CN1335855A - 新蛋白质,其编码基因及它们的使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是筛选和鉴定新的抗微生物蛋白,浓度甚至相对较低的该蛋白质也能抑制植物致病性微生物的生长,所述微生物如Pyricularia oryzae和茄属丝核菌,它们能导致损害水稻作物的两种主要疾病。本发明的另一目的是克隆该蛋白质的基因。根据本发明,提供了抗微生物蛋白,可通过硫酸铵沉淀法沉淀Lyophyllum shimeji获得含水提取物级分来获得该蛋白质,其中所述蛋白质具有至少抗茄属丝核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性,其在SDS－PAGE法中,显示出分子量约为70kDa和/或约为65kDa的组分的存在。本发明还提供了编码该蛋白质的基因和使用它们的方法。

Description

新蛋白质，其编码基因及它们的使用方法

技术领域

本发明涉及具有抗微生物活性的新蛋白质，编码该蛋白质的基因和使用所述蛋白质和基因的方法。更具体地，本发明涉及源自Lyophyllum shimeji，并具有至少抗茄属丝核菌和Pyricularia oryzae的抗微生物活性的蛋白质，编码该蛋白质的基因，和使用所述蛋白质和基因的方法。

本申请要求1999年9月21日提交的日本专利申请267238/1999(其全部内容列入本文作为参考)的优先权。

背景技术

已知如壳多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶的裂解酶是具有抗植物致病性微生物的抗真菌或抗微生物活性的植物蛋白质。体外实验证实：尽管这些类型的酶单独使用时可以发挥作用(Schlumbaum等，(1986)，自然324，pp365-367，Broglie等，(1991)，科学254，pp1194-1197)，但如果联合使用两种或多种上述酶，一般会获得增强的作用(Mauch等，(1988)，植物生理学，88，pp936-942；Sela-Buurlage等，(1993)，植物生理学，101，pp857-863)。如果用于抑制真菌生长，已知当单独使用这些裂解酶时，需要其使用浓度约为几十至几百μg/ml，或者当联合使用这些酶时，每种酶的浓度约为几μg/ml。然而，就本发明人所知道的而言，至今尚未阐明这些裂解酶能够对导致水稻作物大面积受损的Pyricularia oryzae发挥任何抗微生物作用。

以防卫素为例的低分子量抗真菌肽(AFP)也具有抗微生物活性，据报道其中的Ca-AMP1(日本国內公告号505048/96)和CB-1(Oita等，(1996)，Biosci.Biotech.Biochem，60，pp481-483)显示出抗Pyricularia oryzae和茄属丝核菌的抗微生物活性。而Rs-AFP1和Ar-AFP2(Terras等，1992，生物化学杂志，267，pp15301-15309)，以及Ace-AMP1(日本国内公告号501424/97)显示出抗Pyricularia oryzae的抗微生物活性。几μg/ml这些低分子量肽能50％抑制包括上述微生物的植物致病性微生物的生长。

人们也尝试分离裂解酶基因或低分子量抗微生物肽基因，并将这些基因转移至植物，从而构建能耐受疾病损伤的植物(Broglie等，(1991)，科学，254，pp1194-1197；Zhu等，(1994)，Bio/Technology12，pp807-812；Lin等，(1995)，Bio/Techmology13，pp686-691；Terras等，(1995)，植物细胞7，pp573-588)。然而，迄今为止几乎无法得到任何被赋予实践可接受水平的耐受性的植物。据认为一个原因是仅表达了低水平的转移基因。然而，据认为更主要的原因是迄今为止所报道的抗微生物蛋白本身具有很低的抗微生物活性。因此，需要鉴定和利用抗微生物活性比现有技术中的更高的抗微生物蛋白。

发明简述

本发明的目的是筛选和鉴定新的抗微生物蛋白，浓度甚至相对较低的该蛋白质也能抑制多种植物致病性微生物的生长，所述微生物包括Pyriculariaoryzae和茄属丝核菌，它们能导致影响水稻的两种主要疾病。

本发明的另一方面是克隆编码所述新蛋白质的基因并测定其碱基序列。

本发明的另一方面是将本发明的基因导入宿主生物(微生物，动物，植物等)以构建转化体，从而使用本发明的基因。

本发明的另一方面是提供抗微生物剂，其含有本发明的抗微生物蛋白。

附图简述

图1显示了通过使用MonoQ柱分离的Lyophyllum shimeji蛋白质图与其抗微生物活性之间的关系。

图2显示了通过MonoQ柱分离的Lyophyllum shimeji蛋白质的电泳模式与其抗微生物活性之间的关系。泳道上方给出的数字分别对应于图1中的级分编号，而M表示分子量标记。泳道下方给出的符号(-，+，++，+++)表示抗微生物活性的强度。箭头表示抗微生物蛋白(70kDa和65kDa)。

发明详述

深入研究上述问题的结果，本发明人建立了体外测定抗Pyricularia oryzae和茄属丝核菌的抗微生物活性的检测系统。完成此项任务之后，他们从食用蘑菇Lyophyllum shimeji中提取蛋白质。然后对提取出的蛋白质联合进行离子交换柱层析和高效液相层析(HPLC)，使用上述检测系统检查所得的每个级分。因此，发明人成功地鉴定，分离和纯化出抗微生物蛋白。另外，还测定了所纯化蛋白质的部分氨基酸序列。然后，使用在这些氨基酸序列的基础上合成的寡核苷酸作为引物进行RT-PCR，从而得到编码该蛋白质的部分长度的cDNA。随后，使用该部分长度的cDNA为探针，筛选源自Lyophyllumshimeji的cDNA文库。结果，分离出编码上述蛋白质的全长cDNA，并测定其完整的碱基序列。因此，本发明人成功地分离出源自Lyophyllum shimeji的新的抗微生物蛋白，并克隆出编码该蛋白质的DNA。另外，他们还测定了该蛋白质的氨基酸序列和DNA的碱基序列，从而完成了本发明。

因此，根据第一方面，本发明提供了抗微生物蛋白，可通过硫酸铵沉淀法沉淀Lyophyllum shimeji获得含水提取物级分来获得该蛋白质，已证实该蛋白质具有至少抗茄属丝核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性，经SDS-PAGE法测定，该蛋白质前体型的分子量约为70kDa，成熟型的分子量约为65kDa。

通常，本发明的抗微生物蛋白具有序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。据推测，约为65kDa的成熟型蛋白质由SEQ ID NO：1的氨基酸残基76至618组成，但本发明并不局限于此。

本发明的抗微生物蛋白不仅包括具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的抗微生物蛋白，也包括具有对SEQ ID NO：2进行一个或多个氨基酸突变所得的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2具有50％或更高同源性的氨基酸序列，并且显示出抗茄属丝核菌或pyricularia oryzae的抗微生物活性的抗微生物蛋白。

优选本发明的抗微生物蛋白与序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有60％或更高，优选为70％或更高，优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。

根据第二方面，本发明提供了抗微生物蛋白，其含有选自下列的单个多肽：具有例如序列表中SEQ ID NO：2中氨基酸残基76至618的部分氨基酸序列的多肽；具有对SEQ ID NO：2进行一个或多个氨基酸突变所得的氨基酸序列的多肽；或具有与SEQ ID NO：2具有50％或更高同源性的氨基酸序列，并且显示出抗茄属丝核菌或pyricularia oryzae的抗微生物活性的多肽；或这些多肽的组合。

关于上述根据本发明第二方面的抗微生物蛋白，与每个特定的氨基酸序列“具有50％或更高同源性的蛋白质”的定义指的是只要至少具有50％同源性即是可接受的。然而，希望该蛋白质具有的氨基酸序列优选具有60％或更高，优选为70％或更高，优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。

根据第三方面，本发明提供了产生本发明的抗微生物蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：

回收通过硫酸铵沉淀法，用75％-饱和硫酸铵沉淀的Lyophyllum shimeji含水提取物级分；和

对该级分进行离子交换层析并回收用0.05M至1M的NaCl洗脱的级分。

根据第四方面，本发明提供了编码本发明的抗微生物蛋白的基因。

通常，本发明的基因具有序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列，通过在此碱基序列中取代，缺失，插入和/或添加一个或多个碱基而得到的碱基序列，或能在严谨条件下与上述碱基序列杂交的碱基序列。

本发明的基因具有的碱基序列通常与序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列具有50％或更高，优选为60％或更高，优选为70％或更高，优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。

根据第五方面，本发明提供了通过以下方法产生的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用于得到编码源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白的基因，所述方法包括：

从序列表中的SEQ ID NO：1，即编码抗微生物蛋白之基因的碱基序列中选择满足以下需求的两个结构域：

1)每个结构域由15至30个碱基组成；和

2)每个结构域具有40至60％的G+C；

制备单链DNA，该DNA具有与所述结构域的碱基序列相同或互补的碱基序列，或者制备单链DNA混合物，该DNA混合物具有的遗传密码简并性可以确保所述单链DNA所编码的氨基酸残基不会改变；并任选对所述单链DNA进行修饰，而避免损害与编码所述抗微生物蛋白之基因的碱基序列结合的特异性。

优选本发明的寡核苷酸具有序列表中SEQ ID NO：7至12任一个的核苷酸序列。

根据第六方面，本发明提供了分离本发明基因的方法，其中所述方法包括：使用Lyophyllum shimeji cDNA文库为模板，一对上述两个寡核苷酸为引物进行核酸扩增反应，籍此扩增编码本发明抗微生物蛋白的基因的一部分，并使用如此获得的扩增产物为探针筛选cDNA文库，从而分离全长cDNA克隆。

