CN104263664A - 一种具杀线虫活性的假丝酵母菌及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具杀线虫活性的假丝酵母菌及其制备方法与应用，属于微生物农药技术领域。本发明的菌株为克鲁丝假丝酵母菌（ Candidakrusei ）TY9，于2014年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014435，所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株通过常规的液体发酵培养制备，应用于防治植物寄生线虫，特别是对全齿复活线虫和/或松材线虫有良好的防治效果，具有成本低，制备工艺简单，原料易得，杀线虫效果好等优点，适合产业化推广应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种具杀线虫活性的假丝酵母菌及其制备方法与应用。
背景技术
线虫作为一类重要的病原物，它的危害已成为农林生产上的重要问题。全世界已报道的植物寄生线虫达200多属5000余种。作物病原线虫危害粮食、油料、蔬菜、水果、棉花、大豆、花生、三七、西洋参等3000多种植物，由于其具有地域分布广、宿主种类多样、隐蔽性强、防控困难等特点，已成为农业生产中的第二大病害。据不完全估计植物寄生线虫每年造成全球1570亿美元的损失。松材线虫、根结线虫、胞囊线虫是最严重的危害多种重要作物的线虫。松材线虫病是松树的一种毁灭性病害。由于其危害严重、防治困难而受到世界各国的高度重视，在世界上被列为重要的危险性森林病害。通常感病后40多天即可造成松树枯死，3~5年即可摧毁成片松树，给人们带来了极大的经济损失。松材线虫的危害引起疫区的恐慌，被称为无烟的森林火灾。根结线虫仅对世界上重要的经济作物每年造成的损失就高达数百亿美元。从世界范围看，根结线虫造成的年收入损失率约为10%。根结线虫病害在我国大部分地区都有发生，导致作物常年减产25%左右，严重时可以达70%以上。花生根结线虫在我国山东胶州半岛发生严重，对产量影响极大，一般减产20~30%，严重的减产70~80%。在我国除东北三省外，内蒙古、河北、北京、山西、安徽、江苏等省市仅大豆胞囊线虫的受害面积就达2 000万亩以上，一般造成产量损失15~20%，严重的地块达50~80%以上，严重病土甚至4~5年不能种植大豆，粗略估计每年造成损失达1亿美元。在河南燕麦胞囊线虫病每年造成了小麦减产15~20%，已严重威胁我国小麦的安全生产。另外，小麦受此线虫侵染后，很容易受到其它病原物的入侵，加重了危害。
目前，虽然可以通过传统的轮作、土壤改良及化学防治等途径加以控制某些植物的线虫病，但对于一些经济作物和林木而言，轮作防病难以实施，甚至根本不可能进行。近些年来，随着人们环境意识的增强，化学杀线剂的应用逐步受到限制，除了继续探索低毒，低残留，高选择性的化学农药外，人们更关注开发生物防治制剂以作为化学农药的补充或替代品。因此，对线虫的生物防治研究自然成为重点和焦点问题。
线虫的生物防治是直接利用线虫的生物天敌或者其某些方面的生物特性来进行防治。线虫的天敌多种多样，主要有食线虫真菌、细菌、螨、捕食性线虫等，目前国内外研究的以食线虫真菌为主。但是，由于土壤存在的抑真菌作用等因素的影响，限制了线虫生物防治的发展。同时，在微生物家族中，酵母菌由于其对宿主的低毒性、生长快速、易于培养，一般不产生对人和寄主有害的代谢产物，对多种胁迫条件和逆境具有较强的耐受力，对多数化学杀菌剂不敏感，能与多种化学物质及物理方法结合使用。此外，酵母菌的遗传学基础研究比较清楚，其遗传转化系统比较完善，具有通过基因工程技术提高其生防效力的潜力。因此，研究开发酵母菌杀线虫剂对防治线虫和开发新的生物杀线虫剂具有重要的意义。目前关于假丝酵母菌生物防治线虫的相关技术报道有限，市场上无来源于假丝酵母菌的用于防治线虫的商品生物防治制剂，尚属技术空白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种具杀线虫活性的假丝酵母菌及其制备方法，开发假丝酵母菌源生物杀线虫剂。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种具杀线虫活性的假丝酵母菌，该菌株经分类学鉴定，命名为克鲁丝假丝酵母菌（Candida krusei）TY9，于2014年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址是湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编是430072，保藏编号为CCTCC M 2014435，拉丁学名为Candida krusei。
所述克鲁丝假丝酵母菌TY9系本发明人在开展胞外蛋白酶对线虫侵染机制的研究中，从大量植物根系土壤酵母菌中筛选的假丝酵母菌属。研究发现其对线虫具极高的毒杀活性，通过多批次杀线虫活性试验确定其活性后，对菌株进行形态学、生理生化及分子鉴定，确定为克鲁丝假丝酵母菌（Candida krusei）TY9菌株。
