ES2225835T3 - Proteinas antimicrobianas. - Google Patents

Proteinas antimicrobianas.

Info

Publication number
ES2225835T3
ES2225835T3 ES95903856T ES95903856T ES2225835T3 ES 2225835 T3 ES2225835 T3 ES 2225835T3 ES 95903856 T ES95903856 T ES 95903856T ES 95903856 T ES95903856 T ES 95903856T ES 2225835 T3 ES2225835 T3 ES 2225835T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
cys
protein
antifungal
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES95903856T
Other languages
English (en)
Inventor
Willem Frans Broekaert
Bruno Philippe Angelo Cammue
Rupert William Osborn
Sarah Bronwen Rees
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Ltd
Original Assignee
Syngenta Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syngenta Ltd filed Critical Syngenta Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2225835T3 publication Critical patent/ES2225835T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

PROTEINAS ANTIMICROBIALES CAPACES DE AISLARSE DE SEMILLAS DE LA "HEUCHERA" O "AESCULUS" QUE MUESTRAN UN AMPLIO ESPECTRO DE ACTIVIDAD ANTIFUNGAL Y ALGUNA ACTIVIDAD CONTRA LA BACTERIA GRAMPOSITIVA. EL ADN QUE CODIFICA LAS PROTEINAS PUEDE AISLARSE E INCORPORARSE EN VECTORES. SE PUEDEN PRODUCIR PLANTAS TRANSFORMADAS CON ESTE ADN. LAS PROTEINAS ENCUENTRAN UNA APLICACION COMERCIAL COMO AGENTES ANTIBACTERIALES O ANTIFUNGICOS; LAS PLANTAS TRANSFORMADAS MOSTRARAN UNA RESISTENCIA A LAS ENFERMEDADES INCREMENTADA.

