RU2312141C2 - Среда для культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников и способы их применения - Google Patents
Среда для культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2312141C2 RU2312141C2 RU2005102061/13A RU2005102061A RU2312141C2 RU 2312141 C2 RU2312141 C2 RU 2312141C2 RU 2005102061/13 A RU2005102061/13 A RU 2005102061/13A RU 2005102061 A RU2005102061 A RU 2005102061A RU 2312141 C2 RU2312141 C2 RU 2312141C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- autologous
- stem cells
- autologous human
- progenitor stem
- cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 18
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 161
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 140
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 91
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 68
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 36
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 30
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 25
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 24
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 22
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 claims description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 21
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 20
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 20
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 17
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 16
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 claims description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 claims description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 13
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 13
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 12
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000001964 muscle biopsy Methods 0.000 claims description 10
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 9
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 9
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims description 7
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims description 7
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 7
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 6
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 claims description 5
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 5
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 5
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 claims description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 5
- LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-N-(2,6-dimethylphenyl)piperidine-2-carboxamide Chemical compound CCCCN1CCCCC1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 claims description 4
- 229960003150 bupivacaine Drugs 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000049018 human NCAM1 Human genes 0.000 claims description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 4
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 claims description 3
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 claims description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 2
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 claims description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 claims 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 2
- -1 antibiotic Substances 0.000 abstract 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 37
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 22
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 21
- 230000001114 myogenic effect Effects 0.000 description 13
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 8
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 7
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 7
- 206010048858 Ischaemic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 6
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 5
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 5
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 5
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 5
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 210000001174 endocardium Anatomy 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003483 hypokinetic effect Effects 0.000 description 3
- 208000022368 idiopathic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 3
- 238000011265 2D-echocardiography Methods 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010003639 CD56 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000004652 CD56 Antigen Human genes 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000009729 Ventricular Premature Complexes Diseases 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 2
- 201000011304 dilated cardiomyopathy 1A Diseases 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000142 dyskinetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 230000010247 heart contraction Effects 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000010176 18-FDG-positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 1
- VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 6alpha-methylprednisolone Chemical compound C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)CO)CC[C@H]21 VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 0.000 description 1
- 206010001541 Akinesia Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- GNPVGFCGXDBREM-FTXFMUIASA-N Germanium-68 Chemical compound [68Ge] GNPVGFCGXDBREM-FTXFMUIASA-N 0.000 description 1
- 208000000857 Hepatic Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 108010013709 Leukocyte Common Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000017095 Leukocyte Common Antigens Human genes 0.000 description 1
- 206010027727 Mitral valve incompetence Diseases 0.000 description 1
- 101100345589 Mus musculus Mical1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000012879 PET imaging Methods 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 206010067171 Regurgitation Diseases 0.000 description 1
- YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N Rosiglitazone Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 101710151387 Serine protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 101710119665 Trypsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010047281 Ventricular arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 206010047289 Ventricular extrasystoles Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- IYIKLHRQXLHMJQ-UHFFFAOYSA-N amiodarone Chemical compound CCCCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC(I)=C(OCCN(CC)CC)C(I)=C1 IYIKLHRQXLHMJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005260 amiodarone Drugs 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012786 cultivation procedure Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000035487 diastolic blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001610 euglycemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000000910 hyperinsulinemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960004393 lidocaine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N lidocaine hydrochloride monohydrate Chemical compound O.[Cl-].CC[NH+](CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- 238000012543 microbiological analysis Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000010016 myocardial function Effects 0.000 description 1
- 230000004070 myogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000004683 skeletal myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000035488 systolic blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 208000003663 ventricular fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 206010047302 ventricular tachycardia Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
- C12N5/0659—Satellite cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
- C12N2501/91—Heparin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Аутологическая среда содержит аутологическую человеческую сыворотку, гепарин, протамин, среду с основными питательными веществами, антибиотик, противогрибковое средство и/или фактор роста фибробластов. Среда позволяет увеличить объем аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников при культивировании. Также предложены способы ее получения и применения. Изобретение может быть использовано в медицине. 10 н. и 19 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение касается, в целом, получения и очистки аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников в условиях, обеспечивающих возможность их использования в клеточной терапии. В частности, изобретение касается среды для аутологического культивирования таких клеток и ее применения в культивировании и увеличении объема упомянутых клеток, а также композиций, содержащих их.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одной из сложнейших проблем медико-биологических исследований является разработка терапевтических стратегий, позволяющих заменять или восстанавливать клетки или ткани, разрушенные или поврежденные при наиболее изнуряющих или инвалидизирующих заболеваниях, таких как нейродегенеративные заболевания (болезни Паркинсона и Альцгеймера), диабет, мышечные и сердечные заболевания, печеночная недостаточность и т.д.
Одной из наиболее многообещающих терапевтических стратегий является клеточная терапия, основанная на хорошо известном факте, что существует возможность получения клеток, более или менее недифференцированных, которые способны делиться с выработкой функциональных дифференцированных клеток и в некоторых случаях даже способны к регенерации. К ним относятся стволовые клетки и клетки-предшественники, которые далее будут вместе именоваться стволовыми клетками-предшественниками. Эти клетки могут быть обнаружены в эмбриональных и даже во взрослых тканях. Поэтому клеточная терапия заключается в трансплантации или имплантации пациенту достаточного количества стволовых клеток-предшественников для воссоздания и восстановления функциональности поврежденного органа.
Один из предложенных способов клеточной терапии основан на использовании стволовых клеток-предшественников взрослого организма, полученных от животного (ксеногенные клетки), от донора (аллогенные клетки), или от самого пациента (аутологические клетки). Использование аутологических стволовых клеток-предшественников лишено некоторых недостатков других способов клеточной терапии, таких как нехватка доноров, необходимости иммунодепрессивного лечения во избежание отторжения организмом пациента, а также этических проблем, связанных с использованием эмбриональных клеток.
Тем не менее, чтобы осуществление клеточной терапии стало возможным, необходимы дополнительные знания о том, какие клетки являются пригодными в каждом конкретном случае и как их идентифицировать, а, кроме того, необходима разработка методик правильной обработки стволовых клеток-предшественников, обеспечивающей их пригодность для клинического использования.
Аутологическая клеточная кардиомиопластика (СМР) представляет собой конкретный пример клеточной терапии для лечения сердечных заболеваний (ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность и т.д.). Общее доработанное описание можно найти в Curr. Control. Trials Cardiovasc. Med. 2001; 2:208-210 (D.A.Taylor). Методики и композиции для выделения, культивирования, увеличения объема и использования различных стволовых клеток-предшественников, пригодных для СМР, можно найти в US 5130141, WO/0107568, WO/0194555, WO 79854301, US 2001/0038837 и US 5543318.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение касается, в целом, получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, пригодных для использования в клеточной терапии, и, в частности, создания доступной методики правильной обработки стволовых клеток-предшественников, обеспечивающей их пригодность для клинического применения, включая специфические способы их получения, культивирования, очистки и увеличения объема.
Предлагаемое в данном изобретении решение основано на том обнаруженном авторами факте, что применение аутологической среды культивирования, включающей аутологическую человеческую сыворотку и питательные вещества, вместе с антикоагулянтом, обеспечивает возможность культивирования in vitro, очистки и увеличения объема аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, которые могут быть использованы в изготовлении фармацевтических композиций для лечения различных патологий посредством клеточной терапии.
Изобретение описано на примере получения аутологической среды культивирования, содержащей питательные вещества, аутологическую человеческую сыворотку, гепарин и протамин, и ее использования в культивировании in vitro, очистке и увеличении объема аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, пригодных для изготовления соответствующих фармацевтических композиций для лечения ишемических кардиомиопатий и идиопатических кардиомиопатий посредством аутологической клеточной СМР.
Один из аспектов данного изобретения относится к среде культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, содержащей аутологическую человеческую сыворотку и питательные вещества, вместе с антикоагулянтом и средством реверсирования антикоагуляции.
В соответствии с другим аспектом, изобретение касается способа приготовления упомянутой среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников. В одном из вариантов осуществления аутологическую человеческую сыворотку, присутствующую в такой среде культивирования, получают путем плазмофереза.
В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к использованию упомянутой среды культивирования in vitro, очистки и увеличения объема аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.
В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к способу получения композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, включающему инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников в упомянутой культуре и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.
В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к способу получения композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, пригодных для использования в клеточной терапии, который включает инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в упомянутой культуре и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных.
В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к композиции, обогащенной аутологическими человеческими стволовыми клетками-предшественниками мышечных.
В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие мышечные стволовые клетки-предшественники, вместе с одним или более наполнителями, приемлемыми с фармацевтической точки зрения.
В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к терапевтическому способу аутологической клеточной СМР для образования, регенерации и восстановления дисфункциональной ткани миокарда путем имплантации фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, регенераторы сердечной ткани, выращенные ex vivo в аутологической среде культивирования.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 представляет собой столбцовую диаграмму, отображающую оценку функции левого желудочка путем анализа фракции выброса левого желудочка (LVEF), рассчитанной по двумерной эхокардиограмме (2D) и на основе автоматического определения границы между кровью и эндокардом (ABD): до хирургической операции (базовая величина), во время последующих контрольных наблюдений через 40 дней после клеточной трансплантации (40 дней) и во время последующих контрольных наблюдений в течение 3 месяцев (3 месяца).
Фиг.2 показывает оценку перфузии путем РЕТ-томографии с использованием 13N-аммония и РЕТ-оценку метаболизма глюкозы 18F-FDG (фтордиокси-D-глюкозы): до хирургической операции (базовая величина) и во время контрольного наблюдения (КН) через 3 месяца после клеточной трансплантации (КН 3 месяца). Фиг.2А: Снимки, принадлежащие пациенту №5, являющемуся типичным примером пациента, получившего клеточную трансплантацию. Фиг.2В: Снимки, соответствующие сердцу пациента №9, не получившего клеточной трансплантации (из-за заражения культуры миогенных клеток скелетной мышцы). Стрелки показывают ткань в области инфаркта, до и после операции.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Аутологическая среда культивирования
В первом аспекте данное изобретение относится к аутологической среде культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, называемой здесь далее "аутологической средой культивирования по изобретению", которая содержит:
а) от 0,1% до 90 вес.% аутологической человеческой сыворотки;
b) от 0,1% до 10000 МЕ/мл гепарина;
c) от 0,1% до 10000 МЕ/мл протамина; и
d) среду культивирования с основными питательными веществами, включая или не включая глутамин, в количестве, необходимом до 100 вес.%.
