KR20050037549A

KR20050037549A - 인간 원종 줄기세포들을 자가 배양하기 위한 배지와 그의응용

Info

Publication number: KR20050037549A
Application number: KR1020057000034A
Authority: KR
Inventors: 후안 까를로스 차께스; 쁘로스뻬르까르도소펠리뻬; 헤레로스곤잘레스헤수스
Original assignee: 인스띠뜌또 씨엔띠피꼬 이그리에가 떼끄놀로지꼬 데 나바라 에세.아.; 후안 까를로스 차께스
Priority date: 2002-07-02
Filing date: 2003-06-11
Publication date: 2005-04-22
Also published as: BR0312365A; NZ537397A; RU2312141C2; CN100572527C; WO2004005494A1; IL165969A0; KR100960173B1; CN1665922A; AU2003240857B2; KR20080091874A; RU2005102061A; JP2005531322A; ES2198216B1; EP1972684A1; ES2198216A1; JP5379340B2; AU2003240857A1; MXPA04012601A; US20060110368A1

Abstract

본 발명은 인간 원종 줄기세포들을 자가 배양하기 위한 배지에 관한 것으로서, 자가 인간혈청 무게의 0.1 에서 90% 사이; 헤파린 무게의 0.1 에서 10000 UI/ml 사이; 프로타민 무게의 0.1 에서 10000 UI/ml 사이; 그리고 100% 무게까지 충분한 양으로, 글루타민이 있거나 또는 없는 기본 영양분을 함유한 배양배지를 포함하고, 인간 원종 중기세포의 자가 배양 및 증식에 이용될 수 있다. 상기 세포를 포함하는 조성물이 환자에 이식되어 기능이 손상된 심근 조직의 생성, 재생, 회복을 위한 자가 세포 심근성형술에 이용될 수 있다.

Description

인간 원종 줄기세포들을 자가 배양하기 위한 배지와 그의 응용 {Medium for culturing autologous human progenitor stem cells and applications thereof}

본 발명은 일반적으로 세포치료학적인 사용이 가능한 상태에서의 인간 원종(progenitor) 줄기세포의 획득과 조작에 관한 것으로서, 특히 그 세포들을 함유하는 구성체뿐 아니라 그러한 세포의 자가배양을 위한 배지와 그 세포들의 배양과 증식에서 그들의 응용에 관한 것이다.

생명의학 연구의 가장 큰 도전 중 하나는 가장 절망적이고 불치병인 질환들-신경퇴행성 질환 (파킨슨씨병, 알츠하이머), 당뇨, 근육질환, 심장질환, 간부전증 등-에서 손상되고 파괴된 세포와 조직들을 대체하거나 복구할 수 있도록 하는 치료학적 전략의 발전에 있다.

가장 전도유망한 치료학적 전략 중 하나는 세포 치료학으로서, 다소 분화되지 않았지만 분열하여 자신을 기능적으로 분화된 세포로 만들 수 있고, 어떤 경우에는 심지어 자신을 다시 만들어 낼수 있는 세포들이 있다는 잘 알려진 사실 위에서 창안됐다. 그들 중, 줄기세포와 원종세포가 있고, 이들 둘이 결합되어 원종 줄기세포가 될 것이다. 이 세포들은 배아상태와 심지어 성숙한 조직에서도 발견될 수 있다. 그러므로, 세포치료학은 손상된 기관의 기능성을 복구하여 회복시키기 위해 충분한 양의 원종 줄기세포를 환자에게 다른 조직이나 같은 조직에서 이식하는 방법인 것이다.

세포치료학에서 제시된 방법 중 하나는 성숙한 이종세포를 보유한 동물로 부터나 또는 동종세포를 보유한 적합판정환자에서 얻어진 원종 줄기세포의 사용에 근거한 것이다. 자가 원종 줄기세포를 사용하는 것은 배아세포 사용에 관련된 인종적 제약뿐만 아니라 그 세포의 공여자가 없거나 환자의 거부반응을 피하기 위한 면역 억제치료를 필요로 하는 경우와 같은 세포치료에서 보여지는 몇가지 단점들로 부터는 자유롭다.

그럼에도 불구하고, 세포치료학은 실제로 적용이 되어 각 경우마다 적합한 세포들에 대한 더 좋은 지식을 발전시키며, 그 세포들의 정체를 밝혀내어 그것들을 실제 임상적 응용에 적합할 수 있도록 합당한 원종 줄기세포 조작과정을 발전시키는 것이 필요하다.

자가 세포 심근성형술(autologous cell cardiomyoplasty: CMP)은 허혈성 심장질환, 심부전 등 심장질환 치료에 오래 쓰여왔던 세포치료의 명확한 실례이다. 최근 일반적 용례들은 CURR.CONTROL. TRIALS CARDIOVASC MED.2001:2:209-210(D.A. TAYLOR) 에 수록되어 있다. CMP 에 유용한 다른 원종 줄기세포들의 분리 배양 증식을 위한 과정과 그 구성은 US5130141, WO/0194555, WO79854301, US2001/0038837 그리고 US5543318에서 찾을 수 있다.

도 1은 좌심실 기능 평가를 나타내는 막대그림으로서, 좌심실 박출율(LVEF)을 분석하고 이차원 초음파 심음향도(2D)와 자동 경계 추적기(ABD)로 계산한 것이다. 이것은 외과적수술(Basal) 전, 세포이식 후 계속 관찰하는 중 40일째 되는 날과 3개월 경과후 관찰한 결과를 보여준다.

도 2는 수술(Basal) 전과 세포 이식후 3개월 (FU 3 months) 경과 후 엔-암모늄(N-ammonium)으로 나타내어지는 PET 관류와 PET 18 F-FDG 에 의한 포도당의 대사에 대한 평가를 보여준다. 도 2A: 환자 번호 5번에 의한 영상으로 세포이식을 받은 대표적 예. 도 2B: 환자 번호 9번에 의한 영상 (근골격 세포배양의 오염으로 인해 세표 이식을 받지 않은 환자). 화살표는 수술 전과 후의 경색된 조직을 나타낸다.

본 발명은 일반적으로 다음과 같은 문제들에 직면해 있다. 세포치료에서 사용하기에 적합한 자가 원종 줄기세포를 공급해야 하는 문제, 특히 세포의 획득, 배양, 정화 그리고 증식의 특정한 방법들을 포함해서 임상 적용에 맞도록 하기 위해 원종 줄기세포들을 잘 조작해낼 수 있는 과정을 만들어 내야한다는 문제가 있다.

본 발명을 위해 제시된 해결방법은 발명자가 자가 인간혈청, 영양분을 항응고제와 함께 섞은 자가 배양 배지를 사용하여 인 비트로(in vitro) 상태에서 자가 인간 원종 줄기세포의 획득, 정화, 증식을 가능하게 한 사실을 관찰해온 것을 근거로 하고 있다.

또한, 그러한 방법들은 세포치료학적 방법에 의한 다양한 병리학적 치료를 위한 약제학적 조성물들을 이끌어내는데 이용될 수도 있다.

본 발명은 자가 배양 배지를 만드는 것으로 설명될 수 있는데, 이 배지는 영양분, 자가 인간혈청, 헤파린(heparin) 및 프로타민(protamine)을 함유하며, 인 비트로 상태에서 자가 인간 근육 원종 줄기세포를 배양, 정화, 증식시켜, 자가세포 CMP를 사용하여 개인특유의 심근질환들 뿐만 아니라 허혈성 심근질환 치료를 위한 적절한 약제학적 조성물을 만들어 내는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 측면은 자가 인간혈청과 영양분들이 항응고제와 항응고제 작용에 반하는 물질과 동시에 함유되어 있는 자가 인간 원종 줄기세포들의 배양배지에 관한 것이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 이미 언급된 자가 인간 원종 줄기세포들의 배양배지를 조제하는 방법에 관한 것으로서, 특수한 조작을 하여 그 배양배지에 있는 자가 인간 혈청을 혈장사혈을 통해 얻어낼 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 언급된 자가 인간 원종 줄기세포들의 인 비트로 상태에서의 배양, 정화, 증식을 위한 배지의 사용에 관한 것이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가 인간 원종 줄기세포들의 조성을 얻어내는 방법에 관한 것으로서, 언급된 자가 인간 원종 줄기세포를 배양하여 얻어진 그 자가 인간 원종 줄기세포들을 정화하는 조작을 포함한다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 세포치료학적 응용에 유용한 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 얻어내는 방법에 관한 것으로서, 언급된 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 배양하고, 얻어진 그 자가 인간근육 원종 줄기세포를 정화시키는 것을 포함한다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 많이 배양할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 자가 인간근육 원종 줄기세포는 약제학적 관점에서 타당한 정도로 한가지 또는 더 많은 부형물질을 같이 함유하고 있다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가세포 CMP의 치료학적 방법에 관한 것으로서, 자가 인간근육 원종 줄기세포와 심장조직의 재생기와 자가 배양 배지에서 증식된 탈체를 구성하는 약제학적 조성물을 이식시키는 방법으로 기능부전의의 심근 조직을 만들어 내고 재생시키며 복구시키게 하는 것이다.

1. 자가 배양 배지

첫번째 관점에서, 본 발명은 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지에 관련된 것으로서, 이하 "자가 배양 배지의 발명" 이라 칭하며 그 배지는 다음과 같이 구성된다:

a) 자가 인간혈청 무게의 0.1 에서 90% 사이

b) 헤파린 무게의 0.1 에서 10000 UI/ml 사이;

c) 프로타민 무게의 0.1 에서 10000 UI/ml 사이; 그리고

d) 100%무게까지 충분한 양으로, 글루타민이 있거나 또는 없는 기본영양분을 함유한 배양배지.