Description

Proteínas antimicrobianas.
Esta invención se refiere a proteínas antimicrobianas, a procedimientos para su fabricación y utilización, y a secuencias de ADN que las codifican. En particular se refiere a proteínas antimicrobianas que se pueden aislar de semillas de Heuchera.
En este contexto, las proteínas antimicrobianas se definen como proteínas que poseen al menos una de las actividades siguientes: actividad antifúngica (que puede incluir actividad antilevadura), actividad antibacteriana. La actividad incluye un conjunto de efectos antagonistas como inhibición parcial o muerte. Estas proteínas pueden ser oligoméricas o pueden ser subunidades de un único péptido.
El género Heuchera forma parte de la familia de plantas Saxifragaceae. La familia Saxifragaceae es una familia ampliamente distribuida que comprende principalmente hierbas y arbustos perennes, que contiene las y las grosellas así como muchas flores de jardín conocidas.
Las plantas producen un amplio conjunto de compuestos antifúngicos para combatir invasores potenciales y en los últimos diez años ha resultado evidente que las proteínas con actividad antifúngica forman una parte importante de estas defensas. Se han descrito numerosas clases de estas proteínas incluyendo tioninas, beta-1,3-glucanasas, proteínas que inactivan los ribosomas, zeamatinas, lectinas que se unen a quitina y quitinasas. Estas proteínas han obtenido una atención considerable porque potencialmente podrían utilizarse como agentes de biocontrol.
La Solicitud de Patente Internacional Número PCT/GB92/01.570 (publicada el 18 de marzo de 1993 con el número de publicación WO93/05.153) describe una clase de proteínas que comprende proteínas antifúngicas (AFP) y proteínas antimicrobianas (AMP). La clase incluye las proteínas siguientes: Rs-AFP1 y Rs-AFP2 que pueden aislarse de Raphanus sativus (Terras FRG et al., 1992, J Biol Chem, 257:15301-13309), Bn-AFP1 y Bn-AFP2 que pueden aislarse de Brassica napus, Br-AFP1 y Br-AFP2 que pueden aislarse de Brassica rapa, Sa-AFP1 y Sa-AFP2 que pueden aislarse de Sinapis alba, At-AFP1 que puede aislarse de Arabidopsis thaliana, Dm-AMP1 y Dm-AMP2 que pueden aislarse de Dahlia merckii, Cb-AMP1 y Cb-AMP2 que pueden aislarse de Cnicus benedictus, Lc-AFP que puede aislarse de Lathyrus cicera, Ct-AMP1 y Ct-AMP2 que pueden aislarse de Clitoria ternatea. Esta clase de proteínas se referirá de ahora en adelante en la presente memoria como "proteínas del tipo Rs-AFP". Éstas y otras proteínas antimicrobianas derivadas de las plantas son útiles como fungicidas o antibióticos, particularmente para fines agrícolas. Las proteínas pueden aplicarse en o alrededor de una planta o pueden expresarse en la planta.
Actualmente, hemos purificado una proteína antimicrobiana potente nueva.
Hemos purificado una proteína antimicrobiana nueva de las semillas de Heuchera sanguinea, denominada de ahora en adelante en la presente memoria Hs-AFP1 (Heuchera sanguinea-proteína antifúngica 1). Hs-AFP1 es un polipéptido de 5 kDa; dichos polipéptidos pueden asociarse como dímeros. Hs-AFP1 muestra un amplio rango de actividad antifúngica.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una proteína antifúngica que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos prácticamente homóloga a la SEC ID NO: 1 con al menos un 60% de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos total mostrada en la SEC ID NO: 1, siempre que dicha proteína tenga actividad antifúngica.
Una proteína antifúngica de acuerdo con la invención puede aislarse de las semillas de Heuchera, y puede también aislarse de las semillas tanto de especies relacionadas como no relacionadas, o puede producirse o sintetizarse por cualquier método apropiado.
La proteína antifúngica puede extraerse y purificarse de material vegetal, fabricarse a partir de su secuencia de aminoácidos conocida mediante síntesis química utilizando un sintetizador de péptidos estándar, o producirse en un organismo apropiado (por ejemplo, un microorganismo o una planta) por expresión de ADN recombinante. La proteína antifúngica resulta útil como un fungicida y puede utilizarse para aplicaciones agrícolas o farmacéuticas.
La secuenciación de aminoácidos de Hs-AFP1 muestra que es homóloga a las proteína de tipo Rs-AFP (Publicación de la Solicitud de Patente Internacional Número WO93/05.153). La secuencia de aminoácidos de Hs-AFP1 se muestra como SEC ID NO: 1.
La Figura 5 muestra la alineación de la secuencia de Hs-AFP1 (SEC ID NO: 1) con las proteínas del tipo Rs-AFP antifúngicas/antimicrobianas Rs-AFP1 (SEC ID NO: 3), Rs-AFP2 (SEC ID NO: 4), Dm-AMP1 (SEC ID NO: 5), Cb-AMP1 (SEC ID NO: 6), Ct-AMP1 (SEC ID NO: 7) y Lc-AFP (SEC ID NO: 8) como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional Número WO93/05.153. También se muestra parte de las secuencias de las proteínas Si\alpha2 de Sorghum (SEC ID NO: 9) y gl-P de Triticum (SEC ID NO: 10), así como los productos génicos predichos de pSAS10 (Vigna) (SEC ID NO: 11), pl230 (Pisum) (SEC ID NO: 12) y p322 (Solanum) (SEC ID NO: 13) (que se discutirán más adelante en la presente memoria). Se han introducido guiones en las secuencias para proporcionar un alineamiento óptimo.
Las proteínas del tipo Rs-AFP comparten una fracción estructural común que también se encuentra en la secuencia de Hs-AFP1. La alineación de la secuencia de Hs-AFP1 con las proteínas del tipo Rs-AFP muestra que comparten una fracción consenso cisteína-glicina que se muestra en la Figura 3. Resulta claro a partir de la Figura 3 que el número de restos de aminoácidos entre las cisteínas y las glicinas conservadas varia ligeramente en las diferentes secuencias y en las secuencias parciales mostradas: se han introducido guiones en las secuencias para proporcionar un alineamiento óptimo. Con la numeración de restos relativa a la secuencia de Hs-AFP1, el total de los ocho restos de cisteína tienen posiciones conservadas en los restos con los números 6, 17, 23, 27, 39, 48, 50 y 54 y hay dos glicinas conservadas en los números de posiciones 15 y 37. Además, hay un resto aromático conservado en la posición 13, y un resto de glutamato conservado en la posición 31.
La secuencia de Hs-AFP1 muestra un 48% de identidad de secuencia con Rs-AFP1. A pesar de las similitudes entre la proteína de Heuchera (Hs-AFP1), y las proteínas del tipo Rs-AFP, existen diferencias en el contenido y secuencia de aminoácidos globales.