所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株的主要形态特征为：在YM平板培养基上菌落呈圆形，饱满，表面湿润光滑，菌苔白色；细胞圆形，椭圆形，芽殖。
所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株的主要生理生化特征为：发酵葡萄糖，脲酶阴性，DBB反应阴性；细胞卵形，多边芽殖，形成假菌丝；发酵葡萄糖、半乳糖，不发酵麦芽糖、蔗糖、松三糖、棉子糖；同化木糖、乙醇、甘油；不产生色素，酯化性能高，代谢产生乙酸乙脂；产甘油，产酸性蛋白酶。
一种制备所述克鲁丝假丝酵母菌TY9的方法，先经过试管种培养，再经液体扩大培养来制备，具体步骤如下：
①试管种培养
培养基的重量配比为：1~3%酵母提取物，0.5~2%蛋白胨，1~4%葡萄糖，1~3%氯化钠，1.8~2%琼脂，pH 5~6.5；将所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌体接种到上述培养基上，24~30℃下培养1~3天，获得试管种；
②液体扩大培养
液体培养基由下述重量百分比的原料组成：1~3%酵母提取物，0.5~2%蛋白胨，1~4%葡萄糖，1~3%氯化钠，余量为水，pH5~6.5；将步骤①制备的试管种接种到500mL三角瓶液体培养基中，每瓶装200mL，于24~30℃下摇床培养，培养时间2~5天，转速为200~300r/min。
优选的，所述步骤②中的液体培养基的pH为6.5。
本发明提供了一种杀线虫活性成分的提取方法，具体步骤如下：将所述步骤②制备的发酵培养物于6000r/min离心10分钟，取上清液，按0%~90%饱和度加入硫酸铵，于4oC静置2小时，然后8500r/min离心30分钟，弃上清；用50mmoL磷酸缓冲液（39mL的50mmoL磷酸二氢钠加61mL的50mmoL磷酸氢二钠，pH为7）重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋（分子量为8000~14000Da）于10~20倍的50mmoL磷酸缓冲液中透析3~4次，每次3小时，即得杀线虫活性成分，将其保存于4oC冰箱中待用。
本发明还涉及所述克鲁丝假丝酵母菌TY9的应用，所述克鲁丝假丝酵母菌TY9应用于防治植物寄生线虫。
所述克鲁丝假丝酵母菌TY9具有杀线虫活性，可用于制备植物寄生线虫的生防制剂，用于植物寄生线虫的生物防治，所述的植物寄生线虫为全齿复活线虫（Panagrellus redivivus）和/或松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）。
对所述克鲁丝假丝酵母菌TY9杀线虫作用机理的研究发现，其杀线虫功能主要源于蛋白酶成份，主要作用机理是该菌株产生的胞外蛋白酶分解线虫体壁，破坏线虫体壁的完整，使线虫内容物外泻，最终将线虫杀死；在整个杀线虫过程中，伴随着产生蛋白酶、水解酶对线虫的作用，其毒力显著。
本发明采用的是从克鲁丝假丝酵母菌菌种中分离出的1株综合性状较好的菌株，于2014年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014435；鉴于该菌株可能由于（自发的、物理的或化学的）突变、原生质体融合，转化或其他通过生物技术而发生变化或被改造，本菌种任何菌株的突变株、变种和衍生物均在本发明的保护范围内。
本发明的有益效果如下：
①本发明提供了克鲁丝假丝酵母菌（Candida krusei）TY9，具有良好的杀线虫活性，可用于防治植物寄生线虫，对比传统的化学类防治方法，其环境友好，生产成本低，生产过程简单，对环境无污染。
②本发明所述克鲁丝假丝酵母菌TY9的培养温度为24~30℃，对能耗的要求不高，其适用的营养基质原料易得，无需生长因子，适用性较广，适合于产业推广应用。
③本发明可应用于制备杀线虫活性制剂，填补了本技术领域的技术不足，并进一步提供了所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株的培养方法及应用，为酵母菌源生物防治线虫提供重要的技术基础，特别是针对植物全齿复活线虫和松材线虫的生物防治。本发明对于植物寄生线虫的生物防治、微生物杀线虫剂的开发应用和农产品的无公害生产，具有极其重要的意义，适合于推广应用。
具体实施方式
为了更详细地进一步阐明而不是限制本发明，给出下列实施例。
首先对克鲁丝假丝酵母菌（Candida krusei）TY9菌株进行发酵培养，然后从发酵培养液中提取活性成分，进行杀线虫活性实验，确定其对植物全齿复活线虫和松材线虫的作用。
实施例一
制备所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株的方法，先经过试管种培养，再经液体扩大培养来制备，可按如下步骤进行：
①试管种培养
培养基的重量配比为：3%酵母提取物，2%蛋白胨，4%葡萄糖，3%氯化钠，2%琼脂，pH6.5；将所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌体接种到上述培养基上，30℃下培养3天，获得试管种；
