella, 2003], которые основаны на выращивании мышечных клеток в суспензии в питательной среде, с использованием поддерживающей структуры. Владимир Миронов предлагает создание биореактора, в котором клетки выращиваются на коллагеновых сфероидах, служащих основой для прикрепления и дифференцировки клеток, либо из таких сфероидов «печатают» орган [Mironov et al., 2009]. В подходе Уильяма Ван Еелена, запатентовавшего свою идею в США и Германии [Van Eelen et al., 1999], в качестве такой поддерживающей структуры используется коллагеновая сеть, питательная среда время от времени обновляется или фильтруется через нее. Также существуют идеи об использовании других типов поддерживающих структур, таких как большие листы съедобного или легко отделяемого материала, - мышечная ткань может использоваться для дальнейшей обработки после скручивания до необходимой толщины [Edelman et al., 2005]. Однако данные подходы до сих пор остаются лишь теоретическими, поскольку с их помощью еще не удалось обеспечить масштабное производство массы мышечных клеток. Предлагаемый же нами способ культивирования миобластов предполагает использование иммортализованной линии клеток, что позволяет отказаться от постоянного отбирания клеток у животных.
Разные исследователи предлагают использовать различные типы поддерживающих структур: шарики из съедобного коллагена с порами [Edelman et al., 2005], коллагеновая губка, полученная их быков [Van Eelen et al., 1999]. Известны каркасы, изготовленные также из фибронектина, ламинина или синтетических материалов, таких как альгинат, политимидиловая или полиуридиловая кислота [US patents №5686091, №5863984, №5916265]. Российские исследователи предлагают использовать в качестве каркасов губки, полученные из плазмы крови животных, с высокоразвитой поверхностью [патент РФ №2314719]. Однако при использовании таких исходных материалов для создания поддерживающей структуры (несинтетические - животного происхождения) велика вероятность загрязнения биомассы патогенами, значительно увеличивается риск попадания в нее пестицидов, мышьяка, диоксина, гормонов, а при использовании синтетических веществ появляется необходимость удаления данных структур для применения в пищевых целях, что усложняет процесс и увеличивает время производства. Агароза, из которой создаются гели в патентуемом изобретении, является линейным полисахаридом, образованным из чередующихся остатков β-D-галактопиранозы и 3,6-ангидридо-α-1-галактопиранозы, объединенных 1→4 связью. Агарозу получают из агара, путем экстрагирования из красных (филофора) и бурых водорослей (Gracilaria, Gelidium, Ceramium и др.), произрастающих в Белом море и Тихом океане, и образующих в водных растворах плотный студень. Такой материал (агароза) является натуральным, поэтому его деградация не является обязательной. Кроме того, данный материал позволяет создавать пористые гели с необходимым диаметром пор, варьируя процентность агарозы. Также описанные подходы предполагают использование отдельно твердой фазы (неподвижной) - поддерживающей структуры и жидкой фазы - питательной среды в постоянном движении. В предлагаемом же нами способе агарозный гель содержит в порах питательные элементы, в достаточном количестве для достижения клетками необходимой плотности. Таким образом, создается одна твердая фаза.
Также предлагается выращивать мышечные клетки в ферментере с использованием периодического культивирования с добавлением субстрата: питательные вещества добавляют в низких концентрациях в процессе ферментации. Одним из преимуществ метода является возможность регулирования скорости роста клеток, которую можно соизмерять со скоростью подачи кислорода. Данная технология немного технически проще, чем описанная выше (с использованием агарозных гелей), и соизмерима с ней по эффективности.
Питательные среды, используемые в опытах по культивированию мышечных клеток, в большей массе содержат БСА (бычий сывороточный альбумин) [Shah, 1999], и/или белковую компоненту, и/или некоторые факторы животного происхождения [Merten, 1999]. Однако такие компоненты неприемлемы для культивирования клеток для пищевых целей по уже указанной причине, а именно ввиду большой вероятности загрязнения биомассы патогенами и токсичными веществами; также ввиду высокой стоимости. В связи с этим в патентуемом изобретении предлагается использовать в качестве питательной среды или компонентов питательной среды экстракты организмов, синтезирующих большой процент белка от их биомассы (бактерий, либо дрожжей, либо водорослей, либо растений). Получается, используются белки неживотного происхождения (биотехнологического происхождения - полученные в клетках бактерий - например, E.coli; дрожжей - например, Saccharomyces; водорослей - например, Spirulina; растений - например, Glycine max). Любые другие вещества белковой природы, предполагаемые для использования при осуществлении способа культивирования, также предлагаются биотехнологического происхождения (рекомбинантные белки), например переносчики кислорода (наряду с питательными элементами необходимы для жизнеобеспечения клеток), например гемоглобин, что также отличает данное изобретение от существующих подходов. Такой подход позволяет создать безопасный продукт, с низкой себестоимостью, что является его бесспорным преимуществом.