La actividad antifúngica de Hs-AFP1 produce una gran ramificación (hiper ramificación) de las hifas de los hongos de determinadas especies. Este efecto morfológico es similar al producido por Rs-AFP1 o Rs-AFP2.
Hs-AFP1, y las proteínas del tipo Rs-AFP son parcialmente homólogas a los productos proteicos predicho de los genes inducidos de Fusarium pl39 y pl230 en guisante (Pisum sativum - un miembro de la familia Fabaceae) como describen Chiang y Hadwiger (1991, Mol Plant Microbe Interact, 4: 324-331). Esta homología la comparten con el producto proteico predicho del gen pSAS10 de fréjol (Vigna unguiculata - otra Fabaceae) como describe Ishibashi et al (1990, Plant Mol Biol , 15:59-64). Las proteínas también son parcialmente homólogas con el producto proteico predicho del gen p322 en patata (Solanum tuberosum - un miembro de la familia Solanaceae) como describe Stiekema et al (1988, Plant Mol Biol, 11:255-269). Recientemente se ha purificado de tubérculos de patata una proteína cuya secuencia de aminoácidos amino terminal es prácticamente idéntica a la proteína madura codificada por p322 y se ha demostrado que posee actividad antimicrobiana (Moreno et al, 1994, Eur J Biochem, 233:135-139). No se conoce nada de las propiedades biológicas de las proteínas codificadas por los genes pl39, pl230, pSAS10 o p322 porque sólo se ha estudiado el ADNc. Sin embargo, los genes pl39 y pl230 se activan después de que la planta sufra una enfermedad u otra clase de estrés. Se ha propuesto que el gen pSAS10 codifica una proteína implicada en la
germinación.
Las secuencias de Hs-AFP1 y de las proteínas del tipo Rs-AFP muestran un grado menor de homología parcial con las secuencias de un grupo de inhibidores de \alpha-amilasa pequeños encontrados en los miembros siguientes de Gramineae: sorgo (Bloch y Richardson, 1991, FEBS Lett, 279:101-104), trigo (Colitta et al, 1990, FEBS Lett, 270:191-194) y cebada (Mendez et al, 1990, Eur J Biochem, 194:533-539). Se sabe que estas proteínas, incluyendo Si\alpha2 de sorgo y g-1-purotionina (g-1P) de trigo, inhiben la \alpha-amilasa de los insectos y que pueden ser tóxicas para las larvas de los insectos aunque esto nunca se ha mostrado. No se sabe si estos inhibidores de \alpha-amilasa muestran alguna actividad antifúngica u otra actividad antimicrobiana: no se ha publicado ningún otro dato respecto a su actividad
biológica.
El conocimiento de su estructura primaria permite fabricar la proteína antimicrobiana, o partes de ella, mediante síntesis química utilizando un sintetizador de péptidos estándar. También permite la producción de construcciones de ADN que codifican la proteína antimicrobiana.
La invención también proporciona una secuencia de ADN que codifica una proteína antifúngica de acuerdo con la invención. La secuencia de ADN puede ser una secuencia de ADNc o una secuencia genómica, y puede derivarse de un clon de ADNc, un clon de ADN genómico o ADN producido utilizando un sintetizador de ácidos nucleicos estándar.
La secuencia de ADN puede predecirse a partir de la secuencia de aminoácidos conocida y el ADN que codifica la proteína puede fabricarse utilizando un sintetizador de ácidos nucleicos estándar. De manera alternativa, la secuencia de ADN puede aislarse de bibliotecas de ADN derivado de plantas. Las sondas de oligonucleótidos apropiadas pueden derivarse de la secuencia de aminoácidos conocida y pueden utilizarse para rastrear una biblioteca de ADNc para buscar clones de ADNc que codifican parte o toda la proteína. Estas mismas sondas de oligonucleótidos o clones de ADNc pueden utilizarse para aislar el gen o genes de la proteína antimicrobiana mediante rastreo de bibliotecas de ADN genómico. Estos clones genómicos pueden incluir secuencias control que operan en el genoma de la planta. De esta manera también es posible aislar secuencias de promotor que pueden utilizarse para dirigir la expresión de las proteínas antimicrobianas (u otras). Estos promotores pueden responder particularmente a condiciones medioambientales (como la presencia de un patógeno fúngico), y pueden utilizarse para dirigir la expresión de cualquier gen
diana.
La secuencia de ADN que codifica la proteína antifúngica puede incorporarse a una construcción de ADN o a un vector en combinación con secuencias reguladoras apropiadas (promotor, terminador, etc). La secuencia de ADN puede situarse bajo el control de un promotor constitutivo o inducible (estimulado, por ejemplo, por condiciones medioambientales, presencia de un patógeno, presencia de un compuesto químico). Dicha construcción de ADN puede clonarse o transformarse en un sistema biológico que permita la expresión de la proteína codificada o de una parte activa de la proteína. Los sistemas biológicos apropiados incluyen microorganismos (por ejemplo, bacterias como Escherichia coli, Pseudomonas y endofitos como Clavibacter xyli subesp. cynodontis (Cxc); levaduras; virus; bacteriofagos; etc), células en cultivo (como células de insecto, células de mamífero) y plantas. En algunos casos, la proteína expresada puede ser posteriormente extraída y aislada para ser utilizada.
Una proteína antifúngica de acuerdo con la invención (como Hs-AFP1) es útil como un fungicida. La invención proporciona además un procedimiento para combatir hongos patógenos para las plantas en el que se exponen a una proteína antifúngica de acuerdo con la invención.
Para las aplicaciones farmacéuticas, la proteína antifúngica puede utilizarse como un fungicida para tratar infecciones de mamíferos (por ejemplo, para combatir levaduras como Candida). La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende la proteína antifúngica de la invención. La invención proporciona además la proteína antifúngica de la invención para utilizarse como un producto farmacéutico.
Una proteína antifúngica de acuerdo con la invención también puede utilizarse como un conservante (por ejemplo, como un aditivo alimentario).
Para aplicaciones agrícolas, la proteína antifúngica puede utilizarse para mejorar la resistencia a enfermedades o la tolerancia a enfermedades de las cosechas bien durante la vida de las plantas o para la protección de la cosecha después de la recogida. Los patógenos expuestos a las proteínas resultan inhibidos. La proteína antifúngica puede erradicar un patógeno que está establecido en la planta o puede proteger a la planta de futuros ataques de patógenos. El efecto de erradicación de la proteína es particularmente ventajoso.
