CN1139454A - 抗微生物蛋白 - Google Patents

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Abstract

能够从霍氏草属或七叶树属种子中分离出来的抗微生物蛋白，显示了广泛的抗真菌活性和一些抗革兰氏阳性细菌的活性。编码此蛋白的DNA可被分离，并掺入载体。可生产用此DNA转化的植物。该蛋白具有作为抗真菌或抗细菌制剂的商业应用；转化的植物显示增长的疾病抵抗力。

Description

抗微生物蛋白
本发明涉及抗微生物蛋白，它们的生产方法和应用，以及编码它们的DNA序列。尤其涉及能从霍氏草属(Heuchera)或七叶树属(Aesculus)的种子中分离出来的抗微生物蛋白。
在本文中，抗微生物蛋白可被定义为至少具有下列活性之一的蛋白质：抗真菌活性(可包括抗酵母菌活性)，抗细菌活性。活性包括一定范围的拮抗效果例如部分抑制或致死。该蛋白是寡聚的或是单肽亚单位。
霍氏草属是虎耳草科植物家族的一部分。虎耳草科是一广泛分布的大科，主要包括多年生的草木和灌木，包含穗醋粟、鹅莓以及许多多普通的花园花木。
七叶树属是七叶树科植物家族的一部分。七叶树科是包含两个属树木的小科，七叶树属因它的装饰树而广为人知，显著地，其棕色的种子是“conkers”的马粟(马粟树)更为孩子们所珍视。
植物产生大量抗真菌的化合物以抵抗潜在的入侵者，最近10年已弄清楚的是，具抗真菌活性的蛋白质形成了这些防御机制的重要部分。该蛋白的若干种类已被描述，包括thionins、β1，3-葡聚糖酶、核糖体-灭活蛋白、zeamatins、几丁质结合的植物血凝素和几丁质酶。这些蛋白质已得到了极大的注意，因为它们能有效地被用作生物控制剂。
国际专利申请号PCT/GB92/01570(公开于1993年3月18日，公开号是WO93/05153，其公开内容在此引入作为参考)描述了一类蛋白质，它包含抗真菌蛋白(AFPS)和抗微生物蛋白(AMPS)，该类蛋白质包括以下蛋白：能够从萝卜中分离出来的Rs-AFP1和Rs-AFP2(Terras FRG et al，1992，J Biol Chem，267：15301～15309)、能够从蔓菁中分离出来的Bn-AFP1和Bn-AFP2，能够从芜菁中分离出来的Br-AFP1和Br-AFP2，能够从白芥中分离出来的Sa-AFP1和Sa-AFP2，能够从拟南芥菜中分离出来的At-AFP1。能够从光滑大丽花中分离出来的Dm-AMP1和Dm-AMP2。能够从有疗效蓟属中分离出来的Cb-AMP1和Cb-AMP2。能够从扁荚山黎豆中分离出来的Lc-AFP，能够从蓝花豆中分离出来的Ct-AMP1和Ct-AMP2。该蛋白此后将被归类为“Rs-AFP-型蛋白”。这些和其它植物源的抗微生物蛋白可用作杀真菌剂或抗菌素，尤其对于农业的目的。该蛋白可被用于植物或围绕植物或在植物中被表达。
目前我们已经纯化了两种新的有效的抗微生物蛋白。
我们已经从珊瑚钟(Heuchera sanguinea)的种子中纯化了一种新的抗微生物蛋白，下文称做Hs-AFP1(珊瑚钟-抗真菌蛋白1)。Hs-AFP1为一种5KDa的多肽：此多肽可结合为二聚体。Hs-AFP1显示出广谱的抗真菌活性。
我们还从马粟树(Aesculus hippocastanum)的种子中纯化了一种新的抗微生物蛋白，下文中叫做(马粟树-抗微生物蛋白1)。象Hs-AFP1一样，Ah-AMP1是一5KDa的多肽。Ah-AMP1显示出广谱的抗真菌活性。
本发明提供了一种抗微生物蛋白，它具有如SEQ ID NO 1或SEQID NO 2所示的氨基酸序列或基本与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2同源的氨基酸序列(优选地至少具有60％的序列等同性)，条件是该蛋白具有抗微生物活性。
依据本发明的抗微生物蛋白能从霍氏草属或七叶树属的种子中分离出来，且也能够从相关的或不相关的种类中分离出来，或可通过任何合适的方法被生产或合成。
该抗微生物蛋白可从植物材料中提取和纯化出来，利用标准肽合成仪通过化学合成的方法按照其已知氨基酸序列生产，或通过重组体DNA的表达在一合适的生物体(例如微生物或植物)中生产。该抗微生物蛋白可用作抗真菌剂或抗菌素且可在农业或药学中应用。
对Hs-AFP1和Ah-AMP1的氨基酸测序显示它们与Rs-AFP-型蛋白(国际专利申请公开号WO93/05153)同源。Hs-AFP1的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；Ah-AMP1的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
图5显示Hs-AFP1(SEQ ID NO 1)和Ah-AMP1(SEQ IDNO 2)以及Rs-AFP-型抗真菌的/抗微生物的蛋白Rs-AFP1(SEQ ID NO3)，Rs-AFP2(SEQ ID NO 4)，Dm-AMP1(SEQ ID NO 5)，Cb-AMP1(SEQ ID NO 6)，Ct-AMP1(SEQ ID NO 7)和Lc-AFP(SEQID NO 8)(如国际专利申请公开号WO93/05153所描述)的序列的排列比较。还显示了自蜀黍(Sorghum)的Siα2(SEQ ID NO 9)和自小麦属(Triticum)的g1-P(SEQ ID NO 10)、加上pSAS 10(豇豆属)(SEQ ID NO 11)、pI230(豌豆属)(SEQ ID NO 12)和p322(茄属)(SEQ ID NO 13)的预期基团产物的蛋白质的部分序列(后面讨论)。将破折号引入序列以得到最佳排列。
Rs-AFP-型蛋白质共有一共同的结构基序，该基序也存在于Hs-AFP1和Ah-AMP1的序列中。Hs-AFP1和Ah-AMP1与Rs-AFP-型蛋白的序列排列显示它们共有图5所示的一致的半胱氨酸-甘氨酸基序。从图5清楚看到，在保守的半胱氨酸和甘氨酸间的氨基酸残基数在不同的序列中轻度变化，且部分序列显示：将破折号引入序列以得到最佳排列。就相对于Hs-AFP1的序列对残基编号而言，所有8个半胱氨酸残基保存在6、17、23、27、39、48、50和54号位残基处且在15和37号位置有2个保守的甘氨酸。另外，在位置13有一保守的芳香族残基，在位置31有一保守的谷氨酸残基。
Hs-AFP1序列显示48％序列与Rs-AFP1一致。Ah-AMP1序列显示54％序列与Rs-AFP1一致。Hs-AFP1显示在氨基酸序列水平上与Ah-AMP1有52％一致。尽管霍氏草属蛋白(Hs-AFP1)、七叶树属蛋白(Ah-AMP1)和Rs-AFP-型蛋白之间有相似性，但在总的氨基酸组成及序列上存在不同。
Hs-AFP1的抗真菌活性引起特定种类的真菌菌丝严重分枝(超分枝)。该形态学效应与由Rs-AFP1或Rs-AFP2产生的类似。蛋白Ah-AMP1，尽管抑制真菌的生长，却并不引起菌丝的超分枝。此活性与蛋白Dm-AMP1、Cb-AMP1、Ct-AMP1和Lc-AFP的活性很相似。