Основным типом клеток мышечной ткани являются миоциты - зрелые клетки скелетных мышц (у взрослого человека в длину 2-3 см, в ширину - 100 мкм), представляющие собой синцитий: множество ядер в одной цитоплазме. Предшественниками миоцитов являются миобласты. Показано, что последовательность экспрессии генов и синтеза белков в процессе дифференцировки мышечной ткани in vitro, в целом, подобна таковой in vivo [Мануйлова и др., 2001].
Определенные сигналы, такие как наличие в среде факторов роста фибробластов или гепатоцитов (FGF, HGF - fibroblast growth factor, hepatocyte growth factor), могут поддерживать миобласты в пролиферативном состоянии. Если же данные факторы убрать из питательной среды, клетки перестают делиться, дифференцируются и сливаются.
Процесс дифференцировки является кооперативным: дифференцирующиеся миобласты секретируют факторы, стимулирующие другие миобласты к дифференцировке.
В данном изобретении предлагается использовать FGF, HGF для поддержания миобластов в пролиферативном состоянии, а отсутствие данных факторов - для дифференцировки и слияния миобластов.
Механизм, регулирующий число мышечных клеток и их размер, связан с наличием экстраклеточного сигнального белка, миостатина, а также его ингибиторов. На мышах показано, что при отсутствии экспрессии гена, кодирующего миостатин, мышцы вырастают в 2-3 раза больше, чем в норме. Оказывается, мутации того же гена наблюдаются у определенных пород скота: при селекции животных с большой мышечной массой бессознательно выбрались те особи, которые дефектны по гену миостатина. Миостатин относится к суперсемейству сигнальных белков TGFβ (transforming growth factor beta), в норме он секретируется мышечными клетками. Очевидно, что его функция - ограничение роста мышц. Небольшие количества данного белка можно обнаружить у взрослого человека, а при СПИДе (синдром приобретенного иммунного дефицита) у пациентов с выраженной потерей мышечной массы детектируются повышенные количества миостатина.
Нарастание большей мышечной массы наблюдается и при использовании ингибиторов миостатина, например фоллистатина и пептидов на его основе [Nakatani et al., 2008].
Патентуемый способ предполагает использование ингибиторов миостатина в качестве компонентов питательной среды, либо использование линий миобластов с отсутствием рецептора к миостатину, либо с отсутствующей экспрессией миостатина. Последние два подхода особенно актуальны, поскольку в данном случае не придется добавлять в среду ингибиторы миостатина, что удешевит производство.
Подход с использованием иммортализованной линии миобластов любых животных является уникальным, другие исследователи предлагают постоянно отбирать миобласты, либо сателлитные клетки [Van Eelen, 1999], либо мезенхимальные клетки [патент РФ №2314719], либо тканевые экспланты [Benjaminson et al., 2002]. Однако предлагаемый в данном изобретении подход удобнее, поскольку периодическое отбирание клеток требует дополнительных затрат. Кроме того, каждую новую партию клеток от животных необходимо проверять на наличие патогенов, определять наличие токсических веществ, гормонов, пестицидов. Более того, продукт не будет одинаковым от партии к партии (ввиду разных вкусовых качеств, консистенции, внешнего вида продукта), что может негативно сказаться на спросе на продукцию, а также на продуктивности метода. В добавление необходимо сказать, что при использовании тканевых эксплантов высока вероятность отмирания доли клеток ввиду недоступности для них питательных веществ, поскольку ткань подразумевает скопление клеток, скрепленных межклеточными контактами. Отмирающие клетки могут выделять токсические вещества. Кроме того, питательная среда будет расходоваться на рост других типов клеток, помимо мышечных, что выразится в меньшем содержании мышечных клеток в пищевом продукте, чем при использовании в качестве исходной миобластной линии клеток.