La exposición de un patógeno de las plantas a una proteína antifúngica puede conseguirse de diferentes formas, por ejemplo:
(a) una composición que comprende la proteína aislada puede aplicarse a partes de la planta o al suelo que la rodea utilizando técnicas agrícolas estándar (como pulverización); la proteína puede haberse extraído de tejido de la planta o puede haberse sintetizado químicamente o haberse extraído de microorganismos modificados genéticamente para expresar la proteína;
(b) una composición que comprende un microorganismo modificado genéticamente para expresar la proteína antifúngica puede aplicarse a una planta o al suelo en el que la planta crece;
(c) un endofito modificado genéticamente para expresar la proteína antifúngica puede introducirse en el tejido de la planta (por ejemplo, a través de un tratamiento de las semillas);
[Un endofito se define como un microorganismo que tiene la capacidad de mantener una relación endosimbiótica no patógena con una planta anfitriona. Se ha descrito un método para incrementar la protección de plantas mediante endofitos en una serie de solicitudes de patentes por Crop Genetics International Corporation (por ejemplo, Publicación de Solicitud Internacional Número WO90/13.224, Publicación de Patente Europea Número EP-125.468-B1, Publicación de Solicitud Internacional Número WO91/10.363, Publicación de Solicitud Internacional Número WO87/03.303). El endofito puede estar modificado genéticamente para producir compuestos químicos agrícolas. La Publicación de Solicitud de Patente Internacional Número WO94/16.076 (ZENECA Limited) describe la utilización de endofitos que han sido modificados genéticamente para expresar una proteína antimicrobiana derivada de
plantas].
(d) ADN que codifica una proteína antifúngica puede introducirse en el genoma de la planta de manera que la proteína se exprese en el cuerpo de la planta (el ADN puede ser ADNc, ADN genómico o ADN producido utilizando un sintetizador de ácidos nucleicos estándar).
Las células de las plantas pueden transformarse con construcciones de ADN recombinante de acuerdo con diferentes métodos conocidos (plásmidos Ti de Agrobacterium, electroporación, microinyección, pistola de microproyectiles, etc). Las células transformadas pueden, en casos apropiados, regenerarse en plantas enteras en las que el material nuclear nuevo se incorpora de manera estable en el genoma. De esta forma se pueden obtener tanto plantas monocotiledoneas como dicotiledoneas, aunque las últimas son habitualmente más fáciles de regenerar. Parte de la progenie de estos transformantes primarios heredarán el ADN recombinante que codifica la proteína o proteínas
antifúngicas.
La invención proporciona además una planta con una resistencia mejorada frente a un patógeno fúngico y que contiene ADN recombinante que expresa una proteína antifúngica de acuerdo con la invención. Esta planta puede utilizarse como parental en cruces estándar de plantas para desarrollar híbridos y líneas que tengan una resistencia fúngica mejorada.
El ADN recombinante es ADN heterólogo que se ha introducido en la planta o en sus ancestros por transformación. El ADN recombinante codifica una proteína antifúngica expresada mediante administración a un sitio de ataque del patógeno (como las hojas). El ADN puede codificar una subunidad activa de una proteína antifúngica.
Un patógeno puede ser cualquier hongo que crezca dentro, sobre o cerca de la planta. En este contexto, la resistencia mejorada se define como una tolerancia incrementada a un patógeno fúngico si se compara con la de una planta salvaje. La resistencia puede variar de un ligero incremento en la tolerancia a los efectos del patógeno (donde el patógeno se inhibe parcialmente) hasta resistencia total de manera que la planta no se ve afectada por la presencia del patógeno (donde el patógeno se inhibe de manera severa o muere). Un nivel incrementado de resistencia frente a un patógeno particular o de resistencia frente a un espectro amplio de patógenos pueden constituir una mejora en la resistencia. Las plantas transgénicas (o las plantas derivadas de ellas) que muestran una resistencia mejorada se seleccionan después de la transformación de la planta o del cruce posterior.
Cuando la proteína antifúngica se expresa en una planta transgénica o en su progenie, el hongo se expone a la proteína en el sitio del ataque del patógeno en la planta. En particular, mediante la utilización de las secuencias génicas reguladoras apropiadas, la proteína puede producirse in vivo cuando y donde vaya a ser más eficaz. Por ejemplo, la proteína puede producirse en las partes de la planta donde no se expresa normalmente en cantidad pero donde la resistencia a las enfermedades es importante (como en las hojas).
Los ejemplos de plantas modificadas genéticamente que pueden producirse incluyen cosechas de campo, cereales, frutas y verduras como: canola, girasol, tabaco, remolacha, algodón, soja, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomates, mangos, melocotones, manzanas, peras, fresas, plátanos, melones, patatas, zanahoria, lechuga, col, cebolla.
La invención se describirá ahora con ejemplos sólo mediante referencia a los dibujos, en los que:
La Figura 1 muestra el cromatograma de intercambio catiónico para la purificación de Hs-AFP1 y el gráfico asociado de la inhibición del crecimiento fúngico;
La Figura 2 muestra el cromatograma de fase reversa de la Hs-AFP1 purificada;
La Figura 3 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de Hs-AFP1, y de otras proteínas;
y mediante referencia al LISTADO DE SECUENCIAS en el que:
SEC ID NO 1 es la secuencia de aminoácidos de Hs-AFP1;
SEC ID NO 2 es la secuencia de aminoácidos de Ah-AMP1;
SEC ID NO 3 es la secuencia de aminoácidos de Rs-AFP1;
SEC ID NO 4 es la secuencia de aminoácidos de Rs-AFP2;
SEC ID NO 5 es la secuencia de aminoácidos de Dm-AMP1;
SEC ID NO 6 es la secuencia de aminoácidos de Cb-AMP1;
SEC ID NO 7 es la secuencia de aminoácidos de Ct-AMP1;
SEC ID NO 8 es la secuencia de aminoácidos de Lc-AFP;
SEC ID NO 9 es parte de la secuencia de aminoácidos de Si\alpha2;
SEC ID NO 10 es parte de la secuencia de aminoácidos de \gamma1-P;
SEC ID NO 11 es parte de la secuencia de aminoácidos predicha del producto del gen pSAS10;
SEC ID NO 12 es parte de la secuencia de aminoácidos predicha del producto del gen pl230;
