CN109988227A - 线虫肠道共生菌bc7的功能蛋白及其应用 - Google Patents

线虫肠道共生菌bc7的功能蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了线虫肠道共生菌BC7的功能蛋白，来源于线虫肠道共生菌BC7菌株，其cDNA核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2所示，编码478个氨基酸。该功能蛋白与鞭毛蛋白具有协同抑制B16杀线虫的作用，且单独的功能蛋白不能引起B16形态变化，与鞭毛蛋白一起时能使B16形成长链状，从而减弱其杀线虫活性。

Description

线虫肠道共生菌BC7的功能蛋白及其应用
技术领域
本发明属于重组蛋白技术领域，具体涉及线虫肠道共生菌BC7的功能蛋白及其应用，具体为其对芽孢杆菌Bacillus nematocida B16的抑制作用。
背景技术
植物线虫是一类寄生在植物体上的线虫，植物寄生线虫是危害植物的重要病原之一，其危害超过细菌和病毒，仅次于真菌病害。全球每年因作物病原线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元。植物寄生线虫可以造成作物产量和品质下降。在世界范围内，线虫病害对小麦、水稻和玉米等20种主要粮食作物造成的损失平均为10.7％，对棉花、柑橘和番茄等20种重要经济作物造成的损失平均为14％，局部地区线虫对单一作物造成的损失可高达80％，甚至绝收。
植物寄生线虫生防细菌的研究是近几年兴起的新的研究热点，越来越多的杀线虫细菌被分离出来，目前研究的较为深入的杀线虫细菌主要包括芽孢杆菌Bacillus、巴氏杆菌Pasteurella和假单胞菌Pseudomonas等。芽孢杆菌属是土壤根际微生物中常见的种类，目前约有200多种芽孢杆菌被报道，其中对线虫有明显抑制活性的约有20种，不同的芽孢杆菌的杀线虫机制也不尽相同。2004年，云南大学从土壤中筛选到芽孢杆菌新种Bacillusnematocida B16，发现了该菌利用独特的“特洛伊”木马机制侵染线虫，通过产生特异性挥发物质，利用线虫的趋化性完成对线虫的诱捕，然后通过分泌侵染性丝氨酸蛋白酶和中性金属蛋白酶对线虫肠道结构进行破坏，导致线虫死亡。但是研究发现，线虫肠道内存在内生菌BC7会对芽孢杆菌B16产生抑制作用，阻止芽孢杆菌B16的生长繁殖和对线虫肠道的破坏，从而降低B16的杀线虫活性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了线虫肠道共生菌BC7的功能蛋白及其对芽孢杆菌B.nematocida B16的抑制作用。
本发明提供线虫肠道共生菌BC7的功能蛋白，所述功能蛋白基因的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2所示。
作为优选，所述功能蛋白基因的cDNA核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供上述功能蛋白在抑制芽孢杆菌B.nematocida B16中的应用。
作为优选，所述应用为阻止芽孢杆菌B.nematocida B16的生长繁殖和对线虫肠道的破坏。
作为优选，所述功能蛋白基因的表达载体为PET32a。
作为优选，所述应用为功能蛋白异源表达后与鞭毛蛋白协同抑制芽孢杆菌B.nematocida B16。
作为优选，所述将功能蛋白异源表达是将功能蛋白与载体PET32a连接，导入感受态细胞，进行诱导表达。
作为优选，所述功能蛋白与鞭毛蛋白一起促使芽孢杆菌B.nematocida B16形成长链状从而减弱其杀线虫活性。
本发明的功能蛋白与鞭毛蛋白具有协同抑制B16杀线虫的作用，且单独的功能蛋白不能引起B16形态变化，与鞭毛蛋白一起时能使B16形成长链状从而减弱其杀线虫活性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明使用的是线虫肠道共生菌BC7菌株，该菌株对杀线虫细菌芽孢杆菌Bacillus nematocida B16的杀线虫活性有很强的抑制作用，将该线虫肠道共生菌BC7菌株Yokenella sp.BC7于2018年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2018716。
上述线虫肠道共生菌BC7菌中的未知功能蛋白基因共编码1437bp，编码478个氨基酸，将该基因异源表达后，其表达产物亦具有抑制芽孢杆菌B.nematocida B16杀线虫的功能。该基因的功能主要是与鞭毛蛋白一起促使芽孢杆菌B.nematocida B16形成长链状从而减弱其杀线虫活性。
实施例1
步骤一、从线虫肠道内共筛选到9株共生菌，其中BC7具有抑制B16杀线虫的作用，为探索其抑制机制，将BC7发酵液煮沸后发现抑制作用丧失则确定其抑制因子为蛋白质。
步骤二、将BC7菌体接种到LB液体培养基试管中(每管装5ml)，于37℃、220rpm摇床培养12h，获得试管种。再将其转接到500ml LB液体培养基中，于37℃、220rpm摇床培养60h，得到BC7发酵液。
采用硫酸铵分级沉淀：将发酵液于10000rpm 4℃离心20min，取上清液分别加入固体硫酸铵至饱和度为30％、35％、50％、70％、90％，4℃搅拌2h，4℃静置2h，10000r/min离心10min，将沉淀溶解在PBS缓冲液中得粗提液。粗提液装入透析袋中透析24h，透析完后进行SDS-PAGE电泳。采用滤纸片法分别测定各组分的活性，确定最佳硫酸铵饱和度为35％，分子量大小为55KDa。将此条带送到上海颢泽生物医药科技有限公司进行质谱鉴定，确定为未知功能蛋白。