본 발명의 자가 배양 배지는 자가 인간 원종 줄기세포들을 그 다음 이식할 대상인 동일 환자로부터 얻어낸 자가 인간혈청에서 만들어진 완전한 배양배지이다. 이 자가 인간혈청은, 원한다면, 기존의 치료법을 따를 수도 있다. 예를 들면, 보체(complement)를 불활성화하기 위한 온열 치료법 같은 방법이다.

자가 인간혈청은 어떠한 기존의 치료법에 의해서도 자가 인간 원종 줄기세포들을 후속으로 이식할 대상인 동일환자로부터 얻어낼 수 있다. 예를 든다면, 그 환자의 혈액 표본이나 또는 언급된 환자에게 가급적이면 혈장사혈(plasmapheresis)을 행하는 방법이 있겠다. 본 발명의 특정 과정에서 혈장사혈은 항응고제로 헤파린과 항응고를 막는 프로타민 설페이트(protamine sulfate)를 사용한다. 잘 알려진 것처럼, 혈장사혈은 시트르산 덱스트로스 항응고용액(anticoagulant solution acid-citrate-dextrose: ACD)을 사용 한다-물 1리터에 시트르산 모노하이드레이트(citric acid monohydrate) 8g, 시트레이트(citrate) 22g, 항응고제로서 글루코스 모노하이드레이트(glucosemonohydrate) 24.5g을 첨가한 액. 이 항응고액은 칼슘 킬레이터(calcium chelator)를 제공하여 ACD의 효과를 방지하고 혈장사혈과정에서 혈청을 얻을 수 있게 한다. 그래서 이때 칼슘을 첨가하는 것이 필요한데, 이는 후에 세포 배양에서 방해가 되기 때문이다. 혈장사혈과정에서는 환자의 혈액 손실이 없기 때문에 혈장사혈 치료법은 환자의 혈액 표본으로부터 채취한 것보다 매우 많은 혈청 공급을 가능하게 하는데, 이는 환자를 위해서도 중요한 장점이 된다. 더욱이, 헤파린과 프로타민을 사용한 혈장사혈법에서 얻어진 혈청은 세포배양에서 보통 일어날 수 있는 문제점이 없이 배양배지에서 사용할 수 있다.

본 발명의 자가 배양 배지는 기본 영양분을 함유하고 있고, 선택적으로 글루타민(glutamine)을 함유하기도 한다. 세포배양을 위한 기본 영양분을 가지는 이용가능한 상업적 용도의 배지들이 있는데, 원칙적으로 세포배양을 위한 충분한 영양분을 공급하는 어떠한 배지도 이 발명에 사용될 수 있다. 그러나 특히 영양분은 HAM F12 [GIBCO BRL] 배지에 의해 공급된다.

특별하게, 본 발명의 자가 배양 배지는, 게다가, 항균성분을 포함한다. 실제로, 어떤 항균물질은 본 발명에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 자가 배양 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 그리고 이들 혼합물 중에서 선택하여 항균성분을 포함시킨다. 그러므로 본 발명의 자가 배양 배지는, 또한 원한다면, 항진균제도 포함할 수 있고- 예를 들어, 암포테리신(amphoterycin) B, 그리고 천연 또는 재조합 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast Growth Factor) (bFGF)와 같은 성장인자도 포함할 수 있다.

특별한 구현예에서, 본 발명의 자가 배양 배지는 다음과 같은 성분들을 포함한다:

배지 HAM F12 무게의 89%;

환자로부터의 자가 인간혈청 10%;

헤파린 0.1에서10000 UI/ml;

프로타민 0.1에서 10000 UI/ml; 그리고

1% 페니실린/스트렙토마이신 그리고 선택적으로

0.25 mg/ml 암포테리신 B and/or

0.1 to 250pg/ml의 재조합 bFGF

2. 자가 배양 배지 발명의 조작법

또 다른 측면에서, 본 발명은 주어진 자가 인간 원종 줄기세포의 배양배지 조작법에 관한 것으로서, 그것의 각기 다른 성분들을 혼합하고 균등하게 만드는 것을 포함한다.

한가지 이점인 것은 이미 언급된 혈장사혈법에 의한 자가 인간혈청은 혈장을 얻기 위해 항응고제로서 헤파린을 사용했고, 항응고기전을 막고 혈청을 얻기 위해 프로타민을 사용한다는 것이다. 이 과정 중에서 자가 인간혈청은 이미 헤파린과 프로타민을 포함하게 된다.

3. 자가 배양 배지의 사용

본 발명은 자가 배양 배지를 사용하여 자가 인간 원종 줄기세포들을 인 비트로 상태에서 배양시키고, 정화하고 증식시킨다.

자가 인간 원종 줄기세포의 증식을 위한 배양배지에서 자가 인간혈청을 사용하는 것은 많은 이점을 보인다. 예로서, 세포성장을 위해 어린 소 혈청을 사용하는 전통적 세포배양기술들에서 야기될 수 있는 조류 질환, 바이러스성 감염증, 동물원성 감염에 의한 오염의 위험없이 세포증식은 세계전역에서 수행될 수 있다. 소혈청 대신에 인간세포 배양에서 자가 인간혈청을 얻어 사용하는 것은 아래와 같이 아주 큰 이점을 보여준다:

1) 항원-항체 반응을 피할 수 있다, 2) 이종 단백질에서 야기되는 염증반응들을 피할 수 있다, 3) 인간에 적용하기 전에 소혈청에서 배양된 세포들에서 필요한 반복되는 세척으로 인한 파괴를 피할 수 있다. 실제로 자가세포 CMP를 수행한 임상적 실례에서 소혈청으로 치료한 후 2주 경과한 환자에게서 악성 심실 부정맥의 소견을 보여왔으며, 전체 40%의 환자가 합병증으로 인해 인공 세동제거기(Implantable defibrillator)의 이식을 필요로 하고 있다.

4. 자가 인간 원종 줄기세포 조성물의 준비 방법

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가 인간 원종 줄기세포의 조성물 준비 방법에 관한 것으로서, 그것은 자가 배양 배지에서 언급된 자가 인간 원종 줄기세포들을 배양하고 얻어진 자가 인간 원종 줄기세포들을 정화하는 과정을 포함한다.

실제로 어떠한 자가 인간 원종 줄기세포도 각각의 경우에 배지와 배양의 조건을 구체적 세포종류에 잘 맞추어 주면 본 발명의 자가 배양 배지에서 배양되고 증식될 수있다. 그렇지만 특히 자가 인간 원종 줄기세포가 자가 인간 근육 원종 줄기세포라는 것은 다음 장에서 자세히 설명하게 될 것이다.

그 자가 인간 원종 줄기세포는 자가 인간 원종 줄기세포들을 이식하게 될 적합한 대상환자에서 생검(biopsy)으로 얻어낸 것일 것이다.

본 발명의 자가 배양 배지에서 그 자가 인간 원종 줄기세포들을 배양하는 것은 세포가 성장하고 분화할 수 있는 조건에서 수행된다.

자가 인간 원종 줄기세포의 정화는 어떠한 종래의 방법에 의해서도 행해질수 있다. 특히, 언급된 자가 인간 원종 줄기세포의 정화과정은 면역정제과정을 포함하고 있고, 언급된 자가 인간 원종 줄기세포의 특징인 세포외 항원의 확인이 가능한 자가 인간 원종 줄기세포의 특정적 선택적 항체의 사용에 의해 수행된다. 유용하게도, 상기 자가 인간 원종 줄기세포들의 특정적 선택적 항체는 자기 마이크로스피어(microsphere)들에 결합되어 자기 세포 분리기의 사용에 의해 자가 인간 원종 줄기세포들을 정화해내어 많이 채취해내게 된다.

앞서 설명된 방법에 의해 얻어진 자가 인간 원종 줄기세포들은 약제학적 조성물로 제시될 수도 있고 유전자 치료에도 이용될 수 있다.

5. 자가 인간 근육 원종 줄기세포 채취 방법

앞서 언급한 것처럼, 본 발명에서 특별하게 선호되어 고려되는 실현에서는 자가 인간 원종 줄기세포가 자가 인간 근육(또는 근원성세포) 원종 줄기세포라는 것이다.

그러므로, 또 다른 측면에서는 본 발명이 세포치료에 사용하기에 적절하게 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻는 방법에 관한 것이고, 이는 언급된 배양배지에서 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 배양하고 얻어진 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 정화해내는 것이다.

자가 인간 근육 원종 줄기세포는 자가 인간 원종 줄기세포, 특히, 근골 생검조직을 이식할 적합한 대상환자에서 생검해서 얻어낼 수 있다.

지난 연구에서는 생검을 고려하기 앞서 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 증식을 자극하는 약물을 포함하는 약제학적 조합을 환자에 적용하는 것이 생검영역에서는 배양의 시작단계에서 언급된 세포들의 수를 증가시킬 수 있다고 말하고 있다. 특히, 근골 생검을 시작하기 전에 보통 선결조건화가 환자에게 적용될 때 이루어져야 하는데 생검전 이틀과 15분 전에 생검이 수행되는 부분인 근육사이를 통해 세포증식을 자극하는 언급된 약물을 포함하는 약제학적 조합이 적용되어야 한다. 특히, 언급된 약물은 리도카인 부피바카인과 같은 국소마취제로서, 근아세포의 증식을 촉진하며, 후에 세포배양의 더 놓은 효율성에서 고려되는 물질이다.