SEC ID NO 13 es parte de la secuencia de aminoácidos predicha del producto del gen p322.
Ejemplo 1 Ensayos de actividad antifúngica y antibacteriana
La actividad antifúngica se determinó mediante microespectrofotometría como se ha descrito previamente (Broekaert, 1990, FEMS Microbiol Lett, 69:55-60). De manera rutinaria, los ensayos se realizaron con 20 \mul de una disolución de ensayo (esterilizada por filtración) y 80 \mul de una suspensión de esporas de hongo (2 x 10^{4} esporas/ml) en caldo de dextrosa y patata de fuerza media (1/2 PDB). El medio de crecimiento artificial (SMF) consistió en K_{2}HPO_{4} (2,5 mM), MgSO_{4} (50 \muM), CaCl_{2} (50 \muM), FeSO_{4} (5 \muM), CoCl_{2} (0,1 \muM), CuSO_{4} (0,1 \muM), Na_{2}MoO_{4} (2 \muM), H_{3}BO_{3} (0,5 \muM), KI (0,1 \muM), ZnSO_{4} (0,5 \muM), MnSO_{4} (0,1 \muM), glucosa (10 g/l), asparagina (1 g/l), metionina (20 mg/l), mio inositol (2 mg/l), biotina (0,2 mg/l), tiamina-HCl (1 mg/l), y piridoxina-HCl (0,2 mg/l). Los microcultivos control contenían 20 \mul de agua destilada estéril y 80 \mul de la suspensión de esporas
fúngicas.
A no ser que se indique otra cosa, el organismo de ensayo fue Fusarium culmorum (cepa IMI 180420) y la incubación se realizó a 25ºC durante 48 horas. El porcentaje de inhibición del crecimiento se define como 100 veces la proporción de la absorbancia corregida del microcultivo control menos la absorbancia corregida del microcultivo de ensayo sobre la absorbancia corregida a 595 nm del microcultivo control. Los valores de absorbancia corregida son la absorbancia a 595 nm del cultivo medida después de 48 horas menos la absorbancia a 595 nm medida después de 30 minutos.
La actividad antibacteriana se determinó de forma microespectrofotométrica como sigue. Se preparó una suspensión bacteriana inoculando agarosa nutriente (triptona, 10 g/l; agarosa Seaplaque (FMC), 5 g/l). Se añadieron alicuotas (80 \mul) de la suspensión bacteriana (10^{5} unidades formadoras de colonias por ml) a muestras esterilizadas por filtración (20 \mul) en microplacas de 96 pocillos de fondo plano. Se midió la absorbancia a 595 nm del cultivo con la ayuda de un lector de microplacas después de 30 minutos y de 24 horas de incubación a 28ºC. Se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento como se ha descrito más arriba para el ensayo de la actividad antifúngica.
Ejemplo 2 Purificación de proteínas antifúngicas de semillas de Heuchera sanguinea
Se molieron veinte gramos de semillas de H sanguinea (obtenidas de Okkerse, Mechelen, Bélgica) en un molinillo de café y la molienda resultante se extrajo durante 2 horas a 4ºC con 100 ml de un tampón de extracción frío que contiene 10 mM NaH_{2}PO_{4}, 15 mM Na_{2}HPO_{4}, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 2 mM tiourea, y 1 mM PMSF. El homogenado se estrujó a través de una gasa y se aclaró mediante centrifugación (30 minutos a 7.000 x g). El sobrenadante se dializó frente a agua destilada utilizando tubos de celulosa benzoilada (Sigma) con un peso molecular de corte de 2.000 Da. Después de la diálisis se ajustó la disolución a 50 mM (NH_{4})Ac (pH 9) por adición del tampón diez veces concentrado, y se pasó posteriormente por una columna Fast Flow Q-Sepharosa (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (12 x 5 cm) en equilibrio con 50 mM NH_{4}Ac (pH 9). La fracción de proteína que pasó a través de la columna se liofilizó y se volvió a disolver finalmente en 50 ml de 20 mM NH_{4}Ac (acetato de amonio), pH 6.
Esta fracción se aplicó en una columna (10 x 1,6 cm) de S-Sefarosa de Alta Resolución (Pharmacia) equilibrada previamente con 20 mM de tampón NH_{4}Ac. La columna se eluyó a 1 ml/minuto con un gradiente lineal de 120 ml de 20 a 500 mM NH_{4}Ac (pH 6). El eluido se evaluó para determinar la presencia de proteína mediante una medición en línea de la absorbancia a 280 nm (resultados mostrados en el panel inferior de la Figura 1) y se recogió en fracciones de 7,5 ml.
Las fracciones se liofilizaron y se volvieron a disolver en agua destilada. De estas fracciones se ensayaron 5 \mul en los ensayos microespectrofotométricos de actividad antifúngica descritos en el Ejemplo 1 utilizando el medio de crecimiento artificial suplementado con 1 mM CaCl_{2} y 50 mM KCl (resultados mostrados como histogramas en el panel superior de la Figura 1). Toda la actividad antifúngica se encontró en el pico principal, que eluyó a aproximadamente 300 mM NH_{4}Ac (indicado por una cabeza de flecha en la Figura 1).
La fracción que mostró la actividad antifúngica más alta se purificó adicionalmente por cromatografía de fase reversa. Esta fracción se cargó en una columna (25 x 0,93 cm) Pep-S (sílice porosa C_{2}/C_{18}, Pharmacia) en equilibrio con 10% acetonitrilo con 0,1% TFA. La columna se eluyó a 4 ml/min con un gradiente lineal de 200 ml de 10% acetonitrilo/0,1% ácido trifluoroacético (TFA) a 95% acetonitrilo/0,1% TFA. El eluido se evaluó para determinar la presencia de proteína mediante una medición en línea de la absorbancia a 280 nm. Se recogieron fracciones de 2 ml del eluido, se secaron en vacío, y finalmente se disolvieron en 0,5 ml de agua destilada de los que 10 \mul se utilizaron en un ensayo microespectrofotométrico de actividad antifúngica utilizando el medio de crecimiento artificial descrito en el Ejemplo 1, suplementado con 1 mM CaCl_{2} y 50 mM KCl.
La Figura 2 muestra el cromatograma de fase reversa de la fracción activa purificada mediante cromatografía de intercambio catiónico. El panel inferior muestra la evaluación del eluido para determinar la presencia de proteína por medición de la absorbancia a 280 nm. El panel superior muestra la actividad antifúngica obtenida mediante el ensayo microespectrofotométrico. El cromatograma muestra tres picos de los que el primero, que eluyó a 25% de acetonitrilo contiene toda la actividad antifúngica. El factor activo aislado de este pico (indicado con una cabeza de flecha en la Figura 2) se llama Hs-AFP1 (Heuchera sanguinea - Proteína Antifúngica 1).
Ejemplo 3 Estructura molecular de la proteína antifúngica purificada, Hs-AFP1