Аутологическая среда культивирования по изобретению представляет собой полную среду культивирования, полученную из аутологической человеческой сыворотки, взятой у того пациента, который является объектом последующей имплантации аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников. Аутологическая человеческая сыворотка, если это желательно, может быть подвергнута обычной обработке, например тепловой обработке, с целью инактивации комплемента.
Аутологическая человеческая сыворотка может быть взята у того пациента, который является объектом последующей имплантации аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, при помощи любой общепринятой методики, например из образцов крови пациента или, предпочтительно, путем проведения плазмофереза у упомянутого пациента. В одном из вариантов осуществления изобретения, плазмоферез проводят с использованием гепарина в качестве антикоагулянта и протамина сульфата для реверсирования антикоагуляции. Хорошо известно, что плазмоферез обычно проводят с использованием ACD (антикоагулирующий раствор "кислота-цитрат-декстроза") [например, на 1 литр воды добавляют моногидрат лимонной кислоты (8 г), цитрат (22 г) и моногидрат глюкозы (24,5 г) в качестве антикоагулянта]. Этот антикоагулянт высвобождает кальциевый хелатор, поэтому для реверсирования эффекта ACD и получения сыворотки необходимо добавить кальций, который впоследствии причиняет вред клеточной культуре. Плазмоферез позволяет получить весьма существенное количество сыворотки, превосходящее количество сыворотки, полученной из образцов крови пациента, так как при плазмоферезе не происходит потери крови у пациента, что является для него важным преимуществом. Кроме того, использование сыворотки, полученной из плазмофереза с использованием гепарина и протамина, дает возможность ее использования в среде культивирования без последующих проблем в клеточной культуре.
Аутологическая среда культивирования по изобретению содержит основные питательные вещества и, возможно, глутамин. Существуют доступные серийно выпускаемые среды, которые содержат основные питательные вещества для клеточной культуры. В принципе, любая среда, предоставляющая необходимые питательные вещества для культивирования клеток, может быть использована в данном изобретении. В одном из вариантов осуществления питательные вещества предоставляются средой НАМ F12 [GIBCO BRL].
В одном из вариантов осуществления аутологическая среда культивирования по изобретению дополнительно содержит антибиотик. Практически любой антибиотик может быть использован в данном изобретении. В одном из вариантов осуществления аутологическая среда культивирования по изобретению включает антибиотик, выбранный из пенициллина, стрептомицина, гентамицина и их смесей. Подобным образом, аутологическая среда культивирования по изобретению может также содержать, если это желательно, противогрибковое средство, например, амфотерицин В и/или фактор роста, например фактор роста фибробластов, такой как нативный или рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF).
В одном из вариантов осуществления аутологическая среда культивирования по изобретению содержит:
89 вес.% среды НАМ F12;
10% аутологической человеческой сыворотки пациента;
гепарин 0,1-10000 МЕ/мл;
протамин 0,1-10000 МЕ/мл; и
1% пенициллина/стрептомицина и, возможно,
0,25 мг/мл амфотерицина В и/или
0,1-250 пг/мл рекомбинантного bFGF.
2. Способ приготовления аутологической среды культивирования по изобретению
В другом аспекте изобретение относится к способу приготовления среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по данному изобретению, который включает смешивание и гомогенизацию различных ее компонентов.
Предпочтительно, упомянутую аутологическую человеческую сыворотку получают плазмоферезом, как описано выше, с использованием гепарина в качестве антикоагулянта для получения плазмы и протамина для реверсирования антикоагуляции и получения сыворотки. Таким образом, полученная аутологическая человеческая сыворотка уже содержит гепарин и протамин.
3. Применение аутологической среды культивирования по изобретению
В следующем аспекте изобретение относится к использованию аутологической среды культивирования по изобретению для культивирования in vitro, очистки и увеличения объема аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.
Использование аутологической человеческой сыворотки в среде культивирования для выращивания аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников создает множество преимуществ, например выращивание клеток может осуществляться в любой точке земного шара без риска заражения прионами, вирусами и болезнями, передаваемыми от животного человеку, что присуще традиционным способам культивирования клеток с использованием эмбриональной телячьей сыворотки для выращивания клеток. Использование аутологической человеческой сыворотки в культурах человеческих клеток вместо телячьей сыворотки создает большие преимущества, так как (i) позволяет избежать реакции "антиген-антитело", (ii) позволяет избежать воспалительных реакций, вызываемых гетерологическими белками; и (iii) позволяет избежать разрушения клеток в результате многократных промывок, обязательных для клеток, культивируемых в телячьей сыворотке, перед их введением в человеческий организм. Фактически, имеющийся клинический опыт аутологической клеточной СМР показывает наличие злокачественной желудочковой экстрасистолии у пациентов через 2 недели после терапии клетками, культивированными в телячьей сыворотке; в 40% случаев это осложнение требует применения имплантируемых дефибрилляторов.
4. Способ получения композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников
В следующем аспекте изобретение относится к способу получения композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, включающему инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников в аутологической среде культивирования по изобретению и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.
Практически любая аутологическая человеческая стволовая клетка-предшественник может быть подвергнута культивированию и развитию в аутологической среде культивирования по изобретению, при условии адаптации в каждом случае условий среды и культивирования к конкретному клеточному типу. Однако в одном из вариантов осуществления, который будет описан более подробно в следующем разделе, такие аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники представляют собой аутологические человеческие стволовые клетки - предшественники мышечных.
Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники могут быть получены путем биопсии у соответствующего пациента, являющегося объектом последующей имплантации таких аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.
Инкубацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников в аутологической среде культивирования по изобретению проводят в условиях, обеспечивающих возможность роста и деления клеток.
Очистка полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников может быть проведена любым традиционным способом. В частности, очистка упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников включает иммуноочистку путем использования специфических и селективных антител к таким аутологическим человеческим стволовым клеткам-предшественникам, что дает возможность идентификации упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников на основе характерных внеклеточных антигенов. Предпочтительно, упомянутые специфические и селективные антитела к таким аутологическим человеческим стволовым клеткам-предшественникам соединяют с магнитными микросферами для очистки и обогащения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников при помощи магнитного клеточного сепаратора.
Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники, полученные описанным выше способом, могут быть введены в состав фармацевтических композиций и могут быть использованы в генной терапии.
5. Способ получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных
Как указано выше, в отдельном и предпочтительном варианте осуществления данного изобретения аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники представляют собой аутологические человеческие стволовые клетки, являющиеся предшественниками мышечных или миогенных клеток.
Поэтому в следующем аспекте изобретение относится к способу получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, пригодных для использования в клеточной терапии, который включает инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в упомянутой среде культивирования и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных.
Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных могут быть получены путем биопсии у соответствующего пациента, являющегося объектом последующей имплантации таких аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, в частности биопсии скелетных мышц.
Предшествующими исследованиями установлено, что введение пациенту перед осуществлением биопсии, в области биопсии, фармацевтической композиции, включающей фармацевтический препарат, стимулирующий пролиферацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, обеспечивает возможность увеличения количества упомянутых клеток при инициации культуры. В частности, такая предварительная обработка осуществляется путем внутримышечного введения пациенту перед проведением биопсии скелетных мышц, обычно в течение периода от 2 дней до 15 минут перед осуществлением биопсии, в области проведения биопсии, фармацевтической композиции, включающей упомянутый фармацевтический препарат, стимулирующий клеточную пролиферацию. В частности, упомянутый фармацевтический препарат представляет собой местный анальгетик, такой как лидокаин или бупивакаин, стимулирующий пролиферацию миобластов, что впоследствии обеспечивает более высокую эффективность культивирования клеток.
Путем биопсии скелетных мышц извлекают образец мышечной ткани, который подвергают обычной обработке для расщепления мышечных волокон, как описано ниже. Полученную клеточную суспензию культивируют в аутологической среде культивирования по изобретению. Вообще говоря, образец, извлеченный путем мышечной биопсии, содержит различные типы тканей, например адипоциты, фибробласты, предшественники мезенхимы, гемопоэтические клетки, мышечные волокна, васкулярную ткань (эндотелий, гладкие мышцы) и, безусловно, миобласты и клетки-сателлиты. Обычно исходное содержание аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в образце скелетной мышцы, извлеченном путем биопсии, которые имеют фенотип, определяемый как CD56+/CD45-, составляет менее 10%. Подобным образом присутствует также небольшая доля стволовых клеток (клеток-сателлитов), трудно поддающихся идентификации, которые воспроизводят сами себя и дифференцируются в клетки, которые экспрессируют антиген CD56 и могут быть предшественниками мышечных клеток. Как известно, процесс дифференциации этого клеточного типа включает этап развития клетки-сателлита в миобласт, затем в незрелый миоцит, позднее в зрелый миоцит, и наконец, в мышечное волокно. Предшественниками мышечных клеток могут быть миобласты и миоциты (зрелые и незрелые), которые могут быть идентифицированы на основе присутствия антигена CD56, интрацитоплазматической экспрессии десмина и отсутствия антигена CD45 (то есть, они показывают фенотип СВ56+/десмин+/СD45-). Во время культивирования клеток происходит пролиферация клеток-сателлитов и миобластов, которые к этому времени превращаются в миоциты. Таким образом, после инкубации и развития клеток в среде культивирования накапливаются миобласты и миоциты (зрелые и незрелые), используемые в изготовлении фармацевтической композиции для инъекции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных пациенту, которые, после инъекции завершают процесс дифференциации в организме пациента, превращаясь в мышечные волокна или миоволокна и развивая свою функцию.
Инкубацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в аутологической среде культивирования по изобретению осуществляют в условиях, обеспечивающих возможность развития клеток (роста и деления).
Очистка полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных может быть проведена любым традиционным способом. В частности, очистка упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников включает иммуноочистку путем использования специфических и селективных антител к таким аутологическим человеческим стволовым клеткам-предшественникам, что дает возможность идентификации упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников на основе характерных внеклеточных антигенов, например антител к человеческому CD56 (CD56 представляет собой внеклеточный антиген, характерный для скелетных мышц) в отсутствие специфического антигена гемапоэтической клетки CD45 (т.е. отбираются клетки, показывающие фенотип CD56+/CD45-).