②液体扩大培养
液体培养基由下述重量百分比的原料组成：3%酵母提取物，2%蛋白胨，4%葡萄糖，3%氯化钠，余量为水，pH6.5；将步骤①制备的试管种接种到500mL三角瓶液体培养基中，每瓶装200mL，于30℃下摇床培养，培养时间5天，转速为300r/min。
上述液体扩大培养所得发酵液中杀线虫活性成分的提取方法如下：将所述步骤②制备的发酵培养物于6000r/min离心10分钟，取上清液，按90%饱和度加入硫酸铵，于4oC静置2小时，然后8500r/min离心30分钟，弃上清；用50mmoL磷酸缓冲液（39mL的50mmoL磷酸二氢钠加61mL的50mmoL磷酸氢二钠，pH为7）重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋（分子量为14000Da）于20倍的50mmoL磷酸缓冲液中透析4次，每次3小时，即得杀线虫活性成分；将其保存于4oC冰箱中待用。
实施例二
制备所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株的方法，先经过试管种培养，再经液体扩大培养来制备，可按如下步骤进行：
①试管种培养
培养基的重量配比为：2%酵母提取物，1.2%蛋白胨，2.5%葡萄糖，2%氯化钠，1.9%琼脂，pH6；将所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌体接种到上述培养基上，28℃下培养2天，获得试管种；
②液体扩大培养
液体培养基由下述重量百分比的原料组成：2%酵母提取物，1.2%蛋白胨，2.5%葡萄糖，2%氯化钠，余量为水，pH6；将步骤①制备的试管种接种到500mL三角瓶液体培养基中，每瓶装200mL，于26℃下摇床培养，培养时间3天，转速为250r/min。
上述液体扩大培养所得发酵液中杀线虫活性成分的提取方法如下：将所述步骤②制备的发酵培养物于6000r/min离心10分钟，取上清液，按60%饱和度加入硫酸铵，于4oC静置2小时，然后8500r/min离心30分钟，弃上清；用50mmoL磷酸缓冲液（39mL的50mmoL磷酸二氢钠加61mL的50mmoL磷酸氢二钠，pH为7）重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋（分子量为12000Da）于16倍的50mmoL磷酸缓冲液中透析4次，每次3小时，即得杀线虫活性成分；将其保存于4oC冰箱中待用。
实施例三
制备所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株的方法，先经过试管种培养，再经液体扩大培养来制备，可按如下步骤进行：
①试管种培养
培养基的重量配比为：1%酵母提取物，0.5%蛋白胨，1%葡萄糖，1%氯化钠，1.8%琼脂，pH5；将所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌体接种到上述培养基上，24℃下培养1天，获得试管种；
②液体扩大培养
液体培养基由下述重量百分比的原料组成：1%酵母提取物，0.5%蛋白胨，1%葡萄糖，1%氯化钠，余量为水，pH5；将步骤①制备的试管种接种到500mL三角瓶液体培养基中，每瓶装200mL，于24℃下摇床培养，培养时间2天，转速为200r/min。
上述液体扩大培养所得发酵液中杀线虫活性成分的提取方法如下：将所述步骤②制备的发酵培养物于6000r/min离心10分钟，取上清液，不加硫酸铵，于4oC静置2小时，然后8500r/min离心30分钟，弃上清；用50mmoL磷酸缓冲液（39mL的50mmoL磷酸二氢钠加61mL的50mmoL磷酸氢二钠，pH为7）重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋（分子量为8000Da）于10倍的50mmoL磷酸缓冲液中透析3次，每次3小时，即得杀线虫活性成分；将其保存于4oC冰箱中待用。
实施例四
制备所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株的方法，先经过试管种培养，再经液体扩大培养来制备，可按如下步骤进行：
①试管种培养
培养基的重量配比为：2%酵母提取物，1%蛋白胨，2%葡萄糖，2%氯化钠，1.8%琼脂，pH5.5；将所述克鲁丝假丝酵母菌TY9菌体接种到上述培养基上，26℃下培养2天，获得试管种；
②液体扩大培养
液体培养基由下述重量百分比的原料组成：2%酵母提取物，1%蛋白胨，2%葡萄糖，2%氯化钠，余量为水，pH5.5；将步骤①制备的试管种接种到500mL三角瓶液体培养基中，每瓶装200mL，于26℃下摇床培养，培养时间4天，转速为200r/min。
上述液体扩大培养所得发酵液中杀线虫活性成分的提取方法如下：将所述步骤②制备的发酵培养物于6000r/min离心10分钟，取上清液，按30%饱和度加入硫酸铵，于4oC静置2小时，然后8500r/min离心30分钟，弃上清；用50mmoL磷酸缓冲液（39mL的50mmoL磷酸二氢钠加61mL的50mmoL磷酸氢二钠，pH为7）重新溶解，将重新溶解所获溶液装入21mm透析袋（分子量为10000Da）于15倍的50mmoL磷酸缓冲液中透析4次，每次3小时，即得杀线虫活性成分；将其保存于4oC冰箱中待用。