Таким образом, патентуемое изобретение представляет собой способ культивирования мышечных клеток in vitro для получения биомассы, используемой для пищевых целей, при котором в качестве культивируемых клеток используется иммортализованная линия миобластов любого животного. В такой линии клеток обеспечиваются отсутствие экспрессии миостатина ввиду генетического состава самих клеток; либо нормальный уровень экспрессии миостатина, но в этом случае обеспечивается введение в питательную среду ингибиторов миостатина; либо отсутствие экспрессии рецептора к миостатину. Иммортилизованная клеточная линия культивируется в ферментерах, либо на тонких агарозных гелях, содержащих в порах компоненты питательной среды. Для поддержания пролиферации миобластов клеткам подается FGF и/или HGF. Для дифференцировки миобластов обеспечивается недоступность данных факторов для клеток. Особенностями питательной среды являются: использование в качестве источника азота (аминокислот, в т.ч. незаменимых) вместо БСА белков неживотного происхождения; при использовании клеток с нормальной экспрессией миостатина - использование ингибиторов миостатина (например, фоллистатина и его аналогов); использование переносчиков кислорода, например гемоглобина, полученных с помощью биотехнологических методов. Питательной средой или компонентами питательной среды могут быть экстракты организмов, синтезирующих большой процент белка от их биомассы, они же являются источником микроэлементов, витаминов (бактерии, либо дрожжи, либо водоросли, либо растения).
Таким образом, настоящее изобретение является уникальным ввиду подходов, используемых для реализации способа. Заявленный способ культивирования мышечных клеток in vitro позволяет достичь технического результата - получения безопасной биомассы (не содержащей патогены, токсические вещества) для пищевых целей. Кроме того, данный способ позволяет получить биомассу в масштабируемых количествах, а также уменьшить время создания такой биомассы.
Пример 1. Получение биомассы мышечных клеток с использованием ферментера.
Миобласты помещали в среду, содержащую деионизированную воду, сбалансированный буферный солевой раствор (для снабжения клеток необходимыми ионами и поддержания осмотического баланса), глюкозу, бикарбонат (с его помощью поддерживали необходимое значение pH - между 7,2 и 7,5), дрожжевой экстракт (содержит на 100 г: белка 47-56 г (все, в т.ч. незаменимые аминокислоты), жиры - 2-6 г, золу - 6 г, лизин - 4,2 г, метионин + цистин 1,7 г; антиоксиданты: глутатион и серосодержащие аминокислоты; витамины: PP, холин, группы B - B1, B2, B6, B9, B12; микроэлементы: кальций 0,086 г, магний 0,18 г, натрий 3,6 г, калий 2,6 г, фосфор 0,104 г); в качестве переносчика кислорода - гемоглобин, полученный с помощью биотехнологических методов. Буферный раствор содержал ионы Na+, К+ (незаменимы в некоторых внутриклеточных реакциях, имеют важное значение также для поддержания осмотического баланса клеток). При использовании клеток с нормальной экспрессией миостатина в среду добавляли дополнительный компонент - фоллистатин (ингибитор миостатина), полученный с помощью биотехнологических методов.
Получившуюся смесь клеток и питательной среды с добавлением в нее факторов роста фибробластов и гепатоцитов для поддержания пролиферативного состояния миобластов помещали в ферментер (биореактор). Осуществляли периодическое культивирование с добавлением субстрата: питательные вещества добавляли в низких концентрациях в процессе ферментации. При достижении необходимого объема биомассы клеткам перестали подавать FGF, HGF. В результате, миобласты дифференцировались в миоциты. По завершении данного этапа клетки собирали, формируя биомассу для последующего использования в пищевых целях.
Культивирование проводили с соблюдением оптимального для клеток температурного режима (36-37°C).
Пример 2. Создание иммортализованной линии миобластов с отсутствующей экспрессией миостатина
Линию миобластов получали с использованием клеток от молодого животного, поскольку в таких клетках длина теломерных участков больше, чем у взрослого, тем более, старого животного, что обеспечивает больший пролиферативный потенциал.
В таких отобранных клетках животного добивались отсутствия экспрессии гена, кодирующего миостатин, с помощью нокаута данного гена (у Bos taurus - в положении 2q14-q15) введением замещающей векторной конструкции и последующего отбора измененных клеток.
Такие миобласты иммортализовывали введением в клетки конструкции, осуществляющей встраивание гена теломеразы в геном клетки, в конкретное место, обеспечивающее необходимый уровень экспрессии данного гена. Теломераза - это рибозим, способный удлиннять теломеры, был обнаружен в бессмертных клеточных линиях. Множество различных типов клеток было иммортализовано с помощью данного фермента, и ни одна не показала признаков нарушения роста, связанного с раковой трансформацией [Harley, 2002].