근골생검에 의한 근조직 표본이 수집되면 근섬유를 분해해 내기 위해 기존의 조작법을 써야 하는데, 이는 나중에 더 자세히 설명될 것이다. 결과적으로 얻어진 세포 현탁액은 본 발명의 자가 배양배지에서 배양된다. 일반적으로 근육생검에 의해 추출된 표본은, 지방세포, 섬유아세포, 간엽조직전구체, 조혈세포, 근섬유, 혈관조직(내피조직 평활근), 그리고 분명하게도 근아세포와 위성세포들과 같은 각기 다른 타입의 조직을 포함한다. 전형적으로, 생검에서 추출된 근골 표본에 있는 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 초기 성분은 CD56+/CD45- 가 10% 미만인 것으로 정의된다. 마찬가지로, 자신을 번식시키고 CD56 항원을 나타내는 근세포와 다르고 근육 전구체가 될 수 있어 정체 파악이 어려운 줄기세포(위성세포)도 작은 퍼센트 존재한다. 알려진 것처럼, 세포타입의 분화과정은 위성세포에서 근아세포로, 그 다음 미성숙 근세포로, 그 후 성숙근세포로, 그리고 마침내 근섬유로 단계적으로 구성된다. 근육 전구체는 근아세포, 근세포(성숙,미성숙)일 것이고, 그것은 항원 CD56가 존재함에 의해 확인될 수 있고, 세포간혈장의 데스민 유출이나 항원 CD45(즉, 그것들이 표현형 CD56+/데스민+/ CD45-를 나타냄)가 없는 사실에 의해서도 확인가능하다. 세포 배양과정에 위성세포와 근아세포의 증식이 촉진되고 근세포로 변화되고 있다. 그러므로, 배양배지에서 배양과 세포증식 후에 환자의 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 주입하기 위한 약제학적 조합을 조작해 내는데 쓰이는 근아세포와 근세포들(성숙 그리고 미성숙)이 축적된다. 일단 주입되면 적합한 환자에게서 분화과정을 끝내고 근섬유로 변화되고 그들의 기능을 발전시킨다.

본 발명의 자가 배양배지에서 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 배양은 세포증식(성장과 분화)를 가능하게 하는 조건에서 이루어진다.

자가 인간 근육 원종 줄기세포의 정화는 기존의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 특히, 언급된 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 정화는 이 세포들의 특정적 선택적 항체들의 사용을 포함하며, 이 항체들은 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 특징이라 할 수 있는 세포외 항원의 확인을 가능하게 해준다. 예로서, 조혈세포 CD45(즉, CD56+/CD45- 의 표현형을 보이는 세포들이 선택된다)의 선택적 항원이 없을 경우 인간 항체 anti- CD56(CD56은 근육 골격의 특징적 세포외 항원이다).

유리하게도, 상기 항체들은 자기 마이크로스피어들에 결합되어 자기 세포분리기에 의하여 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 정화하고 풍부하게 한다. 또 다른 특별한 실현에서는, 세포배양이 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 확인 분리하는 과정 전에 섬유아세포들을 안정시킬 목적으로 사전 평판배양(pre-plating)의 전단계를 거쳐야 한다는 것이다. 이 경우, 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 정화는 언급된 세포배양에서 섬유아세포 전체 또는 일부분을 안정시킬 목적으로 사전 평판단계로의 세포 배양을 수행하고, 그후 인간 항체 anti- CD56, 선택적으로는 자기 마이크로스피어에 결합된 인간 항체 anti- CD56의 사용과 표현형 CD56+/CD45- 를 보이는 세포들의 선택에 의하여 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 확인 분리하는 것을 포함한다.

앞서 언급한 방법에 따라 얻어진 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 포함하는 조성은 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다.

선택적으로, 본 발명은 근골조직 생검으로부터 시작하여 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 채취하는 과정을 제공하며, 약제학적 조합을 준비하기 위해:

a) 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 포함한 근골조직 조각을 추출하기위해 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 이식할 대상환자에서 생검을 수행하고;

b) 배양된 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 증식을 가능하게 하는 조건 하에서 본 발명의 자가 배양배지에서 골격근으로부터 얻은 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 배양하고;

c) 상기 배양된 자가 인간 근육 원종 줄기세포를 정화하고; 그리고

d) 상기 정화된 자가 인간 근육 원종 줄기세포를 수집하고; 그리고 선택적으로

e) 상기 정화된 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 약제학적 조성을 만들 때까지 냉동시키는 것을 포함한다.

앞에서 언급했듯이, 생검이 이루어질 부분에 리도카인이나 부피바카인같은 국소마취제를 생검전 이틀과 15분 사이 간격으로 환자에게 국소적용하는 것은 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 증식을 촉진하고 배양 시작단계에서 그러한 세포의 수를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 자가 배양배지에서 골격근으로부터의 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 배양은 그 세포들의 증식이 가능한 조건하에서 연속된 기존의 방법들, 예를 들어, 세척, 지방조직 제거, 근육 부수기, 효소적 분해, 여과, 침강에 의한 세포 수집의 수행을 포함하고 있다. 일반적으로, 근섬유의 효소분해 후에 많은 양의 세포 파편들을 포함한 세포 현탁액이 생산된다. 배양단계 후에 세포들과 섬유 찌꺼기들은 제거되고 이 현탁액에는 근육 원종 줄기세포가 풍부해진다.

배양된 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 정화의 목적은 다른 것들 중에서도 실질적으로 근육아세포가 없는 자가 인간 근육 원종 줄기세포가 풍부한 조합을 얻어내는 것이다. 이 목적을 위해 세포배양은 근아세포나 위성세포보다 더 빨리 침강하는 근아세포의 성질에 의해 사전-평판배양의 첫단계를 진행할수 있고 그 후의 과정으로 기존의 방법에 의해 자가 인간근육 원종 줄기세포의 확인 및 분리 과정을 수행할 수 있는데, 그 세포의 특정적 선택적 항체를 이용하는 방법이 있다. 표현형 CD56+/CD45-를 보이는 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 특징인 세포외 항원을 확인가능하게 하는 것으로 그 항체는 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 선택적으로 인식하고, 자기 마이크로스피어에 선택적으로 결합된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 구성하는 약제학적 조성에 관한 것으로, 적어도 약제학적 관점에서 타당한 한 부형물질이 같이 포함되어 있다. 특히, 그러한 약제학적 조성물은 주사제 형태로 투여하는 방법이 적당하다. 원칙적으로 약제학적 관점에서 타당하고 자가 인간 근육 원종 줄기세포을 운반할 수 있는 부형물질이 본 발명에 이용될 수 있다. 특별한 실현에서, 그런 약제학적 조성물은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 재현탁시킬 수 있는 부형물질로 사용되는 알부민을 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "약제학적 조성물" 은 세포이식과정 중 치료 목적을 위해 준비된 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 조성물을 지칭한다. 이 조성물은 적어도 5천만 cells/ml의 세포 밀도와 적어도 40%의 자가 원종 줄기세포들 CD56+/ CD45-40를 갖는 최소 2천만개의 세포들, 본 발명의 자가 배양배지, 및 적어도 약제학적 관점에서 타당한 부형물질을 포함한다. 특별한 실현예에서, 그러한 약제학적 조성물은 5천만 - 7천만 cells/ml의 세포밀도와 적어도 70%의 자가 원종 줄기세포 CD56+/CD45-를 갖는 2천만 내지 2억개의 세포들과, 본 발명의 자가 배양 배지, 및 전체 무게에 대하여 0.1% 내지 0.2%의 양을 갖는 인간 알부민을 포함한다.

앞에서 설명한 방법으로 얻은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들과 그 세포들을 포함한 약제학적 조성물은 다음과 같은 용도의 약제학적 조성물의 제조에 이용될 수 있다:

심근 조직의 복구 및/또는 재구성의 목적, 및/또는

허혈 후 심부전의 치료 목적, 및/또는

심근 확장 질환의 치료 목적 및/또는

비허혈 심근질환의 치료 목적.

6. 치료 과정

다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가 세포 CMP의 치료과정에 관한 것으로서, 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 포함하는 약제학적 조성물을 이식해서 기능 부전의 심근조직을 만들고 다시 재생하고 복구시킨다. 이것은 그 세포가 심조직을 재생하는 능력이 있음에 기인하고, 자가 배양배지에서 증식되고 탈체상태(ex vivo)로도 유지할 수 있다; 상기 과정은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 이식할 대상 환자로부터 얻은 물질 표본을 수집하고, 본 발명에서 제공된 자가 배양배지에서 배양시켜서 그 세포들을 증식시키고, 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 함유하는 물질을 추출하였던 그 환자에게 상기 수집된 자가 인간원종 줄기세포들을 이식하는 것을 포함한다.

확실히 전망할 수 있는 것은 본 발명이 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 포함하는 약제학적 조성물의 이식을 통해 자가 세포 CMP의 치료 과정을 가능하게 해줄 수 있다는 것이다. 그 세포는 심조직의 재생기가 되고, 탈체로 유지될 수 있고 자가 배양배지에서 증식된다; 그리고 상기 과정은,

a) 가급적 리도카인이나 부피바카인 같은 국소마취제를 근육주사해서 전처치한 환자의 근육으로부터 골격근을 생검하고;

b) 상기 환자의 자가혈청으로부터 자가인간 원종 줄기세포들의 배양배지를 준비하고;

c) a)의 생검과 b)에서의 배양배지로부터 자가 인간 근육 원종 줄기세포가 풍부한 조성물을 준비하고;

d) c)의 조성물로부터 약제학적 조성물을 준비하고;

e) d)의 자가 원종 줄기세포의 약제학적 조성물을 심근 손상 부분에 이식하는 단계들을 포함한다.