杀线虫活性试验如下：
1.制备试验用药剂
按前述液体扩大培养方法培养克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株，按前述提取杀线虫活性成份的方法制备试验用药剂。
2.制备对照用药剂
对照1：按前述1制备试验用药剂的方法制备对照用药剂，但培养基中不接入克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株；
对照2：以50mmoL磷酸缓冲液作为对照；
对照3：以透析后的透析溶液作为对照；
对照4：为了证明杀线虫有效成份是蛋白酶，将制备供试药剂煮沸灭活后作为对照。
3.制备试验用线虫
①制备全齿复活线虫
将全齿复活线虫接种于燕麦片培养基上，于28℃下培养6天，冻于4℃冰箱备用。将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5mL离心管内，加5mL无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫；用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μL的线虫悬浮液。
②制备松材线虫
在100mL三角瓶中放入15g经水浸泡2天的玉米粒，加水10mL，高压灭菌，接入灰葡萄孢（Botrytis cinerea），25℃培养4~7天；待菌丝铺满三角瓶后，接种经0.25%次氯酸钠表面消毒的松材线虫，28℃培养15~20天；用无菌水将线虫洗下，制成含量为15条/μL的线虫悬浮液。
4.试验方法
药效试验方法为：取试验用药剂200μL于1.5mL离心管中，加入活线虫150条，离心管平放，置于25oC下，全齿复活线虫分别于12小时、24小时、48小时；松材线虫分别于24小时、48小时、60小时检查，计算线虫的死亡率；并在光学显微镜下观察线虫体壁变化情况。
鉴定死亡的方法为：在处理离心管中加入1~5滴5%氯化钠溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
分别用4种对照药剂，每次处理重复三次。
线虫死亡率的计算式：
线虫的死亡率%=死线虫数/150×100
5.试验结果
表1 对全齿复活线虫的毒杀效果
表2 对松材线虫的毒杀效果
结果表明，从克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株液体发酵液中提取的试验用药剂对全齿复活线虫和松材线虫均具有较好的杀虫效果，48小时线虫的平均死亡率在70%以上。将处理后的线虫在光镜下观察，与对照相比，实验组线虫体壁由完整——部分溶解——完全溶解变化明显。由于线虫体壁的破坏，线虫内容物大量外泻，致使线虫最终死亡。表1和表2的结果还表明，供试线虫不同，其作用时间也不相同，全齿复活线虫24小时死亡率已达95%，而松材线虫60小时死亡率则为90%。
结果同时表明，在克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株中，杀线虫的主要活性成份是酶类。而将同批提取的试验用药剂（对照4）经过煮沸，导致蛋白质变性后，其杀线虫活性非常小，且线虫体壁不出现溶解现象，这也进一步确证了克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株对线虫的活性成份主要为酶类。
本发明克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株是一类全新发现的具有显著的杀线虫活性的克鲁丝假丝酵母菌，其主要作用成份是酶；同时克鲁丝假丝酵母菌TY9菌株在本发明培养条件下生长快，容易进行工业化生产，具备了很好的应用开发前景。
Claims (5)
1.一种具杀线虫活性的假丝酵母菌，其特征在于：该菌株为克鲁丝假丝酵母菌（Candida krusei）TY9，于2014年9月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014435，拉丁学名为Candida krusei。
2.一种制备如权利要求1所述具杀线虫活性的假丝酵母菌的方法，包括所述克鲁丝假丝酵母菌TY9经过常规的液体发酵后制备杀线虫制剂，其特征在于：所述克鲁丝假丝酵母菌TY9的液体发酵培养基由下述重量百分比的原料组成：1~3%酵母提取物，0.5~2%蛋白胨，1~4%葡萄糖，1~3%氯化钠，余量为水，pH5~6.5。
3.如权利要求2所述具杀线虫活性的假丝酵母菌的制备方法，其特征在于：所述液体培养基的pH为6.5。
4.如权利要求1所述具杀线虫活性的假丝酵母菌的应用，其特征在于：所述克鲁丝假丝酵母菌TY9应用于防治植物寄生线虫。
5.如权利要求4所述具杀线虫活性的假丝酵母菌的应用，其特征在于：所述的植物寄生线虫为全齿复活线虫和/或松材线虫。
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