线虫肠道共生菌BC7菌中的功能蛋白基因的cDNA核苷酸序列如下：
ATGACCACTGACATCAACAACAAGACGTTTCTGAACACGCTGTCGCATCTGGCTTCCTCTGCCGGGAACTTCTCACCGACAGTAACATCCACCGGCACGGCGCCGCCCGCTGCGGCATCTGTCTCTGCGAAGGTGATTTTTGACAGTCAGATGGCAGAAATTGTCGCCGTGTTCTCCATGTCGCCAGCCAAAATCAGCGCTGCTGCGACAGCATCAACGCCAGCGGATAGTGTGCTTTCGGGCCCGATGCAACTTGAGTTGAGCAATGAAGGCGTATTCTCGCTAAGCGAGCTGGGGGAGTTACTCCTCGGTAACTACGCCGATAATCAGGGCGATGTGAGTCAGGCGCTGACCAGCCTCGGGCTGGACACCAACACGAATTTCCCAACCAAATCTGCCGTGTCGCTGAATATCACGACGCAATCGGGTTCTGTTGTACATCTGAATCTGACGCGTCAGAGTGATGGTATTGCGGTAGAGCTCACGACCGAAGGCGGCAAAGCCAGCGATGACGAAGCGGCAGAAATCGCAAAATTGGGAAATGCCTTCCAGTCTGCGCTTAACGGTCTGAGCGAGAAGCCCCCGAGAATGGACGTTTCCGGCCTGACGCAGTTTGACAGCTCACTCATCAAATCCGTCGATCTGAAAACTGACCTCAGCCGTGGCGATCTGTCGCAGCAATCCCTTAACTTCCATGCTGACGATAAAGAACGCTGGATTGGTTATCAGGACAATAATTTCTCGCTGAAAATGACCAGCGATACGTCTAATCCGTCTCTGGTGGGCACTGCGGCTGAACAACAGGCGGCAATAAACACCTGGGATACGAAGTTTGATATAGCGCTGCGTGATGTTTATGGCGATAGCGATCAAATGGTGATGCTTGAGACTGCGTTCCATCCGCCGAATCAGACGCAGCCAATAGAGAGCAGCGAGGCGAGCTCAGCGAGCGATATCCATATGAGCGATGACAGCAAGGATAAGTTCCGTCGTATGCATCATTTCTCTCTGGCGCTGGTGGAAAAGAAGCAGGGCATCAACCCGTATCGTATGGATGAGAAAGAGAGCTTCGCGTACCAGGCATCGCAATCGACACAAGAAAGTACGTCGCATGATGGTTCGCTAAGCGTTAAGCAGACGCTGCATACGCATCTGACCGCGTCCTGGTATCAGGTGCCGGATCCGGTCACGCTGCTTTTACTTACCTCGAGCATAATATCACCGAATTATCTGTACCAGACGGTAGATAATGATGATACCACTGCCACCACCGTCAATTACAATGCGAATGGCCTTCTTACCAGTAATGGTAATAATACGCAGGTGAATAATGTCGAACCGGTGCGTCAGAATCTTTTGAGCGAAGTGGTGGATATAACCATCAACCCAGAAAAGAATCAGCGCACCACCTTACTCGTCATGCCCATAGCCACGTAA
对应的线虫肠道共生菌BC7菌中的功能蛋白基因的氨基酸序列如下：
MTTDINNKTFLNTLSHLASSAGNFSPTVTSTGTAPPAAASVSAKVIFDSQMAEIVAVFSMSPAKISAAATASTPADSVLSGPMQLELSNEGVFSLSELGELLLGNYADNQGDVSQALTSLGLDTNTNFPTKSAVSLNITTQSGSVVHLNLTRQSDGIAVELTTEGGKASDDEAAEIAKLGNAFQSALNGLSEKPPRMDVSGLTQFDSSLIKSVDLKTDLSRGDLSQQSLNFHADDKERWIGYQDNNFSLKMTSDTSNPSLVGTAAEQQAAINTWDTKFDIALRDVYGDSDQMVMLETAFHPPNQTQPIESSEASSASDIHMSDDSKDKFRRMHHFSLALVEKKQGINPYRMDEKESFAYQASQSTQESTSHDGSLSVKQTLHTHLTASWYQVPDPVTLLLLTSSIISPNYLYQTVDNDDTTATTVNYNANGLLTSNGNNTQVNNVEPVRQNLLSEVVDITINPEKNQRTTLLVMPIAT
步骤三、构建所述的未知功能蛋白基因的蛋白表达载体PET32a，对BC7提质粒进行双酶切，双酶切验证成功后，导入BL21大肠杆菌感受态细胞，采用0.1mM IPTG在30℃下诱导6h使其表达，利用一站式His标记蛋白质微量纯化套装进行蛋白纯化。
步骤四、利用液体培养方法，对所述的未知功能蛋白基因表达产物测试对芽孢杆菌B.nematocida B16的抑制作用，观察芽孢杆菌B.nematocida B16形态变化，结果表明：单独的未知功能蛋白表达产物对芽孢杆菌B.nematocida B16的形态无影响，与鞭毛蛋白一起时才能使芽孢杆菌B.nematocida B16形态发生变化，促使芽孢杆菌B.nematocida B16形成长链状从而减弱其杀线虫活性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 线虫肠道共生菌BC7的功能蛋白及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaccactg acatcaacaa caagacgttt ctgaacacgc tgtcgcatct ggcttcctct 60