자가 인간 근육 원종 줄기세포는 근아세포와 근세포(성숙 그리고 미성숙)로 구성되어 있고, 그 세포들이 심근에 이식될 때 심조직을 재생하는 능력을 가진다.

본 발명에서 사용되었듯이 "심근 손상" 이라는 용어는 개개의 특이적인 심근질환들뿐 아니라 허혈상태를 말한다. 특히, 본 발명에 의한 자가 세포 CMP 시술은 수술이나 상피 맥관재생의 가능성이 없는 심근경색으로 인한 허혈성 심근질환환자와 다른 심장 맥관재생술을 한 환자에게 적용될 수 있다. 이 자가 세포 CMP의 목적은 경색이 증폭되는 것을 막고 심근 재구형하고 김근을 재생하는 것이다. 허혈성 심근질환의 정의는 좌우심실경색이 있으면서 나중에는 승모판의 허혈성 역류 가능성이 있는 환자를 포함한다. 특히, 본 발명에 의한 자가 세포 CMP 과정은 특이적 확장성 심근질환을 가진 환자에게 적용된다.

세포 CMP의 장점에는 섬유종 감소, 경색된 손상 부위 축소, 심실벽의 탄성도와 속성(심장 확장 기능의 복구에 필수적)의 개선이 있다.

특별한 구현예에서, d)에서의 자가 원종 줄기세포의 약제학적 조성물을 심근 손상 부위에 이식하는 것은 직접 주입하는 방법에 의한다. 본 발명에서 사용된 용어 "직접 주입에 의한 이식" 은 허혈성 또는 특이적 심근질환을 가진 환자에게 본 발명에서 제공된 약제학적 조성물을 심회막이나 맥관내피에 적용하는 것을 가리킨다. 특히 고려할 것은 허혈성 심근질환 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 심외막이나 맥관내피에 적용하는 경우 다음과 같은 퍼센티지에 따라서 분포된다:

경색 말초부위에서 대략 70%, 손상부위의 중심부위에서 대략 30%. 심외막 적용은 기존의외과적 노출이나 흉강경에 의한 것이고 외과적 근사(고전적 또는 축소 흉골절제술)에서 허혈 부위는 경색 부위와, 주로 주변 부위에 치료용 조성물을 주입할 수 있도록 잘 노출된다. 본 발명에서 제공된 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 함유하는 약제학적 조성물의 주입은 손상주변 부위에도 가능하다. 본 발명에 의한 이식의 확산으로 잔여물을 관류시켜서 말초 부분에서 이식된 세포가 주요하게 생존할 수 있고 총체적 심근 맥관재생이 가능할 수 있다. 그리고 심한 섬유증 허혈성 상해에서 이루어진 이식과정에서 관찰될 수 있는 높은 세포 치사율을 어느 정도 피할 수 있게 된다.

또 다른 특별한 구현예에서, 심근 손상부위에 d)의 자가 원종 줄기세포의 약제학적 조성물을 이식하는 것은 체순환경로 또는 상피 정맥 통로를 통해 관상혈관을 통한 주입에 의한다.

또 다른 특별한 구현예에서, 본 발명에 의한 자가 세포 CMP 과정은 특이적 확장성 심근질환을 가진 환자에게 적용되는데 좌우심실의 심근에 있는 관상동맥사이에 본 발명에서 제공하는 약제학적 조성물을 다중으로 이식하는 것이다.

최근, 심장 수술에 새로운 컴퓨터화 외과 처치 시스템이 도입되었다. 로보트가 보조하는 관상혈관교 수술이나 흉부를 통한 바이패스(부행로) 수술이 증가하고 있다. 이것은 감염위험의 감소와 뛰어난 외관적 결과로 환자가 빨리 안전하게 회복할 수 있도록 하고 있다. 특히, 바늘이 영상-제어 로보트 손에 의해 심근에 삽입되고, 관도 흉부 바깥에 위치하며 작은 직경을 가진 확장 튜브에 바늘이 연결되어 있다. 심부전 환자에서 이와 같이 접근할 수 있는 이점은 자가 세포 CMP 치료는 심장을 직접 조작하지 않고 안전하게 이루어 질 수 있고 혈류학적 교란이나 심실세동의 위험도 피할 수 있다.

이 세포 CMP의 좋은 효과는 주입된 세포의 치사율로 인하여 제한될 수 있다. 이 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 자가 원종 줄기세포의 경피적 또는 외과적 이식과정에 의한 주기적 주입이 이루어져야 한다. 이 접근은 점차적으로 경색된 부위를 줄여가거나 병소부위인 심근부위를 개선시켜서 본 CMP의 목적을 이룰 수 있게 해준다. 이 목적과 더불어 본 발명은 각 개체의 세포배양과정 중에서 세포들을 격리시켜 냉동시켜서 각 자가 원종 줄기세포환자의 개인 맞춤 은행을 만들어 준다. 그 저장된 자가 원종 줄기세포로부터 새 세포배양이 새로운 생검이나 조직 제거 과정 없이 새로운 조성물을 만듦으로서 확장될 수 있다.

다음의 예들은 본 발명을 묘사해주고 그에 의한 무한한 목적을 설명해 줄 것이다.

예 1

이 예에서는 자가 세포 CMP를 사용하여 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 채취하고 조작하는 과정이 기술되어 있는데, 수축기 이완기 혈압을 만들어 내는 살아있는 조직학적 구조에서 보이는 손상된 기능부전인 심근조직을 복구하는 목적이 있다.

1.1 골격 근육의 생검

외과적 생검을 가지고 과정을 진행시키기 전에, 그것을 리도카인 2% 용액을 전회측 대퇴근과 주위로 환자에게 근육주사하였다. 생검은 전외측 대퇴근에서 5 cm 절개해낸 것이고, 멸균상태로, 2 m³내지 3 m³ 근골 조각이 삽입되었다(15g). 추출된 근육조직은 즉시 가위로 조각내어지고, 완전 배양배지 또는 황산완충용액에 삽입되고 4℃의 온도로 유지된다. 세포 격리와 정화 과정과 그 배양은 세포생존이 보장되도록 가능한 신속히 시작될 것이다. 그 표본은 적합한 용기와 저온을 유지하는 세포생물학 실험실에서 수행된다.

1.2 자가 배양배지의 준비

혈액 표본으로부터

혈액을 수혈하는 과정에서 정맥혈은 환자에서서 뽑게 된다. 혈청 수집을 위해 10ml 용량의 50개 튜브들이 정맥주사로 채워진다. 단층유입만 되는 밀실에서 세포들을 침강시키고 피브린을 침전시킨 후에 혈청은 각 튜브로부터 추출되고 비어있는 혈액백에 수집된다. 혈청 표본은 혈액학적 미생물학적 실험(세균과 바이러스)을 위해 취해지는데, 그 혈청이 담긴 백은 -80℃에서 냉동되고 혈액학적 미생물학적 실험 결과를 기다리게 된다.

배양배지를 준비하기 전, 혈청의 보체는 한 시간 동안 56℃에서 열처리되어 불활성화되고 여과된다. 부분적 혈청은 배양배지에 결합되어 4℃에서 보관된 후 37℃까지 가열하여 세포 배지가 있는 병에 붓기 전 여과한다. 최종 배양배지는 환자의 자가 인간혈청 10%, 배지HAM-F12 (GIBCO-BRL, Cat. No.21765 ) 89%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, 헤파린 (수집된 혈청의 2 UI/ml ), 프로타민(설페이트 용액에서), (수집된 혈청의 3UI/ml ), 그리고 선택사항으로 암포테리신 B (0.25 mg/ml ) 그리고/ 또는 0.1 에서 250pg/ml의 재조합 bFGF를 함유한다.

남아 있는 인간혈청은 -40℃에서 얼려서 새로운 배지 준비에 사용될 수 있도록 한다. 모든 배양 준비 조작에서 보체는 다시 56℃에서 불활성화시켜서 여과한다.

혈장사혈과정으로부터

혈장사혈 과정을 실시한 직후 환자에게 비단편 소디움 헤파린 50 UI/kg 을 적용한다. 혈장사혈과정은 사용되는 장비에서 보통 진행되던 과정대로 수행된다. 혈장사혈 중에 표준 항응고제는 헤파린함유 0.9% 식염수로 대체된다. 혈장은 5% 알부민으로 대체된다. 이 과정은 자가 배양배지 준비에 필요한 혈장의 양을 확보하면 종결된다. 수집된 혈장에서 헤파린의 양은 환자의 혈장 용적에 따라 계산되고, 헤파린 각 UI 당 프로타민 1.5UI 만큼이 가산된다. 그것은 혈장 응집이 생성될 때까지 유지된다. 그후 혈청은 냉동된 정제수에서 추출되고 분포된다. 혈액표본에서 수집된 혈청에서처럼, 이 경우 그 혈청표본은 사용되기전 혈액학적 미생물학적으로 분석된다.