Пример 3. Создание иммортализованной линии миобластов с отсутствующей экспрессией рецептора миостатина.
Создали линию миобластов (см.пример 2), добились отсутствия экспрессии гена, кодирующего рецептор миостатина, иммортализовали данную линию клеток (см.пример 2).
Пример 4. Приготовление агарозного геля с питательной средой для культивирования миобластной линии клеток, не экспрессирующей миостатин или рецептор к миостатину.
Поскольку средний размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 000 кДа, агароза такой процентности вполне подходит для наших целей. Таким образом, приготовили 2% агарозу, с использованием деионизированной воды, сбалансированного буферного солевого раствора (ионы Na+ (120 мМ), К+), стерильного раствора глюкозы, стерилизованного раствора бикарбоната. В качестве питательных элементов в агарозу добавляли порошок спирулины (содержит антиоксидант β-каротин, а также железо, кальций, натрий, калий, медь, магний, марганец, цинк, фосфор, селен, витамины A, B1, B2, B3, B6, B12, PP, биотин, фолиевую кислоту, инозитол, пантотенат, витамины C и E, гамма-линоленовую кислоту и глютаминовую кислоту; 100 г продукта содержат: белки: 65 г, жиры: 6 г, углеводы: 12 г, зола 8 г), в качестве переносчика кислорода - гемоглобин, полученный с помощью биотехнологических методов. Все компоненты, помимо воды, добавляли в агарозу, охлажденную до 40-35°C, тщательно перемешивали. Заливали гель из такой агарозы толщиной не более 0,5 см.
Пример 5. Приготовление агарозного геля с питательной средой для культивирования миобластной линии клеток, экспрессирующей миостатин.
Приготовили раствор, описанный в примере 4, на основе агарозы, с дополнительным компонентом - фоллистатином (ингибитор миостатина), полученным с помощью биотехнологических методов. Заливали гель из такого раствора толщиной не более 0,5 см.
Пример 6. Получение миобластной клеточной массы в большом объеме
Приготовили агарозный гель (см. пример 4, пример 5, в зависимости от типа миобластной клеточной линии), с использованием в качестве источника питательных элементов соевый изолят (экстрагированный из Glycine max белок, очищенный от липидов, полисахаридов, ингибитора трипсина, содержит на 100 г: белка 90 г (все, в т.ч. незаменимые, аминокислоты), жиры - 0 г, золу - 6 г, волокна - 0,3 г, метионин 1,7 г; антиоксиданты: глутатион и серосодержащие аминокислоты; витамины: PP, холин, группы B - B1, B2, B6, B9, B12; микроэлементы: кальций 0,086 г, магний 0,18 г, натрий 3,6 г, калий 2,6 г, фосфор 0,104 г), поместили миобласты на такой гель на достаточном для получения оптимального объема биомассы расстоянии друг от друга. Обрабатывали клетки факторами роста фибробластов и гепатоцитов в необходимом для достижения максимального объема клеточной массы количестве. Культивирование проводили с соблюдением оптимального для клеток температурного режима (36-37°C).
Пример 7. Получение клеточной массы миоцитов в большом объеме
Приготовили агарозный гель (см. пример 4, пример 5, в зависимости от типа миобластной клеточной линии), поместили миобласты на такой гель, обеспечили их пролиферацию до необходимого уровня (см. пример 6). Далее перестали подавать клеткам FGF, HGF. В результате, миобласты дифференцировались в миоциты, клеточная масса приобрела вид «мышечного среза». При применении гелей толщиной 0,1 см такие гели не удаляли, использовали выращенную биомассу вместе с ними.
Культивирование проводили с соблюдением оптимального для клеток температурного режима (36-37°C).
Пример 8. Получение мышечной биомассы с использованием двух типов гелей.
Приготовили агарозный гель (см. примеры 2 - 5, в зависимости от типа миобластной клеточной линии), в который также ввели FGF, HGF, для обеспечения пролиферации миобластов до достижения оптимальной клеточной плотности.
Затем приготовили второй агарозный гель (см. пример 4, пример 5, в зависимости от типа миобластной клеточной линии), без использования FGF, HGF.
При остановке роста клеток агарозный гель расплавили, клеточную массу переместили на приготовленный второй гель, обеспечив дифференцировку миобластов в миоциты. Таким образом, получили биомассу, имеющую вид «мышечного среза».