La estructura molecular de la proteína antifúngica purificada se analizó adicionalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de sodiododecilsulfato (SDS-PAGE). SDS-PAGE se realizó en geles comerciales precast (PhastGel de Alta Densidad de Pharmacia) utilizando un aparato de electroforesis PhastSystem (Pharmacia). El tampón de la muestra contenía 200 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1% (p/v) SDS, 1 mM EDTA, 0,005% azul de bromofenol y, a no ser que se indique otra cosa, 1% (p/v) ditioeritritol (DTE). Se separaron doscientos nanogramos de las proteínas en los geles. Se utilizaron como marcadores de peso molecular fragmentos de mioglobina (Pharmacia) con los tamaños siguientes: 17 kDa, 14,5 kDa, 8 kDa, 6 kDa, y 2,5 kDa. Las proteínas se fijaron después de la electroforesis en 12,5% glutaraldehido y se tiñeron con plata de acuerdo con Heukeshoven y Dernick (1985, Electrophoresis, 6, 103-112).
Después de reducir los restos de cisteína con DTE, Hs-AFP1 muestra una única banda con una masa molecular aparente de aproximadamente 5 kDa. Hs-AFP1 sin reducir migra como una única banda de aproximadamente 10 kDa. Estos resultados muestran que la Hs-AFP1 nativa puede ser una proteína oligomérica, que consiste probablemente en un dímero del polipéptido de 5 kDa. La estructura oligomérica parece estar estabilizada por uniones disulfuro.
Ejemplo 4 Potencia antifúngica y antibacteriana
La potencia antifúngica de la proteína purificada se evaluó en diferentes hongos patógenos para las plantas, utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 1. El crecimiento de los hongos, la recogida de las esporas fúngicas y la preparación de fragmentos de micelio se realizó como se ha descrito previamente (Broekaert et al, 1990, FEMS Microbiol Lett, 69:55-60). Se aplicaron diluciones seriadas de las proteínas antifúngicas a los hongos, bien utilizando medio de crecimiento SMF- (el medio de crecimiento artificial del Ejemplo 1), medio SMF+ (medio SMF- suplementado con 1 mM CaCl_{2} y 50 mM KCl), medio de crecimiento 1/2 PDB- (caldo de dextrosa y patata de fuerza media como en el Ejemplo 1) o medio de crecimiento 1/2 PDB+ (medio 1/2 PDB- suplementado con 1 mM CaCl_{2} y 50 mM KCl). El porcentaje de inhibición del crecimiento se determinó por microespectrofotometría. La concentración requerida para un 50% de inhibición del crecimiento después de 48 h de incubación (valor CI_{50}) se calculó de las curvas de dosis respuesta.
Los resultados de Hs-AFP1 están resumidos en la Tabla 1. Las abreviaturas utilizadas son: CI_{50} = concentración requerida para una inhibición del crecimiento del 50% determinada como se describe en el Ejemplo 1; ND = no determinado; SP = esporas; PrSp = esporas pregerminadas en el medio durante 24 horas; MF = fragmentos de micelio preincubados durante 48 horas en el medio antes de la adición de las proteínas; BHR = intervalo amplio de anfitrión; SF = hongo saprofítico; SMF- = medio de crecimiento artificial como se describe en el Ejemplo 1; SMF+ = SMF- suplementado con 1 mM CaCl_{2} y 50 mM KCl; 1/2PDB- = caldo dextrosa de y patata de fuerza media como se describe en el Ejemplo 1; 1/2PDB+ = 1/2PDB- suplementado con 1 mM CaCl_{2} y 50 mM KCl.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
1
2
3
Los resultados de la Tabla 1 ilustran el amplio rango de actividad antifúngica que presenta la proteína Hs-AFP1.
En los medios SMF+ y 1/2PDB+ (que contienen sales como aditivos para simular la fuerza iónica de las condiciones fisiológicas en los tejidos de las plantas), la actividad de las dos proteínas se reduce en comparación con su actividad en los medios SMF- ó 1/2PDB-. La reducción en la actividad dependiente de las sales es claramente dependiente del organismo utilizado en el ensayo.
Hs-AFP1 interfiere con los procesos de crecimiento de los hongos, lo que se refleja en una reducción en la longitud de las hifas. Hs-AFP1 también produce hiper ramificación de las hifas de Fusarium culmorum. Un efecto similar se produce por las proteínas antifúngicas Rs-AFP1 y Rs-AFP2 de semillas de Raphanus sativus (Terras FRG et al, 1992, J Biol Chem, 267:15301-15309).
La actividad antibacteriana de Hs-AFP1 se determinó en cuatro bacterias gram positivas (Bacillus subtilis JHCC 553331; Micrococcus luteus ATCC 93411; Staphylococcus aureus ATCC 25923; Streptococcus feacolis ATCC 29212) y en dos bacterias gram positivas (Escherichia coli HB101 y Proteus vulgaris JHCC 558711). Hs-AFP1 no inhibió el crecimiento de estas bacterias cuando se ensayó a concentraciones de 200 \mug/ml.
Ejemplo 5 Inhibición de \alpha-amilasa
Se preparó un extracto crudo de \alpha-amilasa de intestinos diseccionados de cucarachas adultas (Blatta orientalis) mediante homogeneización en 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl_{2} y eliminación de fragmentos celulares por centrifugación. Las \alpha-amilasas humana y porcina se obtuvieron de Sigma. El inhibidor tipo 1 de \alpha-amilasa de trigo (obtenido de Sigma) se utilizó como control positivo. Los extractos de amilasa se incubaron con péptidos durante 20 minutos a 30ºC antes de la adición de almidón y la actividad enzimática se detectó utilizando el método de Bernfeld (1955, Methods Enzymol, Colwick y Kaplan eds, vol 1:149-158).
Las actividades de inhibición de \alpha-amilasa de Hs-AFP1 se compararon en \alpha-amilasas de las tres fuentes con las del homólogo SI\alpha3 de Sorgum bicolor, que se ha publicado previamente que inhibe las \alpha-amilasas del intestino de insectos (Bloch y Richardson, 1991, FEBS Lett, 279:101-104). SI\alpha3 inhibió la actividad de las enzimas del intestino de insecto y de saliva humana en más de un 70% a concentraciones tan bajas como 5 \mug/ml. Se consiguió una inhibición comparable con 10 U/ml de un preparación comercial del inhibidor tipo 1 de \alpha-amilasa de trigo. SI\alpha3 resultó prácticamente inactivo en la enzima de páncreas porcino como han publicado previamente Bloch y Richardson (1991).
Por el contrario, no se observó ninguna inhibición de la actividad \alpha-amilasa con Hs-AFP1 o Ah-AMP1 ensayadas en las tres enzimas incluso cuando se incluyeron a concentraciones tan altas como 200 \mug/ml.
Ejemplo 6 Secuenciación de aminoácidos de Hs-AFP1
Los restos de cisteína de la proteína antifúngica se modificaron mediante S-piridiletilación utilizando el método de Fullmer (1984, Anal Biochem, 142, 336-341). Los reactivos se eliminaron mediante HPLC en una columna (25 x 0,4 cm) Pep-S (sílice poroso C_{2}/C_{18}) (Pharmacia). Las proteínas S-piridiletiladas se recuperaron eluyendo la columna con un gradiente lineal de 0,1% ácido trifluoracético (TFA) a acetonitrilo con 0,1% TFA. Las fracciones de proteína resultantes se sometieron a análisis de secuencia de aminoácidos en un Secuenciador de Proteína 477A (Applied Biosystems) con detección en línea de derivados de aminoácidos feniltiohidantoín en un Analizador 120A (Applied Biosystems).