1.3 위성세포의 분리와 in vitro 증식

모든 조작은 멸균상태로 단층유입밀실에서 수행된다. 체외이식된 근육 골격의 조각들은 황산완충용액에서 세척된다. 지방조직은 가위로 제거되고 세심하게 근육들을 부순다. 근육조각들을 다시 황산완충용액에서 세척하여 상층부분이 깨끗이 나타나도록 한다. 100그램을 5분동안 원심분리한다. 그 조직은 2가지 병행하여 효소처리를 해서 분해시키는데; 첫째로, 세포들은 콜라게나제(collagenase) IA (1.5 ml/mg/g 섬유)에서 배양시키는데 한시간동안 배양한다. 매 10분마다 기계적으로 튜브를 흔들어 분해가 잘 되도록 한다. 또 그 튜브는 37℃에서 상호 궤도교반작용이 있는 배양기에 넣을 수도 있다. 둘째로, 그것을 20분동안 0.25 트립신(trypsin) 1X EDTA (2ml)를 넣어 배양한다. 끝나면 즉시 세포들을 세척하고 (300그램을 10분동안) 효소반응을 멈추기 위해 환자에게서 얻어진 적합혈청을 1ml 첨가하도록 한다. 여과는 40 (세포착색나일론) 크기의 망을 사용한다. 망에 남겨질 수 있는 조각들은 분해과정을 반복해서 처리한다. 마지막으로 여과 세포는 침강(300그램을 20분)으로 수집하고 상층부분은 버린다.

세포는 신선한 완전 배양배지, 즉, 환자의 자가 인간혈청 10%, 배지HAM-F12 (GIBCO-BRL, Cat. No.21765) 89%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, 그리고 선택적으로 암포테리신 B (0.25 mg/ml), 상기 암포테리신 B는 헤파린 (수집된 혈청의 2 UI/ml), 프로타민 (설페이트 용액에서), (수집된 혈청의 3UI/ml )을 추가로 포함하는 신선한 완전 배양배지에서 재현탁되고, 그리고 세포배양을 위한 병에 심겨진다. 그 후, 병들은 습도가 높은 환경, 37℃, 3주간, 5% H₂O가 있는 조건에서 배양된다. 병들은 불규칙적 세포증식을 막기 위해 단계를 구분하지 않고 배양기에 놓아둔다. 2일에서 3일동안 배양한 후 혈액세포와 죽은 세포들을 제거하기 위해 배지를 다시 갈아준다. 그 세포들이 자라서 세포합류가 50% 될 때 배양의 한 단계는 높은 밀도로 근육 분화를 보이는 현상을 막기 위해 제외되어야 한다(1:5 비율로). 50% 세포합류가 이루어질 때 모노뉴클레오타이드(mononucleated) 세포들이 모노뉴클레오타이드 근관에서 분화하는 것을 막기 위해 여러 단계들이 필요하다

배양의 각 단계에서 세포들은 트립신처리를 함으로서 얻어진다(각 병마다 2.5트립신 2ml/EDTA 함유하고, 배양기에서 1분에서 5분동안 배양). 완전한 세포 분리는 떠있는 세포들을 현미경을 통해 관찰함으로 증명할 수 있다. 그리고 반응은 완전한 배양배지의 첨가로 멈추어지고 최종산물인 세포의 현탁액은 다른 다섯개의 병에 분포된다. 세포배양과정의 각 단계에서 세균(호기성, 혐기성 세균 실험)과 바이러스 곰팡이가 제어된다.

1.4 섬유아세포들의 제거

섬유아세포들은 일반적으로 배양을 오염시키기 때문에, 적합한 근아세포의 증식을 수행하기 위해 이들을 제거해야 한다. 그 첫 단계를 수행하고, 트립신으로 주화한 후 배양된 세포들은 30분동안 배양기에서 보관된다. 이 시간이 섬유아세포가 침강하기에 충분하며 그 동안 근아세포의 대다수(보다 작음)가 현탁상태로 있다. 세포상층부는 수집되고 새 배양병에 옮겨진다. 근아세포의 순도는 인간항체 ANTI-CD56을 이용한 유량 세포계산기와 세포간 데스민 염색법으로 측정한다. 근아세포 순도가 50%에 못미치는 표본은 다시 세포 농축에 들어가야 한다. 그 목적을 위해 두번째 단계에서는 세포들을 얻고 그것을 심기전에 쥐항체 항인간 CD56을 표지시켜 자기 마이크로스피어에 결합되도록 한다. 자기 세포분리기를 사용하는 양전하 선택방법에 의하면 90% 이상의 세포들에서 CD56과 데스민을 나타내는 근아세포, 원종근육세포들이 풍부한 세포 집단들이 얻어진다.

보통 최종적으로 필요한 양만큼의 세포들을 얻기 위해서는 여러 과정이 이루어져야 한다. 일반적으로, 대략 3주가 되어야 2억개 이상의 세포들을 얻을 수 있다. 이 숫자는 다중연쇄 배양체계에서의 과정들에서 상승될 수 있는 것이다.

1.5 맞춤은행을 위한 세포분리

세포배양과정중에서 몇 세포는 냉동되어 각 환자를 의해 분리될 수 있다. 이렇게 저장된 세포로부터 시작되어 주기적으로 반복해서 심근간 주입을 할 경우(그때 반복되는 생검은 피한다) 새 세포배양은 증식될 수 있다. 두번째 단계에서 CD56이 고농도로 농축된 양성 세포의 표본들은 5% DMSO 용액에서 저온보관되어서 프로그램에 따라 냉동되고, 결국 액체질소에서 저장되는 것이다. 세포 농도는 25에서 50 million/ml 가 될 것이다, 다시 필요해지면 차후의 목적 (경피적 이식) 을 위해 세포들을 다시 녹이고 근아세포 배지에서 배양시키는데 그것은 탈체 증식을 시켜온 것이다.

1.6 주입액 배지

세포 이식을 하는 날 세포는 주입액 배지(인간알부민 0.5%와 완전 배양배지)에서 얻어지고 세척되며, 이식 전에는 얼음에서 보관된다. 유량 세포계산기에 의해 근아세포의 최종순도율이 측정된다. Malassez 세포계산기(트립판 청색 염색법에 의함)를 사용하여 세포농도와 생존능력을 결정한다. 이와 같이 이식 전에 세포배양멸균도 또한 측정된다(그램 테스트).

1.7 세포배양 과정

세포이식은 심외막과 혈관내피에 적용된다. 심외막에 적용하는 것은 기존의 외과적 노출 또는 흉강경에 의해 할 수 있는데, 외과적 접근에서는(고전적 또는 축소 흉골절개술) 허혈 부위가 잘 노출되어서 경색부위와 주로 주변 부위에 세포현탁액을 대략 10번 주입할 수 있어야 한다. 이 목적 때문에 바늘은 휘어진 것으로 23에서 26 G 4cm를 사용한다. 권장되는 세포농도는 50에서 70 million/ml 이다. 이 주입은 대략 15분 동안 천천히 되어야 한다. 다 주입한 후에 각 바늘의 구멍은 세포현탁액의 역류를 막기 위해 1분에서 2분동안 프린트 압력으로 막아져야 한다.

근아세포의 이식 프로토콜:

- 최소 2천만개 세포들을 이식. 가급적이면 약 2억만개.

- 세포 농도; 50 - 70 million/ml.

- 배양시간; 약 21일.

- 근아세포농도; 70% 상회.

- 평균세포수명 2-8 C ; 96시간.

예 2

이 예는 심근경색을 앓고 잇는 환자에게 본 발명의 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 조성물을 심근사이에 이식하기 위한 적합도와 안전도를 평가하는 1상 2상 임상시험이다

물질과 방법

2.1 환자의 선택

이 실험은 최소 본 프로토콜에 포함되기 4주전부터 심근경색을 앓아온 총 12명의 환자에게 수행되었던 것으로서, 그들은 관상동맥 바이패스가 필요했던 환자들이다. 환자 선택을 위해서 연령(30세부터 80세까지 포함), 심장 기능(좌심실 박출율이 25% 상외) 그리고 악성부정맥이나 근육위축병력이 없고, 간부전 신부전 테스트나 임신테스트, HIV나 간염에서 모두 양성이 아닌지 확인한다.

2.2 근육 생검과 그 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 배양과 특징

예 1 에서 기술된 것처럼 치료를 위한 조성물을 위해 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 준비하는 조작이 수행되었다. 근육생검은 염산 리도카인으로 전처치를 한 후, 멸균상태에서 전측부 대퇴근으로부터 실시되었다. 본 과정에서 본 발명의 자가인간 배양배지는 79% 배지 HAM F12 (GIBCO-BRL)를 포함한다. 단락 1.2의 마지막 예에서 설명된 것처럼 그 환자의 자가혈청은 혈장사혈을 통해 채취되고 근육 생검을 실시하는 전날 수행되었다.(환자당 800에서 2135ml, 평균; 1735ml )

위성세포의 분리를 위해서 효소적 분해를 배양기에서 실시했는데, 처음에 트립신/EDTA (0.5 mg/ml, 0.53 mm EDTA, GIBCO-BRL)를 넣어 실시했고, 그후 콜라게나제(0.5 mg/ml, GIBCO-BRL)를 넣어 실시했다. 세포증식과 섬유아세포의 제거 과정은 앞에서 보여준 예처럼 수행하였다. 채취된 근아세포의 순도는 유량 세포계산기로 측정하였는데 인간 N-CAM (CD56), CD45 와 데스민에대한 선택적 단클론성 향체들로 염색하여 측정하였다.

평균 근원 세포들은 환자당 221 10 (항상 105- 390 10 범위내) 개가 얻어졌고 근원세포 CD56+/CD45-의 평균 순도는 65.6±6.4%였다.

