CN1252839A - 氧化应激抗性基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物,尤其是转基因植物,植物部分及植物细胞,它们过量表达铁结合蛋白(如铁蛋白),及针对广泛非生物性及生物性氧化应激环境(如针对百草枯或萎蔫酸的处理以及针对病毒、细菌和真菌感染)有增强的抗性。本发明也包括编码苜蓿铁蛋白或其功能性变异体的核酸序列,以及用所说的序列使得植物对氧化应激条件产生抗性。本发明有益于减少因广泛的应激条件而导致的对作物的环境损害。

Description

氧化应激抗性基因

本发明涉及植物，尤其是转基因植物，植物部分及植物细胞，它们过量表达铁结合蛋白(如铁蛋白)，及针对广泛的非生物及生物性氧化应激环境(如针对百草枯和萎蔫酸的处理以及针对病毒、细菌和真菌感染)有增强的抗性。本发明也包括编码苜蓿铁蛋白或其功能性变异体的核苷酸序列，以及用所说的序列使得植物对氧化应激条件产生抗性。

本发明有益于减少因广泛的应激条件而导致的对作物的环境损害。

至于本说明书和权利要求，我们将依据给定的定义应用下述技术术语。至于本发明的解释，应理解成下述定义的术语在应用当中是符合给定定义的，即使所说的定义与所说的技术术语的通常解释吻合得不完全一致。

蛋白的“功能性变异体”是这样一个多肽：其氨基酸序列可通过替换、缺失和/或添加一个到多个氨基酸残基而从原来蛋白的氨基酸序列衍生得到，(衍生方式要保证)尽管氨基酸序列有变化，但其功能性变异体至少保存原来蛋白的生物学活性当中的至少一种活性的一部分，该种活性对该领域的技术人员来说可以测定。功能性变异体与从之衍生而来的蛋白通常至少有50％的同源性(即其氨基酸序列50％是一致的)，有利的情况下至少有70％的同源性，更有利的情况下至少有90％的同源性。某蛋白的任一功能部分或其变异体亦称为功能性变异体。

术语“过量表达：此处用其最可能的广义。一种特殊类型的分子(通常指一多肽或一RNA)当被说成在一个细胞内“过量表达”，指的是该分子表达的水平大大超过高出天然水平(例如超过20％)且可检测到。细胞内一种分子的过量表达可通过传统的突变和筛选技术以及遗传操作方法完成。术语“异位表达”此处是指一种过量表达的特殊实现形式，包含这样一种意思，例如：一个异位表达的蛋白在植物的一个空间位点表达但自然状况下此处它根本上不表达(或检测不到)，此即，所说的蛋白在所说的位点上过量表达。

植物，植物部分，一个植物组织或一个植物细胞当它可以忍受重大的可检测到的(例如，至少20％)更强的破坏效应，例如用某一类型的破坏性药剂基剂量或强度更强，而较之于天然的对应部分并不受到任何可检测到的损害。便称为就拥有了针对一个损伤效应，例如破坏性药剂的“增强抗性”。

在本发明描述的框架之内，“铁蛋白”定义成该领域中通常的意义，指一个能结合铁离子的蛋白(Theil E.C.，1987，生化年鉴(Ann.Rev.Biochem.)56：289-315)。真核生物铁蛋白家族的成员在氨基酸序列和三维结构两方面均高度保守(Lobreaux，S.等，1992，生化杂志(Biochem.J.)288：931-939)。

术语“氧化应激”用的也是其非常广泛的意义，包括所有类型的非生物性(例如用不同的化学试剂处理或暴露于极端的天气环境如高温、低温或干燥条件下)和生物性(不同的感染试剂感染)应激条件，在其损伤效应的表现当中，氧化产生的活性自由基起到了一个可检测到重要作用。