La secuencia de aminoácidos de Hs-AFP1 se determinó por degradación de Edman N-terminal automatizada. La secuencia de aminoácidos completa de Hs-AFP1 se muestra como SEC ID NO 1.
Hs-AFP1 tiene una longitud de 54 aminoácidos. Contiene ocho cisteínas y los restos de aminoácidos básicos son relativamente abundantes.
Hs-AFP1 contiene un resto de tirosina en la posición 41, un resto de fenilalanina en la posición 43 y un resto de prolina en la posición 44. Se encuentran aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes de Rs-AFP1 y Rs-AFP2 (Y en la posición 38, F en la posición 40, P en la posición 41) pero están reemplazados por restos de aminoácidos no homólogos en otras proteínas del tipo Rs-AFP. Un estudio del plegamiento 3-dimensional de una proteína relacionada de semillas de trigo (Bruix et al, 1993, Biochemistry, 32:715-724) indica que estos aminoácidos conservados están localizados en un bucle de la proteína que conecta dos hojas \beta antiparalelas. Este bucle puede formar parte del sitio activo que es responsable de la interacción con el receptor (o receptores) potencial en las hifas de los hongos.
Es de destacar que Rs-AFP1, Rs-AFP2 y Hs-AFP1 producen hiper ramificación en los hongos, mientras que Dm-AMP1, Dm-AMP2, Cb-AMP1 y Cb-AMP2 no. Esto indica que cada grupo de proteínas puede estar interaccionando bien con una diana diferente en el hongo o con la misma diana de un modo distinto.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: ZENECA Limited
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 15 Stanhope Gate
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Londres
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Inglaterra
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: W1Y 6LN
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS ANTIMICROBIANAS
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA DE ORDENADOR: Patentin Release #1,0, Versión #1,25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ANTERIORES A LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9326424.0
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DECUMPLIMENTACIÓN: 24-DIC-1993
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Hs-AFP1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gly Val Lys Leu Cys Asp Val Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly His}
\sac{Cys Gly Ser Ser Ser Lys Cys Ser Gln Gln Cys Lys Asp Arg Glu His}
\sac{Phe Ala Tyr Gly Gly Ala Cys His Tyr Gln Phe Pro Ser Val Lys Cys}
\sac{Phe Cys Lys Arg Gln Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Ah-AMP1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Cys Asn Glu Arg Pro Ser Gln Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn}
\sac{Thr Ala His Cys Asp Lys Gln Cys Gln Asp Trp Glu Lys Ala Ser His}
\sac{Gly Ala Cys His Lys Arg Glu Asn His Trp Lys Cys Phe Cys Tyr Phe}
\sac{Asn Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rs-AFP1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glx Lys Leu Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly}
\sac{Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Arg}
\sac{His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr}
\sac{Phe Pro Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rs-AFP2
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glx Lys Leu Cys Gln Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly}
\sac{Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys Ala Arg}
\sac{His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr}
\sac{Phe Pro Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Dm-AMP1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn}
\sac{Thr Gly His Cys Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His}
\sac{Gly Ala Cys His Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe}
\sac{Asn Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Cb-AMP1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn}
\sac{Thr Lys His Cys Asp Asp Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His}
\sac{Gly Ala Cys His Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe}
\sac{Asn Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Cb-AMP1
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Leu Cys Glu Arg Ala Ser Leu Thr Trp Thr Gly Asn Cys Gly Asn}
\sac{Thr Gly His Cys Asp Thr Gln Cys Arg Asn Trp Glu Ser Ala Lys His}
\sac{Gly Ala Cys His Lys Arg Gly Asn Trp Lys Cys Phe Cys Tyr Phe Asp}
\sac{Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Lc-AFP
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Thr Cys Glu Asn Leu Ser Gly Thr Phe Lys Gly Pro Cys Ile Pro}
\sac{Asp Gly Asn Cys Asn Lys His Cys Lys Asn Asn Glu His Leu Leu Ser}
\sac{Gly Arg Cys Arg Asp Asp Phe Xaa Cys Trp Cys Thr Arg Asn Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: pSAS10
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Thr Cys Glu Asn Leu Val Asp Thr Tyr Arg Gly Pro Cys Phe Thr}
\sac{Thr Gly Ser Cys Asp Asp His Cys Lys Asn Lys Glu His Leu Leu Ser}
\sac{Gly Arg Cys Arg Asp Asp Val Arg Cys Trp Cys Thr Arg Asn Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: pl230
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Thr Cys Glu Asn Leu Ala Gly Ser Tyr Lys Gly Val Cys Phe Gly}
\sac{Gly Cys Asp Arg His Cys Arg Thr Gln Glu Gly Ala Ile Ser Gly Arg}
\sac{Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys Trp Cys Thr Lys Asn Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Sia3
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Val Cys Met Gly Lys Ser Ala Gly Phe Lys Gly Leu Cys Met Arg}
\sac{Asp Gln Asn Cys Ala Gln Val Cys Leu Gln Glu Gly Trp Gly Gly Gly}
\sac{Asn Cys Asp Gly Val Met Arg Gln Cys Lys Cys Ile Arg Gln Cys Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: y1P
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ile Cys Arg Arg Arg Ser Ala Gly Phe Lys Gly Pro Cys Met Ser}
\sac{Asn Lys Asn Cys Ala Gln Val Cys Gln Gln Glu Gly Trp Gly Gly Gly}
\sac{Asn Cys Asp Gly Pro Phe Arg Arg Cys Lys Cys Ile Arg Gln Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: p322
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His Cys Glu Ser Leu Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Thr Arg}
\sac{Asp Ser Asn Cys Ala Ser Val Cys Glu Thr Glu Arg Phe Ser Gly Gly}
\sac{Asn Cys His Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Lys Pro Cys}