2.3 세포의 이식술

외과적 처치 전에 각 환자는 양자방출단층촬영기(PET) 와 초음파 심음향도 (HOLTER EGC 24시간)를 사용하여 기능과 생존능력을 확인한 후 결정한다. 체외 순환과 함께 관상동맥 바이패스도 근육생검 시행 후 3주에서 4주사이에 시행되었다. 환자는 평균 2개의 이식편을(1개에서 4개 사이) 받았다.

일단 모든 이식편을 봉합하고 자의적 심박을 재정립하면 세포이식은 최소 열번의 반복된 주입에 의해 경색부위 및 주변 부위 심외막에 적용되었다. 초음파 심음향도의 관점에서 해당구역인 것은 저동성,무동성 또는 운동이상증으로 확인되어 온 곳들이다. 주입을 위해서는 안구를 통한 캐뉼러 23G (Maersk Medical Ltd. Redditch, B98 9NL GB)가 사용되었다. 세포이식을 받은 구역은 외과적 처치 전에 초음파 심음향도에 의해 확인되었는데, 그 목적은 세포 이식술을 차후에 감시할 동안 그 구역의 수축율을 평가하기 위한 것이다.

외과적 처치 후에 환자들은 연속적인 원격모니터링을 받아야했다. 혈액표본은 심장괴사 효소의 존재를 평가하기 위해 매 6시간마다 채취되었다. 염증을 예방하기 위해 메틸프레드니졸론이 수술후에 500mg 적용되었다. 심장 부정맥을 예방하기 위하여 경구로 아미로다론을 3개월동안 복용하였다고 보고되었다. CMP 처치후 반응을 모니터링하기 위해 PET와 (이식후 3개월) 초음파 심음향도 (이식후 40일과 3개월) 사후관찰을 했다. 이처럼 Holter-ECG 를 사용해서 부정맥의 유무도 모니터링하였다(이식후 40일과 3개월).

그 프로토콜과 모든 과정들은 법적으로 요구되는 사항에 따라 제도적으로 지역적 인종적 위원회의 임상시험에 대한 사전 승인 후 진행된 것이다.

초음파심음향도적 연구

전체적 지협적 심근 수축율은 이차원 초음파 심음향도에의해 측정되었다(초음파 시스템 Sonos5500 필립스). 지협적인 좌심실벽의 운동 분석은 Standard Committee of the American Society of Echocardiograghy (Schiller NB er al, JAM Soc Echocardiogra. 1989;2;358-367)에 기록된 과정에 의하였다; 좌심실은 16 부분으로 나뉘어 졌고 각 부분에대한 벽의 운동은 1=정상 2=저동상태 3=무동상태 4=운동실조. 지협적 운동성의 지표 (벽의 운동 스코어 지표, WMSI)는 각 부분 지표를 더하고 평가된 부분의 숫자로 나누는 것이다. 지표 WMSI는 세포이식에서 다루어진 부분에서 얻어진 것이고 다른 것들은 처치가 없었던 부분에서 나온 것이다. 좌심실박출율(LVEF)은 심내막 경계 자동추적기에의해 얻어진것이다(자동경계추적기 ABD) (Perez JE et al, J. Am. Coll. Cardiol. 1992;19;336-344). 각 부분의 지협적 수축율은 색역학과 조직 도플러에 의해 측정되었고, 이 평가들은 이중맹검 (사전에 아무것도 모르는 2명의 개개 관찰자)에 의한 것이다. 이 실험에서 좌심실의 최종 이완기 용적에서의 재생산성은 2.8±6.4 (CV5.5%,) 그리고 박출율은 (LVEF) 0.3±4.6 (CV 6.6% ) 이었다.

양자 방출 단층촬영 영상화 (PET)

외과적 처치 전과 세포 이식후 3개월에 심근의 혈류, 대사 포도당을 PET로 측정했다.

관류와 대사 실험은 PET(ECAT EXACT HR+ Siemens/CTI knoxville, USA)로 수행했다. 이것은 4.5mm 단면사이에서 공간 해상도를 가지고 62개 경축 방향을 촬영할 수 있다. 포도당 대사 (¹⁸F-FDG)의 연구와 관류되는 물질 (¹³N-ammonium)을 추적하기 위한 물질을 생산하는 것은 원자핵 파괴장치 (cyclone 18/9, Ion Beam Applications, Belgium)와 방사선 약학 연구센타에서 수행되었다.

각 환자에서 촬영결과를 얻는 프로토콜은 시야에 심장을 국재화시키기 위해 게르마늄-68을 사용하는 2분-전달 실험으로 시작되었다. 그리고 양자적 변성을 교정해내기 위한 5분 포착이 이어졌다. 그 직후 ¹³N-ammonium (9.25 MBq/Kg, maximum 740 MBq)은 분당 10ml의 등속으로 정맥주입되어 관류된다. 역동적인 영상 포착은 주입 순간에 시작되었다. 역동적이고 순차적인 연속적 영상들은 가변적 존속 계획과 함께 20분동안 얻어졌다: 12 x 10s, 4 x 10s, 4 x 30s, 3 x 300s. PET 자료 습득은 도서목록에 이미 기술된 프로토콜에 따라 수행되었다(Muzik O et al. J. Nucl. Med. 1993;34;336-344). 일단 영상들이 관류평가를 위해 모아지면 ¹³N-ammonium 방사능(분해반감기 9.9 분)의 물리학적 퇴행을 가능케 하는 50분이 생겼다. 순차적으로 영상들의 습득은 포도당의 대사 실험에서 시작되었고, 다음의 진혈당성 과인슈린혈증의 고정 방법에 의해 수행되었다(Knuuti MJ et al,J. Nucl. Med. 1992;33:1255-1262). ¹⁸F-FDG 는 절충된 85에서 95 mg/dl 범위, 4.6MBq/Kg, 최대 370 MBq.에서 포도당 농도가 안정화 된 후에 한꺼번에 정맥주입을 했다. 연속된 ¹⁸F-FDG 의 영상 습득은 주입 순간에 시작되었다. 그것은 60분동안 지속되었고 (8 x15s, 2 x30s, 2 x120s, 1 x180s, 4 x300s, 3 x600s ) 그후 위에서 언급한 Knutti et al 에서 기술된 프로토콜을 이어갔다.

영상들의 습득을 마치고 변성을 교정하기 전에 그 전달의 분할이 수행되었다 대사 실험의 영상들은 OSEM법-2반복과 8부분집합-을 사용하여 재구성되었다(부분집합의 기대치의 최대화를 요구함). 모든 실험들은(대사뿐 아니라 관류에도) 6mm FWHM (full width at half maximum)의 가우시안 여과기 (Gaussian smoothing filter)를 사용했다. 보통 분석할 때 경축방향의 영상은 좌심실의 짧은 축과, 수직 장축, 그리고 수평 장축에 의해 새롭게 방향이 조정되었다.

결론적으로 정량분석에서는 좌심실의 짧은 축에서 중간영역의 6개 연속된 부분이 사용되었다. 심근 혈류는 3개의 구성 모형(Muzik O er al. J. Nucl. Med. 1993;34:83-91)에 의한 절대 속도로 계산되었고 포도당 이용율(심근 포도당 이용율 Rmgu )은 Patlak 그래픽 분석에 의해 추정되었다 (Patlak CS er al. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1985;5:584-590).

결과

2.4 세포 이식술과 외과수술 후 발전

인구통계학적, 임상적 그리고 실험에서 환자들의 기능적 특성들이 다음의 표 1과 2에 수집되어있다.

표 1 환자들의 특징

경우	나이	성별	국소적 경색	발전경색(달)	증상:앙기나/협심증	등급 NYHABasal/FU	국소적 Bypass
1	63	M	전방	4	불안정/Ⅲ	Ⅲ/Ⅱ	LAD, RC, OM
2	64	M	전방-끝	6	Ⅲ/Ⅱ	Ⅱ/Ⅰ	LAD, OM
3	40	M	하위	5	불안정/Ⅱ	Ⅱ/I	RC, LAD
4	55	M	전방	23	I/I	Ⅱ/Ⅰ	LAD,RC,OM
5	68	M	전방-끝	168	Ⅲ/Ⅲ	Ⅲ/Ⅱ	LAD, RC, OM
6	74	M	전방	10	/Ⅲ	Ⅲ/Ⅲ	LAD
7	69	F	하위	125	불안정/Ⅱ	Ⅱ/	LAD, RC, OM, Dg
8	71	M	하위	108	불안정/Ⅱ	Ⅱ/I	LAD, OM
9	56	M	전방	120	Ⅲ/	I/I	LAD, Dg, OM
10	74	M	하위	20	Ⅲ/Ⅱ	Ⅱ/	LAD, OM, Dg, RC
11	68	M	전방	3	I/I	Ⅰ/Ⅰ	LAD, RC, OM
12	73	M	전방-끝	146	Ⅲ/Ⅲ	Ⅲ/Ⅱ	LAD, Dg, OM

약어:

성별 M: 남성 F: 여성

분류 NYHA: 뉴욕심장학회의 분류

FU: 외과적 처치와 세포이식 후 3개월동안 관찰한 결과를 평가한 것

바이패스 부위 LAD: 좌전방 하행동맥, RC: 우측 관상동맥, M: 둔각 가장자리 동맥, Dg: 사선 관상동맥

관상동맥 바이패스 수술 중에 일단 이식이 끝나고, 자발적 심장박동을 회복하면 경색된 부위가 보이고 3ml에서 5ml 사이 용량으로 주입된 용액은 20x 10⁶ cells/ml 농도에서 근원세포들을 함유하고 있다. 주입영역은 초음파 심음향도 관찰로 확인되었다. 언급된 이식을 위한 세포 수집 직 후에 즉시 이식과정으로 넘어가기전 몇 미생물 배양이 오염을 예방하기 위해 수행되었다. 이러한 이유로 세포 표본이 그람테스트에서 양성이 나오자, 9번 환자는 이식술을 받지 못했다. 그럼에도 불구하고, 이 환자는 후속되는 관찰대상으로서 프로토콜의 실험 대상이 되었다.