在它们的不同发育时期，植物均被暴露于广泛的生物性和非生物性应激条件下。因此，发展广泛的应激抗性力增强的良种畜是具有很高经济意义的重要任务。

在应激条件下例如光照强度高，UV-B辐射，重金属污染，高温或低温，缺水，涝害，损伤，病毒、细菌、真菌感染，昆虫之类伤害，氧气毒性可以明显对作物产生损害。活性氧如单线态氧、超氧自由基(O₂ ^-)，羟自由基(OH⁺)和过氧化氢(H₂O₂)对应激植物的受伤起到了关键性作用。一个好的证据是由超氧自由基(O₂ ^-)和过氧化氢造成的生物学损伤依赖于铁的存在。细胞内的自由铁库可通过Haber-Wiess或Fenton反应与H₂O₂或O₂ ^-反应从而产生活性羟自由基(Halliwell和Gutteridge，1984，Biochem.J.219：1-14)。在细胞内大部分非代谢的铁都被滞留在铁蛋白中；因此铁蛋白可以限制铁的可获得，也就可以限制活性羟自由基的产生。编码铁蛋白的cDNA已从多种植物中分离出来。这些蛋白质在氨基酸序列和三维结构方面均高度保守(Lobreoux S.等，1992，生化杂志(Biochem.J.)288：931-939)。铁蛋白位于叶绿体内且铁可激活它们的合成(Seckbach，J.1982，植物营养杂志(J.Plant.Nutr.)5：369-394；Lobreaux等1992，植物分子生物学(Plant Mol Biol)19：563-575)。在正常的生长条件下，铁蛋白仅只在胚胎内合成而不在营养器官如根和叶中合成(Lobreaux和Briat：生化杂志(Biochem.J.)1991，274：601-606)。

在那些铁蛋白的合成和降解脱离了正常的代谢调控的系统中，可望出现铁蛋白分子显著的抗氧化剂效应。在氧化应激条件下已显示，铁蛋白分子发生降解，其释放的铁离子极大地提高了有害基团的生产速率(Cairo等1995，生化化学杂志(Journal of BiochemicalCemistry)270：700-703)。

专业内部人士知道大量的传统的植物育种方法和遗传操作技术以提高特定作物对预定的应激条件(例如针对寒冷、干旱、紫外光或病原)的抗性。然而，这些已知的方法此处不去一一详述，因它们和本发明中方法相去甚远。这些以前发明的方法的一个共同特征是，它们提高的是不同植物针对一种单一的预设的应激条件(或针对来源相同的有限的一组应激条件)的抗性，例如通过表达一个特定的抗性基因。然而本领域还没有一种特定的方法可以为植物提供针对广泛的包括非生物和生物应激条件的抗性。

如此，本发明的目的是提供一个新的、普遍适用的方法，以提供作物，尤其是转基因作物，它们针对广泛的包括非生物和生物应激条件的增强的抗性。

根据另一方面，这也是本发明的一个目的：即提供作物和育种材料，优选为转基因的植物，它们针对广泛的包括非生物和生物应激条件的增强抗性。

基于其以前的内容，发明人逐渐明了一个重要的新的遗传操作方法将被开发出来，以完成上述目标，或许能揭示不同的非生物和生物应激条件损伤机制中的一个共同步骤。

因此，本发明的方法建立在新的理论概念上，即在植物不同的器官中过量表达或异位表达的铁蛋白或其他铁结合蛋白，例如转铁蛋白，将会降低细胞内的铁浓度，因此亦将减少氧诱导自由基团的损伤效应。此处有必要强调的是，本发明的方法绝对是新的，由于本领域中没有公开过某种方法可以赋予植物针对广泛的非生物的和生物的应激条件以抗性。而且，迄今为止也未公开某种方法其中铁蛋白在植物中因任何理由以任何方式过量表达。

因此，为了达到本发明的上述目标，我们从苜蓿(Medicago sativaL.)克隆了铁蛋白cDNA基因，在烟草的营养组织中进行了过量表达。

经发现，和本发明的基本概念相一致，在营养组织中异位表达苜蓿铁蛋白的转基因烟草较之原来的烟草植株对非生物性(用不同的化学试剂处理)和生物法(病毒，细菌和真菌感染)应激条件的抗性大大提高且转化子显示总体适应能力和再生特征也有改进。