Предпочтительно, упомянутые антитела соединяют с магнитными микросферами для очистки и обогащения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных при помощи магнитного клеточного сепаратора. В другом варианте осуществления клеточную культуру подвергают стадии предварительного посева с целью осаждения фибробластов перед проведением идентификации и выделения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных. В этом случае очистка аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных включает стадию предварительного посева клеточной культуры с целью осаждения всех или части фибробластов, присутствующих в упомянутой клеточной культуре, и затем идентификацию и выделение аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных путем использования антител к человеческому CD56, соединенных обычным способом с магнитными микросферами, и селекцию клеток, показывающих фенотип CD56+/CD45-.
Композиция, включающая аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, полученные вышеупомянутым способом, представляет собой дополнительный аспект данного изобретения.
В альтернативе, изобретение относится к способу получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, начиная с тканевой биопсии скелетных мышц, для приготовления фармацевтической композиции, который включает:
a) проведение биопсии у пациента, являющегося объектом последующей имплантации аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, для извлечения фрагмента ткани скелетных мышц, содержащего аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных;
b) культивирование упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных из скелетных мышц в аутологической среде культивирования по изобретению в условиях, обеспечивающих возможность развития упомянутой культуры аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных;
c) очистку упомянутых культивированных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных; и
d) сбор упомянутых очищенных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных; и, возможно,
e) замораживание упомянутых очищенных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных до изготовления такой фармацевтической композиции.
Как указано выше, местное введение пациенту, в течение периода от 2 дней до 15 минут перед осуществлением биопсии, в области проведения биопсии, лидокаина или бупивакаина стимулирует пролиферацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных и позволяет увеличить количество таких клеток при инициации культуры.
Культивирование упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных из скелетных мышц в аутологической среде культивирования по изобретению в условиях, обеспечивающих возможность развития упомянутой культуры аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, включает проведение ряда предварительных обычных процедур обработки, например промывки, удаления жировой ткани, разделения мышц, ферментативного расщепления, фильтрации и сбора клеток, например, путем осаждения. Как правило, после ферментативного расщепления мышечных волокон образуется клеточная суспензия, содержащая большое количество клеточных обломков. После стадий культивирования обломки клеток и волокон удаляют и обогащают суспензию стволовыми клетками-предшественниками мышечных.
Очистку культивированных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных проводят, кроме всего прочего, для получения композиций, обогащенных аутологическими человеческими стволовыми клетками-предшественниками мышечных, которые, по существу, не содержат фибробластов. С этой целью клеточная культура может быть подвергнута первой стадии предварительного посева, в результате которой фибробласты осаждаются быстрее, чем миобласты или клетки-сателлиты, и последующему процессу идентификации и выделения упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных любым общепринятым способом, например путем использования специфических и селективных антител к таким клеткам, что дает возможность идентификации на основе внеклеточных антигенов упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, показывающих фенотип CD56+/CD45-, при помощи антител, которые специфически узнают такие аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, соединенных обычным способом с магнитными микросферами.
В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, вместе с, по меньшей мере, одним наполнителем, приемлемым с фармацевтической точки зрения. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция пригодна для парентерального введения. В принципе, любой наполнитель, приемлемый с фармацевтической точки зрения и способный доставлять аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, может быть использован в данном изобретении. В одном из вариантов такая фармацевтическая композиция включает альбумин, используемый в качестве наполнителя для поддержания аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в виде суспензии.
В данном изобретении выражение "фармацевтическая композиция" относится к композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, подготовленной для терапевтического применения в клеточном имплантате, содержащей, по меньшей мере, 20 миллионов клеток, при плотности клеток, по меньшей мере, 50 миллионов клеток/мл и, по меньшей мере, 40% аутологических стволовых клеток-предшественников CD56+/CD45-, аутологическую среду культивирования по изобретению и, по меньшей мере, один наполнитель, приемлемый с фармацевтической точки зрения. В одном из вариантов осуществления, такая фармацевтическая композиция содержит от 20 до 200 миллионов клеток при плотности клеток от 50 до 70 миллионов клеток/мл, и, по меньшей мере, 70% аутологических стволовых клеток-предшественников CD56+/CD45-, аутологическую среду культивирования по изобретению и человеческий альбумин в количестве от 0,1% до 20 вес.% от общего веса.
Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, полученные способом, описанным выше, а также содержащие их фармацевтические композиции могут быть использованы в приготовлении фармацевтической композиции:
для восстановления и/или воссоздания ткани сердечной мышцы, и/или
для лечения постишемической сердечной недостаточности, и/или
для лечения дилатационной кардиомиопатии и/или
для лечения неишемической кардиомиопатии.
6. Терапевтическая методика
Согласно следующему аспекту данное изобретение относится к терапевтической методике проведения аутологической клеточной СМР для образования, регенерации и восстановления дисфункциональной ткани миокарда путем имплантации фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, способные регенерировать сердечную ткань, выращенные и поддерживаемые ex vivo в аутологической среде культивирования; при этом упомянутая методика включает отбор образца материала у пациента, являющегося объектом последующей имплантации, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, увеличение количества таких клеток путем культивирования в аутологической среде культивирования по данному изобретению и имплантацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, отобранных у пациента, у которого предварительно был извлечен упомянутый материал, содержащий аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных.
В частности, изобретение относится к терапевтической методике проведения аутологической клеточной СМР для образования, регенерации и восстановления дисфункциональной ткани миокарда путем имплантации фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, регенераторы сердечной ткани, поддерживаемые ех vivo после выращивания в аутологической среде культивирования; при этом упомянутая методика включает следующие этапы:
а) биопсия скелетной мышцы у пациента, предпочтительно, с предварительной обработкой путем внутримышечной инъекции местного анестетика, такого как лидокаин или бупивакаин;
b) приготовление среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников на основе аутологической сыворотки пациента;
c) изготовление композиции, обогащенной аутологическими человеческими стволовыми клетками-предшественниками мышечных на основе биопсии а) и среды культивирования b);
d) изготовление фармацевтической композиции на основе композиции с); и
e) имплантация фармацевтической композиции аутологических стволовых клеток-предшественников d) в пораженные участки миокарда.
Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных включают миобласты и миоциты (зрелые и незрелые) и обладают способностью восстанавливать сердечную ткань при их имплантации в сердечную мышцу.
В данном описании выражение "пораженные участки миокарда" относится как к ишемической, так и к идиопатической кардиомиопатиям. В частном варианте осуществления методика проведения аутологической клеточной СМР по изобретению применяется для пациентов с ишемической кардиомиопатией вследствие инфаркта миокарда, для которых невозможна хирургическая или подкожная реваскуляризация, а также для пациентов с альтернативной сердечной реваскуляризацией. Цель такой аутологической клеточной СМР - ограничение развития инфаркта, реконструкция сердечной ткани и регенерация миокарда. Определение пациентов с ишемической кардиомиопатией включает пациентов с инфарктом правого или левого желудочков, причем в последнем случае - с возможностью ишемической регургитации митрального клапана. В другом варианте осуществления методику аутологической клеточной СМР по изобретению применяют для пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией.
Преимущества клеточной СМР включают снижение фиброза, уменьшение рубцовой области инфаркта и улучшение эластичности и свойств стенки желудочка (что существенно для восстановления диастолической функции).
В одном из вариантов осуществления имплантацию фармацевтической композиции аутологических стволовых клеток-предшественников d) в пораженные участки миокарда выполняют путем прямой инъекции. Выражение "имплантация путем прямой инъекции" в данном изобретении означает эпикардиальное или эндоваскулярное введение фармацевтической композиции по изобретению пациентам с ишемической или идиопатической кардиомиопатиями. В одном из вариантов осуществления ее выполняют путем эпикардиального или эндоваскулярного введения фармацевтической композиции по изобретению пациентам с ишемической кардиомиопатией, с распределением следующим образом: около 70% - в периферическую область инфарктного рубца и 30% - примерно в центральную часть рубца. Эпикардиальное введение может быть выполнено при помощи обычного хирургического обнажения или путем торакоскопии. При хирургическом подходе (классическом или миниторако/стернотомии) ишемическую область обнажают в достаточной мере для возможности проведения инъекций терапевтической композиции в область инфаркта и, главным образом, в окружающие области. Инъекция фармацевтической композиции, содержащей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных по данному изобретению, также может быть сделана в периферическую область поражения. При таком распределении имплантации по изобретению достигают максимального выживания имплантированных клеток в периферической области за счет остаточного орошения и существующей коллатеральной реваскуляризации миокарда и, в некоторой степени, избегают высокой смертности клеток, наблюдаемой в имплантатах, введенных в высокофиброзную ткань ишемического рубца.
В другом варианте осуществления имплантат фармацевтической композиции аутологических стволовых клеток-предшественников d) в пораженные участки миокарда осуществляют путем системного или интракоронарного введения через подкожный венозный доступ.
В следующем варианте осуществления методику аутологической клеточной СМР по изобретению применяют для пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией путем осуществления нескольких имплантаций фармацевтической композиции по изобретению между коронарными артериями в миокарде обоих желудочков.
Сегодня мы располагаем новыми компьютеризованными системами для хирургии сердца. Увеличивается количество роботизированных операций по коронарному шунтированию путем торакального доступа, так как они обеспечивают возможность быстрого и безопасного излечения пациента при сниженном риске инфекции и отличном косметическом результате. В одном из вариантов осуществления при помощи видеоконтролируемого манипулятора в миокард вводят иглу, снаружи торакса размещают шприц и соединяют его с иглой при помощи пневмокамеры малого размера. Преимущество такого подхода при лечении пациентов с сердечной недостаточностью заключается в том, что терапевтическая методика аутологической клеточной СМР может выполняться безопасно, без манипуляций с сердцем, что устраняет риск гемодинамических изменений и фибрилляции желудочков.