표 2. 환자들의 특성

경우	근육 생검(g)	근육 세포이식(×10⁶)	Basal LVEF2D/ABD	LVEF FU2D/ABD
1	10	318	35/37	55/56
2	13	165	40/45	50/53
3	7.5	192	45/46	70/65
4	7	393	40/47	62/66
5	10	200	27/26	40/50
6	9	110	30/38	40/48
7	9.5	171	40/38	No FU
8	5.5	105	40/42	47/51
9	9	0	45/40	35/38
10	14	390	25/29	No FU
11	10	100	40/43	51/49
12	11.3	180	43/41	46/45

약어:

LVEF: 좌심실박출율

FU: 외과적처치와 세포이식후 3개월동안 관찰한 결과를 평가한 것

2D: 2차원적

ABD: 자동 심내막 경계 추적기

이식술을 받은 환자에서 외과처치후 발전은 합병증을 보이지 않았다는 것이다. 앞선 임상실험에서 골격 근원세포의 이식에 연관괸 심장부정맥이 관찰되었는데, 환자들은 입원중(계속적인 원격치료)에 모니터링 되었고, 이식후(Holter - ECG에 의해, 24시간동안) 40일과 3개월째에도 관찰되었다. 어떤 경우든지 부정맥의 현저한 증가가 있었다. 더욱이, 미성숙한 심실 박동수는 이식후 줄어들었다. 그러나 6번환자는 수술후 40일째에 비지속적 심실빈맥을 보였다. 위 사실을 설명할수 있는 사실은 이 환자가 외과처치중 동맥류제거술을 받았다는 것이다.

심장과 간의 효소를 혈청학적으로 분석한 것이 이식 후의 현저한 변화를 보여주지는 못하고 점차적으로 정상속도로 돌아갔다. 염증의 간접적 측정을 위해 사후관찰 중 이식술 시행후에 급진적 변화를 보임이 없어서 단백질C가 결정되었다. 모든 환자는 병원에서 퇴원하였고 모두 여전히 생존해있다.

2.5 좌심실의 기능

이차원 초음파심음향도로 측정된 좌심실박출율의 평균치는 외과적 수술 전에 35.5±2.3% (평균치±표준평균오차)로부터 53.5±4.98% 로 증가되었고, 이것은 이식한지 3개월됐을 때 측정된 것이다 (p<0.05). 자동 심내막 경계 추적장치(ABD) 의 초음파 심음향도에 의해 측정된 총체적 심장 수축율은 39.8 3.26% 에서 56.3 3.1% 로 증가되었다(p<0.05) (그림 1).

또한 국소적 수축율의 개선도 있었는데, 무동증/저동증/운동이상증의 평균수치가 7(수술전 5-10사이)에서 3(이식후 3개월째 0-5사이)로 감소함을 보이고 있었다.

지협적 기본 운동 지표 WMSI - 평균 1.72±0.14 - 는 이식후 3개월째 1.25±0.07 (p<0.05) (표 3)으로 감소했다. 근원세포의 이식에서 유래한 심장 기능의 잠재적 효과를 맥관재생에서 오는 효과와 구별하기 위해 세포이식을 받은 부분과 받지않은 부분의 WMSI 지표에서의 개선정도를 비교했다. WMSI는 수술전 기본 지표와 비교했을 때 3개월째에서 현저해 감소했고 세포이식을 받은 부분에서 더 많이 감소했다.

WMSI 의 감소는 NYHA분류에서 기본 2.2±0.2로부터 3개월째 2.5±0.26로 개선된 것과 연결된다 (p<0.01).

표 3 지협적 기능 (WMSI 지표에 의해 측정됨, Wall motion score index )

	Basal	40일	3개월
전반적0.027	1.73±0.07	1.40±0.07	1.25±0.07
치료부0.027	2.64±0.13	2.03±0.16	1.64±0.16
비치료부0.043	1.29±0.13	1.1±0.06	1.05±0.04

2.6 심근 관류와 타당성 예비조사

관류 (PET-ammonium )와 대사 (FDG-포도당 ) 연구가 수술 전(1일에서 5일 전)과 이식 후 3개월째에 7명의 환자를 대상으로 실험함으로 진행되었다. 수량적 속도를 결정짓는 각 부분에서의 추적자의 저류에 의해 측정했다. 수술 전 심근에서 포도당의 평균 저류농도는 0.158±0.126 μmol.g^-1.min^-1인 반면 3개월째에는 0.270±0.008 μmol.g^-1.min^-1 (p<0.05)였다. 경색부위(심근경색으로 인한 조직괴사)의 구별된 분석에서 암모늄과 포도당 조류의 현저한 증가가 입증되었는데 이것은 경색부위에서 심근의 개선 타당성을 제시해준다.(표.4) 도 2 또한 참조하라.

표 4 양자 방출 단층촬영 영상화 PET. 12N-ammonium 저류에 의한 혈류의 평가와 18F-FDG 에 의한 포도당대사의 평가

		Basal	3개월	P
전반적	¹⁸F-FDG	0.158±0.026	0.270±0.008	0.028
	¹³N-ammon	0.47±0.05	0.5±0.003	0.273
경색 부위	¹⁸F-FDG	0.126±0.022	0.231±0.011	0.028
	¹³N-ammon	0.36±0.004	0.39±0.01	0.686
비경색 부위	¹⁸F-FDG	0.170±0.029	0.284±0.013	0.046
	¹³N-ammon	0.59±0.007	0.62±0.06	0.5

본 연구의 주된 결론은 : 1. 심근경색의 병력을 가지고 있고 관상동맥 바이패스 수술을 받았던 환자의 심근에 자가 골격 근원세포들을 직접 이식하는 것이 타당하고 안전하다. 2. 바이패스에서 유래된 효과와 세포 이식에서 온 효과를 명확히 구별할 수 없지만 이 연구의 기능성과 타당성은 자가 근원세포의 이식이 좌심실의 수축율을 향상시키고 조직복구를 기여한다는 사실을 제시하고 있다. 3. 골격 근아세포는 수술후 최소 3개월까지 이식될 수 있다.

골격 근원세포가 알맞게 이식될 수 있음을 증명할지라도 직접 심근을 연구하는 것이 필요할것이다. PET를 사용하여 측정된 포도당 저류의 증가현상은 생존할 수 있는 조직은 발견되지 않았던 경색 부위에서 일단 이식술이 시행된 후 생존가능한 조직이 발견되기 시작했다. 반면 대조환자가 이 연구에 포함되지 않았다 할지라도, 세포배양에서 미생물오염에 의해 오직 관상동맥 바이패스 수술만을 받았던 9번환자의 18F-FDG - PET 결과는 3개월 관찰했으나 포도당 이용율(그림 2B )의 현저한 변화를 보이지 않았고 이 사실은 고무적이라 할 수 있다.

이러한 결과는 자가 골격 근아세포의 이식과 함께 관상동맥 바이패스 수술을 한 것이 눈에 띄게 심근 수축율을 개선시켰음을 보여 주고 있고, 이것은 박출율 증가와 특히 WMSI 지표의 감소로 증명된다. 이 결과로서는 심기능의 개선이 오직 바이패스술 시행때문이라고 결론지울 수 없다. 이와 같은 분획에서 포도당 저류가 증가하면서 세포이식을 받은 심근분획에서 더 많은 향상을 보여왔다는 사실은 심기능 개선이 오직 바이패스 시행때문만은 아니라는 것을 보여준다. 자가 세포 이식이 심근 기능 향상에 책임이 있다는 증명된 증거를 얻기 위해서 다른 치료법의 협조없이 이식을 행하는 것이 필요할 것이고, 요즈음 세포가 경피주입으로 이식되지 않는다면 윤리적이 아니라는 것도 일리는 있다.

다른 임상적 실험에 관한 최근 연구에서는 자가 골격 근아세포의 이식이 심장 부정맥과 연관되어 있다고 제시하고 있다 (Menasche P er al. Lancet 2001;357:279-280. Menasche P er al. J. Am. Coll. Cardiol. 2003:41:1078-1083. Hagege AA et al. Lancet 2003:361:491-492 Pagani FD et al. J. Am. Coll. Cardiol. 2003;41:879-888. 실제로 몇 환자들은 심간 세동제거기의 이식이 필요하다. 지금까지는 이러한 부정맥의 원인을 확실히 알지 못했다. 그러나 그것들이 전기 재도입 회로의 형성과 관련이 있을 수 있고 (아마 이식된 골격 근아세포에서 만들어진 세극결합이 없기때문일 것이다), 이식된 세포의 숫자와 용적, 또는 자가 근아세포의 사용에도 관련될 수도 있다. 이러한 프로토콜에서 자가 근아세포의 배양과 in vitro증식에 이종단백의 재료를 구성할 수 있는 태아단계의 소혈청을 사용해온 점을 지적하는 것이 중요하다. 인간세포와 소혈청을 3주간 접촉시키면 위에서 말한 동물 단백질들이 세포표면에 고정되어 있다. 이런 세포들을 이식하는 것은 염증반응을 일으킬수있고 이어서 섬유종도 일으킬 수 있다. 수행된 임상병리학적 실험들은 본 방법에 따라 이식된 세포들이 새로 맥관이생성되지 않았던 곳에섬유질 형태로 깊이 심어지는 것을 보여준다. 이 조직학적 배열은 극심한 심실부정맥의 전위생성을 유도할 수 있는 재도입 회로에 대한 위험을 나타내고 있다. 이런 연구와 달리 본 임상 실험에서는 어떠한 면역 반응도 피하기 위해 완전 자가배양배지에서 증식된 자가 골격 근아세포들을 사용해 오고 있다 이러한 사실들은 왜 본 임상 실험에서 이같은 부정맥이 관찰되지 않았는지를 설명해 줄 수 있다.