Hs-AFP1、Ah-AMP1和Rs-AFP-型蛋白与下述预期蛋白产物部分同源，即Chiang和Hadwiger(1991，Mol Plant MicrobeInteract，4：324-331)所描述的在豌豆中(豌豆-蝶形花科家族的成员)镰刀菌属诱导基团pI39和pI230的预期蛋白产物。Ishibashi等(1990，Plant Mol Biol，15：59-64)所描述的在豇豆中(有爪状花瓣的豇豆-另一蝶形花科)pSAS10基团的预期蛋白产物有同样的同源性。该蛋白质还与Stiehema等(1988，Plant MolBiol，11：255-269)描述的在马铃薯中(马铃薯-茄科家族成员)p322基团的预期蛋白产物部分同源。最近，一种其氨基末端氨基酸序列与p322编码的成熟蛋白几乎一致的蛋白质已被从马铃薯结节中纯化出来并显示具有抗微生物活性(Moreno et al，1994，Eur.JBio Chem，223：135-139)。关于pI39，pI230，pSAS10或p322基因编码的蛋白质的生物活性一无所知，仅研究了其cDNA。然而，在植物被疾病或其它压力打击后，pI39和pI230基因被激活。有人提出，pSAS10基因编码一种与出芽相关的蛋白质。
Hs-AFP1、Ah-AMP1和Rs-AFP-型蛋白序列显示与在下列禾本科成员中发现的一组小α-淀粉酶抑制物的序列有较低等级的部分同源。所述禾本科成员有：蜀黍(Bloch and Richardson，1991，FEBSLett，279：101-104)、小麦(Colitta et al，1990，FEBS Lett，270：191-194)和大麦(Menolez et al，1990 Eur J Biochem，194：533-539)。已知此类蛋白，包括来自蜀黍的Siα2和来自小麦的g-1-嘌呤硫素(g-1p)，可抑制昆虫的α-淀粉酶且可能对昆虫幼虫有毒性，尽管此从未显示。尚不了解这些α-淀粉酶抑制物是否显示任何抗真菌或其它抗微生物活性：尚无有关它们生物活性的其它资料的报道。
有关它们初级结构的知识使得能够利用标准肽合成仪通过化学合成生产抗微生物蛋白，或其部分。还使编码抗微生物蛋白的DNA构建体的生产成为可能。
本发明进一步提供了编码本发明的抗微生物蛋白的DNA序列。此DNA序列可以是一cDNA序列或基因组序列，可能起源于cDNA克隆，基因组DNA克隆或利用标准核酸合成仪生产的DNA。
DNA序列可从已知氨基酸序列推测，且编码蛋白的DNA可利用标准核酸合成仪生产。另一种可选择方法，DNA序列可从植物源的DNA文库中分离。合适的寡聚核苷酸探针可来源于已知氨基酸序列，并用于筛查cDNA文库以得到编码一些或所有该蛋白的cDNA克隆。这些同样的寡聚核苷酸探针或cDNA克隆可用于通过筛查基因组DNA文库而分离实际的抗微生物蛋白基因。该基因组克隆可包括在植物基因组中操纵的控制序列。因此也可能分离启动子序列，此启动子序列可用于启动该抗微生物(或其它)蛋白的表达。这些启动子对环境条件(如真菌致病菌的存在)尤其敏感，且可用于启动任何靶基因的表达。
该编码抗微生物蛋白的DNA序列可掺入到DNA构建体或载体，并与合适的调节基因序列(启动子、终止子等)结合。该DNA序列可置于组成型的或可诱导型启动子控制下(由下列因素刺激，如环境条件致病菌的存在、化学制剂的存在)。此DNA构建体可被克隆成转化入允许被编码的蛋白或蛋白活性部分表达的生物系统。合适的生物系统包括微生物(例如，细菌如大肠埃希氏菌、假单胞菌属和内寄生菌，如clavibacter xyli subsp.cynodontis(Cxc)，酵母菌，病毒；噬菌体：等)，培养的细胞(如昆虫细胞、哺乳动物细胞)和植物。在某些情况下，该表达的蛋白基本上可被提取并分离利用。
依照本发明的抗微生物蛋白(如Hs-AFP1或Ah-AMP1)可用作抗真菌剂或抗菌素。本发明进一步提供了通过将真菌或细菌与依照本发明的抗微生物蛋白接触而防治它们的方法。
在药学的应用方面，抗微生物蛋白可用作抗真菌剂或抗细菌剂而治疗哺乳动物感染(例如，对抗酵母菌如念珠菌属)。
依照本发明的抗微生物蛋白还可用作防腐剂(例如，作为食物添加剂)。
在农业的应用方面，该抗微生物蛋白可用于提高作物在植物的生物期间，以及作为收割后作物的保护方面对疾病的抵抗力或对疾病耐受性。暴露于蛋白的致病菌被抑制。该抗微生物蛋白可根除已定居于植物的致病菌或保护植物免除致病菌的攻击。该蛋白的根除效果是尤其有利的。
植物致病菌与抗微生物蛋白接触可用多种方法达到，例如：
(a)通过利用标准农业技术(如喷雾)将包含分离蛋白的组合物应用于植物部分或周围土壤，该蛋白质可自植物组织中提取或化学合成或自经遗传工程修饰为表达该蛋白的微生物中提取。
(b)在植物，或植物生长的土壤中应用包含一种微生物的组合物，所述微生物已经遗传工程修饰可表达抗微生物蛋白。
(c)在植物组织中引入经遗传工程修饰的可表达抗微生物蛋白的内寄生菌(例如，通过种子处理方法)；[内寄生菌可被定义为一种微生物，其具有进入植物并与植物宿主达到非致病的内共生关系的能力。植物的内寄生菌增强保护作用的方法已被作物遗传国际公司在一系列专利申请中描述(例如，国际申请公开号WO90/13224，欧洲专利公开号EP-125468-B1，国际申请公开号WO91/10363，国际申请公开号WO87/03303)。可将内寄生菌进行遗传修饰而生产农业用化学药品。国际专利申请公开号WO94/16076(Zeneca有限公司)描述了经遗传修饰可表达植物源在微生物蛋白的内寄生菌的应用]。
(d)编码抗微生物蛋白的DNA可引入植物基因组，以便蛋白在植物体内表达(该DNA可以是cDNA，基因组DNA或利用标准核酸合成仪生产的DNA)。
依照已知的多种方法可用重组DNA构建体转化植物细胞(土壤杆菌属Ti质粒，电穿孔法，微量注射，显微投影枪，等)。该转化的细胞然后在合适的条件下再生为完整植物，其中新的核物质稳定地掺入到基因组中。可用此法获得转化单子叶植物和双子叶植物，尽管后者常更易再生。这些初级转化体的一些后代将继承编码抗微生物蛋白的重组体DNA。
本发明进一步提供了一种植物，其具有提高的对真菌或细菌致病菌的抵抗力，且包含表达本发明抗微生物蛋白的重组体DNA。在标准植物繁殖杂交中，此植物可用作亲本以研制具提高的对真菌或细菌的抵抗力的杂种或家系。
重组体DNA是通过转化引入植物或其祖先的异源DNA。重组体DNA编码抗微生物蛋白，该蛋白表达并传送至致病菌攻击的部位(如叶子)。该DNA可编码抗微生物蛋白的活性亚单位。
致病菌可以是生长于植物上、内或附近的任何真菌或细菌。在本文中，提高的抵抗力定义为与野生型植物相比具增强的对真菌或细菌致病菌的耐受性。抵抗力可变化，从对致病菌效应的耐受性轻度增加(这里致病菌部分抑制)变化至完全有抗性以致植物不受致病菌存在的影响(这里致病菌被严重抑制或杀死)。对一特定致病菌的抗性或对广谱致病菌的抗性水平的提高均组成了抗性的提高。随着植物转化或接着的杂交后，选择出显示提高抵抗力的转基因植物(或来源于该转基因植物的植物)。
如果抗微生物蛋白在转基因植物或其后代中表达，那么在植物致病菌攻击的位置，真菌或细菌与蛋白接触。特别是，通过利用合适的基因调控序列，在最有效的时间和地点，蛋白质可在体内生产。例如，蛋白质可在植物的一部分中表达，那里其数量表达不正常但疾病抵抗力是重要的(如在叶子中)。
可被生产的遗传工程修饰的植物的例子包括田地作物、谷类、水果和蔬菜如：canola、向日葵、烟草、糖甜菜、棉花、大豆、玉米、小麦、大麦、稻、蜀黍、蕃茄、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、土豆、胡萝卜、莴苣、甘蓝、洋葱。