Благоприятный эффект клеточной СМР может быть ограничен коэффициентом смертности инъецируемых клеток. Для решения этой проблемы в данном изобретении предлагается осуществление периодических инъекций при помощи методик подкожной или хирургической имплантации аутологических стволовых клеток-предшественников по изобретению. Такой подход будет способствовать достижению цели СМР за счет постепенного уменьшения поврежденных областей инфаркта или восстановления патологического миокарда. С этой целью изобретение включает создание специализированного банка аутологических стволовых клеток-предшественников каждого пациента, полученных из выделенных и замороженных клеток во время процедуры культивирования, проведенной для каждого пациента. Из сохраненных в банке аутологических стволовых клеток-предшественников могут быть выращены новые клеточные культуры для изготовления новых композиций, без проведения новой биопсии или извлечения ткани.
Следующие примеры приведены для иллюстрации изобретения и должны рассматриваться лишь как неограничивающие примеры.
Пример 1
В данном примере описаны получение и обработка аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных для использования в аутологических клеточной СМР с целью восстановления поврежденной дисфункциональной ткани миокарда в живой тканевой структуре, способной производить систолическое и диастолическое давление.
1.1 Биопсия скелетных мышц
За день до проведения хирургической биопсии пациенту вводят путем внутримышечной инъекции 2%-ный раствор лидокаина в переднелатеральную часть группы мышц бедра и окружающие ткани. Биопсию проводят путем 5 см разреза в переднелатеральной части группы мышц бедра и извлечения в стерильных условиях фрагмента 2-3 см3 скелетной мышцы (15 г). Извлеченную мышечную ткань сразу же разрезают на кусочки ножницами, помещают в полную среду культивирования или в раствор фосфатного буфера (PBS) и выдерживают при 4°С. Процедуру выделения и очистки клеток и их культивирование необходимо начинать как можно скорее, чтобы гарантировать выживание клеток. Образцы отправляют в лабораторию биологии клетки в подходящем контейнере и при низкой температуре.
1.2 Приготовление аутологической среды культивирования
Из образцов крови
В службе переливания крови у пациента отбирают венозную кровь. Путем венопункции наполняют 50 10-мл пробирок для сбора сыворотки. После осаждения клеток и выпадения фибрина, в условиях камеры ламинарного потока, сыворотку экстрагируют из каждой пробирки и собирают в пустой баллон для крови. Отбирают образцы сыворотки для гематологических и микробиологических исследований (на бактерии и вирусы). Баллон с сывороткой замораживают при -80°С до получения результатов гематологических и микробиологических исследований.
Перед приготовлением среды культивирования подвергают тепловой инактивации комплемент сыворотки при 56°С в течение 1 часа и после этого производят фильтрацию. Часть сыворотки объединяют со средой культивирования и выдерживают при 4°С, затем нагревают до 37°С и фильтруют перед введением клеточной культуры. Конечная среда культивирования содержит 10% аутологической человеческой сыворотки пациента, 89% среды HAM-F12 (GIBCO-BRL, Cat. No.21765), 1% пенициллина/стрептомицина, гепарин (2 МЕ/мл собранной сыворотки), протамин (в виде сульфата), (3 МЕ/мл собранной сыворотки) и, возможно, амфотерицин В (0,25 мг/мл) и/или 0,1-250 пг/мл рекомбинантного bFGF.
Остальную человеческую сыворотку замораживают при -40°С до приготовления новой среды культивирования. В каждом препарате среды культивирования комплемент снова инактивируют при 56°С в течение 1 часа с последующей фильтрацией.
Из плазмофереза
Сразу после осуществления плазмофереза пациенту вводят дозу 50 МЕ/кг нефракционированного гепарина натрия. Процедуру плазмофереза проводят в соответствии со стандартной методикой, применяемой для данного оборудования. Во время плазмофереза стандартный антикоагулянт заменяют физиологическим раствором 0,9% хлорида натрия с гепарином в качестве антикоагулянта. Плазму заменяют альбумином с концентрацией 5%. Процедуру завершают сразу после получения объема плазмы, необходимого для приготовления аутологической среды культивирования. Количество гепарина в собранной плазме рассчитывают в соответствии с объемом плазмы пациента и добавляют 1,5 МЕ протамина на каждую ME гепарина. Плазма находится в таком виде до коагуляции. Затем сыворотку выделяют, распределяют в виде небольших аликвот и замораживают. Так же как и для сыворотки, полученной из образцов крови, в этом случае образцы сыворотки также подвергают гематологическому и микробиологическому анализу перед использованием.
1.3 Выделение клеток-сателлитов и выращивание in vitro
Все виды обработки проводят в асептических условиях и с использованием камеры с ламинарным потоком. Фрагменты извлеченной скелетной мышцы промывают в PBS. Жировую ткань удаляют ножницами и осторожно разделяют мышечные волокна. Фрагменты мышцы снова промывают в PBS, пока надосадочный слой не станет визуально чистым. Ткань центрифугируют 5 минут при 100 g. Затем ткань расщепляют путем двух последовательных ферментативных обработок: сначала клетки инкубируют в коллагеназе IA (1,5 мл/мг/г ткани) в течение 1 часа. Каждые 10 минут пробирки взбалтывают для механического содействия расщеплению. Либо пробирки помещают в инкубатор с возвратно-поступательным/орбитальным взбалтыванием (ROSI) при 37°С. Затем клетки инкубируют в течение 20 минут с 0,25 трипсина 1 Х EDTA (2 мл). Сразу после этого клетки промывают (10 минут при 300 g) и для прекращения ферментативной реакции добавляют 1 мл соответствующей сыворотки пациента, полученной ранее. Проводят фильтрацию через сетку с ячейкой 40 мкм (нейлоновый клеточный фильтр). Для фрагментов, которые могли остаться в сетке, процедуру расщепления повторяют снова. Наконец, клетки, полученные после фильтрации, собирают путем осаждения (20 минут при 300 g), а супернатант выбрасывают.
Клетки пересуспендируют в свежей полной среде культивирования: 10% аутологической человеческой сыворотки пациента, 89% среды HAM-F12 (GIBCO-BRL, Cat. No.21765), 1% пенициллина/стрептомицина и, возможно, амфотерицин В (0,25 мг/мл), дополнительно содержащей гепарин (2 МЕ/мл собранной сыворотки) и протамин (в виде сульфата) (3 МЕ/мл собранной сыворотки), и высевают в колбы для клеточной культуры. Затем колбы инкубируют в течение 3 недель при 37°С при влажности 5%. Колбы помещают в инкубатор без наклона во избежание неправильной пролиферации клеток. После 2-3 дней инкубации инкубацию возобновляют в среде для удаления кровяных клеток и мертвых клеток. После выращивания клеток до субконфлюэнции (50% смыкания монослоя) осуществляют один этап культивирования (фракция 1:5) во избежание появления миогенной дифференциации при высоких плотностях. Понадобится проведение нескольких этапов 50%-х конфлюэнций для предотвращения дифференциации моноядерных клеток в многоядерные мышечные трубочки.
На каждом этапе культивирования клетки собирают путем трипсинизации (2 мл 2,5 трипсина/этилендиаминтетрауксусная кислота в каждой колбе в течение 1-5 минут в инкубаторе). Полное отделение клеток проверяют путем наблюдения в микроскопе плавающих клеток. Затем реакцию прекращают путем добавления полной среды культивирования и суспензию полученных клеток распределяют в 5 новых колб. На каждом этапе культивирования клеток проводят исследование на бактерии (анализ на аэробные и анаэробные бактерии), вирусы и грибы.
1.4 Удаление фибробластов
Как правило, культуры загрязнены фибробластами, поэтому для их удаления необходимо добиться соответствующего увеличения объема миобластов. При проведении первого пассажа и после нейтрализации трипсином культивируемые клетки выдерживают в инкубаторе в течение 30 минут. Этого времени достаточно для осаждения фибробластов, в то время как большинство миобластов (более мелких) остаются в суспензии. Клеточный супернатант собирают и переносят в новые колбы для культивирования. Степень чистоты миобластов измеряют проточным цитометром с человеческим антителом к CD56 и окраской на десмин. Образцы со степенью чистоты миобластов менее 50% подвергают процедуре клеточного обогащения. С этой целью на второй стадии, после сбора клеток и перед их посевом, их обрабатывают мышиным антителом анти-CD56 (человека), соединенным с магнитными микросферами. Путем положительной селекции при помощи магнитного сепаратора клеток получают клеточные популяции, обогащенные в высокой степени миобластами, предшественниками мышечных клеток, более чем в 90% которых экспрессируется CD56 и десмин.
Обычно для получения необходимого количества клеток необходимо провести несколько пассажей. Как правило, примерно к концу 3 недели получают более 200 миллионов клеток. Это количество может быть увеличено пассажами в многоцепьевой системе культивирования.
1.5 Выделение клеток для специализированного банка
Во время культивирования клеток для каждого пациента может быть выделено некоторое количество клеток, которые могут быть заморожены. Из этих сохраненных клеток могут быть выращены новые клеточные культуры для осуществления периодических повторных интрамиокардиальных инъекций (что позволит избежать повторения процедур биопсии). Во время второго пассажа некоторые образцы обогащенных клеток, положительных на CD56, подвергают криоконсервации с использованием 5% диметилсульфоксида (DMSO), при условии запрограммированного замораживания и, наконец, хранят в жидком азоте. Концентрация клеток должна составлять 25-50 миллионов клеток на 1 мл. В случае необходимости клетки размораживают и культивируют в среде для миобластов для последующего использования (подкожной имплантации) после выращивания ex vivo.
1.6 Инъекционная среда
В день клеточной имплантации клетки собирают и промывают в инъекционной среде (человеческий альбумин 0,5% и полная среда культивирования) и сохраняют до имплантации на льду. Проточным цитометром измеряют конечную степень чистоты миобластов. С использованием цитометра Malassez (путем окрашивания трипановым синим) определяют концентрацию и жизнеспособность клеток. Кроме того, перед имплантацией оценивают стерильность клеточной культуры (грам-тест).
1.7 Методика культивирования клеток
Имплантация клеток может быть выполнена путем эпикардиального или эндоваскулярного введения. Эпикардиальное введение может быть выполнено путем хирургического вмешательства или путем торакоскопии. При хирургическом вмешательстве (классическом или миниторако/стернотомии) ишемическую область обнажают в достаточной мере для возможности осуществления около 10 инъекций клеточной суспензии в области инфаркта и, главным образом, в окружающую область. Для этой цели используют изогнутую иглу калибра 23-26G×4 см. Рекомендуемая плотность клеток составляет 50-70 миллионов клеток/мл. Инъекцию выполняют медленно, около 15 минут. После каждой инъекции отверстия иглы должны быть заблокированы путем надавливания (1-2 минуты) во избежание регургитации клеточной суспензии.