根据第七方面，本发明提供了含有本发明基因的重组载体。

关于本发明的重组载体，优选载体是表达载体。

根据第八方面，本发明提供了通过将本发明的重组载体导入宿主生物而得到的转化体。

根据第九方面，本发明提供了抗微生物剂，其含有本发明的抗微生物蛋白作为活性成分。

以下将详细描述优选实施方案以阐明本发明。

根据本发明的第一方面，提供了源自Lyophyllum shimeji，具有抗植物致病性微生物之抗微生物活性的蛋白质，本发明并不局限于该蛋白质的来源，生产方法等，只要它具有本说明书中所述的特征即可。即本发明的抗微生物蛋白可以是天然蛋白质，利用基因工程技术由重组DNA表达的蛋白质，或化学合成的蛋白质。

通常，本发明的蛋白质具有由序列表中SEQ ID NO：2的618个氨基酸组成的氨基酸序列。然而，众所周知天然蛋白质常与具有一个或多个氨基酸突变的突变蛋白质相伴，所述氨基酸突变是由以下因素引起的：即产生蛋白质的生物体品种差异，取决于生态型差异的基因突变或存在非常类似的同工酶所致的基因突变。本文所用术语“氨基酸突变”指的是取代，缺失，插入和/或添加例如一个或多个氨基酸。尽管本发明的蛋白质具有由克隆基因的碱基序列推定的，SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但它并不局限于具有此序列的蛋白质。即本发明欲包括同源蛋白质，只要它具有本说明书中所述的特征即可。同源性至少为50％或更高，优选为60％或更高，优选为70％或更高，优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高。

在本说明书中，通过使用例如Altschul等(核酸研究，25，pp.3389-3402，1997)所报道的BLAST程序比较序列数据，即可测定同源性百分比。该程序可得自国际互联网上的国立生物技术信息中心(NCBI)或日本DNA数据库(DDBJ)站点。该站点详细描述了通过BLAST程序搜索同源性的多种条件(参数)。尽管可对参数的构成进行某种程度的改动，但通常通过使用缺省值进行搜索。

通常，通过用其它一个或多个具有类似特性的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基所得到的突变体具有类似于完整蛋白质的特性，所述取代如用一个疏水氨基酸取代另一个疏水氨基酸，用一个亲水氨基酸取代另一个亲水氨基酸，用一个酸性氨基酸取代另一个酸性氨基酸，或用一个碱性氨基酸取代另一个碱性氨基酸。通过使用基因工程技术制备具有所需突变的重组蛋白质的方法是本领域技术人员众所周知的，因此，这些突变蛋白质也包含在本

发明的范围中。

在SDS-PAGE法中，前体型本发明蛋白质的分子量约为70kDa，相当于具有序列表中SEQ ID NO：2第1至618位氨基酸序列的多肽，成熟型本发明蛋白质的分子量约为65kDa，相当于具有序列表中SEQ ID NO：2第76至618位氨基酸序列的多肽。通常，本发明的抗微生物蛋白具有序列表中SEQ IDNO：2的氨基酸序列，但本发明并不局限于此。

因此，本发明提供了抗微生物蛋白，其含有选自下列的单个多肽：具有序列表中SEQ ID NO：2氨基酸序列第1至618位的部分氨基酸序列的多肽；和具有第76至618位氨基酸序列的多肽，或其组合。上述多肽包括具有以上说明书中所述突变的同源多肽。

通过使用硫酸铵沉淀法，离子交换柱层析等，可从Lyophyllum shimeji子实体中纯化本发明的蛋白质，这一点将在下文实施例中描述。或者，通过使用能在宿主中扩增并能表达蛋白质的表达载体，将本发明序列表中SEQ IDNO：1的第8至1861位DNA序列，或第233至1861位DNA序列导入大肠杆菌，酵母，昆虫或特定的动物细胞，也可以大量得到相应的蛋白质。

使用DDBJ的BLAST程序对本发明源自Lyophyllum shimeji的蛋白质进行同源性搜索，结果表明：甚至在最高的情况下，全长氨基酸序列之间的同源性也仅为45％，未发现其它同源序列。根据这些事实可以得出结论：该蛋白质是一种新的蛋白质。本发明公开了该蛋白质的氨基酸序列和编码它的DNA序列，结果，通过使用基因工程技术(杂交，核酸扩增，如PCR等)，利用这些序列或其部分，可以容易地从其它物种中分离出编码具有类似生理学活性的蛋白质的基因。在这种情况下，由这些基因编码的新蛋白质也属于本发明的范围之內。对本发明的DNA序列进行同源性搜索的结果，只搜索到一个极短长度(32个碱基)的序列，其同源性为93％。

彩绒革盖菌的吡喃糖氧化酶与本发明源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白显示出最高的同源性(全长氨基酸序列之间的同源性为45％)。吡喃糖氧化酶是氧化吡喃糖(如葡萄糖)以形成2-酮产物和过氧化氢的酶。据报道，该酶可用于分析其它吡喃糖(参见日本专利公开号205861/96，列入本文作为参考)。  已发现本发明源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白实际上显示出吡喃糖氧化酶活性，其比活非常高，而针对葡萄糖等的Km值较低。离子交换柱级分中抗微生物活性的强度可以由吡喃糖氧化酶活性的强度预测得到。因此，据估计本发明所发现的，源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白的抗微生物活性与吡喃糖氧化酶相关。关于本发明抗微生物活性的功能机制，一种理论是：在氧化检测培养基中所含葡萄糖的过程中，由该酶形成的过氧化氢对致病性微生物产生有害作用，但不必拘泥于该理论。

通过适当组合常用于纯化和分离蛋白质的方法即可纯化和分离本发明的蛋白质，所述方法如硫酸铵沉淀，离子交换层析(MonoQ，A Sepharose，DEAE等)等。

如下文实施例所述，使Lyophyllum shimeji粒化并用缓冲液提取。过滤提取物之后，在上清液中加入硫酸铵以给出适当的浓度(例如75％-饱和)，静置混合物。由此得到含有本发明蛋白质的沉淀物。透析沉淀物，进行离子交换层析，用盐浓度梯度(例如50mM至1M氯化钠)洗脱，从而回收含有所需蛋白质的级分。

本发明进一步提供了编码本发明的抗微生物蛋白的基因。基因类型不受限制。即它可以是天然来源的DNA，重组DNA，化学合成的DNA。基因可以是基因组cDNA或cDNA克隆。

通常，本发明的基因具有序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列。然而，SEQ ID NO：1是在仅为本发明例子的下列实施例中所得克隆的碱基序列。本领域技术人员众所周知：天然基因伴随有少量突变，所述突变是由产生该基因的生物品种差异，或生态型差异引起的，或者是由非常相似的同工酶的存在引起的。因此，本发明的基因并不局限于具有序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列的基因，可包括编码本发明的抗微生物蛋白的任何基因。

本发明公开了该蛋白质的氨基酸序列和编码它的DNA序列，结果，通过使用基因工程技术(杂交，核酸扩增等)，利用这些序列或其部分，可以容易地从其它物种中分离出编码具有类似生理学活性的蛋白质的基因。在这种情况下，所得的基因也属于本发明的范围之内。

可以在没有任何限制的任意条件下进行同源基因的筛选。通常，优选利用严谨条件(例如6×SSC，5×Denhardt’s，0.1％SDS，25℃至68℃)。优选杂交温度范围为45℃至68℃(无甲酰胺)或25℃至50℃(50％甲酰胺)。本领域技术人员众所周知：可以通过适当地设置杂交条件(甲酰胺浓度，盐浓度，温度等)克隆所含核苷酸序列具有某一水平或上述水平同源性的DNA。如此克隆的同源基因都包括在本发明的范围之內。

核酸扩增反应的例子包括：利用温度循环进行的反应，如聚合酶链反应(PCR)(Saiki等，1985，科学230，pp1350-1354)，连接酶链反应(LCR)(Woh等，1989，基因组学4，pp560-569；Baringer等，1990，基因89，pp117-122和Baranny等，1991，美国国家科学院院刊88，pp189-193)和基于转录的扩增(Kwoh等，1989，美国国家科学院院刊86，pp1173-1177)和等温反应，如链置换扩增(SDA)(Walker等，1992，美国国家科学院院刊89，pp392-396；和Walker等，1992，核酸研究，20，pp1691-1696)，自我-维持的序列复制(3SR)(Guatelli等，1990，美国国家科学院院刊87，pp1874-1878)和Qβ复制酶系统(Lizardi等，1988，生物技术6，pp1197-1202)。另外，可以按欧洲专利0525882等所报道，在竞争性扩增靶核酸和突变序列的基础上，使用基于核酸序列的扩增(NASBA)。优选使用PCR法进行扩增。

通过使用上述杂交，核酸扩增等克隆的同源基因与序列表中SEQ IDNO：1的碱基序列具有至少为50％，优选为60％或更高，优选为70％或更高，优选为80％或更高，特别优选为90％或更高，最优选为95％或更高的同源性。

本发明进一步提供了通过以下方法产生的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用于得到源自Lyophyllum shimeii的抗微生物蛋白，所述方法包括：