现在仅利用附图的参考通过举例的方法描述本发明。其中：
图1显示对Hs-AFP1进行纯化的阳离子交换色谱和相关的真菌生长抑制图。
图2显示用于纯化Hs-AFP1的反相色谱。
图3显示对Ah-AMP1进行纯化的阳离子交换色谱和相关的真菌生长抑制图。
图4显示用于纯化Ah-AMP1的反相色谱。
图5显示Hs-AFP1、Ah-AMP1和其它蛋白质的氨基酸序列排列；参考序列表，其中
SEQ ID NO 1是Hs-AFP1的氨基酸序列；
SEQ ID NO 2是Ah-AMP1的氨基酸序列；
SEQ ID NO 3是Rs-AFP1的氨基酸序列；
SEQ ID NO 4是Rs-AFP2的氨基酸序列；
SEQ ID NO 5是Dm-AMP1的氨基酸序列；
SBQ ID NO 6是Cb-AMP1的氨基酸序列；
SEQ ID NO 7是Ct-AMP1的氨基酸序列；
SRQ ID NO 8是Lc-AFP的氨基酸序列；
SEQ ID NO 9是Siα2的部分氨基酸序列；
SEQ ID NO 10是g1-P的部分氨基酸序列；
SEQ ID NO 11是pSAS10基因产物的预期部分氨基酸序列；
SEQ ID NO 12是pI230基因产物的预期部分氨基酸序列；
SEQ ID NO 13是p322基因产物的预期部分氨基酸序列；
                  实施例1
           抗真菌和抗细菌活性分析。
抗真菌活性通过以前描述的显微分光光度法测量(Broekaert，1990，FEMS Microbiol Lett，69：55-60)。通常，用20μl(经过滤灭菌的)检测溶液与80μl真菌孢子悬浮液(2×104孢子/ml)在半浓度土豆葡萄糖液体培养基(1/2PDB)中进行测验。合成的生长培养基(SMF)由以下组成：K2HPO4(2.5mM)，MgSO4(50μM)，CaCl2(50μM)，FeSO4(5μM)，CoCl2(0.1μM)，CuSO4(0.1μM)，Na2MoO4(2μM)，H3BO3(0.5μM)，KI(0.1μM)，ZnSO4(0.5μM)，MnSO4(0.1μM)，葡萄糖(10g/l)，天冬酰胺(1g/l)，甲硫氨酸(20mg/l)，肌-肌醇(2mg/l)，生物素(0.2mg/l)，硫胺-HCl(1mg/l)，和吡哆醇-HCl(0.2mg/l)。对照微生物培养物包括20μl无菌的蒸馏水和80μl真菌孢子悬浮液。
除非另外说明，检测生物体是大刀镰刀菌(株IMI 180420)且在25℃培养48小时。百分生长抑制定义为控制微生物培养物的校正吸收率减去检测微生物培养物的校正吸收率，然后除以对照微生物培养物在595nm处的校正吸收率所得的比率乘以100。校正吸收率值等于48小时之后测量的培养物在595nm的吸收率减去30分钟之后测定的在595nm的吸收率。
抗细菌活性通过下面显微分光光度法测定。细菌悬浮液通过接种软营养琼脂糖(胰胨，10g/l，Seaplaque琼脂糖(FMC)，5g/l)制备。细菌悬浮液的(105菌落形成单位/每ml)部分(80μl)被加入在平底96-孔微板的经过滤灭菌的样本(20μl)中。将之在28℃培养30分钟后或24小时后借助于微板读数器来测定培养物在595nm的吸收率。对于抗真菌活性分析，百分生长抑制如上所述的来计算。
                   实施例2
           从珊瑚钟种子中纯化抗真菌蛋白
将二十克珊瑚钟种子(自Okkerse，Mechelen，Belgium得到)放入一咖啡磨具中研磨且得到的粗粉用100ml冰冻提取缓冲液在4℃提取2小时，所述冰冻缓冲液含有10mM NaH2PO4，15mM Na2HPO4100mM KCl，2mM EDTA，2mM硫脲，和1mM PMSF。匀浆用通过干酪包布压榨并通过离心(7,000×g，30分钟)将匀浆澄清。上清液用截止在2,000Da苯甲酰化的纤维素管道(Sigma)在蒸馏水中广泛渗析。渗析后通过加入10倍浓缩的缓冲液将溶液调整在50mM(NH4)Ac(pH9)，并随后在用50mM NH4Ac(pH9)平衡过的-Q-琼脂糖快流(Pharmacia Uppsala，Sweden)柱(12×5cm)上通过。通过该柱的蛋白质组份是冻干的，并最后在50ml 20mM NH4Ac(醋酸铵)，pH6中再溶解。将该组份上样到预先用20mM NH4Ac缓冲液平衡的S-琼脂糖高效(Pharmacia)柱(10×1.6cm)上。该柱用120ml自20至500mM NH4Ac(pH6)的线性梯度以1ml/min洗脱。洗脱物通过实时测量于280nm的吸收率而检验蛋白(结果显示在图1下边部分)并收集于7.5ml组份中。
该组份被冻干并于蒸馏水中再溶解。这些组份中5μl在实施例1描述的显微分光光度法抗真菌活性分析中，用附加1mM CaCl2和50mM KCl的合成的生长培养物(结果如图1上部分的直方图所示)测定。所有抗真菌活性被包含于主峰，其于围绕300mM NH4Ac洗脱(图1中箭头指示)。
显示最高抗真菌活性的组分通过反相色谱法进一步纯化。这组份被载样于Pep-S(多孔的二氧化硅C2/C18，Pharmacia)柱(25×0.93cm)上，该柱用含0.1％TFA的10％乙腈平衡。此柱用200ml自10％乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)至95％乙腈/0.1％TFA的线性梯度以4ml/min洗脱。洗脱物通过实时测量于280nm的吸收值而检验蛋白。洗脱物的两ml部分被收集、真空干燥，然后溶解于0.5ml蒸馏水中，其中10μl被用于显微分光光度法抗真菌活性分析，并用实施例1描述的，补充了1mM CaCl2和50mM KCl的合成生长培养基。
图2显示通过阳离子交换色谱纯化的活性组份的反相色谱。下部显示通过于280mm测定的吸收率而监测洗脱物的蛋白。上部显示通过显微分光光度法分析测定的抗真菌活性。色谱显示3个峰，其中第一个，用25％乙腈洗脱，含所有抗真菌活性。从此峰中分离的活性因子(图2中箭头所指示)叫做Hs-AFP1(珊瑚钟-抗真菌蛋白1)。
                     实施例3
              自马粟树种子中纯化抗真菌蛋白
从马粟树收集马粟树(马粟)的种子。将种子轰裂且100g轰裂的种子被冻干。冻干的种子被置入咖啡磨具中研磨且所得粗粉于100ml冰冻提取缓冲液中提取(见实施例1)。匀浆通过干酪包布压榨并通过离心澄清(7,000×g，30分钟)。上清液用苯甲酰化的纤维素管道(Sigma，St Louis，MO)在蒸馏水中广泛渗析。渗析后加入10倍浓缩的缓冲液将溶液调整至50mM(NH4)Ac(pH9)，并使溶液通过用50mM NH4Ac(pH9)平衡的Q-琼脂糖快速(PharmaciaUppsala，Sweden)柱(12×5cm)。将通过该柱的蛋白质组份冻干，并最后再溶解于50ml 20mM NH4Ac(pH6)中。这组份应用于用50mM NH4Ac pH6.0平衡的S-琼脂糖高效(Pharmacia)柱(10×1.6cm)。该柱用20-500ml NH4Ac，pH6.0的线性梯度于1ml/min洗脱210分钟以上。通过实时测量于280nm吸收率而监测洗脱物蛋白(结果显示图3下边部分)并收集于7.5ml组份中。将取自每个组份的样本冻干，再溶解于7.5ml蒸馏水中。这些样本中5ml于显微分光光度法抗真菌活性分析中，用补加1mM CaCl2和50mMKCl的合成的生长培养基(结果显示于图3的上边部分)。测定色谱分析之后，抗真菌活性用主峰共洗脱，其于300mM NH4Ac左右被洗脱(如图3箭头所示)。显示最高抗真菌活性的组份用反相色谱法进一步纯化。这组份载样于用0.1％TFA(三氟乙酸)平衡的PEP-S(多孔的二氧化硅C2/C18，Pharmacia)柱(25×0.4cm)。该柱用0.1％TFA至50％乙腈/0.1％TFA的线性梯度于1ml/min显色50分钟以上。实时测定280nm吸收率而检验洗脱物蛋白质(结果于图4下部显示)。1ml分被收集，真空干燥，并溶解于0.5ml蒸馏水中。取每个组份5ml分析抗真菌活性(结果显示于图4上部)。该物质产生出活性的单个峰，于25％乙腈洗脱。这代表纯化的蛋白Ah-AMP1(马粟树-抗真菌蛋白1)。