还要强调的是，与本发明的基本概念相一致，有可能过量表达的铁蛋白分子是通过结合植物细胞内的自由铁离子而表达它们的综合防护效应，可以设想，通过过量表达其他铁结合蛋白，例如转铁蛋白，可产生类似的保护效应。

因此，本发明提供植物细胞，其过量表达铁结合蛋白，并对氧化应激有增强的抗性。本发明的植物通过此处介绍的遗传操作方法更利于产生，但也可以通过传统的突变和筛选技术生产。本发明的转化子植株较之于它们未经修饰的铁结合蛋白表达水平未提高的对照部分，显示了大大提高的针对氧化应激条件的抗性。

依据本发明的植物细胞最好是转基因细胞，其通过导入核酸而转化，导入核酸可用例如载体的形式，该核酸编码一个铁结合蛋白，最好是铁蛋白的表达。

依据本发明的优选实施方案，本发明提供植物细胞过量表达一种铁蛋白，它有如附属序列表中SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，或该蛋白功能性变异体，上述功能性变异体与所说的铁蛋白多肽至少达50％的同源性，更为有利地，至少70％的同源性为更有利，至少90％的同源性为最有利。

本发明还提供包括根据本发明细胞的植物，最好是转基因植物，及其部分。

依据本发明的优选实施方案，用10μM百草枯处理本发明的植物叶子70小时之后其光合反应的强度并未下降。

依据本发明的植物、植物部分或植物细胞针对萎蔫酸的处理和/或病毒和/或细菌和/或真菌起源的感染优选拥有增强的抗性。

本发明还提供分离的、富集的、无细胞和/或重组的核酸序列，包括或由下述核苷酸序列组成，该核苷酸序列编码有序列表中的SEQID No：2序列的苜蓿铁蛋白，或其功能性变异体。优选的核酸与SEQID No：1(图1的DNA序列)至少有90％的同源性，更优选的情况至少有95％的同源性且最优选的情况至少有98％的同源性。优选的情况下这些核酸是cDNA，重组载体或其他重组构建体。

本发明也包括应用这些核酸制备与本发明植物细胞，植物部分和植物。

下述的发明内容和实施例显示在植物的营养组织中合成铁结合蛋白铁蛋白提供了针对百草枯产生的自由基的抗性。与本观察结果相一致我们也证实用广谱的不相关的病原体感染本发明的转基因植物所诱发的症状有显著的减少。本发明基于铁结合蛋白异位表达的新技术，因此就潜在着很高的农业价值，它可能减少作物由于生物性或非生物性应激条件引起的普遍氧化损害。

虽则不想受任何理论解释的限制，我们认为上述发现支持这样的假设：由于铁结合蛋白(铁蛋白)的过量生产，本发明植物中的铁离子就可以更有效地结合，因此，氧诱导自由基引起的损伤减少了且本发明植物的总体适应能力和再生性质有了提高。依据本发明的植物将也能够显示针对目前尚未检测的其他应激条件的抗性，例如，针对极度的低温或高温和干燥，其中包含有类似的铁介导的退化作用。

虽然上述内容对专业人员来说已十分明了，我们还想在此强调依据本发明的方法的普遍适用性。我们已经证实在植物营养组织中异位表达苜蓿来源的铁结合蛋白可使转基因烟草植株增强针对广谱的应激条件的抗性。由于本发明的开拓性技术是基于绝对普通的概念即减小植物靶组织的铁离子浓度，本领域的技术人员将会理解本发明的优点不能被限制在已显示的特定的实施方案中，而是相反确保植物总体的应激抗性的此种新方法可以应用于其他任何有农业或园艺价值的作物实例中。

另经证实的是，用两种不同类型的启动子(一种是植物的，一种是病毒的)胚胎特异性苜蓿铁蛋白在烟草植株的营养组织中异位过量表达，对靶组织没有任何损害。于是可以设想，任何类型的植物特异性启动子(组成型的或空间的和/或发育调节型的)可用于本发明中以在期望的植物部分或组织中过量表达铁结合蛋白。