Протокол имплантации миобластов:
- имплантат, по меньшей мере, 20 миллионов клеток, предпочтительно ~200 миллионов клеток;
- плотность клеток: 50-70 миллионов клеток на 1 мл;
- время культивирования: ~21 день;
- концентрация миобластов: выше 70%;
- средняя продолжительность жизни клеток при 2-8°С: 96 часов.
Пример 2
В данном примере описаны клинические испытания фазы I/II, проводимые для оценки пригодности и безопасности интрамиокардиальной трансплантации композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных по изобретению пациентам, перенесшим инфаркт миокарда.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ
2.1 Отбор пациентов
В исследовании участвовали 12 пациентов, которые ранее перенесли инфаркт миокарда, по меньшей мере, за 4 недели до их включения в протокол, и таких, которые ожидали аортокоронарного шунтирования. При отборе пациентов в расчет принимали возраст (приемлемый - в диапазоне 30-80 лет), сердечную функцию (фракции выброса левого желудочка выше 25%) и отсутствие злокачественной аритмии или анамнеза мышечной дистрофии, а также отсутствие положительного результата в тестах на печеночную или почечную дисфункцию, беременность, ВИЧ или гепатит.
2.2 Мышечная биопсия, культивирование и идентификация аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных
Получение аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных для терапевтической композиции осуществляли по описанию в Примере 1.
Мышечную биопсию выполняли в переднелатеральной части группы мышц бедра в стерильных условиях и после предварительной обработки лидокаина гидрохлоридом. Во время операции использовали аутологическую среду культивирования клеток человека по изобретению, содержащую 79% среды НАМ F12 (GIBCO-BRL). Аутологическую сыворотку пациента получали путем плазмофереза, как описано в пункте 1.2 предыдущего примера, который проводили за день до проведения мышечной биопсии (от 800 до 2135 мл на пациента, в среднем 1735 мл).
Для выделения клеток-сателлитов проводили ферментативное расщепление путем инкубации с трипсином/EDTA (0,5 мг/мл и 0,53 мл EDTA, GIBCO-BRL) и затем с коллагеназой (0,5 мг/мл GIBCO-BRL). Методика выращивания клеток и удаления фибробластов описана в предыдущем примере. Степень чистоты миобластов в собранных клетках измеряли проточным цитометром и окраской по специфическим моноклональным антителам к человеческому N-CAM (CD56), CD45 и десмину.
Среднее число миогенных клеток, полученных на 1 пациента, составляло 221×106 (всегда в диапазоне 105-390×106), а средняя степень чистоты миогенных клеток CD56+/CD45 составляла 65,6±6,4%.
2.3 Трансплантация клеток
Перед хирургической операцией у каждого пациента определяли функцию и жизнеспособность сердечной мышцы путем позитронной эмиссионной томографии (PET), эхокардиограммы и электрокардиограммы (Holter EGC 24 часа). Аортокоронарное шунтирование с экстракорпоральным кровообращением проводили через 3-4 недели после проведения мышечной биопсии. Пациенты получили в среднем 2 трансплантаци (от 1 до 4).
После наложения всех швов и восстановления самопроизвольного сердечного сокращения проводили клеточную имплантацию путем эпикардиального введения, по меньшей мере, 10 повторных инъекций в области инфаркта и окружающие области, которые с электрокардиографической точки зрения были идентифицированы как гипокинетические, акинетические или дискинетические. Для инъекций использовали глазную канюлю калибра 23G (Maersk Medical Ltd. Redditch, B98 9NL GB). Области, в которые должен был быть введен клеточный имплантат, идентифицировали перед хирургической операцией путем эхокардиограммы, чтобы оценить сократимость упомянутых областей во время последующего наблюдения за клеточной трансплантацией.
После хирургической операции пациенты находились под постоянным телеметрическим наблюдением. Образцы крови отбирали каждые шесть часов для выявления сердечных некротических ферментов. Для предотвращения воспаления после операции вводили метилпреднизолон (500 мг). Для предотвращения сердечных аритмий проводили 3-месячное лечение амиодароном перорально. Для оценки реакции на проведенную кардиомиопластику осуществляли последующее врачебное наблюдение посредством PET (через 3 месяца после трансплантации), эхокардиограммы (через 40 дней и через 3 месяца после трансплантации). Кроме того, оценивали наличие аритмий посредством Holter-ECG (через 40 дней и через 3 месяца после трансплантации).
Протокол и все проведенные процедуры были предварительно одобрены этическим комитетом института и региональным этическим комитетом по клиническим испытаниям в соответствии с требованиями закона.
Эхокардиографические исследования. Общую и регионарную сократимость миокарда измеряли путем двумерной эхокардиографии (при помощи ультразвуковой системы Sonos 5500, Phillips). Анализ регионарного движения стенки левого желудочка выполняли по методике, описанной в Standards Committee of the Amercan Society of Echocardiography (Schiller NB et al, J AM Soc Echocardiogr. 1989; 2:358-367): левый желудочек разделили на 16 фрагментов и оценивали для каждого сегмента движение стенки как 1 = нормальное, 2 = гипокинезия, 3 = акинезия, 4 = дискинезия. Индекс регионарной подвижности (бальный индекс движения стенки, WMSI) определяли как сумму индексов всех сегментов, деленную на количество оцененных сегментов. Индекс WMSI получили для сегментов, обработанных клеточным имплантатом и отдельно - для необработанных сегментов. Фракцию выброса левого желудочка (LVEF) получали при помощи системы автоматического определения границы между кровью и эндокардом (автоматическое определение границы ABD) (Perez JE et al, J. Am. Coll. Cardiol. 1992; 19:336-344). Также оценивали регионарную сократимость каждого сегмента при помощи технологии ColorKinesis и ультразвукового анализа ткани по Доплеру. Оценки выполняли в виде двойного слепого испытания (2 независимых наблюдателя, не обладающих предварительной информацией). Воспроизводимость в испытании для конечного диастолического объема в левом желудочке составила 2,8±6,4 (коэффициент вариации 5,5%), а для фракции выброса (LVEF) 0,3±4,6 (коэффициент вариации 6,6%).
Позитронная эмиссионная томография (PET). При помощи PET оценивали кровоток в миокарде и метаболизм глюкозы, до хирургической операции и через 3 месяца после клеточной трансплантации.
Оценку перфузии и метаболизма проводили в РЕТ-томографе (ЕСАТ EXACT HR+, Siemens/CTI knoxville, USA), который обеспечивает 62 трансаксиальных среза с пространственным разрешением между планами 4,5 мм. Метки для исследования метаболизма глюкозы (18F-FDG) и для перфузии (13N-аммоний) получали в циклотроне (циклон 18/9, Ion Beam Applications, Бельгия) и в лаборатории радиофармпрепаратов данного центра.
Протокол получения снимков каждого пациента осуществляли в виде 2-минутного пропускания германия-68 для локализации сердца в поле наблюдения, а затем 5-минутного пропускания для выполнения поправки на фотонное затухание. Сразу после этого начинали перфузию 13N-аммония (9,25μКи/кг, максимум 740μКи) путем внутривенной инъекции с постоянной скоростью 10 мл/мин. Получение динамических данных начинали в момент инъекции. Получение снимков в динамической последовательности осуществляли в течение 20 минут по схеме переменной длительности: 12×10 с, 4×10 с, 4×30 с, 3×300 с. Получение данных PET осуществляли в соответствии с протоколом, описанным в библиографии (Muzik О et al. J. Nucl. Med. 1993; 34:336-344). После накопления снимков для оценки перфузии оставляли 50 минут на физическое затухание радиоактивности 13N-аммония (период полураспада 9,9 минут). Затем начинали получение данных метаболического превращения глюкозы с использованием эугликемического гиперинсулинемического клэмп-теста (Knuuti MJ et al, J. Nucl. Med. 1992; 33:1255-1262). 18F-FDG вводили путем внутривенной инъекции, после стабилизации уровней глюкозы в диапазоне 85-95 мг/децилитр, ударной дозы 4,6 μКи/кг, максимум 370μКи. Получение последовательных снимков 18F-FDG начинали в момент инъекции и продолжали в течение 60 минут (8×15 с, 2×30 с, 2×120 с, 1×180 с, 4×300 с, 3×600 с) в соответствии с протоколом, описанным Knuuti et al, см. выше.
После получения снимков выполняли сегментацию пропускания, до коррекции экранирования, снимки метаболического испытания реконструировали с использованием метода OSEM (максимизация ожидания упорядоченных подгрупп) с двумя повторностями и 8 подгруппами. Ко всем опытам (и перфузии, и метаболизму) применяли фильтр Гаусса (сглаживающий фильтр Гаусса) с 6 мм FWHM (полная ширина полумаксимального объема). Для обычного анализа трансаксиальные снимки переориентировали относительно короткой оси, вертикальной длинной оси и горизонтальной длинной оси левого желудочка.
Наконец, для количественного анализа использовали 6 смежных секций средней области левого желудочка по короткой оси. Кровоток в миокарде рассчитывали в виде абсолютных скоростей в соответствии с 3-компартментной моделью (Muzik О et al. J. Nucl. Med. 1993; 34:83-91), а скорости использования глюкозы (скорости использования глюкозы в миокарде, rMGU) оценивали путем графического анализа Патлака (Patlak CS et al. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1985; 5:584-590).