从序列表中的SEQ ID NO：1，即编码抗微生物蛋白之基因的碱基序列中选择满足以下需求的两个结构域：

1)每个结构域由15至30个碱基组成；和

2)每个结构域具有40至60％G+C；

制备单链DNA，该DNA具有与所述结构域的碱基序列相同，或与之互补的碱基序列，或者制备单链DNA混合物，该DNA混合物具有遗传密码简并性，以确保单链DNA所编码的氨基酸残基不会改变；任选对单链DNA进行修饰，而避免损害与编码抗微生物蛋白之基因的碱基序列结合的特异性。本发明的寡核苷酸可用于杂交以检测或分离本发明的基因。也可以在如PCR的扩增反应中将这些寡核苷酸一个适当配对用作引物。

本发明的寡核苷酸可具有序列表中SEQ ID NO：8至12任一个的核苷酸序列。可将这些核苷酸序列设计成PCR引物以克隆编码各个蛋白质的基因片段。这些引物含有混合在一起的，所有编码相应氨基酸的潜在碱基。

通过使用Lyophyllum shimeji子实体cDNA文库为模板，和上述寡核苷酸的适当组合，进行核酸扩增反应(PCR等)来扩增和分离本发明基因的片段。使用所得扩增产物为探针，通过例如噬斑杂交进一步筛选cDNA文库，即可分离全长cDNA克隆。核酸扩增反应的方法和条件，噬斑杂交条件等是本领域技术人员众所周知的。

本发明进一步提供了含有本发明基因的重组载体。根据例如Sambrook，J等(分子克隆，实验室手册(第2版)，冷泉港实验室，1.53(1989))所报道的方法，将本发明基因的DNA片段整合至诸如质粒等载体中。更加方便的方法是使用商购连接试剂盒(例如Takara Shuzo有限公司的产品)。将所得重组载体(例如重组质粒)转移至宿主细胞(例如大肠杆菌TB1，LE392或XL-1Blue)。

据Sambrook，J等，分子克隆，实验室手册(第2版)，冷泉港实验室，1.74(1989)的报道，将质粒转移至宿主细胞的方法包括例如磷酸钙法，氯化钙/氯化铷法，电穿孔法，电注射法，用PEG等化合物进行处理，和使用基因鸟枪的方法。

通过将所需基因连接至本领域可得到的重组载体(例如质粒DNA)中，可以方便地制备载体。本文可以使用的载体的具体例子包括源自大肠杆菌的质粒，如pBluescript，pUC18，pUC19和pBR322，但本发明并不局限于此。

表达载体对产生所需蛋白质特别有用。对表达载体的类型没有特别的限制，只要它具有以下功能即可，即能在多种原核和/或真核宿主细胞中表达所需基因，从而产生所需蛋白质。优选载体的例子包括大肠杆菌表达载体，如pQE-30，pQE-60，pMAL-C2，pMAL-p2，pSE420等。关于酵母中的表达载体，优选pYES2(糖酵母属)和pPIC3.5K，pPIC9K和pAO815(毕赤氏酵母属)。关于昆虫中的表达载体，优选pBacPAK8/9，pBK283，pVL1392，pBlueBac4.5等。

通过将所需表达载体转移至宿主细胞可制备转化体。对所用宿主细胞没有特别的限制，只要它能与本发明的表达载体相容因而能被转化即可。即可以利用本领域常用的多种细胞，包括天然细胞和人工建立的重组细胞。其例子包括(属于埃希氏菌属和芽胞杆菌属的)细菌，(属于糖酵母属，毕赤氏酵母属等的)酵母，动物细胞，昆虫细胞和植物细胞。

至于宿主细胞，优选使用大肠杆菌，酵母或昆虫细胞。其具体例子包括大肠杆菌菌株(M15，JM109，BL21等)，酵母(INVSc1(糖酵母)，GS115和KM71(各为毕赤氏酵母)等)和昆虫细胞(BmN4，蚕幼虫等)。动物细胞的例子包括源自小鼠，非洲爪蟾，大鼠，仓鼠，猴，人的细胞，和由上述细胞建立的培养细胞系。对植物细胞没有特别的限制，只要它能被培养即可，所述植物细胞包括源自例如烟草，拟南芥，水稻，玉米和小麦的细胞。

当使用细菌(特别是大肠杆菌)作为宿主细胞时，表达载体一般至少由启动子/操纵子结构域，起始密码子，编码所需抗微生物蛋白的基因，终止密码子，终止子和可复制单位组成。

当使用酵母，植物细胞，动物细胞或昆虫细胞作为宿主细胞时，一般优选表达载体至少含有启动子，起始密码子，编码所需抗微生物蛋白的基因，终止密码子和终止子。还可任选其含有编码信号肽的DNA，增强子序列，所需基因5’和3’侧的非-翻译结构域，选择标记结构域，可复制单位等。

本发明载体中起始密码子的适当例子是甲硫氨酸密码子(ATG)。终止密码子的例子包括常用的终止密码子，如TAG，TGA和TAA。

本文所用术语“复制单位”指的是能在宿主细胞中复制其完整DNA序列的DNA。其例子包括天然质粒，人工修饰的质粒(即由天然质粒制备的质粒)和合成质粒。质粒的适当例子包括质粒pQE30，pET，pCAL或其人工修饰质粒(如用足够的限制性酶处理pQE30，pET或pCAL得到的DNA片段)(对大肠杆菌而言)；质粒pYES2和pPIC9K(对酵母而言)；和质粒pBacPAK8/9等(对昆虫细胞而言)。

关于增强子序列和终止序列，可以使用本领域技术人员常用的那些，例如源自SV40的序列。

关于选择标记，可以利用本领域通过常规方法常用的选择标记。其例子包括抗生素抗性基因(四环素，氨苄青霉素，卡那霉素，新霉素，潮霉素，壮观霉素等)。

通过将至少上述启动子，起始密码子，编码所需抗微生物蛋白的基因，终止密码子和终止结构域顺序地和环形地连接至适当的可复制单位即可制备表达载体。在此方法中，必要时也可以通过常规方法，如用限制性酶消化或使用T4DNA连接酶连接，来使用适当的DNA片段(例如接头，其它限制性酶位点等)。

可使用公知方法将本发明的表达载体导入(即转化(转导))至宿主细胞。

也就是说，可通过以下方法进行转化，例如对细菌(大肠杆菌，枯草芽胞杆菌等)而言的Cohen等(美国国家科学院院刊，69，2110(1972))报道的方法，原生质体法(Mol.Gen.Genet.，168，111(1979))或感受态法(分子生物学杂志，56，209(1971))；对酿酒酵母而言的Hinnens等(美国国家科学院院刊，75，1927(1978))报道的方法和锂法(细菌学杂志，153，163(1988))；对植物细胞而言的叶片法(科学，227，129(1985))和电穿孔法(自然，319，791(1986))；对动物细胞而言的Graham(病毒学，52，456(1973))报道的方法；和对昆虫细胞而言的Summers等(分子细胞生物学，3，pp2156-2165(1983))报道的方法。

通过使用本发明的DNA片段，转化植物的载体可用于构建对疾病具有耐受性的植物。对植物载体没有特别的限制，只要它能表达相应的基因并因而产生所需的蛋白质即可。所述载体的例子包括pBI1221和pBI121(Clontech有限公司)和由它们衍生的载体。另外，尤其是为了转化单子叶植物，可使用例如pIG121Hm，pTOK233(Hiei等，植物杂志，6，pp271-282(1994))，pSB424(Komari等，植物杂志，10，pp165-174(1996))。

通过用本发明的DNA片段取代上述载体中的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因位点以构建转化植物所用的载体，然后将该载体转移至植物，即可制备转基因植物。优选转化植物所用的载体至少含有启动子，起始密码子，所需基因(本发明的DNA序列或其部分)，终止密码子和终止子。另外，所述载体还任选含有编码信号肽的DNA，增强子序列，所需基因5’和3’侧的非-翻译结构域，选择标记结构域等。

对启动子和终止子没有特别的限制，只要它能在植物细胞中发挥作用即可。能够组成型表达的启动子的例子包括：已被整合至上述载体中的35S启动子，以及肌动蛋白和遍在蛋白基因启动子。然而，更优选整合诱导型启动子。通过使用诱导型启动子，仅在转基因植物与害虫接触之后才能产生所需蛋白质，因此植物获得了耐受性。可用于此目的的诱导型启动子的例子包括：苯丙氨酸脱氨酶，壳多糖酶，葡聚糖酶，硫堇和消炎痛控释剂基因的启动子，和其它可应答害虫或应力的基因的启动子。

通过使用下列方法将基因转移至植物，所述方法包括：农杆菌的使用(Horsch等，科学，227，129(1985)；Hiei等，植物杂志，6，pp271-282(1994))，电穿孔法(Fromm等，自然，319，791(1986))，PEG法(Paszkowski等，EMBOJ.，3，2717(1984))，显微注射法(Crossway等，Mol.Gen.Genet.，202，179(1989))，微量碰撞法(McCabe等，Bio/Technology，6，923(1988))等。可以不加限制地使用任何方法，只要它能将基因转移至所需植物即可。类似地，宿主植物并不局限于特定的物种，只要它能与本发明转化植物的载体相容，并能被其转化即可。也即，可利用本领域常用的植物，例如双子叶植物(例如烟草，拟南芥，番茄，黄瓜，胡萝卜，大豆，马铃薯，甜菜，萝卜，中国甘蓝，油菜植物，棉花，矮牵牛属植物等)和单子叶植物(例如水稻，玉米，小麦等)。