Claims (7)

1. Una proteína antifúngica que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 60% de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos total mostrada en la SEC ID No. 1.
2. ADN que codifica una proteína antifúngica según la reivindicación 1.
3. Un microorganismo, célula en cultivo o planta transgénica que contiene ADN según la reivindicación 2, donde dicho ADN es ADN recombinante heterólogo.
4. Una planta transgénica con resistencia mejorada a un patógeno fúngico cuando se compara con plantas del tipo salvaje y que contiene ADN recombinante heterólogo que expresa una proteína antifúngica según la reivindicación 1.
5. Un procedimiento para combatir hongos patógenos para las plantas que comprende exponer el hongo a una proteína antifúngica según la reivindicación 1.
6. Una composición farmacéutica que comprende la proteína antifúngica de la reivindicación 1.
7. La proteína antifúngica de la reivindicación 1, para utilizarse como producto farmacéutico.
ES95903856T 1993-12-24 1994-12-19 Proteinas antimicrobianas. Expired - Lifetime ES2225835T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9326424A GB9326424D0 (en) 1993-12-24 1993-12-24 Biocidal proteins
GB9326424 1993-12-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2225835T3 true ES2225835T3 (es) 2005-03-16

Family

ID=10747200

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES95903856T Expired - Lifetime ES2225835T3 (es) 1993-12-24 1994-12-19 Proteinas antimicrobianas.

Country Status (13)

Country Link
US (2) US5750504A (es)
EP (1) EP0736096B1 (es)
JP (1) JP3631492B2 (es)
CN (1) CN1080303C (es)
AT (1) ATE279519T1 (es)
AU (1) AU696550B2 (es)
BR (1) BR9408415A (es)
CA (1) CA2177854A1 (es)
DE (1) DE69434071T2 (es)
DK (1) DK0736096T3 (es)
ES (1) ES2225835T3 (es)
GB (1) GB9326424D0 (es)
WO (1) WO1995018229A1 (es)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9525474D0 (en) * 1995-12-13 1996-02-14 Zeneca Ltd Antifungal proteins
AU724158B2 (en) * 1995-12-13 2000-09-14 Syngenta Limited Antifungal proteins
US6909032B2 (en) 1996-01-31 2005-06-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation DNA encoding a macadamia integrifolia anti-microbial protein, constructs comprising the same and plant material comprising the constructs
US5773696A (en) 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6121436A (en) * 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
GB9714564D0 (en) 1997-07-10 1997-09-17 Zeneca Ltd Composition
US6855865B2 (en) * 1999-05-07 2005-02-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acids encoding plant defensins and methods of use thereof
GB9918156D0 (en) * 1999-08-02 1999-10-06 Zeneca Ltd Synthetic peptides
GB9918155D0 (en) * 1999-08-02 1999-10-06 Zeneca Ltd Proteins and peptides
WO2002074906A2 (en) * 2001-03-16 2002-09-26 Eli Lilly And Company Lp mammalian proteins; related reagents
AU2002322388A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Defensin polynucleotides and methods of use
EP2709641B1 (en) * 2011-05-16 2017-12-13 Vital Food Processors Limited A dietary supplement
CN107683770B (zh) * 2017-10-25 2019-11-26 上海市农业科学院 一种矾根‘抹茶’种苗的培育方法
CN111690035A (zh) * 2020-06-05 2020-09-22 广州颜如玉生物科技有限公司 一种提高抗菌肽产量的方法
CN114853913A (zh) * 2022-06-24 2022-08-05 五康生物科技股份有限公司 一种植物抗菌肽AFP1与芽孢杆菌分泌肽SPamyQ融合蛋白及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ244091A (en) * 1991-08-29 1994-10-26 Zeneca Ltd Biocidal proteins derived from plants, their manufacture, coding sequences and uses
GB9300281D0 (en) * 1993-01-08 1993-03-03 Zeneca Ltd Antimicrobial-protein-producing endosymbiotic micro-organisms

Also Published As

Publication number Publication date
AU696550B2 (en) 1998-09-10
JP3631492B2 (ja) 2005-03-23
EP0736096B1 (en) 2004-10-13
CN1139454A (zh) 1997-01-01
EP0736096A1 (en) 1996-10-09
JPH09507388A (ja) 1997-07-29
BR9408415A (pt) 1997-08-05
DE69434071D1 (de) 2004-11-18
AU1276395A (en) 1995-07-17
DK0736096T3 (da) 2005-02-14
ATE279519T1 (de) 2004-10-15
US5750504A (en) 1998-05-12
CA2177854A1 (en) 1995-07-06
CN1080303C (zh) 2002-03-06
WO1995018229A1 (en) 1995-07-06
DE69434071T2 (de) 2005-03-17
GB9326424D0 (en) 1994-02-23
US5919918A (en) 1999-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Osborn et al. Isolation and characterisation of plant defensins from seeds of Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae
ES2225835T3 (es) Proteinas antimicrobianas.
US6187904B1 (en) Biocidal proteins
US6521590B1 (en) Biocidal proteins
KR20000057395A (ko) 종자 처리에 의한 식물의 과민 반응 유도 내성
US20020152498A1 (en) Antifungal proteins
JPH05502168A (ja) 新規な抗菌調製物、該調製物の製造方法および菌類耐性の大きい植物の作製方法
AU1366492A (en) Biocidal proteins
US5861480A (en) Antimicrobial proteins from aralia and impatiens
López et al. Isolation of a new fungi and wound-induced chitinase class in corms of Crocus sativus
JP3594595B2 (ja) 殺生物性のキチン結合性蛋白質
AU663500B2 (en) Biocidal proteins capable of isolation from amaranthus
CZ289646B6 (cs) Antimikrobiální proteiny, rekombinantní DNA, které je kódují, antimikrobiální prostředek, který je obsahuje, a způsob boje proti houbám či bakteriím
CA2378432A1 (en) Proteins and peptides
US9055744B2 (en) Nucleic and amino acid sequences for the control of pathogen agents
Hidalgo kk Ciudad de la Habana Hoen ef gkkS “Storage of Competent Cells for Agrobacterium Trans