gccgggaact tctcaccgac agtaacatcc accggcacgg cgccgcccgc tgcggcatct 120
gtctctgcga aggtgatttt tgacagtcag atggcagaaa ttgtcgccgt gttctccatg 180
tcgccagcca aaatcagcgc tgctgcgaca gcatcaacgc cagcggatag tgtgctttcg 240
ggcccgatgc aacttgagtt gagcaatgaa ggcgtattct cgctaagcga gctgggggag 300
ttactcctcg gtaactacgc cgataatcag ggcgatgtga gtcaggcgct gaccagcctc 360
gggctggaca ccaacacgaa tttcccaacc aaatctgccg tgtcgctgaa tatcacgacg 420
caatcgggtt ctgttgtaca tctgaatctg acgcgtcaga gtgatggtat tgcggtagag 480
ctcacgaccg aaggcggcaa agccagcgat gacgaagcgg cagaaatcgc aaaattggga 540
aatgccttcc agtctgcgct taacggtctg agcgagaagc ccccgagaat ggacgtttcc 600
ggcctgacgc agtttgacag ctcactcatc aaatccgtcg atctgaaaac tgacctcagc 660
cgtggcgatc tgtcgcagca atcccttaac ttccatgctg acgataaaga acgctggatt 720
ggttatcagg acaataattt ctcgctgaaa atgaccagcg atacgtctaa tccgtctctg 780
gtgggcactg cggctgaaca acaggcggca ataaacacct gggatacgaa gtttgatata 840
gcgctgcgtg atgtttatgg cgatagcgat caaatggtga tgcttgagac tgcgttccat 900
ccgccgaatc agacgcagcc aatagagagc agcgaggcga gctcagcgag cgatatccat 960
atgagcgatg acagcaagga taagttccgt cgtatgcatc atttctctct ggcgctggtg 1020
gaaaagaagc agggcatcaa cccgtatcgt atggatgaga aagagagctt cgcgtaccag 1080
gcatcgcaat cgacacaaga aagtacgtcg catgatggtt cgctaagcgt taagcagacg 1140
ctgcatacgc atctgaccgc gtcctggtat caggtgccgg atccggtcac gctgctttta 1200
cttacctcga gcataatatc accgaattat ctgtaccaga cggtagataa tgatgatacc 1260
actgccacca ccgtcaatta caatgcgaat ggccttctta ccagtaatgg taataatacg 1320
caggtgaata atgtcgaacc ggtgcgtcag aatcttttga gcgaagtggt ggatataacc 1380
atcaacccag aaaagaatca gcgcaccacc ttactcgtca tgcccatagc cacgtaa 1437
<210> 2
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Thr Thr Asp Ile Asn Asn Lys Thr Phe Leu Asn Thr Leu Ser His
1 5 10 15
Leu Ala Ser Ser Ala Gly Asn Phe Ser Pro Thr Val Thr Ser Thr Gly
20 25 30
Thr Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Val Ser Ala Lys Val Ile Phe Asp
35 40 45
Ser Gln Met Ala Glu Ile Val Ala Val Phe Ser Met Ser Pro Ala Lys
50 55 60
Ile Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ser Thr Pro Ala Asp Ser Val Leu Ser
65 70 75 80
Gly Pro Met Gln Leu Glu Leu Ser Asn Glu Gly Val Phe Ser Leu Ser
85 90 95
Glu Leu Gly Glu Leu Leu Leu Gly Asn Tyr Ala Asp Asn Gln Gly Asp
100 105 110
Val Ser Gln Ala Leu Thr Ser Leu Gly Leu Asp Thr Asn Thr Asn Phe