本发明的抗微生物蛋白表现出高度有效的抗微生物活性。例如，极低浓度(5ng/ml)的所述蛋白质可以完全抑制Pyricularia oryzae孢子的萌发(见下文实施例2)。以此浓度长时间保温之后，未观察到孢子的萌发，这表明本发明的蛋白质不是部分抑制Pyricularia oryzae的生长，而是对其表现出抗微生物活性。就发明人所知道的而言，迄今为止尚无人报道过在如此低的浓度(即纳克水平)下能完全抑制致病性微生物生长的抗微生物蛋白。在下列实施例中，将能导致水稻的两种主要疾病损伤的Pyricularia oryzae和茄属丝核菌用于抗微生物试验，以纯化抗微生物蛋白。然而，水平差不多的，由本发明鉴定的Lyophyllum shimeji抗微生物蛋白很可能也对其它植物疾病发挥抗微生物作用。在如上所述的其潜在抗微生物作用的基础上，可将源自Lyophyllum shimeji的，本发明的抗微生物蛋白用于含有处于活性状态中的所述蛋白质的制剂中，例如包括抗微生物剂和杀虫剂的药物中。如上所述，当使用编码本发明蛋白质的DNA序列时，通过将DNA整合至能在大肠杆菌，酵母等中起作用的表达载体，即可大量产生蛋白质。

通过在营养培养基中保温含有按上述制备的表达载体的转化体细胞，可以表达(产生)本发明的蛋白质。营养培养基优选含有宿主细胞(转化体)生长所需的碳源，无机氮源或有机氮源。碳源的例子包括葡萄糖，葡聚糖，可溶性淀粉，蔗糖，甲醇等。无机氮源或有机氮源的例子包括铵盐，硝酸盐，氨基酸，玉米浆，蛋白胨，酪蛋白，肉膏，豆饼，马铃薯提取物等。必要时，还可进一步含有其它营养成分，例如无机盐(氯化钠，氯化钾，磷酸二氢钠，氯化镁等)，维生素和抗生素(四环素，新霉素，氨苄青霉素，卡那霉素等)。通过本领域已知的方法进行保温。可适当选择保温条件(例如温度，培养基的pH，保温时间)以大量产生本发明的蛋白质。例如，在本发明的实施例4中，通过使用大肠杆菌(M15)作为宿主细胞来表达本发明的重组抗微生物蛋白。当在大肠杆菌中表达时，优选在4℃至40℃下进行保温，通过0.01mM至5.0mM IPTG诱导重组蛋白质的表达，但本发明并不局限于此。

可按下列方法从上述保温培养物中回收本发明的蛋白质。当本发明的蛋白质在宿主细胞中积累时，通过例如离心或过滤收集宿主细胞，然后悬浮于适当缓冲液(例如浓度约为100mM至10M的如tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液或MES缓冲液，其pH值范围随缓冲液的不同而变化，优选pH范围为5.0至9.0)。然后，通过适于所用宿主细胞的方法破碎细胞，离心得到宿主细胞的内容物。另一方面，当本发明的蛋白质从宿主细胞中被分泌出来时，通过例如离心或过滤从培养基中分离宿主细胞以得到培养物滤过物。任选对破碎细胞的悬浮液或培养物滤过物进行硫酸铵沉淀和透析，然后纯化和分离本发明的蛋白质。

使用下列方法进行纯化和分离。当用6×组氨酸，GST，麦芽糖-结合蛋白质等标记所述蛋白质时，可使用适于每个所用标记物的亲和层析法。在下文所述的实施例4中，表达了N-末端被6×组氨酸标记的重组抗微生物蛋白，但本发明并不局限于此。通过使用Ni-NTA琼脂糖(由Qiagen制备)纯化该重组蛋白质，所述琼脂糖对6×组氨酸具有亲和性。另一方面，当产生不具有任何标记的本发明的蛋白质时，可以使用下文实施例所述的离子交换层析法。也可以将这些方法与凝胶过滤，疏水层析，等电层析等联合。

如上所述，本发明的抗微生物蛋白可以用于例如预防或治疗由真菌或细菌导致的植物疾病。因此，本发明提供了抗微生物剂，其含有本发明的抗微生物蛋白作为活性成分。一般说来，本发明的抗微生物剂可用于整个植物或其部分。

使用剂量根据植物类型，生长期，条件，使用方法，治疗时间，所用蛋白质的类型(例如是全长蛋白质还是通过取代，缺失，插入和/或添加其部分而衍生得到的蛋白质)，生长地的气候，生长地的土壤等的不同而变化。一天可以使用一次或多次。使用剂量随多个因素而变化。必要时，可以以混合溶液，悬浮液，乳液等的形式使用本发明的抗微生物剂。含水或不含水的溶液或悬浮液含有一种或多种活性物质以及至少一种惰性稀释剂。含水稀释剂的例子包括蒸馏水和生理盐水。不含水稀释剂的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油，如橄榄油和醇类，如乙醇。

这些抗微生物组合物可进一步含有辅助剂，如防腐剂，湿润剂，乳化剂，分散剂或稳定剂(精氨酸，天冬氨酸等)。

通过例如流经抑菌滤器过滤所述组合物，必要时加入杀菌剂或进行照射可使这些组合物灭菌。也可以通过例如冷冻干燥制备无菌的固体组合物，然后在使用前溶解于蒸馏水或其它溶剂中。

根据目的的不同，适当地确定所得抗微生物剂的剂量形式。也即可以将其与上述添加剂混合，然后以片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂，溶液，乳剂等的形式使用。

参照下列实施例，将更详细地描述本发明。然而应理解本发明并不局限于此。

实施例

实施例1：构建检测系统

1)建立检测系统

保温致病性真菌：在燕麦粉培养基(Difco有限公司，添加有1％蔗糖)上保温Pyricularia oryzae(TUS-1菌株，品种337，由农林渔业部，Tohoku国立农业实验站提供)以产生分生孢子。加入10％甘油之后，将分生孢子悬浮液储存于-80℃。

在1/2马铃薯-葡萄糖肉汤(PD肉汤，Difco有限公司)中将茄属丝核菌(JT872菌株)保温2天。使用Teflon匀浆器轻轻研磨3块菌丝体(约5×5mm)与1/2PD培养基，将所得的分级分离的菌丝用作接种源。

将上述接种源分别加入96孔微滴板(Corning有限公司)。以约1000/孔的密度加入Pyricularia oryzae分生孢子，以约300/孔的密度加入经分级分离的茄属丝核菌菌丝以及100μl1/2 PD培养基。然后，在28℃恒温箱中保温这些接种源。通过用微滴板读数仪(Benchmark，Bio-Rad有限公司)测定595nm的光吸收来监测真菌的生长。

盐和缓冲液的影响：通过在培养基中加入确定量的NaCl，磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，Hepes缓冲液，牛血清白蛋白，二硫苏糖醇等，测定盐和缓冲液对真菌生长的影响。

2)Lyophyllum shimeji中蛋白质的提取

预先用剪刀将10g Lyophyllum shimeji(由日本制备，得自Shiga ForestResearch Center)剪成小块，使用液氮冻干，在研钵中研磨以得到小颗粒。然后用30ml 50mM Hepes缓冲液提取颗粒30分钟。使提取物滤过Miracloth，然后以10,000×g离心20分钟。在上清液中加入硫酸铵以达到75％饱和，于4℃静置混合物过夜。再次以15,000×g离心20分钟之后，将沉淀物溶解于3ml10mM Hepes缓冲液(pH7.5)，并使用透析管(Spectra/Porl MWCO6-8000，Spectrum Medical Industries有限公司)或苯甲酰化透析管(SIGMA有限公司)，对着10mM Hepes缓冲液(pH7.5)进行透析。离心除去不可溶的物质之后，得到Lyophyllum shimeji蛋白质样品。通过Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质，测定Lyophyllum shimeji蛋白质样品的蛋白质浓度。

实施例2：纯化抗微生物蛋白

1)粗Lyophyllum shimeji蛋白质样品的抗微生物活性

开始保温Pyricularia oryzae和茄属丝核菌之后，立即在保温系统中加入确定量的粗Lyophyllum shimeji蛋白质样品。然后在2天内，随着时间的流逝监测光吸收的变化，从而测定抗微生物活性的存在或缺乏。连续稀释蛋白质样品，以测定与抗微生物活性有关的稀释限度。结果，发现了针对Pyriculariaoryzae和茄属丝核菌的较高抗微生物活性(表1)。

表1：粗Lyophyllum shimeji蛋白质提取物的抗微生物活性

蘑菇        提取时的pH    完全抑制生长的浓度(μg/ml)

                           P.oryzae    茄属丝核菌

L.shimeji       7.5           30           30

据初步估计，完全抑制Pyricularia oryzae生长所需的Lyophyllum shimeji蛋白质提取物的浓度为30μg或更少的总提取蛋白质/ml。因此，Lyophyllumshimeji提取物显然含有具有高抗细菌活性的物质。关于该蛋白质提取物抑制真菌生长的方式，在高浓度下观察到对萌发的完全抑制，在低浓度下观察到对菌丝生长的抑制。对菌丝延伸的抑制水平明显取决于所用浓度。在Pyricularia oryzae细胞中，将细胞壁与细胞质分开，从而显示出质壁分离-样状态。

