CN112501035B - 基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多而产生捕食器官的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于应用微生物学领域，具体涉及一种基于捕食线虫真菌细胞膜破裂并且内体增多而产生捕食器官的方法。所述方法包括以下步骤：将捕食线虫真菌进行孢子培养；将培养得到的孢子接种到培养基中进行菌丝培养；待菌丝生长连成菌网以后，向固体培养基表面中加入可使细胞膜破裂和内体增多的试剂，置于20‑30℃环境中培养至少36h。本发明方法是将高浓度的氨水加入到捕食线虫真菌的菌丝中，使捕食线虫真菌的细胞膜发生破裂，意外发现在膜修复的过程中可产生大量捕食器官，本发明提供了一种新的促使捕食线虫真菌产生捕食器官的方法，为研究捕食器官形成的机制提供新思路，从而为高效生防制剂的开发奠定了基础。

Description

基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多而产生捕食器官的 方法

技术领域

本发明属于应用微生物学领域，具体涉及一种基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多从而产生捕食器官的方法。

背景技术

植物寄生线虫危害严重，每年给全球农作物经济造成巨大的损失。在我国，几乎所有的经济作物都受到线虫的危害，目前对线虫病虫害的防治仍主要以化学防治为主，但由于化学农药高毒性、高残留，严重影响到农产品安全，而且还会造成环境的污染，因此，生物防治成为大势所趋。捕食线虫真菌因为其奇特的捕食器官而闻名于生防菌圈，这些捕食器官由营养菌丝特化形成，包括收缩环、非收缩环、粘球、粘性分枝、粘性网等，是真菌捕食和侵染线虫的重要武器，捕食器官的形成以及数量的多少与捕食效率密切相关。目前已有部分捕食线虫真菌被开发成为生防制剂，但是由于复杂的土壤环境，现有的生防制剂存在效果不稳定等现象，严重限制了生防试剂的推广和应用。因此，阐明捕食器官形成的机制对于开发出高效的生防制剂至关重要。

近年来，除了线虫以外，能够诱导捕食器官产生的物质陆续被发现，包括线虫提取物、小肽、蛔苷、尿素等。课题组前期发现，尿素进入真菌细胞以后，会在脲酶的作用下分解为氨，氨才是诱导捕食器官产生的效应因子，但使用的是挥发性实验的方法，且未阐明其作用的过程。杨敏在《少孢节丛孢形成捕食器官过程中分泌的氨及环境pH的作用》研究中发现：分别用不同浓度的氨水(0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.7mM、1.0mM、10mM)诱导少孢节丛孢形成捕食器官，结果发现当氨水浓度为0.1mM时就能够诱导少孢节丛孢形成捕食器官，当氨水浓度为0.2mM时形成的捕食器官最多，随着氨水浓度逐渐升高，捕食器官数量减少，当氨水浓度为10mM时抑制捕食器官的形成(杨敏.少孢节丛孢形成捕食器官过程中分泌的氨及环境pH的作用[D].云南大学,2016.)。

发明内容

本发明主要目的是提供一种基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多产生捕食器官的方法，本发明方法是将高浓度的氨水加入到捕食线虫真菌的菌丝中，使捕食线虫真菌的细胞膜发生破裂，发现在膜修复的过程中可产生大量捕食器官，本发明提供了一种新的促使捕食线虫真菌产生捕食器官的方法，为研究捕食器官形成的机制提供新思路，从而为高效生防制剂的开发奠定了基础。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多从而产生捕食器官的方法，其包括以下步骤：

将捕食线虫真菌进行孢子培养；

将培养得到的孢子接种到培养基中进行菌丝培养；

待菌丝生长连成菌网以后，加入可使细胞膜破裂和内体增多的试剂，置于20-30℃环境中培养至少36h。

进一步地，所述可使细胞膜破裂和内体增多的试剂包括氨水。

更进一步地，待菌丝生长连成菌网后，向固体培养表面加入浓度为15-30mM的氨水。进一步地，捕食线虫真菌进行孢子培养的方法为：将捕食线虫真菌菌块接于固体培养基上，20-30℃培养10-20天，产生大量孢子以后，用灭菌的去离子水将孢子洗下，用6层灭菌的擦镜纸过滤，收集孢子滤液。

进一步地，所述固体培养基为CMY固体培养基，制备方法为：将玉米粒按质量体积比20-30g/L与水混合，煮沸30min以上；然后用4-6层纱布过滤，得滤液；向所得滤液中加入占滤液总重为0.6-0.8％的酵母提取物混合均匀后，加入占滤液总重为1.0％-2.0％的琼脂，121℃灭菌20min，冷却凝固，即得。