Культивирование проводили с соблюдением оптимального для клеток температурного режима (36-37°C).
Поскольку при заливании тонких гелей увеличивается площадь поверхности для выращивания клеток, такой способ получения мышечной биомассы позволяет масштабировать производство такой биомассы.
Пример 9. Проверка возможности использования биомассы миоцитов, получаемой согласно патентуемому способу, в пищевых целях.
Для эксперимента использовали взрослых самцов крыс линии Вистар, 180-190 г. Экспериментальные животные поступили из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН. Животных содержали в условиях SPF-вивария с соблюдением режима приема пищи и воды.
Карантин
Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены на группы (опыт и контроль) с помощью метода рандомизации. Животные, не соответствующие критериям, были исключены из исследования в течение карантина.
Содержание животных
Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты. Световой режим: 12 ч - свет, 12 ч - темнота. Температура воздуха поддерживалась в пределах 19-25°C, относительная влажность - 50-70%. Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. При изменении погодных условий контролировался воздухообмен в помещении с помощью анемометра и путем измерения содержания в воздухе углекислого газа и аммиака. Был установлен режим проветривания, обеспечивающий около 15 объемов помещения в час, концентрацию CO2 не более 0.15 объемных %, аммиака - не более 0.001 мг/л. Животные получали воду ad libitum.
Эксперимент
1 группа (контрольная 1). Отобранным животным контрольной группы давали вареное мясо 2 раза в сутки в количестве 12-14 г.
2 группа (опытная 1). Приготавливали питание для животных опытной группы: полученную в результате культивирования в ферментере биомассу миоцитов центрифугировали для отделения питательной среды, питательную среду сливали. Получившуюся биомассу клеток варили и давали животным 2 раза в сутки в количестве 12-14 г.
3 группа (контрольная 2). Отобранным животным контрольной группы давали сырое мясо 2 раза в сутки в количестве 12-14 г.
4 группа (опытная 2). Полученную в результате культивирования в ферментере биомассу миоцитов центрифугировали для отделения питательной среды, питательную среду сливали. Получившуюся биомассу клеток давали животным 2 раза в сутки в количестве 12-14 г.
Данный режим питания выдерживали 30 дней.
Исследовали несколько показателей подострой токсичности крыс.
Регистрация показателей
Общее состояние оценивалось при ежедневном осмотре животных. Взвешивание, измерение ректальной температуры, потребления воды и корма выполнялось раз в неделю и после окончания кормления.
Физиологические исследования проводились до начала опыта и через 30 дней после начала исследования.
1. Влияние на массу тела
Точность используемых весов была верифицирована до начала исследования. Результаты взвешивания крыс представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||
| Влияние кормления мясом и биомассой мышечных клеток на массу тела крыс (г, M±m) | ||||
| Сроки исследования (дни) | Экспериментальная группа | |||
| Опыт 1 | Контроль 1 | Опыт 2 | Контроль 2 | |
| Фон | 190±1,5 | 188±2,7 | 192±3,7 | 180±2,9 |
| 7-й день | 187±2,4 | 187±3,1 | 186±3,2 | 175±2,8 |
| 14-й день | 185±3,1 | 185±2,9 | 180±3,2 | 170±2,3 |
| 21-й день | 184±3,0 | 180±2,8 | 170±2,9 | 168±2,4 |
| 30-й день | 186±2,8 | 175±3,0 | 164±3,1 | 160±2,3 |
Анализ приведенных в таблице 1 данных показывает, что вес животных равномерно уменьшался на протяжении всего срока исследования как в контрольных, так и во всех опытных группах. Наблюдали различия между опытными и контрольными группами животных в скорости потери массы: бóльшую скорость снижения веса наблюдали в опытных группах, в группе, которую кормили сырой биомассой мышечных клеток, наблюдали наибольшую скорость снижения массы тела.