РЕЗУЛЬТАТЫ
2.4 Клеточная трансплантация и послеоперационное развитие
Демографические, клинические и функциональные особенности пациентов, участвовавших в испытании, приведены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1 Особенности пациентов |
|||||||
Пациент | Возраст | Пол | Локализация инфаркта | Развитие (месяцы) | Симптомы локального инфаркта по классификации NYHA | Локализация шунтирования | |
стенокардия/одышка | базовые данные/FU | ||||||
1 | 63 | М | Передняя | 4 | Нестабильное ЛП | III/II | LAD, RC, ОМ |
2 | 64 | М | Передне-вер хушечная | 6 | III/II | II/I | LAD, ОМ |
3 | 40 | М | Нижняя | 5 | Нестабильное /II | II/I | RC, LAD, |
4 | 55 | М | Передняя | 23 | II/I | II/I | LAD, RC, ОМ |
5 | 68 | М | Передне-вер хушечная | 168 | III/III | III/II | LAD, RC, ОМ |
6 | 74 | ж | Передняя | 10 | /III | III/III | LAD |
7 | 69 | М | Нижняя | 125 | Нестабильное/II | III/ | LAD, RC, OM, Dg |
8 | 71 | М | Нижняя | 108 | Нестабильное/II | II/I | LAD, OM |
9 | 56 | М | Передняя | 120 | III/ | II | LAD, Dg, OM |
10 | 74 | М | Нижняя | 20 | III/II | II/ | LAD, OM, Dg, RC |
11 | 68 | М | Передняя | 3 | I/I | I/I | LAD, RC, OM |
12 | 73 | М | Передне-вер хушечная | 146 | III/III | III/II | LAD, Dg, OM |
Аббревиатуры:
Пол: М - мужской; F - женский
Классификация NYHA: Классификация Кардиологической Ассоциации Нью-Йорка.
FU (КН): Контрольное наблюдение, проведенное через 3 месяца после хирургической операции и клеточной трансплантации.
Локализация шунтирования: LAD - левая передняя нисходящая артерия; RC - правая коронарная артерия; М - ветвь тупого края; Dg - диагональная коронарная артерия.
Во время операции аортокоронарного шунтирования, после окончания пересадки и восстановления самопроизвольного сокращения сердца, визуализировали область, пораженную инфарктом, и вводили путем инъекции раствор объемом 3-5 мл, содержащий миогенные клетки при концентрации 20×106 клеток/мл. Области инъекции идентифицировали для последующего эхокардиографического наблюдения. Перед осуществлением трансплантации, сразу после сбора клеток для упомянутой трансплантации, выполняли микробиологическое культивирование для предотвращения заражения культур. По этой причине пациенту №9 не была сделана трансплантация, так как его клеточные образцы показали положительное окрашивание в грам-тесте на стерильность. Тем не менее, данные этого пациента также включили в протокол для последующего наблюдения.
Таблица 2 Особенности пациентов |
||||
Пациент | Мышечная биопсия (г) | К-во имплантированных миогенных клеток (×106) | Базовая LVEF, 2D/ABD | LVEF во время КН, 2D/ABD |
1 | 10 | 318 | 35/37 | 55/56 |
2 | 13 | 165 | 40/45 | 50/53 |
3 | 7,5 | 192 | 45/46 | 70/65 |
4 | 7 | 393 | 40/47 | 62/66 |
5 | 10 | 200 | 27/26 | 40/50 |
6 | 9 | 110 | 30/38 | 40/48 |
7 | 9,5 | 171 | 40/38 | нет КН |
8 | 5,5 | 105 | 40/42 | 47/51 |
9 | 9 | 0 | 45/40 | 35/38 |
10 | 14 | 390 | 25/29 | нет КН |
11 | 10 | 100 | 40/43 | 51/49 |
12 | 11,3 | 180 | 43/41 | 46/45 |
Аббревиатуры:
LVEF - фракция выброса левого желудочка.
КН - Контрольное наблюдение, проведенное через 3 месяца после хирургической операции и клеточной трансплантации.
2D - двумерная эхокардиограмма; ABD - автоматическое определение границы между кровью и эндокардом.
Послеоперационное развитие пациентов с имплантированными клетками проходило без осложнений. Поскольку в предшествующих клинических исследованиях были обнаружены сердечные аритмии, связанные с трансплантацией миогенных клеток скелетной мышцы, то пациенты находились под наблюдением во время госпитализации (непрерывная телеметрия), а также проходили наблюдение через 40 дней и через 3 месяца после трансплантации (посредством Holter-ECG, 24 часа). Ни в одном случае не было обнаружено существенного увеличения аритмий. Более того, после трансплантации было уменьшено число преждевременных сокращений желудочка. Однако у пациента №6 развилась кратковременная вентрикулярная тахикардия через 40 дней после операции. Этот пациент во время операции был подвергнут аневризмэктомии, что могло быть причиной такого явления.
Серологический анализ сердечных и печеночных ферментов не показал существенных изменений после трансплантации, и их количество постепенно возвращалось к нормальным значениям. В качестве косвенного показателя воспаления измеряли протеин С, при этом существенных изменений не произошло ни после трансплантации, ни во время последующего наблюдения.
Все пациенты покинули больницу и в настоящее время живы.
2.5 Функция левого желудочка
Среднее значение фракции выброса левого желудочка, измеренное при помощи двумерной эхокардиографии, увеличилось с 35,5±2,3% (среднее ± стандартная ошибка) перед операцией до 53,5±4,98% через 3 месяца после трансплантации (р<0,05). Общая сердечная сократимость, измеренная эхокардиографически на основе автоматического определения границы между кровью и эндокардом (ABD), увеличилась с 39,8±3,26% до 56,3±3,1% (р<0,05) (Фиг.1).
Также отмечено улучшение регионарной сократимости, продемонстрированное снижением среднего количества акинетических/гипокинетических/дискинетических сегментов с 7 (в диапазоне от 5 до 10, до операции) до 3 (в диапазоне от 0 до 5 через 3 месяца после трансплантации).
Базовый индекс регионарной подвижности WMSI, в среднем 1,72±0,14, снизился через 3 месяца после трансплантации до 1,25±0,07 (р<0,05) (Таблица 3). Для проведения различий между потенциальными преимуществами для сердечной функции, обеспечиваемыми трансплантацией миогенных клеток, и преимуществами, обеспечиваемыми реваскуляризацией, сравнивали улучшение индексов WMSI для сегментов, получивших клеточный трансплантат, и для сегментов, не получивших клеточного трансплантата. Индексы WMSI существенно снизились через 3 месяца по сравнению с базовыми индексами (до операции), причем большее снижение произошло в сегментах, которые получили клеточный трансплантат (Таблица 3).
Снижение WMSI связано с улучшением по классификации NYHA, от базового значения 2,2±0,2 до 1,5±0,26 - значения через 3 месяца (р<0,01).
Таблица 3 Регионарная функция (на основе WMSI, балльного индекса движения стенки) |
||||
Базовая величина | Через 40 дней | Через 3 месяца | Р | |
Общая величина | 1,73±0,07 | 1,40±0,07 | 1,25±0,07 | 0,027 |
Обработанные сегменты | 2,64±0,13 | 2,03±0,16 | 1,64±0,16 | 0,027 |
Необработанные сегменты | 1,29±0,13 | 1,1±0,06 | 1,05±0,04 | 0,043 |
2.6 Перфузия в миокард и анализ применимости
Перфузионное (РЕТ-аммоний) и метаболическое (FDG-глюкоза) исследования проводили на 7 пациентах в виде тестов, проведенных до операции (за 1-5 дней) и через 3 месяца после трансплантации. Для каждой области оценивали удерживание метки с присвоением каждой области количественного цифрового показателя. Среднее удерживание глюкозы для всего миокарда до операции составило 0,158±0,026 мкмоль·г-1·мин-1, а через 3 месяца 0,270±0,008 мкмоль·г-1·мин-1 (p<0,05). Дифференциальный анализ областей, пораженных инфарктом (некротическая ткань в результате инфаркта миокарда) подтвердил существенное увеличение удерживания аммония и глюкозы, что показывает улучшение функции миокарда, т.е. применимость в пораженных инфарктом областях (Таблица 4). См. также Фиг.2.
Таблица 4 Позитронная эмиссионная томография PET. Оценка кровотока по удерживанию 13N-аммония (мл·г-1·мин-1) и метаболизма глюкозы по 18F-FDG (мкмоль·г-1·мин-1). |
||||
Базовая величина | Через 3 месяца | Р | ||
Общая величина | 18F-FDG | 0,158±0,026 | 0,270±0,008 | 0,028 |
13N-аммоний | 0,47±0,05 | 0,5±0,003 | 0,273 | |
Обработанные сегменты | 18F-FDG | 0,126±0,022 | 0,231±0,011 | 0,028 |
13N-аммоний | 0,36±0,004 | 0,39±0,01 | 0,686 | |
Необработанные сегменты | 18F-FDG | 0,170±0,029 | 0,284±0,013 | 0,046 |
13N-аммоний | 0,59±0,007 | 0,62±0,06 | 0,5 |
ОБСУЖДЕНИЕ
Главные выводы исследований:
1. Прямая трансплантация аутологических миогенных клеток скелетной мышцы в миокард пациентов с инфарктом миокарда и аортокоронарным шунтированием в анамнезе применима и безопасна.
2. Хотя явные различия между эффектами после шунтирования и после клеточной трансплантации отсутствуют, исследования функциональности и применимости показывают, что трансплантация аутологических миогенных клеток способствует улучшению сократимости левого желудочка и восстановлению тканей.
3. Скелетные миобласты способны приживаться, по крайней мере, в течение 3 месяцев после хирургической операции.
Хотя для того чтобы проверить, способны ли миобласты скелетной мышцы приживаться в удовлетворительной степени, необходимо непосредственное исследование миокарда, увеличение удерживания глюкозы, выявленное при помощи PET, ясно показывает, что в областях, пораженных инфарктом, в которых не было обнаружено жизнеспособной ткани, после трансплантации начинает появляться жизнеспособная ткань. С другой стороны, хотя в исследование не были включены контрольные пациенты, результаты 18F-FDG-PET для пациента 9, которому было сделано только аортокоронарное шунтирование из-за микробиологического заражения клеточной культуры, не показали существенных изменений в использовании глюкозы при контрольном наблюдении через 3 месяца (Фиг.2В), что является хотя и не окончательным доказательством, но обнадеживающим фактором.
Эти результаты показывают, что аортокоронарное шунтирование с трансплантацией аутологических миогенных клеток скелетной мышцы существенно улучшает сократимость сердца, о чем ясно свидетельствует увеличение фракции выброса и особенно снижение индекса WMSI. Из этих результатов нельзя сделать заключение о том, что улучшение сердечной функции обусловлено только шунтированием. Тот факт, что сегменты миокарда, которые получили клеточную трансплантацию, показали более существенные улучшения, в том числе увеличение удерживания глюкозы в этих сегментах, указывает на то, что улучшение сердечной функции обусловлено не только шунтированием. Для доказательства того, что трансплантация аутологических клеток обусловливает улучшение сердечной функции, следовало бы выполнить трансплантацию без других сопутствующих видов лечения, однако это пока невозможно по этическим соображениям, за исключением имплантации клеток путем подкожной инъекции.