由于有害基因的浓度通常在光合绿色组织中最高，这些组织是本发明的方法第一有用的靶标。然而应该理解，由于以上已论证的基本概念的高度普适性，故本发明根本不能局限于赋予绿色组织的应激抗性，它对设想暴露于任何氧化应激条件(例如被任何病原体感染)的所有其他感兴趣的植物部分(例如，根、茎、花、果实或前述的特异部分)赋予抗性都有作用。图图1

从苜蓿(Medicago sativa)分离的铁蛋白cDNA的核苷酸序列及其推测的氨基酸序列。下划线的部分对应于转运肽。图2

不同物种铁蛋白氨基酸序列的对比。

    HuHfer： 人H亚基(Boyd等1985，生物化学杂志(J.Biol.

             Chem.)260：11755)

    HoLfer： 马脾L链(Heuterspreute和Chrichton 1981，

             FEBS Lett.129：322)

    Peafer： 豌豆种子铁蛋白(Lobreoux S.等1992，生化杂

             志(J.Biochem.)288：931)

    Msfer 1：苜蓿铁蛋白(未发表)图3

本发明中转基因烟草植株营养组织中铁蛋白mRNA的积累。图4

本发明中转基因烟草叶细胞抽提物SDS-PAGE后检测铁蛋白。图5

本发明中转基因烟草叶细胞植物用FLAG抗体经Western印迹分析检测铁蛋白。图6

SR1对照和本发明中C3转化植株用10μM百草枯处理后叶盘荧光强度(Fv/Fm)的变化。图7

SR1对照与本发明中不同的转化植株经10和20μM百草枯处理后叶盘荧光强度(Fv/Fm)的变化。图8

对照SR1和本发明的转化植物经3天10和20μM百草枯处理后叶片中叶绿素含量。

本发明的一些优选实施方案及其概念将以下述实验性实施例的方式做进一步的阐释。然而，应该可以理解，下述实施例仅仅是为了更好地理解本发明的精神，完全不是本发明范围的解释或限制，其范围是在后续的权利要求中定义的。

在下述实施例中，我们论证了本发明在变为现实的过程中，有无数优点。我们分离了一段编码一个新的苜蓿铁蛋白多肽全长cDNA克隆(MsFER1)并用此cDNA在不同的启动子转录控制下于转基因烟草的营养组织中表达铁蛋白。在对表达铁蛋白的转基因烟草进行生化特性鉴定以后，我们证实它们当中的大部分对来源相差很大的不同的非生物性(用损害性化学试剂处理)及生物性(用病毒、细菌和真菌病原感染)应激条件有显著增强的抗性。实施例1鉴定全长苜蓿铁蛋白cDNA(MsFER)克隆并测定其核苷酸及推测的氨基酸序列

为了构建一个cDNA文库和分离编码铁蛋白的cDNA克隆，重组DNA技术的一般方法的应用参照Sambrook J.，Fritsch，F.F.和Maniatis T.所著“分子克隆，实验室手册”(第2版，纽约冷泉港1989)中所述。

很明确地，苜蓿铁蛋白cDNA克隆是以如下方式分离出来。

细胞总RNA由体外培养的主要由体细胞胚构成的苜蓿组织中提取。样品中也存在少量的愈伤组织(Cathala等，1983，DNA，2：329-335)。体细胞胚的形成是用植物生长素(2，4-二氯苯氧基乙酸)如Dudits等所述的方法休克诱导产生的(1991，细胞科学(J.CellScience，)99：473-482)。

然后用oligo-dT纤维素层析的方法从细胞总RNA中分离物中纯化mRNA(Aviv H.和Leder P.1972，美国自然科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)69：1408-1412)。

首条链cDNA在oligo dT引物存在的情况下用AMV逆转录酶合成。第二条链则由DNA聚合酶I合成。用RNase H处理之后，在用末端转移酶添加上dC和dG同源连接物(homolinker)以后，cDNA与用PstI消化的pGEM2载体退火。产物转化进大肠杆菌MC 1061株中，用100μg/L氨苄青霉素筛选。用25μg cDNA产生出2.5×10⁵个初级转化子。96％的克隆包含有显著大小的cDNA插入子。其过程的详细描述见De Loose等(1988，基因(Gene)70：13-23)。