2. Влияние на двигательную и исследовательскую активность
В таблице 2 представлены данные по влиянию кормления мясом и биомассой мышечных клеток на спонтанную двигательную активность крыс (СДА). Крысы по одной помещались в регистрационную камеру автоматического регистратора «Coulburn Instruments», где за каждые 5 минут на протяжении 35 минут у них регистрировалось количество движений.
| Таблица 2 | ||||
| Влияние кормления мясом и биомассой мышечных клеток на СДА крыс (г, M±m) | ||||
| Сроки исследования (дни) | Экспериментальная группа | |||
| Контроль 1 | Опыт 1 | Контроль 2 | Опыт 2 | |
| 0-5 | 51.2±18.1 | 88.9±20.4 | 86.4±41.9 | 72.6±27.3 |
| 6-10 | 46.1±30.5 | 76.4±11.9 | 72.2±24.9 | 70.2±21.9 |
| 11-15 | 43.0±21.9 | 70.5±17.4 | 21.9±11.5 | 65.3±23.6 |
| 16-20 | 22.1±4.7 | 42.5±15.0 | 29.4±16.5 | 67.9±15.0 |
| 21-25 | 31.1±12.4 | 40.8±2.5 | 13.0±6.4 | 64.8±10.2 |
| 26-30 | 31.2±13.6 | 41.4±9.3 | 41.1±10.5 | 67.2±9.0 |
| 31-35 | 18.1±13.6 | 42.9±2.5 | 18.4±7.0 | 72.8±8.8 |
Данные по контрольным животным свидетельствуют, что на протяжении исследования имело место общее снижение СДА (типичное явление в условиях длительных исследований). Однако в опытных группах снижение активности было менее выражено, в случае кормления вареной биомассой мышечных клеток оно составило около 50%, в случае кормления сырой биомассой мышечных клеток наблюдали небольшое снижение активности, которое элиминировалось к концу эксперимента.
Данные по влиянию кормления мясом и биомассой мышечных клеток на структуру поведения крыс в «открытом поле» представлены в таблице 3.
| Таблица 3 | ||||
| Влияние кормления мясом и биомассой мышечных клеток на поведение крыс (г, M±m) | ||||
| Сроки исследования (дни) | Экспериментальная группа | |||
| Опыт 1 | Контроль 1 | Опыт 2 | Контроль 2 | |
| Латентный период | 92±11 | 105±19 | 99±19 | 109±13 |
| Горизонтальная активность | 3.3±1.2 | 2.3±0.4 | 1.6±0.4 | 1.9±0.6 |
| Вертикальная активность | 2.1±0.8 | 2.4±0.5 | 1.8±0.9 | 2.7±0.3 |
| Заглядывания | 2.8±0.3 | 4.2±0.4 | 3.0±0.8 | 3.1±0.4 |
| 30 день | ||||
| Латентный период | 89±13 | 113±25 | 94±14 | 116±27 |
| Горизонтальная активность | 4.1±1.1 | 2.4±1.0 | 2.6±0.09 | 0.9±0.1 |
| Вертикальная активность | 3.0±0.8 | 2.4±1.2 | 3.1±0.7 | 1.0±0.1 |
| Заглядывания | 4.5±0.6 | 1.5±0.4 | 6.8±1.0 | 2.0±1.1 |
Как видно из представленных данных, практически во всех экспериментальных группах животных (исключая контрольные группы) отмечается достоверное укорочение латентного периода, во всех группах наблюдается недостоверное увеличение активности, оцениваемое по количеству вертикальных стоек, пересечений и заглядываний, по сравнению с фоновыми данными, что является характерным для животных, вторично помещаемых в условия «открытого поля». При этом каких-либо статистически достоверных различий в структуре поведения животных опытных групп от групп контроля не отмечается.
Выводы
Тесты на подострую токсичность показали, что выращенная биомасса мышечных клеток не приводит к гибели животных: животные всех четырех групп выжили.
Животные всех групп потеряли в весе. Крысы группы кормленых вареной биомассой мышечных клеток потеряли меньше в весе, чем животные группы кормленых вареным мясом. Крысы кормленых сырой биомассой мышечных клеток потеряли больше в весе, чем животные группы кормленых сырым мясом.
Исследование двигательной и исследовательской активности показали, что кормление биомассой мышечных клеток позволяет добиться меньшего снижения двигательной активности животных и увеличения исследовательской активности, по сравнению с кормлением мясом.
Полученные данные свидетельствуют о возможности использования биомассы миоцитов, полученных с использованием патентуемого способа, в пищевых целях. Исходя из наблюдений за животными можно говорить о диетическом эффекте пищи из предлагаемой мышечной биомассы.
Список литературы
1. Benjaminson MA, Gilchriest JA, Lorenz M. In vitro edible muscle protein production system (MPPS): stage 1, fish. Acta Astronau. 2002 Dec; 51(12):879-89.
2. Boland T, Mironov V, Gutowska A, Roth EA, Markwald RR. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 2003 Jun; 272(2):497-502.