Недавние исследования в отношении других клинических испытаний показывают, что трансплантация аутологических миобластов скелетных мышц связана с сердечными аритмиями (Menasche P et al. Lancet 2001; 357:279-280. Menasche P et al. J. Am. Coil. Cardiol. 2003; 41:1078-1083. Hagege AA et al. Lancet 2003; 361:491-492. Pagani FD et al. J. Am. Coil. Cardiol. 2003; 41:879-888). В самом деле, некоторым пациентам потребовалась имплантация внутрисердечных дефибрилляторов. До настоящего времени точная причина таких аритмий не известна, но они могут быть связаны с образованием электрических цепей циркуляции возбуждения (возможно, из-за того, что с имплантированными миобластами скелетной мышцы не устанавливаются щелевые контакты), количеством и объемом имплантированных клеток или использованием аутологических миогенных клеток. Следует отметить, что в этих протоколах для культивирования и развития in vitro аутологических миогенных клеток была использована зародышевая телячья сыворотка, являющаяся источником ксеногенных белков. Контакт человеческих клеток с телячьей сывороткой в течение 3 недель приводит к фиксированию в клеточной поверхности упомянутых животных белков. Трансплантация этих клеток может вызвать воспалительную реакцию с последующим фиброзом. Проведенные клинико-патологические исследования показывают, что трансплантированные этим способом клетки встраиваются в фиброзную структуру, в которой отсутствует реваскуляризация. Такая тканевая конфигурация представляет опасность для цепей циркуляции возбуждения, которые могут индуцировать эктопическую выработку сильных вентрикулярных аритмий. В отличие от этих исследований, в данном клиническом исследовании были использованы культивированные аутологические миогенные клетки скелетных мышц в полностью аутологической среде культивирования, что позволяет избежать иммунных реакций. Это может служить объяснением того, почему в данном клиническом исследовании таких аритмий не наблюдалось.
Claims (29)
1. Аутологическая среда культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, содержащая:
a) от 0,1 до 90 вес.% аутологической человеческой сыворотки;
b) от 0,1 до 10000 МЕ/мл гепарина;
c) от 0,1 до 10000 МЕ/мл протамина и
d) среду культивирования с основными питательными веществами, включая или не включая глутамин, в количестве, необходимом до получения 100 вес.% и необязательно содержащая:
e) антибиотик;
f) противогрибковое средство и/или
g) фактор роста фибробластов (FGF)
2. Среда культивирования по п.1, при этом упомянутую аутологическую человеческую сыворотку подвергают обработке с целью инактивации комплемента.
3. Среда культивирования по п.1, при этом упомянутую аутологическую человеческую сыворотку получают из образцов крови пациента.
4. Среда культивирования по п.1, при этом упомянутую аутологическую человеческую сыворотку получают путем проведения плазмофереза у пациента-донора упомянутой сыворотки.
5. Среда культивирования по п.4, при этом упомянутый плазмоферез проводят с использованием гепарина в качестве антикоагулянта и протамина сульфата для реверсирования антикоагуляции.
6. Среда культивирования по п.1, в которой упомянутый антибиотик выбран из пенициллина, стрептомицина, гентамицина и их смесей.
7. Среда культивирования по одному из пп.1-5, в которой упомянутым противогрибковым средством является амфотерицин В.
8. Среда культивирования по п.1, которая содержит:
аутологическую человеческую сыворотку пациента в количестве 10%;
гепарин в количестве 0,1-110 МЕ/мл;
протамин в количестве 0,1-100 МЕ/мл,
отличающаяся тем, что дополнительно содержит
1% пенициллина/стрептомицина и, возможно,
0,25 мг/мл амфотерицина В и/или
0,1-250 пг/мл рекомбинантного bFCF,
при этом указанной средой культивирования является среда HAM-F12 в количестве 89%.
9. Способ изготовления аутологической среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8, включающий смешивание аутологической человеческой сыворотки, гепарина, протамина, основных питательных веществ, включая или не включая глутамин, возможно, вместе с антибиотиками, и/или амфотерицином В, и/или фактором роста фибробластов.
10. Способ по п.9, в котором упомянутая аутологическая человеческая сыворотка получена путем плазмофереза.
11. Применение аутологической среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 для культивирования in vitro, очистки и увеличения объема аутологических стволовых клеток-предшественников.
12. Способ приготовления композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, включающий инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников в аутологической среде культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.
13. Способ по п.12, в котором очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников проводят путем использования специфических антител, обеспечивающих возможность идентификации внеклеточных антигенов, характерных для упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.
14. Способ по п.13, в котором упомянутые специфические и селективные антитела к упомянутым аутологическим человеческим стволовым клеткам-предшественникам соединены с магнитными микросферами.
15. Способ получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, пригодных для использования в клеточной терапии, включающий инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в аутологической среде культивировании аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.
16. Способ по п.15, в котором очистка аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных включает использование человеческих антител к CD56, возможно, соединенных с магнитными микросферами, и селекцию клеток, проявляющих фенотип CD56+/CD45-.
17. Способ по п.15, в котором очистка аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных включает проведение стадии предварительного посева клеточной культуры с целью осаждения всех или части фибробластов, присутствующих в упомянутой клеточной культуре, а затем идентификацию и выделение аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных путем использования антител к человеческому CD56, возможно, соединенных с магнитными микросферами, и селекцию клеток, которые проявляют фенотип CD56+/CD45-.
18. Способ получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных на основе биопсии мышечной ткани для изготовления фармацевтической композиции, который включает:
a) проведение биопсии у пациента, являющегося объектом последующей имплантации аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, для извлечения фрагмента ткани скелетных мышц, содержащей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных;
b) культивирование упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных из ткани скелетных мышц в аутологической среде культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 в условиях, обеспечивающих возможность развития упомянутой культуры аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных;
c) очистку упомянутых культивированных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных и
d) сбор упомянутых очищенных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных; и, возможно,
e) замораживание упомянутых очищенных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных до изготовления упомянутой фармацевтической композиции.
19. Способ по п.18, включающий местное введение пациенту, в области биопсии, перед ее проведением, фармацевтической композиции, которая содержит фармакологическое средство, стимулирующее пролиферацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных.
20. Способ по п.18, в котором упомянутое фармакологическое средство включает местный анестетик, выбранный из лидокаина и бупивакаина.
21. Способ по п.18, в котором очистка аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных включает проведение стадии предварительного посева клеточной культуры с целью осаждения всех или части фибробластов, присутствующих в упомянутой клеточной культуре, а затем идентификацию и выделение аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных путем использования антител к человеческому CD56, возможно, соединенных с магнитными микросферами, и селекцию клеток, которые проявляют фенотип CD561+/ CD45-.
22. Композиция для восстановления и/или воссоздания ткани сердечной мышцы, и/или для лечения постишемической сердечной недостаточности, и/или для лечения дилатационной кардиомиопатии, и/или для лечения неишемической кардиомиопатии, обогащенная аутологическими человеческими стволовыми клетками-предшественниками мышечных, которая включает, по меньшей мере, 70% упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в аутологической среде культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных по любому из пп.1-7.
23. Фармацевтическая композиция для восстановления и/или воссоздания ткани сердечной мышцы, и/или для лечения постишемической сердечной недостаточности, и/или для лечения дилатационной кардиомиопатии, и/или для лечения неишемической кардиомиопатии, которая включает, по меньшей мере, 20 миллионов клеток при плотности клеток, по меньшей мере, 50 миллионов клеток/мл и, по меньшей мере, 40% аутологических стволовых клеток-предшественников CD56+/ CD45-, атуологическую среду культивирования аутологических стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 и, по меньшей мере, один наполнитель, приемлемый с фармацевтической точки зрения.
24. Фармацевтическая композиция по п.23, которая включает от 20 до 200 миллионов клеток при плотности клеток от 50 до 70 миллионов клеток/мл и, по меньшей мере, 70% аутологических стволовых клеток-предшественников CD56+/ CD45-, аутологическую среду культивирования аутологических стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 и человеческий альбумин в количестве от 0,1 до 20 вес.% от общего количества.
25. Терапевтический способ аутологической клеточной кардиомиопластики для образования, регенерации и восстановления дисфункциональной ткани миокарда путем имплантации фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, регенераторы сердечной ткани, выращенные ех vivo в аутологической среде культивирования, включающий упомянутую процедуру извлечения образца материала из тела пациента, являющегося объектом последующей имплантации, который содержит аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, выращивание упомянутых клеток путем культивирования в аутологической среде культивирования аутологических стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 и имплантацию собранных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников пациенту, у которого был предварительно извлечен такой материал, содержащий аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных.
26. Терапевтический способ аутологической клеточной кардиомиопластики для образования, регенерации и восстановления дисфункциональной ткани миокарда путем имплантации фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, регенераторы сердечной ткани, выращенные ех vivo в аутологической среде культивирования; при этом упомянутый способ включает следующие этапы:
a) биопсию скелетной мышцы у пациента предпочтительно с предварительной обработкой мышцы путем внутримышечной инъекции местного анестетика;
b) приготовление среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 на основе аутологической сыворотки пациента;
c) приготовление композиции, обогащенной аутологическими человеческими стволовыми клетками-предшественниками мышечных на основе биопсии а) и среды культивирования b);
d) приготовление фармацевтической композиции на основе композиции с) и
e) имплантацию фармацевтической композиции аутологических стволовых клеток-предшественников d) в пораженные участки миокарда.
27. Способ по п.26, в котором имплантацию упомянутой композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников осуществляют путем прямой инъекции в периферическую область инфарктного рубца или путем инъекции в интракоронарные пространства обоих желудочков.
28. Способ по п.26, в котором имплантацию упомянутой композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников осуществляют путем системного или интракоронарного введения через подкожный венозный доступ.