                     实施例4
     纯化的抗真菌蛋白，Hs-AFP1和Ah-AMP1的分子结构
纯化的抗真菌蛋白的分子结构由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进一步分析。用PhastSystem(Pharmacia)电泳仪器于预制商业凝胶(自Pharmacia的PhastGel High Density)上进行SDS-PAGE。样本缓冲液含有200mM Tris-HCl(pH8.3)、1％(w/v)SDS、1mM EDTA、0.005％溴苯酚蓝和，除非另外陈述，1％(w/v)二硫赤藓糖醇(DTE)。两佰毫微克蛋白在凝胶上被分离。肌红蛋白片段被用作分子重量标记(Pharmacia)，其具下列尺寸：17KDa，14.5KDa，8KDa，6KDa和2.5KDa。电泳后依照Heukeshoven和Dernick(1985，Electrophoresis，6，103-112)的方法蛋白质被混入12.5％戊二醛并银染色。
用DTE减少半胱氨酸残基后，Hs-AFP1显示单个区带，具约5KDa表面分子量。未减少的Hs-AFP1迁移于约10KDa的单个区带。这些结果显示，天然的Hs-AFP1可能是一寡聚蛋白质，最可能由5KDa多肽的二聚体组成。此寡聚结构由二硫键连接因而是稳定的。
                    实施例5
              抗真菌和抗细菌效力
用实施例1描述的分析法将纯化蛋白质的抗真菌效力在不同的植物致病真菌上评价，真菌的生长，真菌孢子的收集和收获和菌丝片段的制备如前所述进行(Broeka ert et al，1990，FEMS Microbiollett，69：55-60)。系列稀释的抗真菌蛋白加到真菌，方法是加到生长培养基SMF-(实施例1的合成的生长培养基)，培养基SMF+(补加1mM CaCl2和50mM KCl的培养基SMF-)，生长培养基1/2PDB-(如实施例1的半浓度土豆葡萄糖液体培养基)或生长培养基1/2 PDB+(附加1mM CaCl2和50mM KCl的媒介1/2 PDB-)。百分生长抑制由显微分光光度法测定。培养48小时后要求50％生长抑制的浓度(IC50值)由剂量-反应曲线计算。
对Hs-AFP1和Ah-AMP1的结果总结于表1。所用缩写是：IC50＝按实施例1描述确定的达到50％生长抑制要求的浓度；ND＝未测定的；Sp＝孢子；PrSp＝在培养基中发芽处理24小时的孢子；MF＝加蛋白质前在培养基中预培养48小时的菌丝片段；BHR＝主要的宿主范围；SF＝腐生植物的真菌，SMF-＝如实施例1描述的合成的生长培养基；SMF+＝补加1mM CaCl2和50mM KCl的SMF-：1/2 PDB-＝如实施例1描述的半浓度土豆葡萄糖液体培养基；1/2 PDB+＝附加1mM CaCl2和50mM KCl的1/2 PDB-。
                              表1
               Hs-AFP1和Ah-AMP2蛋白的抗真菌活性真菌                      菌株号    宿主种类    培基   接种物  在AFP-溶液中     IC50  (μg/ml)
                                                             的培养时间
                                                                           Ah-AMP1   Hs-AFP1近缘苦马属                FAJ97     芭蕉属      SMF-      Sp     40              0.75    ND近缘苦马属                FAJ97     芭蕉属      SMF+      Sp     40              25      ND香蕉盘长孢                FAJ86     芭蕉属      SMF-      Sp     40             ＜0.75   ND香蕉盘长孢                FAJ86     芭蕉属      SMF+      Sp     40              32.5    ND透明枝顶孢属              FAJ98     芭蕉属      SMF-      Sp     64             ＜0.75   ND透明枝顶孢属              FAJ98     芭蕉属      SMF+      Sp     64              12.5    ND围小丛壳                  FAJ76     芭蕉属      SMF-      Sp     64             ＜0.75   ND围小丛壳                  FAJ76     芭蕉属      SMF+      Sp     64              12.5    NDMycoshpaerella fijiensis  FUL549    芭蕉属      1/2PDB+   MF     96              0.75    12.5灰葡萄孢                  K1147     BHR         1/2PDB-   Sp     48              25      6灰葡萄孢                  K1147     BHR         1/2PDB+   Sp     48             ＞100    25长柄链格孢                CBS620.83 烟草属      SMF-      Sp     70              25      0.75长柄链格孢                CBS620.83 烟草属      SMF+      Sp     70              100     6表1(继续)真菌          菌株号    宿主种类    培养基    接种物    在AFP-溶液      IC50     (μg/ml)