2)通过离子交换柱层析进行纯化

接着，纯化抗微生物蛋白。在液氮中研磨70g Lyophyllum shimeji，用200ml缓冲液(50mM MES，50mM NaCl，pH6.0)提取蛋白质30分钟。滤过双重折叠的Miracloth之后，以15,000×g离心滤过物20分钟以沉淀杂质。流过滤纸进一步过滤上清液，得到蛋白质样品。将约200ml蛋白质样品倒入填充有离子交换剂Q-SepharoseFF(Pharmacia有限公司)的柱(內径为1.1cm，高度为20cm)中。将50mM Mes(pH6.0)，50mM NaCl用作基础缓冲液，50mM Mes(pH6.0)，1M NaCl用作洗脱缓冲液，将流速控制为2.5ml/分钟。上样样品之后，在100至120分钟內使NaCl梯度从50mM至1M。随后，使洗脱缓冲液过柱40分钟。使用梯度之后4次收集级分(100ml/级分)。连续稀释这4个级分(I，II，III和IV)，进行抗Pyricularia oryzae的抗微生物试验。结果，级分II至IV显示出抗微生物活性。这些级分导致致病性真菌细胞的质壁分离。用Centriprep(Amicon有限公司，MWCO10,000)浓缩显示出最高活性的级分II(对应于0至333mM NaCl)，倒入离子交换柱Mono QHR5/5(Pharmacia有限公司)，以部分纯化该抗微生物蛋白。将50mM Mes(pH6.0)，50mM NaCl用作基础缓冲液，50mM Mes(pH6.0)，1M NaCl用作洗脱缓冲液，将流速控制为1ml/分钟。上样样品之后，在20至40分钟内使NaCl梯度从50mM至1M。每个级分取一部分(1ml)进行抗Pyriculaha oryzae的抗微生物试验和SDS-PAGE电泳。图1显示了HPLC图谱和抗微生物活性强度之间的关系。以4个等级显示通过从每个MonoQ级分中收集5，1和0.2μl，并进行抗Pyriculariaoryzae的抗微生物试验所测定的抗微生物活性，即+++(0.2μl时抑制)，++(1μl时抑制)，+(5μl时抑制)和-(甚至在5μl时也不抑制)。当根据A₂₈₀和抗Pyricularia oryzae的抗微生物活性强度监测蛋白质时，在pH6.0，离子强度(NaCl浓度)为250mM左右出现抗微生物蛋白的洗脱峰。随后，随着离子强度的增加，每个单位洗脱物中蛋白质的抗微生物活性逐渐降低。

接着，加入各级分的10μl等分试样和等量2×SDS电泳缓冲液(Sambrook等，1989)。95℃处理5分钟之后，根据Laemmli(1970)的方法进行SDS-PAGE电泳。至于凝胶，可使用15％PAGEL(ATTO有限公司)，利用银染II试剂盒Wako(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)检测蛋白质。为了粗略估计分子量和蛋白质的量，以一条带代表20ng的方式电泳分子量标记(LMW，由Pharmacia LKB有限公司制备，94kDa，67kDa，43kDa，30kDa，20.1kDa和14.4kDa，从大到小递减)。图2显示了电泳模式和抗微生物活性强度之间的关系。泳道上方给出的数字分别对应于图1中的级分编号。按与图1相同的方式显示抗微生物活性的强度。深入的研究表明：约70kDa和约65kDa的两条带被认为是与抗微生物活性相关的候选蛋白质(图2中的箭头)。由于这两条带的浓度与抗微生物活性水平正相关，这强烈暗示这些带本身就相当于抗微生物蛋白。在这些带中，Q-Sepharose级分和MonoQ级分中的65kDa带在蛋白质带密度和抗微生物活性之间有明显的关联。参照分子量标记(67kDa的白蛋白)，用光密度计估计抗微生物蛋白的量，由此将完全抑制Pyriculariaoryzae生长所必需的浓度计算为约5ng/ml。

3)测定抗微生物蛋白的N-末端氨基酸序列

用Centrifut V-20(Kurabo Industries，Ltd)浓缩MonoQ级分号36至44，并进行SDS-PAG正电泳。清除Tris之后，在无甘氨酸的缓冲系统中将分离的蛋白质转移至PVDF膜(Millipore有限公司)，用考马斯亮蓝进行轻微的染色并脱色。接着，从膜上切下据认为相当于抗微生物蛋白的70kDa和65kDa蛋白质带。通过Edman法，使用气相蛋白质测序仪(HPG1005A蛋白质测序系统)测定N-末端氨基酸序列。

结果，测出65kDa蛋白质的下列30个氨基酸。

N’-NAEEGTAVPYVPGYHKKNEIEFQKDIDRFV-C’(SEQ ID NO：3)

另一方面，无法对70kDa蛋白质测序，原因可能是该蛋白质的N’-末端被封闭。因此，利用赖氨酰內肽酶和V8蛋白酶部分消化70kDa蛋白质，得到43kDa赖氨酰內肽酶-消化产物和45kDa V8蛋白酶-消化产物。通过重新分析这些经部分消化的蛋白质的氨基酸序列，分别由这两种蛋白质测定出下列24个残基和29个残基。

N’-EFDESIRHTLVLRSLQDAYKDRQR-C’(SEQ ID NO：4)和

N’-AERLIGTSTKEFDESIRHTLVLRSLQDAY-C’(SEQ ID NO：5)

由于这些氨基酸序列大多互相重叠，因此测定出总共34个残基的內部氨基酸序列。

N’- AERLIGTSTKEFDESIRHTLVLRSLQDAYKDRQR -C’(SEQ IDNO：6)

在数据库中搜索所测定的氨基酸序列。结果，65kDa蛋白质的30个氨基酸和70kDa蛋白质的34个氨基酸皆显示出与彩绒革盖菌吡喃糖氧化酶的同源性。因此，根据Nishimura等(1996)的方法测定每个MonoQ级分的吡喃糖氧化酶活性。结果发现吡喃糖氧化酶活性的强度与由抗微生物活性强度所预测的一致。因此，估计抗微生物活性可能源自该酶氧化培养基中的葡萄糖的过程中所形成的过氧化氢。接着，只浓缩同时含有65kDa和70kDa蛋白质的级分(图2第42-44号)，分析吡喃糖氧化酶的特性。结果揭示出：这些级分显示出很高的吡喃糖氧化酶活性以及对葡萄糖和1，5-脱水葡萄糖醇的低Km值(表2)。

表2：L.shimeji抗微生物蛋白的吡喃糖氧化酶活性及其各种特性

  酶蛋白质              Km(mM)                   比活

                葡萄糖    1，5-脱水葡萄糖醇     (U/mg)^*

  L.shimeji      0.50             6.5            10.6

^*：1U＝1μmol H₂O₂/分钟，pH7.0，37℃通过SDS-PAGE银染测定酶蛋白质(65kDa+70kDa)的量。

实施例3：分离cDNA

1)设计简并引物

根据1)中测定的氨基酸序列，合成含有所有潜在碱基的混合物的引物(Tm：52至56℃，括号中的数字各表示简并程度)。更具体地，由源自65kDa蛋白质的氨基酸序列(30个残基)合成下列3个引物：

65R1(5’-gargarggiacigcigticc-3’(4))(SEQ ID NO：7)；

65R2(5’-garttycaraargayathgaymg-3’(384))(SEQ ID NO：8)；和

65R3(5’-ttygtiaaygtiathtgyggigc-3’(24))(SEQ ID NO：9)。

另一方面，由源自70kDa蛋白质的部分消化产物的氨基酸序列(34个残基)合成下列3个引物：

70F1(5’-tgickdatiswytcrtcraaytc-3’(384))(SEQ ID NO：10)；

70F2(5’-tgickrtcyttrtaigcrtcytg-3’(64))(SEQ ID NO：11)；和

70F3(5’-ggigcraadatickytgickrtc-3’(96))(SEQ ID NO：12)。

在上述引物中，r表示a或g；y表示c或t；h表示a，c或t；m表示a或c；k表示g或t；d表示a，g或t；s表示g或c；w表示a或t；和i表示肌苷。

2)由Lyophyllum shimeji子实体构建cDNA文库

通过SDS酚法从Lyophyllum Shimeji子实体中提取总核酸，通过氯化锂沉淀回收总RNA。然后通过使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia有限公司)由总RNA制备Lyophyllum shimeji mRNA。由约10g子实体得到20微克mRNA。将5微克mRNA用于ZAP cDNA合成试剂盒(Stratagene有限公司)以合成cDNA。通过使用凝胶过滤柱收集1至5kb cDNA级分，连接至Uni-ZAP XR载体(Stratagene有限公司)，然后包装至Gigapack III(Stratagene有限公司)。所有方法都根据试剂盒所附的厂商说明进行。经计算，如此构建的Lyophyllum shimeji cDNA文库的滴度约为3,000,000pfu。

3)通过RT-PCR制备探针

通过使用1)中合成的引物，利用2)中合成的cDNA为模板进行PCR，从而试着扩增Lyophyllum shimeji蛋白质的部分长度cDNA，所述cDNA可用作筛选文库所用的探针。所用反应条件如下。50μl反应混合物溶液含有100ng cDNA，5μl10×Eq taq缓冲液，4μl各种dNTP，10pmol/每种引物序列和1μlEx taq(Takara Shuzo有限公司)+ Taq START抗体(Clontech有限公司)。通过使用Program Temp控制系统PC-700(ASTEK有限公司)，进行由以下条件组成的PCR：94℃，3分钟1次，94℃，1分钟，50℃，1分钟和72℃，1分钟35轮循环，然后72℃，6分钟1次。结果，用引物组合65R1-70F1，65R1-70F2，65R2-70F1，65R2-70F2，65R2-70F3和65R3-70F1扩增了约0.4至0.5kb的产物。显示出较高扩增效力的约0.4kb片段经凝胶纯化，将其克隆至载体pCRII(由Invitrogen制备)，从而测定碱基序列。在此碱基序列的基础上推定的氨基酸序列含有与实施例2-3)中测定的氨基酸序列的一部分相同的序列，完整的序列显示出与彩绒革盖菌吡喃糖氧化酶中等程度的同源性。根据这些结果，可以证实纯化的70kDa和65kDa抗微生物蛋白是由单个基因编码的，通过RT-PCR得到的cDNA克隆是Lyophyllum shimeji抗微生物蛋白部分长度的cDNA。