29. Способ по п.26, в котором имплантацию упомянутой композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников осуществляют при помощи роботизированной и компьютеризованной системы.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ESP200201540 | 2002-07-02 | ||
ES200201540A ES2198216B1 (es) | 2002-07-02 | 2002-07-02 | Medio de cultivo de celulas madre-progenitoras autologas humanas y sus aplicaciones. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2005102061A RU2005102061A (ru) | 2005-10-10 |
RU2312141C2 true RU2312141C2 (ru) | 2007-12-10 |
Family
ID=30011351
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2005102061/13A RU2312141C2 (ru) | 2002-07-02 | 2003-06-11 | Среда для культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников и способы их применения |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060110368A1 (ru) |
EP (1) | EP1972684A1 (ru) |
JP (1) | JP5379340B2 (ru) |
KR (2) | KR100960173B1 (ru) |
CN (1) | CN100572527C (ru) |
AU (1) | AU2003240857B2 (ru) |
BR (1) | BR0312365A (ru) |
ES (1) | ES2198216B1 (ru) |
IL (1) | IL165969A0 (ru) |
MX (1) | MXPA04012601A (ru) |
NZ (1) | NZ537397A (ru) |
RU (1) | RU2312141C2 (ru) |
WO (1) | WO2004005494A1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2493250C2 (ru) * | 2011-07-08 | 2013-09-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "ПанЭко" | Малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека |
RU2506309C2 (ru) * | 2012-03-11 | 2014-02-10 | Екатерина Алексеевна Федорова | Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей |
RU2524655C2 (ru) * | 2008-03-28 | 2014-07-27 | Лабо Дзюверса Ко., Лтд. | Средство для лечения старения кожи и рубцов |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7253735B2 (en) | 2003-03-24 | 2007-08-07 | Alien Technology Corporation | RFID tags and processes for producing RFID tags |
DE102004025684B4 (de) | 2004-04-29 | 2024-08-22 | OSRAM Opto Semiconductors Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Verfahren zum Ausbilden einer Kontaktstruktur zur elektrischen Kontaktierung eines optoelektronischen Halbleiterchips |
PT1970446E (pt) * | 2005-12-13 | 2011-09-01 | Univ Kyoto | Factor de reprogramação nuclear |
PT2194121T (pt) | 2007-09-11 | 2016-12-05 | Univ Sapporo Medical | Método de proliferação celular e agente farmacêutico para reparação e regeneração de tecidos |
JP5598864B2 (ja) * | 2011-12-05 | 2014-10-01 | 北海道公立大学法人 札幌医科大学 | 細胞増殖方法ならびに組織の修復および再生のための医薬 |
TWI643953B (zh) * | 2014-12-11 | 2018-12-11 | 訊聯生物科技股份有限公司 | 以自體血漿培養原始細胞的方法 |
CN106110304A (zh) * | 2016-07-28 | 2016-11-16 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种祛疤组合物和敷料 |
KR102093810B1 (ko) * | 2017-09-19 | 2020-03-26 | 서울대학교산학협력단 | 면역원성 감소 방법 |
KR102241185B1 (ko) * | 2019-04-23 | 2021-04-16 | (주)셀라토즈테라퓨틱스 | 근골격계 줄기세포의 선택적 분화 조절방법 |
CN112501035B (zh) * | 2020-12-09 | 2022-09-20 | 云南大学 | 基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多而产生捕食器官的方法 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4735726A (en) * | 1981-07-22 | 1988-04-05 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Plasmapheresis by reciprocatory pulsatile filtration |
US4668399A (en) * | 1982-02-16 | 1987-05-26 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Hollow fiber plasmapheresis process |
US5612211A (en) * | 1990-06-08 | 1997-03-18 | New York University | Stimulation, production and culturing of hematopoietic progenitor cells by fibroblast growth factors |
NL9101680A (nl) * | 1991-10-04 | 1993-05-03 | Tno | Werkwijze voor het genetisch modificeren van beenmergcellen van primaten, alsmede daarbij bruikbare cellen die recombinante retrovirale vectoren produceren. |
JPH06113829A (ja) * | 1992-10-09 | 1994-04-26 | Tabai Espec Corp | 動物細胞培地添加血清の調製方法、動物細胞培地の調製方法及び培養装置 |
US5728581A (en) * | 1995-06-07 | 1998-03-17 | Systemix, Inc. | Method of expanding hematopoietic stem cells, reagents and bioreactors for use therein |
WO1998041644A1 (en) * | 1997-03-18 | 1998-09-24 | Introgene B.V. | Methods and compositions for genetically modifying primate bone marrow cells |
EP1007092B1 (en) * | 1997-08-26 | 2006-08-09 | Amgen Fremont Inc. | A process for inhibiting complement activation via the alternative pathway |
US6962698B1 (en) * | 1998-02-17 | 2005-11-08 | Gamida Cell Ltd. | Methods of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells |
US6624141B1 (en) * | 1999-03-17 | 2003-09-23 | The Regents Of The University Of Michigan | Protamine fragment compositions and methods of use |
AU770889B2 (en) * | 1999-07-23 | 2004-03-04 | Genvec, Inc. | Muscle cells and their use in cardiac repair |
US7015037B1 (en) * | 1999-08-05 | 2006-03-21 | Regents Of The University Of Minnesota | Multiponent adult stem cells and methods for isolation |
WO2002072191A2 (en) * | 2001-03-12 | 2002-09-19 | Chachques Juan C | Method of providing a dynamic cellular cardiac support |
US20030044766A1 (en) * | 2001-08-29 | 2003-03-06 | Anne Scholz | Methods and devices for detecting cell-cell interactions |
-
2002
- 2002-07-02 ES ES200201540A patent/ES2198216B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-06-11 KR KR1020057000034A patent/KR100960173B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-06-11 NZ NZ537397A patent/NZ537397A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-06-11 AU AU2003240857A patent/AU2003240857B2/en not_active Ceased
- 2003-06-11 RU RU2005102061/13A patent/RU2312141C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-06-11 CN CNB038155990A patent/CN100572527C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-11 BR BR0312365-0A patent/BR0312365A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-06-11 WO PCT/ES2003/000285 patent/WO2004005494A1/es active Application Filing
- 2003-06-11 US US10/519,974 patent/US20060110368A1/en not_active Abandoned
- 2003-06-11 KR KR1020087023967A patent/KR20080091874A/ko active Search and Examination
- 2003-06-11 JP JP2004518793A patent/JP5379340B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-11 EP EP03730223A patent/EP1972684A1/en not_active Withdrawn
- 2003-06-11 MX MXPA04012601A patent/MXPA04012601A/es active IP Right Grant
-
2004
- 2004-12-23 IL IL16596904A patent/IL165969A0/xx unknown
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2524655C2 (ru) * | 2008-03-28 | 2014-07-27 | Лабо Дзюверса Ко., Лтд. | Средство для лечения старения кожи и рубцов |
RU2493250C2 (ru) * | 2011-07-08 | 2013-09-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "ПанЭко" | Малосывороточная среда для культивирования фибробластов человека |
RU2506309C2 (ru) * | 2012-03-11 | 2014-02-10 | Екатерина Алексеевна Федорова | Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2003240857A1 (en) | 2004-01-23 |
MXPA04012601A (es) | 2005-09-30 |
ES2198216B1 (es) | 2005-04-16 |
AU2003240857B2 (en) | 2008-06-26 |
CN1665922A (zh) | 2005-09-07 |
NZ537397A (en) | 2008-09-26 |
BR0312365A (pt) | 2005-04-05 |
KR100960173B1 (ko) | 2010-05-26 |
KR20050037549A (ko) | 2005-04-22 |
CN100572527C (zh) | 2009-12-23 |
IL165969A0 (en) | 2006-01-15 |
EP1972684A1 (en) | 2008-09-24 |
ES2198216A1 (es) | 2004-01-16 |
KR20080091874A (ko) | 2008-10-14 |
RU2005102061A (ru) | 2005-10-10 |
WO2004005494A1 (es) | 2004-01-15 |
US20060110368A1 (en) | 2006-05-25 |
JP5379340B2 (ja) | 2013-12-25 |
JP2005531322A (ja) | 2005-10-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11821005B2 (en) | Umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) and culture method and application thereof | |
Chachques et al. | Treatment of heart failure with autologous skeletal myoblasts | |
Zheng et al. | Comparison of cardiac stem cells and mesenchymal stem cells transplantation on the cardiac electrophysiology in rats with myocardial infarction | |
RU2312141C2 (ru) | Среда для культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников и способы их применения | |
CN107028980A (zh) | 用于治疗心脏疾病的药物组合物 | |
JP2002511094A (ja) | 間葉幹細胞を用いる心筋再生 | |
US20060088508A1 (en) | Method for obtaining characterized muscle-derived cell populations and uses | |
US20020197240A1 (en) | Marrow stem cell (MSC) transplantation for use in tissue and/or organ repair | |
CN104922059A (zh) | 一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 | |
JP2015503918A (ja) | 同種異系細胞の医療用途の誘導のための方法及び組成物並びに治療的利用 | |
US20040191225A1 (en) | Injection system | |
KR20070112205A (ko) | 심장 조직 재생용 조성물 및 방법 | |
WO2007048352B1 (en) | Pharmaceutical composition and method for regenerating myofibers in the treatment of muscle injuries | |
WO2013168403A1 (ja) | トレハロース含有肺塞栓形成予防用哺乳動物細胞懸濁液 | |
CN108619169A (zh) | 一种治疗缺血性脑卒中的间充质干细胞注射液及制备方法 | |
Mäkelä et al. | Bone marrow–derived mononuclear cell transplantation improves myocardial recovery by enhancing cellular recruitment and differentiation at the infarction site | |
CN106701682A (zh) | 由脐血分离造血干细胞并扩增cd34阳性细胞的方法 | |
Premaratne et al. | Repeated implantation is a more effective cell delivery method in skeletal myoblast transplantation for rat myocardial infarction | |
CN114984219B (zh) | Pd1抑制剂在制备心脏成纤维细胞转分化抑制剂中的用途 | |
Law et al. | Myoblast therapies constitute a safe and efficacious platform technology of regenerative medicine for the human health industry | |
US20160015860A1 (en) | Micro-tissue particles and methods for their use in cell therapy | |
Yang et al. | Cardiac myocyte progenitors from adult hearts for myocardial regenerative therapy | |
Kolapudi et al. | Stem Cells Treatment for the Future Heart Diseases. | |
Tang et al. | Transplantation of 5-azacytidine treated cardiac fibroblasts improves cardiac function of infarct hearts in rats | |
CN114010658A (zh) | TREM2hi巨噬细胞在制备治疗心脏功能障碍药物中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140612 |