                                                    中的培养时间
                                                                   Ah-AMP1     Hs-AFP1芸苔链格孢              芥属        SMF-      Sp        66               1.5         1.5芸苔链格孢              芥属        SMF+      Sp        66               3           3芸苔链格孢    MUCL20297 芥属        SMF-      Sp        48               1.5         ND芸苔链格孢    MUCL20297 芥属        SMF+      Sp        48               12          ND细球腔菌属    LM36uea   芥属        1/2PDB-   Sp        48               0.5         25细球腔菌属    LM36uea   芥属        1/2PDB+   Sp        48               6          ＞100细球腔菌属    SES1      芥属        1/2PDB+   PrSp     120             ＜0.75       ＞100细球腔菌属    SES2      芥属        1/2PDB+   PrSp     120             ＜0.75       ＞100菾菜尾孢      SES       Beta        1/2PDB+   PrSp      72               1.5         1.5大刀镰孢      IMI180420 谷类        SMF-      Sp        48               1.5         0.5大刀镰孢      IMI180420 谷类        SMF+      Sp        48               25          1大刀镰孢      K0311     谷类        1/2PDB-   Sp        48               12          1大刀镰孢      K0311     谷类        1/2PDB+   Sp        48             ＞100         3小麦壳针孢    K1097     小麦属      1/2PDB-   Sp        48               0.5         0.5小麦壳针孢    K1097     小麦属      1/2PDB+   Sp        48               1.5         3表1(继续)真菌          菌株号     宿主种类  培养基    接种物    在AFP-溶液     IC50   (μg/ml)
                                                   中的培养时间
                                                                 Ah-AMP1   Hs-AFP1豌豆壳二孢    MUCL30164  豌豆属    SMF-      Sp        48               0.8       1豌豆壳二孢    MUCL30164  豌豆属    SMF+      Sp        48               15        ＞5指状青霉      K0879      桔果      1/2PDB-   Sp        48               6         1指状青霉      K0879      桔果      1/2PDB+   Sp        48               25        3黄萎轮枝孢    K0937      蕃茄属    1/2PDB-   Sp        48               6         12黄萎轮枝孢    K0937      蕃茄属    1/2PDB+   Sp        48               ＞100     30球孢枝孢      K0791      SF        1/2PDB-   Sp        48               0.5       1球孢枝孢      K0791      SF        1/2PDB+   Sp        48               12        3绿色木霉      K1127      SF        1/2PDB-   Sp        48               ＞100     15绿色木霉      K1127      SF        1/2PDB+   Sp        48               ＞100     ＞100
表1的结果阐述了Ah-AMP1和Hs-AFP1蛋白具有的广泛的抗真菌活性谱。表1的结果还显示Hs-AFP1和Ah-AMP1具有一点不同的活性谱。例如，Ah-AMP1在1/2 PDB+中对细球腔菌属(leptospaeriamaculans)具高度活性，但Hs-AFP1没有；而Hs-AFP1在1/2 PDB+中对大刀镰孢菌(Fusarium culmorum)具高度活性，但Ah-AMP1没有。因此这两个蛋白可互相补充，用作一结合的抗微生物蛋白，更有效地抵抗更广泛的疾病范围。
在培养基SMF+和1/2 PDB+(含有添加的盐反映植物组织中生理条件的离子强度)，两种蛋白质的活性与它们在培养基SMF-或1/2PDB-中相比是减低的。该盐依赖的活性减低显然依赖所检测的生物体。例如，在培养基SMF-及SMF+中Ah-AMP1活性的减少在芸苔链格孢(Alternaria brassicae)是2倍而在香蕉盘长孢(Gloeosporium musarum)是大于10倍。
通过菌丝长度的减少证明Hs-AFP1和Ah-AMP1均干涉真菌的生长过程。Hs-AFP1还引起大刀镰孢的菌丝的超分枝。来自萝卜种子的抗真菌蛋白Rs-AFP1和Rs-AFP2产生相似的效果(Terras FRGet al，1992，J Biol Chem，267：15301-15309)。Ah-AMP1不引起大刀镰孢的菌丝的超分枝；它的菌丝生长抑制方式与下列抗真菌蛋白非常相似；即分别来自大丽花属、蓟属、蝶豆属和香豌豆属的Dm-AMP1、Cb-AMP1、Ct-AMP1和Lc-AFP(国际专利申请公开号WO93/05153)。