4)筛选全长cDNA

从所述载体上切下3)中得到的克隆，将其用作探针以筛选2)中构建的Lyophyllum shimeji cDNA文库。根据ZAP cDNA合成试剂盒(Stratagene有限公司)所附的厂商说明，将约15,000pfu噬菌体与宿主XL1-blue MRF’一起铺于方形平皿(14×10cm)。然后使噬斑与尼龙滤膜Hybond-N+(Amersham有限公司)接触，并根据随膜所附的厂商说明用碱处理。因此，为了变性所述DNA并将其固定在膜上，可根据随膜所附的厂商说明，在高度严紧的条件下进行杂交和洗涤。在首次筛选的过程中，从约120,000pfu噬菌体中得到20个阳性克隆。对这些克隆进行第二次筛选，然后进行第三次筛选，其目的也是纯化噬斑。根据ZAP cDNA合成试剂盒(Stratagene有限公司)所附的厂商说明，对所有这20个克隆进行体內切割。结果，收集了18个已整合至噬菌粒载体pBluescript SK的cDNA克隆。这些克隆的长度为1.7至2.1kb。用限制性酶进行分析，结果表明这些克隆可能源自彼此很相似的基因。

5)测定碱基序列

关于上述18个cDNA克隆，测定5’-和3’-端碱基序列(各约为500bp)。利用分析软件Genetyx版本9.0(Sofeware Development有限公司)分析所得碱基序列数据。结果，所有这些克隆都含有编码实施例2-3)中测定的65kDa蛋白质30个氨基酸的DNA序列，但克隆与克隆之间的polyA添加位点有所不同。利用ABI PRIMS荧光测序仪(1310型Genetic Analyzer，Perkin Elmer有限公司)，通过引物步移法测定最长cDNA克隆第13号(2.1kb)的全部碱基序列。结果，编码Lyophyllum shimeji抗微生物蛋白的全长cDNA由2106个碱基对组成，并含有1854bp的开放阅读框，该阅读框编码618个氨基酸(SEQ ID NO：1和2)。根据该氨基酸序列，估计分子量约为68487，经计算，等电点为6.12。在由纯化的蛋白质测定的氨基酸序列中，源自65kDa蛋白质的30个氨基酸相当于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基号76至105，源自70kDa蛋白质的34个氨基酸相当于SEQ ID NO：2中的氨基酸残基号211至244。这些事实表明：65kDa和70kDa蛋白质由单个基因编码。另外，据估计有7个位置是糖链结合位点(SEQ ID NO：2中的氨基酸残基号154，319，360，412，558，573和583)。

根据这些结果，可得出下列结论：克隆的cDNA源自编码Lyophyllumshimeji抗微生物蛋白的基因。在数据库(DDBJ)中搜索(BLAST)本发明源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白氨基酸序列的同源性。结果，完整的序列显示出与彩绒革盖菌吡喃糖氧化酶氨基酸序列45％的同源性。由于没有其它同源序列，推测该基因编码新的吡喃糖氧化酶-样蛋白质。

实施例4：在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白质

1)构建表达载体

实施例3-5)分离的cDNA克隆第13号携有位于终止密码子下游约0.06kb处的唯一一个EcoT22I限制性位点，和位于终止密码子上游约0.25kb处的唯一的BamHI限制性位点。BamHI也位于该cDNA的5’-端载体的多克隆位点内。首先，用限制性酶EcoT22I(Takara Shuzo有限公司)完全消化整合有该cDNA的质粒(载体：pBluescript)，然后，用BamHI(由Takara制备)部分消化。将如此形成的约2kb BamHI(载体上的BamHI)-EcoT22I片段整合至已被限制性酶BamHI和PstI双消化的大肠杆菌表达载体pQE30(Qiagen有限公司)(即pQEHSPOfull)。如此形成的构建体含有本发明编码Lyophyllum shimeji吡喃糖氧化酶-样蛋白质的全长cDNA的最长开放阅读框(ORF)(含有SEQ ID NO：1碱基序列8至1864位，其编码序列表中SEQ ID NO：2的全长氨基酸序列)，6个组氨酸残基作为标记物结合在所表达蛋白质的N’-末端。

2)在大肠杆菌中表达

使用大肠杆菌M15菌株作为宿主进行表达实验。根据厂商说明(Qiagen)保温菌株，并用IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)诱导蛋白质表达。在含有抗生素氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基中预保温菌株直至OD₆₀₀达到约0.5。随后，在相同培养基中，以不同温度和不同IPTG浓度保温确定的一段时间以诱导表达。根据厂商说明(Qiagen)提取可溶性蛋白质，根据Nishimura等(1996)的方法测定确定量的该蛋白质的吡喃糖氧化酶活性。表3简述了重组蛋白质的表达结果。

表3：在大肠杆菌中表达Lyophyllum shimeji吡喃糖氧化酶

                 诱导条件            吡喃糖氧化酶活性

构建体                                (mU/mL培养物)

              温度(℃)   IPTG(mM)   5小时后  21小时后pQEHSPOfull          37          2         0         0

                 25         0.5        2.5       1

                 16         0.1        15        34pQE30(对照)          25         0.5        0         0

                 16         0.1        0         0

尽管首先在平常条件(37℃，IPTG浓度2mM)下诱导，在可溶性级分中并未检测到吡喃糖氧化酶活性，但表达了大量不溶性的包含物。然后，在多个条件下诱导表达，测定可溶性级分中的吡喃糖氧化酶活性。结果，当诱导条件变得温和，即降低培养物温度和降低IPTG浓度时，吡喃糖氧化酶活性升高。这可能是由于当诱导条件变得温和时，可溶性重组蛋白质的含量有所增加的缘故。相反，从用作对照的pQE30(仅是载体)中未检测到活性。这些结果清楚地表明：克隆的cDNA一定编码活性吡喃糖氧化酶-样蛋白质。当于25℃，IPTG浓度为0.5mM进行诱导时，与诱导开始后5小时相比，21小时之后观察到活性的降低。这可能是因为表达的蛋白质被分解的缘故。

接着，尝试纯化表达的蛋白质。通过使用Ni-NTA Agarose(Qiagen有限公司)从可溶性蛋白质级分中纯化重组的吡喃糖氧化酶-样蛋白质，所述级分源自于16℃，IPTG浓度为0.1mM时诱导表达的细胞。根据厂商说明(Qiagen)吸附，洗涤和洗脱蛋白质。结果，仅在洗脱的级分中发现吡喃糖氧化酶活性。由此揭示出重组蛋白质的N’-末端在大肠杆菌中未被消化，组氨酸残基仍与N’-末端结合；通过Ni-NTA Agarose，利用组氨酸残基可容易地纯化重组蛋白质；克隆的全长cDNA的编码结构域编码此类活性蛋白质(即未除去相当于蛋白质N-末端侧的部分)。据估计，重组蛋白质的产量为几mg/l大肠杆菌培养物肉汤。

效果

预期含有蛋白质组分作为活性成分的制剂可用作潜在的抗细菌剂，所述蛋白质组分的特征在于具有本发明序列表中SEQ ID NO：2的序列，或从其全长序列中除去第1至75位所得的序列。另外，含有上述蛋白质组分作为活性成分的试剂可用于测定糖(如血糖)的水平。预期通过以下方法可以构建对疾病和害虫具有耐受性的植物，所述方法包括：将DNA序列整合至表达盒，所述DNA序列的特征在于序列表中SEQ ID NO：1之DNA序列中第8至1864位或第233至1864位的序列，所述表达盒含有能在植物细胞中起作用的，组成型，器官/时间-特异性或应力-诱导型或疾病/昆虫-诱导型启动子序列，和能在植物细胞中起作用的终止序列；将表达盒转移至植物细胞，得到再生的个体。另外，通过使用能在选定宿主中扩增，并能表达蛋白质的表达载体，将上述DNA序列转移至大肠杆菌，酵母，昆虫或某些动物细胞，即可大量得到蛋白质。

                序列表<110>JAPAN TOBACCO INC.and NORINSUISAN-SENTANGIJYUTU SANGYOUSHINKOUCENTOR<120>新蛋白质，其编码基因及它们的使用方法<130>PC/N(x)-61-17<160>12<210>1<211>2106<212>DNA<213>Lyophyllum shimeji<220><221>CDS<222>(8)...(1861)<400>1atcagcc atg tct ctc tca acc gag cag atg cta cgc gac tat cca cgg    49

    Met Ser Leu Ser Thr Glu Gln Met Leu Arg Asp Tyr Pro Arg

      1               5                  10tct atg caa atc aac gga cag att cct aag aac gca att cac gaa aca    97Ser Met Gln Ile Asn Gly Gln Ile Pro Lys Asn Ala Ile His Glu Thr15                  20                  25                  30tac gga aac gac gga gtt gat gta ttc att gca gga tct gga ccc att   145Tyr Gly Asn Asp Gly Val Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile

                 35              40                  45gga gcg acg tat gca aag ctc tgt gtt gaa gct ggt cta cgt gtt gtg   193Gly Ala Thr Tyr Ala Lys Leu Cys Val Glu Ala Gly Leu Arg Val Val