Claims

a) 자가 인간혈청 무게의 0.1 에서 90% 사이;

b) 헤파린 무게의 0.1 에서 10000 UI/ml 사이;

c) 프로타민 무게의 0.1 에서 10000 UI/ml 사이; 그리고

d) 100% 무게까지 충분한 양으로, 글루타민이 있거나 또는 없는 기본 영양분을 함유한 배양배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
제 1 항에 있어서, 상기 자가 인간혈청은 보체를 불활성화 하기 위한 목적을 가진 치료들을 받는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
제 1 항에 있어서, 상기 자가 인간혈청은 환자의 혈액 샘플들로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
제 1 항에 있어서, 상기 자가 인간혈청은 상기 혈청의 환자 기증자에게로 혈장 사혈을 실행하는 것에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
제 4 항에 있어서, 상기 혈장사혈은 항응고제로 헤파린과 항응고를 막는 프로타민설페이트를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
선행 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 항균물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
제 6 항에 있어서, 상기 항균물질은 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 그리고 이들 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
선행 청구항들중 어느 한 항에 있어서, 암포테리신 B, 및/또는 파이브로블라스트 성장인자 (FGF)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
제 1 항에 있어서, 상기 배양 배지는,

배지 HAM F12 무게의 89%;

환자로부터의 자가 인간혈청 10%;

헤파린 0.1에서10000 UI/ml;

프로타민 0.1에서 10000 UI/ml; 그리고

1% 페니실린/스트렙토마이신 그리고 선택적으로

0.25 mg/ml 암포테리신 B and/or

0.1 to 250pg/ml의 재조합 bFGF를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따르는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지를 준비하기 위한 방법으로서, 상기 배양 배지는 자가 인간혈청, 헤파린, 프로타민,글루타민이 있거나 또는 없는 기본 영양분의 혼합물을 포함하며, 상기 혼합물은, 선택적으로 항균물질, 및/또는 암포테리신 B, 및/또는 피브로블라스트 성장 인자를 함께 갖는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지를 준비하기 위한 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 자가 인간 혈청은 혈장사혈에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지를 준비하기 위한 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따르는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지의 사용으로서, 상기 자가 배양 배지를 사용하여 상기 자가 인간 원종 줄기세포들을 인 비트로 상태에서 배양시키고, 정화하고 증식시키는 것을 특징으로 하는 자가 배양 배지의 사용.
자가 인간 원종 줄기세포들의 조성물을 준비하기 위한 방법으로서, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따르는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지에서, 상기 자가 인간 줄기 세포들을 배양하여 얻어진 상기 자가 인간 원종 줄기세포의 정화를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 조성물을 준비하기 위한 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 자가 인간 원종 줄기 세포의 정화는 상기 자가 인간 원종 줄기 세포의 세포외 항원 특징들의 구별을 허용하는 특정 항체들의 사용에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 조성물을 준비하기 위한 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 자가 인간 원종 줄기 세포들을 위한 상기 특정의 선택적인 항체들은 자기 마이크로스피어들과 결합하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 조성물을 준비하기 위한 방법.
자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻기 위한 방법으로서, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따르는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지에서, 상기 자가 인간 줄기 세포들을 배양하고 얻어진 상기 자가 인간 원종 줄기세포들을 정화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻기 위한 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 정화는 임의적으로 자기 마이크로스피어들에 결합된 인간 항-CD56 항체들의 사용과, 표현형 CD56+/CD45-를 나타내는 상기 세포들의 선택을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻기 위한 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 자가 인간 균육 원종 줄기 세포들의 정화는 상기 세포 배양에 존재하는 피브로블라스트들의 전부 또는 일부를 해결하기 위하여 프리-플레이팅의 단계로 세포 배양을 받고, 임의적으로 자기 마이크로스피어들에 결합된 인간 항-CD56 항체들을 이용하여 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 식별하고 분리하며, 표현형 CD56+/CD45-를 나타내는 상기 세포들을 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻기 위한 방법.
제약 조성물의 준비를 위하여 근섬유의 생검으로부터 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 얻기 위한 절차로서,

a) 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 포함하는 골격섬유의 단편을 추출하기 위하여 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들의 차후 이식 대상 환자에서 생검을 실현하고;

b) 상기 배양된 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들의 증식을 허용하는 조건들 하에서 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따르는 자가 원종 근육 세포들의 자가 배양 배지에서 상기 골격 섬유로부터 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 배양하고;

c) 상기 배양된 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 정화하고; 그리고

d) 상기 정화된 자가 인간 근육 원종 세포들을 모으는 단계들을 포함하고, 선택적으로

e) 상기 제약 조성물이 준비될 때까지 상기 정화된 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 냉동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 얻기 위한 절차.
제 19 항에 있어서, 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들의 증식을 자극하는 약제를 포함하는 약제 조성물의 생검을 수행하기 전에, 생검 분야에서의 국소적 시행을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 얻기 위한 절차.
제 19 항에 있어서, 상기 약제는 국부 마취제를 포함하고, 리도카인과 부피바카인 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 얻기 위한 절차.
제 19 항에 있어서, 상기 자가 인간 균육 원종 줄기 세포들의 정화는 상기 세포 배양에 존재하는 피브로블라스트들의 전부 또는 일부를 해결하기 위하여 프리-플레이팅의 단계로 세포 배양을 받고, 임의적으로 자기 마이크로스피어들에 결합된 인간 항-CD56 항체들을 이용하여 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 식별하고 분리하며, 표현형 CD56+/CD45-를 나타내는 상기 세포들을 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 얻기 위한 절차.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따르는 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들의 자가 배양 배지에서 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들의 적어도 70%를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들에 농축된 조성물.
적어도 5천만 cells/ml의 세포 밀도와 적어도 40%의 자가 원종 줄기세포들 CD56+/ CD45-40를 갖는 최소 2천만개의 세포들, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따르는 자가 원종 줄기세포들의 자가 배양배지, 및 적어도 약제학적 관점에서 타당한 부형물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 24 항에 있어서, 5천만 내지 7천만 cells/ml의 세포밀도와 적어도 70%의 자가 원종 줄기세포 CD56+/CD45-를 갖는 2천만 내지 2억개의 세포들과, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따르는 자가 원종 줄기세포들의 자가 배양배지, 및 전체 양에 대하여 0.1% 내지 0.2%의 중량을 갖는 인간 알부민을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
자가 인간근육 원종 줄기세포들, 심근조직의 재생자들, 및 자가 배양배지에서 증식된 탈체(ex vivo)를 포함하는 약제학적 조성물의 이식에 의하여 기능장애성 심근조직을 생성, 재생 및 복구하는 자가 세포 심근성형술의 치료과정으로서,

자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 포함하는 이식할 대상 환자의 몸으로부터 물질 표본을 수집하고, 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따르는 자가 원종 줄기세포들의 자가 배양배지에서 상기 물질 표본을 배양시켜서 상기 세포들을 증식시키고, 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 함유하는 물질이 전에 추출하였던 그 환자에게 상기 수집된 자가 인간원종 줄기세포들을 이식하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 세포 심근성형술의 치료과정.
자가 인간근육 원종 줄기세포들, 심근조직의 재생자들, 및 자가 배양배지에서 증식된 탈체(ex vivo)를 포함하는 약제학적 조성물의 이식에 의하여 기능장애성 심근조직을 생성, 재생 및 복구하는 자가 세포 심근성형술의 치료과정으로서,

상기 과정은,

a) 바람직하게는 국소마취제를 근육주사해서 전처치한 환자의 근육으로부터 골격근을 생검하고;

b) 상기 환자의 자가혈청으로 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따르는 자가 원종 줄기세포들의 자가 배양배지를 준비하고;

c) a)의 상기 생검과 b)에서의 상기 배양배지로부터 자가 인간 근육 원종 줄기세포가 풍부한 조성물을 준비하고;

d) c)의 조성물로부터 약제학적 조성물을 준비하고; 그리고

e) d)의 자가 원종 줄기세포의 약제학적 조성물을 심근 손상 부분에 이식하는 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 세포 심근성형술의 치료과정.
제 27 항에 있어서, 상기 자가 원종 줄기세포들의 약제학적 조성물의 이식은 경색손상부위의 말초지역에 직접 주입하거나 좌심실에 위치하는 관상혈관들간의 공간들에 주입하는 것에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 자가 세포 심근성형술의 치료과정.
제 27 항에 있어서, 상기 자가 원종 줄기세포들의 약제학적 조성물의 이식은 전신적으로나 경피적으로 정맥 주입에 의한 관상혈관간 적용에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 자가 세포 심근성형술의 치료과정.
제 27 항에 있어서, 상기 자가 원종 줄기세포들의 약제학적 조성물의 이식은 로봇화 및 컴퓨터화된 시스템에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 자가 세포 심근성형술의 치료과정.