进一步地，将培养得到的孢子接种到培养基中进行菌丝培养的方法：

配制水琼脂培养基，灭菌以后倒入培养皿中，待培养基凝固以后，铺上玻璃纸，加入收集得到的孢子滤液，用涂布棒涂布均匀，20-30℃培养至菌丝连成一片。

更进一步地，水琼脂培养基中孢子数为1.0-2.0x10⁴个/mL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明将高浓度的氨水加入到捕食线虫真菌的菌丝中，使捕食线虫真菌的细胞膜发生破裂并且产生大量内体，发现在膜修复的过程中可产生大量捕食器官，可见菌丝外部形态的改变与内部细胞膜的变化紧密相连。本发明提供了一种新的促使捕食线虫真菌产生捕食器官的方法，为研究捕食器官形成的机制提供新思路，从而为高效生防制剂的开发奠定了基础。

本发明方法可诱导捕食线虫真菌产生大量的捕食器官，捕食器官最多可达1100个/cm²。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为不做任何处理时，少孢节丛孢菌丝状态图；

图2为不做任何处理时，少孢节丛孢菌丝电镜图；

图3为本发明一实施例所述方法处理12h，少孢节丛孢菌丝状态图；

图4为本发明一实施例所述方法处理12h，少孢节丛孢电镜图：该阶段为细胞膜破裂和内体增多阶段；

图5为本发明一实施例所述方法处理36h，少孢节丛孢菌丝状态图：该阶段为产生捕食器官阶段；

图6为本发明一实施例所述方法处理36h，少孢节丛孢电镜图，该阶段为细胞膜修复阶段。

图7为本发明实施例1-3所述方法诱导少孢节丛孢产生捕器数量的柱状图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

以下实施例所述捕食线虫真菌以少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)为例进行说明，但本发明所述方法所述捕食线虫真菌包括但不限于少孢节丛孢。

实施例1

基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多而产生捕食器官的方法，其包括以下步骤：

步骤1.将捕食线虫真菌进行孢子培养：

将捕食线虫真菌菌块接于固体培养上，28℃培养10-20天，产生大量孢子以后，用灭菌的去离子水将孢子洗下，收集孢子。

所述固体培养基为CMY固体培养基，制备方法为：将玉米粒按质量体积比20g/L与水混合，煮沸30min以上；然后用6层纱布过滤，得滤液；向所得滤液中加入占滤液总重为0.6％的酵母提取物混合均匀后，加入占滤液总重为1.5％的琼脂，121℃灭菌20min，冷却凝固，即得。

步骤2.将培养得到的孢子接种到培养基中进行菌丝培养：

配制水琼脂培养基，灭菌以后倒入9cm培养皿中，待培养基凝固以后，铺上玻璃纸，加入收集得到的孢子滤液，所述滤液含孢子数为1.0x10⁴个；用涂布棒涂布均匀，28℃培养至菌丝连成一片。

步骤3.待菌丝生长连成菌网以后，向固体培养基表面加入2ml浓度为15mM的氨水，置于28℃环境中培养，每隔12h于光学显微镜下观察菌丝状态，并收取各时间点菌丝，用2.5％的戊二醛固定以后，于透射电镜下观察菌丝细胞膜状态。

由图1-图6可知，不做任何处理的少孢节丛孢菌丝未产生捕食器官；而采用本实施例所述方法处理36h，当细胞处于细胞膜修复阶段时，菌丝同时产生大量捕食器官。统计36h产生的捕食器官个数，如图7所示。

实施例2

基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多而产生捕食器官的方法，其包括以下步骤：

步骤1.将捕食线虫真菌进行孢子培养：

将捕食线虫真菌菌块接于固体培养上，28℃培养10-20天，产生大量孢子以后，用灭菌的去离子水将孢子洗下，收集孢子。

所述固体培养基为CMY固体培养基，制备方法为：将玉米粒按质量体积比20g/L与水混合，煮沸30min以上；然后用6层纱布过滤，得滤液；向所得滤液中加入占滤液总重为0.6％的酵母提取物混合均匀后，加入占滤液总重为1.5％的琼脂，121℃灭菌20min，冷却凝固，即得。

步骤2.将培养得到的孢子接种到培养基中进行菌丝培养：

配制水琼脂培养基，灭菌以后倒入9cm培养皿中，待培养基凝固以后，铺上玻璃纸，加入收集得到的孢子滤液，所述滤液含孢子数为1.0x10⁴个；用涂布棒涂布均匀，28℃培养至菌丝连成一片。