Ah-AMP1和Hs-AFP1的抗细菌活性用4种革兰氏阳性菌(枯草杆菌JHCC 553331；黄色微球菌ATCC 93411；金黄色葡萄球菌ATCC25923；类链球菌ATCC 29212)和两种革兰氏阴性细菌(大肠埃及氏菌HB101和普通变形杆菌JHCC 558711)检测。以200μg/ml的比例的Hs-AFPl并不抑制这些细菌的生长，而在100μg/ml Ah-AMP1抑制枯草杆菌的生长。
                   实施例8
              α-淀粉酶的抑制
α-淀粉酶粗提取物从成年蟑螂(东方蜚蠊)解剖的内脏制备，即通过于20mM Tris/HCl，pH7.5，10mM CaCl2中匀浆及离心移去细胞碎片而制备。人和猪α-淀粉酶购自Sigma。来自小麦的型1α-淀粉酶抑制剂(购自Sigma)用作阳性对照。在加淀粉前将淀粉酶提取物与肽于30℃保温20分钟，并用Bernfeld的方法检测酶的活性(1955，Methods Enzymol，Colwick和Kaplan eds，vol 1：149-158)。
用三种来源的淀粉酶，将Hs-AFP1和Ah-AMP1的α-淀粉酶抑制活性与双色蜀黍的同系物SIα3比较，SIα3以前报道抑制昆虫内脏α-淀粉酶(Bloch and Richardson，1991，FEBS lett，279：101～104)。在低至5μg/ml的速率，SIα3对来自昆虫内脏和人唾液的酶的活性的抑制大于70％。用10U/ml来自小麦的型1α-淀粉酶抑制剂的商品制品获得相当的抑制。如以前Bloch and Richardson报道(1991)，SIα3在来自猪胰腺的酶主要是失活。
相反，甚至当包括速率高至200μg/ml时，用Hs-AFP1或Ah-AMP1在三种酶检验时，未观察到α-淀粉酶活性的抑制作用。
                 实施例7
        Hs-AFP1和Ah-AMP1的氨基酸测序
利用Fullmer的方法(1984，Anal Biochem 142，336-341)将抗真菌蛋白的半胱氨酸残基用S-乙基吡啶修饰。用HPLC在Pep-S(多孔的二氧化硅C2/C18)(Pharmacia)柱(25×0.4cm)移去试剂。用从0.1％三氟乙酸(TFA(至含0.1％TFA的乙腈的线性梯度洗脱该柱，回收S-吡啶乙基化的蛋白。所得蛋白质组份在477A蛋白质序列中(Applied Biosystems)进行氨基酸序列分析，即在120A分析仪(Applied Biosystems)进行苯基海硫因氨基酸衍生物的实时测定。
Hs-AFP1和Ah-AMP1的氨基酸序列通过N-末端自动化Edman降解测定。Hs-AFP1的完全的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，Ah-AMP1的完全的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
Hs-AFP1长54个氨基酸，Ah-AMP1长50个氨基酸。两种蛋白均含有8个半胱氨酸，且碱性的氨基酸残基是相对丰富的。
Hs-AFP1在41位含有一酪氨酸残基，43位有一苯丙氨酸残基及44位有一脯氨酸残基。在Rs-AFP1和Rs-AFP2的相应位置发现相同的氨基酸(在38位的Y，在40位的F，在41位的P)，但在Ah-AMP1和其它的Rs-AFP-型蛋白中被非同源的氨基酸残基取代。对自小麦种子的有关蛋白的3维折迭的研究(Bruix et al，1993，Biochemistry，32：715-724)提示，这些保守的氨基酸位于蛋白质环上，连接二个反平行的β-层。这环可能是活性部位的一部分，其功能为与在真菌菌丝的推断受体的相互反应。
值得注意的，Rs-AFP1，Rs-AFP2和Hs-AFP1均引起真菌超分枝，而Ah-AMP1，Dm-AMP1，Dm-AMP2，Cb-AMP1和Cb-AMP2却不。这提示，每一群蛋白质可能与真菌不同的靶位点相互作用，也可能以不同的方式与同一靶位点相互作用。
                       序列表(1)一般信息：(i)申请人：
  (A)姓名：ZENECA有限公司
  (B)街道：15Stanhope Gate
  (C)城市：伦敦
  (D)州：英格兰
  (E)国家：英国
  (F)邮编(ZTP)：W1Y 6LN(ii)发明题目：抗微生物蛋白(iii)序列数目：13(iv)计算机可读形式：
  (A)介质类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操纵系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)在先申请资料：
  (A)申请号：GB 9326424.0
  (B)提交日：24-DEC-1993(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：54个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：Hs-AFP1(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Asp Gly Val Lys Leu Cys Asp Val Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly His1               5                   10                  15Cys Gly Ser Ser Ser Lys Cys Ser Gln Gln Cys Lys Asp Arg Glu His
    20                      25                  30Phe Ala Tyr Gly Gly Ala Cys His Tyr Gln Phe Pro Ser Val Lys Cys
    35                  40                  45Phe Cys Lys Arg Gln Cys
50(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：50个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：Ah-AMP1(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Leu Cys Asn Glu Arg Pro Ser Gln Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn1               5                   10                  15Thr Ala His Cys Asp Lys Gln Cys Gln Asp Trp Glu Lys Ala Ser His
        20                  25                  30Gly Ala Cys His Lys Arg Glu Asn His Trp Lys Cys Phe Cys Tyr Phe
    35                  40                  45Asn Cys