3. Edelman P.D., McFarland D.C., Mironov V.A. and Matheny J.G., Commentary: In vitro-cultured meat production. 2005. Tissue Eng., 11: 659-662.
4. Harley C.B. Telomerase is not an oncogene. 2002. Oncogene, 21(4), 494-502.
5. Merten O.W. Safety issues of animal products used in serum-free media. 1999. Dev. Biol. Stand., 99: 167-180.
6. Mironov V, Visconti RP, Kasyanov V, Forgacs G, Drake СJ, Markwald RR: Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials 2009, 30:2164-2174.
7. Nakatani M, Takehara Y, Sugino H, Matsumoto M, Hashimoto O, Hasegawa Y, Murakami T, Uezumi A, Takeda S, Noji S, Sunada Y, Tsuchida K. Transgenic expression of a myostatin inhibitor derived from follistatin increases skeletal muscle mass and ameliorates dystrophic pathology in mdx mice. 2008. The FASEB Journal Vol.22. P.477-487.
8. Shah, G. Why do we still use serum in production of biopharmaceuticals. 1999. Dev. Biol. Stand., 99: 17-22.
9. US patent №5686091 International Class A61F 002/00 Biodegradable foams for cell transplantation/ Leong Kam W., Lo Hungnan, Kadiyala Sudhakar; The Johns Hopkins University School of Medicine, Application No. 219017 filed on 03/28/1994.
10. US patent №5863984, International Classes C08L 089/00, A61F 002/00 Biostable porous material comprising composite biopolymers/ Doillon, Charles J.,Pietrucha Krystina, Gaudreault, Rene C; Universite Laval, Cite Universitaire, Application No. 566297 filed on 12/01/1995.
11. US patent №5916265, US Classes: 424/423,623/23.72, International Class A61F 002/02 Method of producing a biological extracellular matrix for use as a cell seeding scaffold and implant/Hu Jie; Application No. 468270 filed on 06/06/1995.
12. Van Eelen, W.F., W.J. van Kooten, W. Westerhof and C. Mummery, 1999. WO/1999/031223: Industrial production of meat from in vitro cell cultures. Patent Description. http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?WO=1999031223.
13. Zandonella C. Tissue engineering: The beat goes on. 2003. Nature, 421: 884-886/
14. Н.Мануйлова E.C., Гордеева О.Ф., Гривенников И.А., Озернюк Н.Д. Эмбриональные стволовые клетки: спонтанная и направленная дифференцировка // Известия Ан. Серия биологическая. 2001. №6. С.704-710.
15. Патент №2314719 Российская Федерация, МПК7 C12N 5/06, А23L 1/31. Способ получения мясного продукта / Рогов И.А., Валихов А.Ф., Демин Н.Я., Кроха Н.Г., Лисицын А.Б., Семенов Г.В., Титов Е.И., Тутельян В.А., Рогов С.И., Эрнст Л.К.; заявитель и патентообладатель МГУПБ - заявка №2006119540, заявл. 06.06.2006; опубл.20.01.2008, Бюл. №2.
Claims (6)
1. Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов, отличающийся тем, что в качестве культивируемых клеток используют иммортализованные миобласты животного, клетки выращивают с использованием питательной среды с белками неживотного происхождения, также содержащей гемоглобин, при этом клетки поддерживают в пролиферативном состоянии с помощью факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов для образования биомассы, а затем вызывают дифференцировку миобластов в миоциты путем удаления из среды факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов, а в случае нормальных по экспрессии миостатина клеток в среду добавляют ингибитор миостатина, полученную биомассу используют в пищевых целях.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки выращивают на агарозном геле 0,01-0,5 см в толщину, в пористую структуру которого введена питательная среда.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки выращивают исключительно в жидкой питательной среде с использованием ферментера.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивируют миобласты, дефектные по миостатину.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивируют миобласты с нормальной экспрессией гена миостатина в присутствии ингибитора миостатина в качестве компонента питательной среды.