然后用随机测序预筛cDNA克隆的方法鉴定出50个EST。用Pharmacia T7测序试剂盒或USB测序2.0试剂盒按其操作说明书进行测序。以体细胞胚制备的RNA探针与cDNA克隆Northern杂交进行预筛选。强杂交克隆被筛选出来。

基于GenBank和EMBL数据库的序列对比显示一个cDNA克隆(被称为MsFER1)与已知的铁蛋白在推导出的氨基酸序列上高度同源，图1所示既有MsFER1克隆的核苷酸(SEQ ID NO：1)又有其氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。包含在此克隆中的cDNA插入子有1036bp长，发现其编码区在40和789之间。编码的蛋白由251个氨基酸组成，它与不同来源的铁蛋白有高度的氨基酸序列一致性。如图2所示，植物铁蛋白与人H及马L铁蛋白有39％～49％的氨基酸一致性，而豌豆和苜蓿铁蛋白的成熟蛋白彼此十分相似(89％的氨基酸同源性)。然而，这两种植物铁蛋白，在叶绿体引导序列的相应区域差异很大。此处的氨基酸序列仅有47％的一致性。因此，刚刚描述的苜蓿铁蛋白可看成铁蛋白家族一个新的变种。实施例2将苜蓿铁蛋白cDNA导入烟草植株以在营养组织中异位表达此蛋白

所用的转化技术基于Hinchee等综述的土壤杆菌基因转运系统，见“植物细胞和组织培养”p.231-270，I.K.Vasil T.A Thorpe，KluwerAcademic Publisher 1994。在本实施例中我们用此系统和Pellegrineschi等描述的载体(1995，生物化学协会通讯(Transitions)23：247-250)。

将MsFER1 cDNA克隆到转化载体的BamHI/KpnI位点，于此它功能性地连接到核酮糖1，5-磷酸羧化酶小亚基基因的启动子上。此启动子最初由Mauer和Chui所描述(1985，核酸研究(Nucleic AcidRes.)7：2373-2387)，对植物绿色组织中的表达特别有用。称为A2，C3和C8的转化烟草植株在所得的转基因克隆，携有此结构。作为选择，也将MsFER1 cDNA连接到Benfey等描述的病毒启动子CaMV35S(1989，The EMBO J.8：2195-2202)上。为了此克隆全长的构建体，我们用下述PCR引物，其在Per Septives自动DNA合成仪中合成。

CC G AAT TCC ATG GCT CTT TCA GCT TCC (SEQ ID NO：3)

  Eco RI位点    铁蛋白转运肽的克隆位点

我们也生产了一种截短的MsFER1 cDNA版本，它缺少靶向引导序列的一个重要部分(见图1)。在此克隆程序中我们用了下述引物：

CG G AAT TCC ATG GAT GGT GAT AAG AGG(SEQ ID NO：4)

  Eco RI位点    转运肽内部的克隆位点

上述寡核苷酸和T7测序引物(Boehringer Mannheim)被用以对指定的DNA片段进行PCR扩增(Mullis和Faloona 1987，酶学方法(Meth.Enzymol.)155：335)。

将经EcoRI/KpnI消化的PCR产物(KpnI限制位点来自T7引物序列)克隆进pFLAG-ATS载体(Scientific Imaging System Kodak，USA)。后者经同样的限制酶消化过。这些构建物中FLAG序列的存在使得其蛋白合成可用抗FLAG M2抗体进行免疫学追踪(Scientific Imaging System Kodak，USA)。

为了产生全长FLAG FERR和部分(pt)FLAG FERR构建体，我们合成了以下Bam-Flag寡核苷酸：C GG ATC CAT GGA CFA CAA GGA CGA GGA(SEQ ID NO：5)