步骤3.待菌丝生长连成菌网以后，向固体培养基表面加入2ml浓度为20mM的氨水，置于28℃环境中培养，培养至36h时，统计产生的捕食器官个数，如图7所示。

实施例3

基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多而产生捕食器官的方法，其包括以下步骤：

步骤1.将捕食线虫真菌进行孢子培养：

将捕食线虫真菌菌块接于固体培养上，28℃培养10-20天，产生大量孢子以后，用灭菌的去离子水将孢子洗下，收集孢子。

所述固体培养基为CMY固体培养基，制备方法为：将玉米粒按质量体积比20g/L与水混合，煮沸30min以上；然后用6层纱布过滤，得滤液；向所得滤液中加入占滤液总重为0.6％的酵母提取物混合均匀后，加入占滤液总重为1.5％的琼脂，121℃灭菌20min，冷却凝固，即得。

步骤2.将培养得到的孢子接种到培养基中进行菌丝培养：

配制水琼脂培养基，灭菌以后倒入9cm培养皿中，待培养基凝固以后，铺上玻璃纸，加入收集得到的孢子滤液，所述滤液含孢子数为1.0x10⁴个；用涂布棒涂布均匀，28℃培养至菌丝连成一片。

步骤3.待菌丝生长连成菌网以后，向固体培养基表面加入2ml浓度为30mM的氨水，置于28℃环境中培养，培养至36h时，统计产生的捕食器官个数，如图7所示。

实施例4

基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多而产生捕食器官的方法，其包括以下步骤：

步骤1.将捕食线虫真菌进行孢子培养：

将捕食线虫真菌菌块接于固体培养上，28℃培养10-15天，产生大量孢子以后，用灭菌的去离子水将孢子洗下，收集孢子。

所述固体培养基为CMY固体培养基，制备方法为：将玉米粒按质量体积比30g/L与水混合，煮沸30min以上；然后用6层纱布过滤，得滤液；向所得滤液中加入占滤液总重为0.8％的酵母提取物混合均匀后，加入占滤液总重为1.5％的琼脂，121℃灭菌20min，冷却凝固，即得。

步骤2.将培养得到的孢子接种到培养基中进行菌丝培养：

配制水琼脂培养基，灭菌以后倒入9cm培养皿中，待培养基凝固以后，铺上玻璃纸，加入收集得到的孢子滤液，所述滤液含孢子数为1.5x10⁴个；用涂布棒涂布均匀，28℃培养至菌丝连成一片。

步骤3.待菌丝生长连成菌网以后，向培养基中加入5ml浓度为15mM的氨水，置于28℃环境中培养48h。

实施例5

基于捕食线虫真菌细胞膜破裂和内体增多而产生捕食器官的方法，其包括以下步骤：

步骤1.将捕食线虫真菌进行孢子培养：

将捕食线虫真菌菌块接于固体培养上，25℃培养10-15天，产生大量孢子以后，用灭菌的去离子水将孢子洗下，收集孢子。

所述固体培养基为CMY固体培养基，制备方法为：将玉米粒按质量体积比20g/L与水混合，煮沸30min以上；然后用6层纱布过滤，得滤液；向所得滤液中加入占滤液总重为0.8％的酵母提取物混合均匀后，加入占滤液总重为1.5％的琼脂，121℃灭菌20min，冷却凝固，即得。

步骤2.将培养得到的孢子接种到培养基中进行菌丝培养：

配制水琼脂培养基，灭菌以后倒入9cm培养皿中，待培养基凝固以后，铺上玻璃纸，加入收集得到的孢子滤液，所述滤液含孢子数为2.0x10⁴个；用涂布棒涂布均匀，28℃培养至菌丝连成一片。

步骤3.待菌丝生长连成菌网以后，向培养基中加入4ml浓度为30mM的氨水，置于25℃环境中培养96h。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.基于少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)细胞膜破裂和内体增多而产生捕食器官的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

将少孢节丛孢进行孢子培养；

将培养得到的孢子接种到固体培养基中进行菌丝培养；

待菌丝生长连成菌网以后，向固体培养表面加入浓度为15-30mM的氨水，置于20-30℃环境中培养至少36h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，少孢节丛孢进行孢子培养的方法为：将少孢节丛孢菌块接于固体培养基上，20-30℃培养10-20天，产生大量孢子以后，用灭菌的去离子水将孢子洗下，用6层灭菌的擦镜纸过滤，收集孢子滤液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为CMY固体培养基，制备方法为：将玉米粒按质量体积比20-30g/L与水混合，煮沸30min以上；然后用6层纱布过滤，得滤液；向所得滤液中加入占滤液总重为0.6％-0.8％的酵母提取物混合均匀后，加入占滤液总重为1.5％-1.8％的琼脂，121℃灭菌20min，冷却凝固，即得。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将培养得到的孢子接种到培养基中进行菌丝培养的方法：

配制水琼脂培养基，灭菌以后倒入培养皿中，待培养基凝固以后，铺上玻璃纸，加入收集得到的孢子滤液，用涂布棒涂布均匀，20-30℃培养至菌丝连成一片。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，水培养基中孢子数为1.0x10⁴-2.0x10⁴个/mL。

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