6. Способ по п.1, по которому культивируют миобласты, дефектные по рецептору к миостатину.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012109240/10A RU2506309C2 (ru) | 2012-03-11 | 2012-03-11 | Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012109240/10A RU2506309C2 (ru) | 2012-03-11 | 2012-03-11 | Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012109240A RU2012109240A (ru) | 2013-09-20 |
| RU2506309C2 true RU2506309C2 (ru) | 2014-02-10 |
Family
ID=49182875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012109240/10A RU2506309C2 (ru) | 2012-03-11 | 2012-03-11 | Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2506309C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020100143A1 (en) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Aleph Farms Ltd. | High quality cultured meat, compositions and methods for producing same |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023150293A2 (en) * | 2022-02-03 | 2023-08-10 | Steakholder Foods Ltd. | Accelerated myotube formation |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2312141C2 (ru) * | 2002-07-02 | 2007-12-10 | Институто Сиэнтифико И Текнолохико Де Наварра, С.А. | Среда для культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников и способы их применения |
| RU2329060C2 (ru) * | 2002-02-06 | 2008-07-20 | Ломанн Энимал Хелт Гмбх Унд Ко.Кг | Способ получения непрерывной клеточной линии и ее применение |
-
2012
- 2012-03-11 RU RU2012109240/10A patent/RU2506309C2/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2329060C2 (ru) * | 2002-02-06 | 2008-07-20 | Ломанн Энимал Хелт Гмбх Унд Ко.Кг | Способ получения непрерывной клеточной линии и ее применение |
| RU2312141C2 (ru) * | 2002-07-02 | 2007-12-10 | Институто Сиэнтифико И Текнолохико Де Наварра, С.А. | Среда для культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников и способы их применения |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020100143A1 (en) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Aleph Farms Ltd. | High quality cultured meat, compositions and methods for producing same |
| US12349704B2 (en) | 2018-11-15 | 2025-07-08 | Aleph Farms Ltd. | High quality cultured meat, compositions and methods for producing same |
| IL282899B1 (en) * | 2018-11-15 | 2025-08-01 | Aleph Farms Ltd | High quality cultured meat, compositions and methods for producing same |
| IL282899B2 (en) * | 2018-11-15 | 2025-12-01 | Aleph Farms Ltd | High quality cultured meat, compounds and methods for producing same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012109240A (ru) | 2013-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2909832T3 (es) | Constructos de células vivas para la producción de un producto de leche cultivada y métodos que los utilizan | |
| Bhat et al. | Prospectus of cultured meat—advancing meat alternatives | |
| US20220298480A1 (en) | Methods for improving cell growth with species-specific or genus-specific proteins and the applications thereof | |
| US20220071233A1 (en) | In vitro insect muscle as a nutrition source | |
| CN107326003A (zh) | 一种利用无血清培养液体外构建的3d模型及其构建方法 | |
| Azhar et al. | Cell-based meat: the molecular aspect | |
| Giglio et al. | A glance into the near future: cultivated meat from mammalian and insect cells | |
| RU2506309C2 (ru) | Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей | |
| US20220403310A1 (en) | Plant fat-based scaffolds for the growth of cell-based meats and methods of making such products | |
| RU2587755C1 (ru) | Способ получения действующего вещества из пантов марала | |
| Lee et al. | Investigation of scaffold manufacturing conditions for 3-dimensional culture of myogenic cell line derived from black sea bream (Acanthopagrus schlegelii) | |
| KR102894068B1 (ko) | 에스신을 이용한 오르간 및 오가노이드 배양조성물과 이를 이용한 오르간 및 오가노이드의 배양방법 | |
| US20220098546A1 (en) | Microbiota-derived postbiotics: alternative supplement to fetal bovine serum for cultured meat | |
| Bolshakov et al. | New products tissue-engineering in the treatment of spinal cord injury | |
| HK40056889A (en) | Live cell constructs for production of cultured milk product and methods using the same | |
| HK40079504A (en) | Live cell constructs for production of cultured milk product and methods using the same | |
| Pham | The Reconstruction of the Physiological Environment for Growing In-Vitro Human Salivary Organoids | |
| Cen et al. | Prospects and challenges of cell-cultured fats in food industries | |
| HK40045060A (en) | Live cell constructs for production of cultured milk product and methods using the same | |
| HK40045060B (en) | Live cell constructs for production of cultured milk product and methods using the same | |
| RU2644248C2 (ru) | Питательная среда плотная для культивирования и выращивания туляремийного микроба | |
| WO2024241315A1 (en) | Edible hydrogel microcarriers comprising cells, compositions comprising same and methods of producing and using same | |
| EP4337757A1 (en) | Plant fat-based scaffolds for the growth of cell-based meats and methods of making such products | |
| RU2493250C2 (ru) | Малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека | |
| CN116478914A (zh) | 无血清细胞培养体系及其细胞消化终止液 |