         50                  55                  60atg gtc gag atc gga gct gct gat agc ttc tac gct gtt aat gcc gaa   241Met Val Glu Ile Gly Ala Ala Asp Ser Phe Tyr Ala Val Asn Ala Glu

     65                  70                  75gaa gga act gca gtt ccc tac gtt cct ggc tac cac aag aag aat gaa   289Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His Lys Lys Asn Glu

 80                  85                  90atc gag ttc cag aaa gat att gac cgc ttc gtc aat gta atc aag gga   337Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val Asn Val Ile Lys Gly95                 100                 105                 110gcc tta caa caa gtc tct gtt cct gtc aga aac cag aac gtg cct aca   385Ala Leu Gln Gln Val Ser Val Pro Val Arg Asn Gln Asn Val Pro Thr

            115                 120                 125ctt gat ccc gga gcc tgg agc gcg ccc cct gga agt tca gcc ata tcg   433Leu Asp Pro Gly Ala Trp Ser Ala Pro Pro Gly Ser Ser Ala Ile Ser

        130                 135                 140aac ggt aaa aat cct cac cag cgg gaa ttc gag aac ttg tct gcg gag   481Asn Gly Lys Asn Pro His Gln Arg Glu Phe Glu Asn Leu Ser Ala Glu

    145                 150                 155gcc gta acg cgt gga gtc ggc ggc atg agt acc cac tgg acg tgc tcc   529Ala Val Thr Arg Gly Val Gly Gly Met Ser Thr His Trp Thr Cys Ser

160                 165                 170acg cca cgg att cat cca ccc atg gaa agt ctc ccg ggc atc ggc cgt   577Thr Pro Arg Ile His Pro Pro Met Glu Ser Leu Pro Gly Ile Gly Arg175                 180                 185                 190ccg aag ctc agt aac gac ccg gca gag gac gac aaa gag tgg aac gag   625Pro Lys Leu Ser Asn Asp Pro Ala Glu Asp Asp Lys Glu Trp Asn Glu

            195                 200                 205ctt tat tcc gag gcc gag cgt ctc atc ggg act tcc acc aag gaa ttc   673Leu Tyr Ser Glu Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe

        210                 215                 220gac gag tca att cgg cac acc ctt gtt ctg cgc tct ttg caa gac gcg   721Asp Glu Ser Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala

    225                 230                 235tac aag gat cgt caa cgt atc ttt cgc cct ctc ccg ttg gca tgc cac   769Tyr Lys Asp Arg Gln Arg Ile Phe Arg Pro Leu Pro Leu Ala Cys His

240                 245                 250cgg ttg aag aac gcg ccg gaa tac gtc gaa tgg cac tca gca gaa aat   817Arg Leu Lys Asn Ala Pro Glu Tyr Val Glu Trp His Ser Ala Glu Asn255                 260                 265                 270ctt ttc cac tct atc tac aac gat gac aag cag aag aag ctc ttt acc   865Leu Phe His Ser Ile Tyr Asn Asp Asp Lys Gln Lys Lys Leu Phe Thr

            275                 280                 285ctg ctg acg aac cat cgc tgc aca cga ctg gcg ctt acg ggc ggg tat   913Leu Leu Thr Asn His Arg Cys Thr Arg Leu Ala Leu Thr Gly Gly Tyr

        290                 295                 300gag aag aag att ggc gct gcc gag gtc agg aat cta ctg gcc acc agg   961Glu Lys Lys Ile Gly Ala Ala Glu Val Arg Asn Leu Leu Ala Thr Arg

    305                 310                 315aat cct agt tcg cag ctg gac agc tat atc atg gcg aag gta tat gta  1009Asn Pro Ser Ser Gln Leu Asp Ser Tyr Ile Met Ala Lys Val Tyr Val

320                 325                 330ctg gcg tcg gga gcg atc ggc aac cca cag att ctc tat aac tcg ggc  1057Leu Ala Ser Gly Ala Ile Gly Asn Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Ser Gly335                 340                 345                 350ttc tct ggg cta cag gtc acg cca cgc aat gac tcg ttg atc ccc aac  1105Phe Ser Gly Leu Gln Val Thr Pro Arg Asn Asp Ser Leu Ile Pro Asn

            355                 360                 365ctg ggg agg tac atc acg gag cag ccg atg gca ttt tgc cag ata gtc  1153Leu Gly Arg Tyr Ile Thr Glu Gln Pro Met Ala Phe Cys Gln Ile Val

        370                 375                 380ttg agg cag gaa ttc gtc gac agc gtg cgc gac gat cct tat gga ctg  1201Leu Arg Gln Glu Phe Val Asp Ser Val Arg Asp Asp Pro Tyr Gly Leu

    385                 390                 395cca tgg tgg aaa gaa gcc gtt gct caa cat att gcc aag aac ccg aca  1249Pro Trp Trp Lys Glu Ala Val Ala Gln His Ile Ala Lys Asn Pro Thr

400                 405                 410gat gca ctg ccc att ccg ttc cgc gat ccg gaa ccc cag gta aca acc  1297Asp Ala Leu Pro Ile Pro Phe Arg Asp Pro Glu Pro Gln Val Thr Thr415                 420                 425                 430cca ttt aca gaa gaa cac ccc tgg cac acg cag att cac cgc gat gct  1345Pro Phe Thr Glu Glu His Pro Trp His Thr Gln Ile His Arg Asp Ala

            435                 440                 445ttt tcg tac ggt gcc gtc ggt cct gag gtg gac tct cgt gtc atc gtc  1393Phe Ser Tyr Gly Ala Val Gly Pro Glu Val Asp Ser Arg Val Ile Val

        450                 455                 460gac ctg cgc tgg ttt ggc gca acc gac cct gaa gca aac aac ctt ttg  1441Asp Leu Arg Trp Phe Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ala Asn Asn Leu Leu

    465                 470                 475gtt ttc cag aac gat gtt caa gac ggg tac agt atg ccg cag ccg acg  1489Val Phe Gln Asn Asp Val Gln Asp Gly Tyr Ser Met Pro Gln Pro Thr

480                 485                 490ttc aga tat cga ccc agc act gcg tca aac gtg aga gca agg aaa atg  1537Phe Arg Tyr Arg Pro Ser Thr Ala Ser Asn Val Arg Ala Arg Lys Met495                 500                 505                 510atg gcc gat atg tgc gaa gtg gcg agc aac ttg gga ggt tat ttg ccc  1585Met Ala Asp Met Cys Glu Val Ala Ser Asn Leu Gly Gly Tyr Leu Pro

            515                 520                 525acg tcc ccc ccg cag ttt atg gat cca ggc ctt gca ctt cat ctt gcg  1633Thr Ser Pro Pro Gln Phe Met Asp Pro Gly Leu Ala Leu His Leu Ala

        530                 535                 540ggg act act cgc att ggc ttc gac aag gca act aca gtg gct gat aac  1681Gly Thr Thr Arg Ile Gly Phe Asp Lys Ala Thr Thr Val Ala Asp Asn

    545                 550                 555aac tcg ctg gtc tgg gac ttt gcc aat ctt tat gtt gca ggc aat ggc  1729Asn Ser Leu Val Trp Asp Phe Ala Asn Leu Tyr Val Ala Gly Asn Gly

560                 565                 570acc atc agg acg ggc ttc ggc gag aac ccg aca ctt acg tcg atg tgc  1777Thr Ile Arg Thr Gly Phe Gly Glu Asn Pro Thr Leu Thr Ser Met Cys575                 580                 585                 590cac gct atc aag agc gcg agg agc atc atc aat aca ctc aag ggt ggg  1825His Ala Ile Lys Ser Ala Arg Ser Ile Ile Asn Thr Leu Lys Gly Gly

            595                 600                 605act gac gga aaa aat aca ggc gag cat cgc aac ctt tga ggaaggagca ac  1876Thr Asp Gly Lys Asn Thr Gly Glu His Arg Asn Leu

        610                 615         618agcagtgtaa acaaacgcgt caagtggcta cttcaagttg aatgcattct ggtcccctac  1936catgttgatg tgtacgatag gcgttgaaag attttgtgta ttactgaacc tgtactttgt  1996ctgaatagtt atggcactat gattcatgtt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  2056aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa             2106<210>2<211>618<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>2Met Ser Leu Ser Thr Glu Gln Met Leu Arg Asp Tyr Pro Arg Ser1               5                  10                  15Met Gln Ile Asn Gly Gln Ile Pro Lys Asn Ala Ile His Glu Thr

             20                  25                  30Tyr Gly Asn Asp Gly Val Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro

             35                  40                  45Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Lys Leu Cys Val Glu Ala Gly Leu Arg

             50                  55                  60Val Val Met Val Glu Ile Gly Ala Ala Asp Ser Phe Tyr Ala Val

             65                  70                  75Asn Ala Glu Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His

             80                  85                  90Lys Lys Asn Glu Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val

             95                 100                 105Asn Val Ile Lys Gly Ala Leu Gln Gln Val Ser Val Pro Val Arg

            110                 115                 120Asn Gln Asn Val Pro Thr Leu Asp Pro Gly Ala Trp Ser Ala Pro

            125                 130                 135Pro Gly Ser Ser Ala Ile Ser Asn Gly Lys Asn Pro His Gln Arg

            140                 145                 150Glu Phe Glu Asn Leu Ser Ala Glu Ala Val Thr Arg Gly Val Gly

            155                 160                 165Gly Met Ser Thr His Trp Thr Cys Ser Thr Pro Arg Ile His Pro