50(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：51个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：Rs-AFP1(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Glx Lys Leu Cys Glu Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly1               5                   10                  15Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Arg
        20                  25                  30His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr
    35                  40                  45Phe Pro Cys
50(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：51个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：Rs-AFP2(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Glx Lys Leu Cys Gln Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly1               5                   10                  15Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys Ala Arg
        20                  25                  30His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile Cys Tyr
    35                  40                  45Phe Pro Cys
50(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：50个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：Dm-AMP1(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn1               5                   10                  15Thr Gly His Cys Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His
        20                  25                  30Gly Ala Cys His Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe
    35                  40                  45Asn Cys
50(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：50个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：Cb-AMP1(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn1               5                   10                  15Thr Lys His Cys Asp Asp Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His
        20                  25                   30Gly Ala Cys His Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe
    35                  40                  45Asn Cys
50(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：49个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：Cb-AMP1(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Asn Leu Cys Glu Arg Ala Ser Leu Thr Trp Thr Gly Asn Cys Gly Asn1               5                       10              15Thr Gly His Cys Asp Thr Gln Cys Arg Asn Trp Glu Ser Ala Lys His
        20                  25                  30Gly Ala Cys His Lys Arg Gly Asn Trp Lys Cys Phe Cys Tyr Phe Asp
    35                  40                  45Cys(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：47个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：Lc-AFP(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Lys Thr Cys Glu Asn Leu Ser Gly Thr Phe Lys Gly Pro Cys Ile Pro1               5                   10                  15Asp Gly Asn Cys Asn Lys His Cys Lys Asn Asn Glu His Leu Leu Ser
        20                  25                  30Gly Arg Cys Arg Asp Asp Phe Xaa Cys Trp Cys Thr Arg Asn Cys