115 120 125
Pro Thr Lys Ser Ala Val Ser Leu Asn Ile Thr Thr Gln Ser Gly Ser
130 135 140
Val Val His Leu Asn Leu Thr Arg Gln Ser Asp Gly Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Leu Thr Thr Glu Gly Gly Lys Ala Ser Asp Asp Glu Ala Ala Glu Ile
165 170 175
Ala Lys Leu Gly Asn Ala Phe Gln Ser Ala Leu Asn Gly Leu Ser Glu
180 185 190
Lys Pro Pro Arg Met Asp Val Ser Gly Leu Thr Gln Phe Asp Ser Ser
195 200 205
Leu Ile Lys Ser Val Asp Leu Lys Thr Asp Leu Ser Arg Gly Asp Leu
210 215 220
Ser Gln Gln Ser Leu Asn Phe His Ala Asp Asp Lys Glu Arg Trp Ile
225 230 235 240
Gly Tyr Gln Asp Asn Asn Phe Ser Leu Lys Met Thr Ser Asp Thr Ser
245 250 255
Asn Pro Ser Leu Val Gly Thr Ala Ala Glu Gln Gln Ala Ala Ile Asn
260 265 270
Thr Trp Asp Thr Lys Phe Asp Ile Ala Leu Arg Asp Val Tyr Gly Asp
275 280 285
Ser Asp Gln Met Val Met Leu Glu Thr Ala Phe His Pro Pro Asn Gln
290 295 300
Thr Gln Pro Ile Glu Ser Ser Glu Ala Ser Ser Ala Ser Asp Ile His
305 310 315 320
Met Ser Asp Asp Ser Lys Asp Lys Phe Arg Arg Met His His Phe Ser
325 330 335
Leu Ala Leu Val Glu Lys Lys Gln Gly Ile Asn Pro Tyr Arg Met Asp
340 345 350
Glu Lys Glu Ser Phe Ala Tyr Gln Ala Ser Gln Ser Thr Gln Glu Ser
355 360 365
Thr Ser His Asp Gly Ser Leu Ser Val Lys Gln Thr Leu His Thr His
370 375 380
Leu Thr Ala Ser Trp Tyr Gln Val Pro Asp Pro Val Thr Leu Leu Leu
385 390 395 400
Leu Thr Ser Ser Ile Ile Ser Pro Asn Tyr Leu Tyr Gln Thr Val Asp
405 410 415
Asn Asp Asp Thr Thr Ala Thr Thr Val Asn Tyr Asn Ala Asn Gly Leu
420 425 430
Leu Thr Ser Asn Gly Asn Asn Thr Gln Val Asn Asn Val Glu Pro Val
435 440 445
Arg Gln Asn Leu Leu Ser Glu Val Val Asp Ile Thr Ile Asn Pro Glu
450 455 460
Lys Asn Gln Arg Thr Thr Leu Leu Val Met Pro Ile Ala Thr
465 470 475

Claims (8)

1.线虫肠道共生菌BC7的功能蛋白，其特征在于：所述功能蛋白基因的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的功能蛋白，其特征在于：所述功能蛋白基因的cDNA核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的功能蛋白在抑制芽孢杆菌B.nematocida B16中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用为阻止芽孢杆菌B.nematocidaB16的生长繁殖和对线虫肠道的破坏。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述功能蛋白基因的表达载体为PET32a。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用为功能蛋白异源表达后与鞭毛蛋白协同抑制芽孢杆菌B.nematocida B16。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述将功能蛋白异源表达是将功能蛋白与载体PET32a连接，导入感受态细胞，进行诱导表达。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述功能蛋白与鞭毛蛋白一起促使芽孢杆菌B.nematocida B16形成长链状从而减弱其杀线虫活性。
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