            170                 175                 180Pro Met Glu Ser Leu Pro Gly Ile Gly Arg Pro Lys Leu Ser Asn

            185                 190                 195Asp Pro Ala Glu Asp Asp Lys Glu Trp Asn Glu Leu Tyr Ser Glu

            200                 205                 210Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe Asp Glu Ser

            215                 220                 225Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Tyr Lys

            230                 235                 240Asp Arg Gln Arg Ile Phe Arg Pro Leu Pro Leu Ala Cys His Arg

            245                 250                 255Leu Lys Asn Ala Pro Glu Tyr Val Glu Trp His Ser Ala Glu Asn

            260                 265                 270Leu Phe His Ser Ile Tyr Asn Asp Asp Lys Gln Lys Lys Leu Phe

            275                 280                 285Thr Leu Leu Thr Asn His Arg Cys Thr Arg Leu Ala Leu Thr Gly

            290                 295                 300Gly Tyr Glu Lys Lys Ile Gly Ala Ala Glu Val Arg Asn Leu Leu

            305                 310                 315Ala Thr Arg Asn Pro Ser Ser Gln Leu Asp Ser Tyr Ile Met Ala

            320                 325                 330Lys Val Tyr Val Leu Ala Ser Gly Ala Ile Gly Asn Pro Gln Ile

            335                 340                 345Leu Tyr Asn Ser Gly Phe Ser Gly Leu Gln Val Thr Pro Arg Asn

            350                 355                 360Asp Ser Leu Ile Pro Asn Leu Gly Arg Tyr Ile Thr Glu Gln Pro

            365                 370                 375Met Ala Phe Cys Gln Ile Val Leu Arg Gln Glu Phe Val Asp Ser

            380                 385                 390Val Arg Asp Asp Pro Tyr Gly Leu Pro Trp Trp Lys Glu Ala Val

            395                 400                 405Ala Gln His Ile Ala Lys Asn Pro Thr Asp Ala Leu Pro Ile Pro

            410                 415                 420Phe Arg Asp Pro Glu Pro Gln Val Thr Thr Pro Phe Thr Glu Glu

            425                 430                 435His Pro Trp His Thr Gln Ile His Arg Asp Ala Phe Ser Tyr Gly

            440                 445                 450Ala Val Gly Pro Glu Val Asp Ser Arg Val Ile Val Asp Leu Arg

            455                 460                 465Trp Phe Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ala Asn Asn Leu Leu Val Phe

            470                 475                 480Gln Asn Asp Val Gln Asp Gly Tyr Ser Met Pro Gln Pro Thr Phe

            485                 490                 495Arg Tyr Arg Pro Ser Thr Ala Ser Asn Val Arg Ala Arg Lys Met

            500                 505                 510Met Ala Asp Met Cys Glu Val Ala Ser Asn Leu Gly Gly Tyr Leu

            515                 520                 525Pro Thr Ser Pro Pro Gln Phe Met Asp Pro Gly Leu Ala Leu His

            530                 535                 540Leu Ala Gly Thr Thr Arg lle Gly Phe Asp Lys Ala Thr Thr Val

            545                 550                 555Ala Asp Asn Asn Ser Leu Val Trp Asp Phe Ala Asn Leu Tyr Val

            560                 565                 570Ala Gly Asn Gly Thr Ile Arg Thr Gly Phe Gly Glu Asn Pro Thr

            575                 580                 585Leu Thr Ser Met Cys His Ala Ile Lys Ser Ala Arg Ser Ile Ile

            590                 595                 600Ash Thr Leu Lys Gly Gly Thr Asp Gly Lys Asn Thr Gly Glu His

            605                 610                 615Arg Asn Leu

    618<210>3<211>30<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>3Asn Ala Glu Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val Pro Gly Tyr His1               5                  10                  15Lys Lys Asn Glu Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val

             20                  25                  30<210>4<211>24<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>4Glu Phe Asp Glu Ser Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu1               5                  10                  15Gln Asp Ala Tyr Lys Asp Arg Gln Arg

             20              24<210>5<211>29<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>5Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe Asp Glu Ser  1               5                  10                    15Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Tyr

             20                  25              29<210>6<211>34<212>PRT<213>Lyophyllum shimeji<400>6Ala Glu Arg Leu Ile Gly Thr Ser Thr Lys Glu Phe Asp Glu Ser1               5                  10                  15Ile Arg His Thr Leu Val Leu Arg Ser Leu Gln Asp Ala Tyr Lys

             20                  25                  30Asp Arg Gln Arg

         34<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><222>9，12，15 and 18<223>i表示肌苷<400>7gargarggia cigcigticc     20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8garttycara argayathga ymg    23<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><222>6，12和21<223>i表示肌苷<400>9ttygtiaayg tiathtgygg igc    23<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><222>3和9<223>i表示肌苷<400>10tgickdatis wytcrtcraa ytc    23<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><222>3和15<223>i表示肌苷<400>11tgickrtcyt trtaigcrtc ytg    23<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><222>3，12和18<223>i表示肌苷<400>12ggigcraada tickytgick rtc    23

Claims (27)

1.抗微生物蛋白，可通过硫酸铵沉淀法沉淀Lyophyllum shimeji获得含水提取物级分来获得该蛋白质，其中所述蛋白质具有至少抗茄属丝核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性，并在SDS-PAGE法中，显示出分子量约为70kDa和/或约为65kDa的组分的存在。

2.根据权利要求1的抗微生物蛋白，其中N-末端具有序列表中SEQ IDNO：3的N-末端氨基酸序列：Asn Ala Glu Glu Gly Thr Ala Val Pro Tyr Val ProGly Tyr His Lys Lys Asn Glu Ile Glu Phe Gln Lys Asp Ile Asp Arg Phe Val。

3.抗微生物蛋白，其具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列，对SEQID NO：2进行一个或多个氨基酸突变所得的氨基酸序列，或与所述序列具有50％或更高同源性，并且显示出抗茄属丝核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性的氨基酸序列。

4.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有60％或更高的同源性。

5.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有70％或更高的同源性。

6.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有80％或更高的同源性。

7.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有90％或更高的同源性。

8.根据权利要求3的抗微生物蛋白，其具有的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有95％或更高的同源性。

9.抗微生物蛋白，其含有选自下列的单个多肽：具有序列表中SEQ IDNO：2的氨基酸序列中的氨基酸残基76至618的部分氨基酸序列的多肽；具有对SEQ ID NO：2进行一个或多个氨基酸突变所得的氨基酸序列的多肽；或具有与SEQ ID NO：2有50％或更高同源性的氨基酸序列，并且显示出抗茄属丝核菌或Pyricularia oryzae的抗微生物活性的多肽；或这些多肽的组合。

10.产生根据权利要求1，3或9的抗微生物蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：

回收通过硫酸铵沉淀法，用75％-饱和硫酸铵沉淀的Lyophyllum shimeji含水提取物级分；和

对所述级分进行离子交换层析并回收用0.05M至1M的NaCl洗脱的级分。

11.编码根据权利要求1，3或9的抗微生物蛋白的基因。

12.根据权利要求11的基因，其具有序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列，通过在此碱基序列中取代，缺失，插入和/或添加一个或多个碱基而得到的碱基序列，或能在严谨条件下与上述碱基序列杂交的碱基序列。

13.根据权利要求11的基因，它与序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列具有50％或更高的同源性。

14.根据权利要求11的基因，它与序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列具有60％或更高的同源性。

15.根据权利要求11的基因，它与序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列具有70％或更高的同源性。

16.根据权利要求11的基因，它与序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列具有80％或更高的同源性。

17.根据权利要求11的基因，它与序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列具有90％或更高的同源性。

18.根据权利要求11的基因，它与序列表中SEQ ID NO：1的碱基序列具有95％或更高的同源性。

19.通过以下方法产生的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用于得到编码源自Lyophyllum shimeji的抗微生物蛋白的基因，所述方法包括：

从序列表中的SEQ ID NO：1，即编码抗微生物蛋白之基因的碱基序列中选择满足以下需求的两个结构域：

1)每个结构域由15至30个碱基组成；和

2)每个结构域具有40至60％的G+C；

制备单链DNA，该DNA具有与所述结构域的碱基序列相同或互补的碱基序列，或者制备单链DNA混合物，该DNA混合物具有的遗传密码简并性可以确保所述单链DNA所编码的氨基酸残基不会改变；并任选对所述单链DNA进行修饰，而避免损害与编码所述抗微生物蛋白之基因的碱基序列结合的特异性。

20.根据权利要求19的寡核苷酸，其具有序列表中SEQ ID NO：7至12任一个的核苷酸序列。

21.分离根据权利要求11的基因的方法，其中所述方法包括：使用Lyophyllum shimeji子实体cDNA文库为模板，一对根据权利要求19的两个寡核苷酸为引物进行核酸扩增反应，籍此扩增编码根据权利要求1的抗微生物蛋白的基因的一部分，并使用如此获得的扩增产物为探针筛选cDNA文库，从而分离全长cDNA克隆。

22.含有根据权利要求11的基因的重组载体。

23.根据权利要求22的重组载体，其中所述载体是表达载体。

24.通过将根据权利要求22的重组载体导入宿主生物而得到的转化体。

25.产生根据权利要求1，3或9的抗微生物蛋白的方法，所述方法包括在促进所述抗微生物蛋白表达的条件下培养根据权利要求24的转化体。

26.通过根据权利要求25的方法得到的重组抗微生物蛋白。

27.抗微生物剂，其含有根据权利要求1的抗微生物蛋白作为活性成分。

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