    35                  40                  45(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：47个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：pSASl 0(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Lys Thr Cys Glu Asn Leu Val Asp Thr Tyr Arg Gly Pro Cys Phe Thr1               5                   10                  15Thr Gly Ser Cys Asp Asp His Cys Lys Asn Lys Glu His Leu Leu Ser
        20                  25                  30Gly Arg Cys Arg Asp Asp Val Arg Cys Trp Cys Thr Arg Asn Cys
    35                  40                  45(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：45个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：pI230(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Asn Thr Cys Glu Asn Leu Ala Gly Ser Tyr Lys Gly Val Cys Phe Gly1               5                   10                  15Gly Cys Asp Arg His Cys Arg Thr Gln Glu Gly Ala Ile Ser Gly Arg
        20                  25                  30Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys Trp Cys Thr Lys Asn Cys
    35                  40                  45(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：48个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：Sia3(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Arg Val Cys Met Gly Lys Ser Ala Gly Phe Lys Gly Leu Cys Met Arg1               5                   10                  15Asp Gln Asn Cys Ala Gln Val Cys Leu Gln Glu Gly Trp Gly Gly Gly
        20                  25                  30Asn Cys Asp Gly Val Met Arg Gln Cys Lys Cys Ile Arg Gln Cys Trp
    35                  40                  45(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：47个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：y1P(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：Lys Ile Cys Arg Arg Arg Ser Ala Gly Phe Lys Gly Pro Cys Met Ser1               5                   10                  15Asn Lys Asn Cys Ala Gln Val Cys Gln Gln Glu Gly Trp Gly Gly Gly
        20                  25                  30Asn Cys Asp Gly Pro Phe Arg Arg Cys Lys Cys Ile Arg Gln Cys
    35                  40                  45(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：
  (A)长度：47个氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性   (ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：
  (A)生物体：p322(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：Arg His Cys Glu Ser Leu Ser His Arg Phe Lys Gly Pro Cys Thr Arg1               5                   10                  15Asp Ser Asn Cys Ala Ser Val Cys Glu Thr Glu Arg Phe Ser Gly Gly
        20                  25                  30Asn Cys His Gly Phe Arg Arg Arg Cys Phe Cys Thr Lys Pro Cys
    35                  40                  45

Claims (11)

1.一种抗微生物蛋白，其氨基酸序列与选自SEQ ID NO 1和SEQID NO 2的序列基本同源。
2.根据权利要求1的一种抗微生物蛋白，其具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的一种抗微生物蛋白，其具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
4.一种抗微生物制剂，包含权利要求1的至少两种抗微生物蛋白。
5.根据权利要求4的一种抗微生物制剂，包含权利要求2的一种蛋白和权利要求3的一种蛋白。
6.编码权利要求1的抗微生物蛋白的DNA。
7.一种生物系统，包含权利要求6的DNA。
8.根据权利要求7的生物系统，其是微生物。
9.根据权利要求7的生物系统，其是植物。
10.一种植物，具有提高的对真菌和细菌致病菌的抵抗力，并包含表达权利要求1的抗微生物蛋白的重组体DNA。
11.防治真菌或细菌的一种方法，包括将真菌或细菌与权利要求1的抗微生物蛋白相接触。
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