BamHI位点 MET       FLAG编码序列

用此引物和pFLAG载体的C24测序引物，制备PCR产物并在BamHI/KpnI位点克隆进转化载体。

如此构建的二元载体(binary vectors)被转进土壤杆菌株中。然后烟草叶盘与此土壤杆菌细胞共培养，转化子在如Claes等所述的含卡那霉素的培养基中进行筛选(1991.植物杂志1：15-26)。一级转化子经自花传粉，T2植物经进一步特征鉴定。实施例3转基因烟草中铁蛋白异位合成的分子证据

Northern印迹杂交被首先用来显示所述导入构建物的功能活性。Northern杂交的操作是依据广泛应用的方案(Sambrook J.Fritsch F.F.和Maniatis T.：“分子克隆，操作手册”2版，冷泉港纽约，1989)。第一，是从转化子营养组织中分离总RNA样品(见Cathala等1983，DNA 2：329-335)。在甲醛溶液中经琼脂糖凝胶电泳之后，RNA被转移到Hybond-N滤膜上(Amersham，Inc.)。放射标记探针是经随机引物³²P-标记而产生的(Freinberg A.P.和Vogelstein B.1983生化年鉴(Anal.Biochem.)137：266-267)。经4-12小时甲醛存在下的预杂交后，再在42℃杂交16-24小时。洗涤条件如下：65-72小时，0.1×SSC，0.1％SDS。如图3所示，在转化植物中有大量铁蛋白mRNA的积累。

部分纯化后铁蛋白的合成就用Laulhere和Laulhere所述的生化方法(1989，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：3629-3635)进行分析。经SDS-PAGE后，对照SR1植物和转化子(C3，A2，C3)的蛋白图差异显著。后者积累了不同数量分子量的26kDa的铁蛋白(图4)。用FLAG检测系统也可以用化学发光(Super Sigfnal^RM-CL-HRP系统，Pierce)在多个转基因烟草植株中(图5)显示铁蛋白的合成。既有的分子数据令人信服地显示了对照植物中铁蛋白的缺乏和转化子营养组织中该蛋白的积累。实施例4铁蛋白的异位合成为转基因植物提供了氧化应激抗性

为了检验本发明的基本概念，我们分析了对照和转化烟草对百草枯(Pq)的抗性。很好地证实了光合电子传递过程产生的电子减少Pq并且自由基形成(Ashton F.M.和Crafts A.S.1981，除草剂作用的模式，Wiley，纽约)。对照和转化植物的叶盘被暴露至10或20μMPq。

功能性损伤用Vass I.等描述的PAM荧光探测仪(1996，生物化学，35：8964-8973)测定该光激发荧光而监测。作为一个例子，图6显示对照SR1叶片在10μM Pq处理60小时后光合功能的丧失，而C3转化子在分析过程中保留住了其光合活性。其他两个转化子(Full9，Pt2)经Pq处理后可观察到类似反应，其中铁蛋白基因是在CaMV35S启动子控制下表达的。这些实验经过数次重复(也参见图7)并且功能特性鉴定令人信服地证实了转化子中的百草枯抗性。这种抗性也可以在监测到叶绿素含量变化的过程中看到(图8)。

用Pq作为自由基的诱导物，此结果支持这样的结论：在其营养组织中合成铁蛋白的转化植物对自由基引起的损伤表达了增强了的忍受性。此处我们必须提及被分析的转化植物在温室条件下的生长过程中缺乏任何可见的变化。转化子的光合作用与对照SR1植物相似。在对照条件下这些植物显示了正常的叶绿素含量(图8)。实施例5过量生产铁蛋白的转化植物对萎蔫酸的处理有增强的抗性

病原发生中自由基功能已被K.E.Hammond-Kosack和J.D.G.Jones提出来(1996，植物细胞8：1773-1791)。因此，我们检测了在绿色组织中表达苜蓿铁蛋白基因转化子的症状形成。首先，我们分析了作为非特异性真菌毒素的萎蔫酸的效应。萎蔫酸以不同浓度注射到对照SR1和转基因(A2，C3和C8)烟草叶片中。注射两天后我们分析叶组织的坏死程度。表1总结了三个试验的结果。

                        表1

表达铁蛋白的转化植物在萎蔫酸处理后减少坏死的情况

	2.5×10-3M		1.25×10-3M		2.5×10-3M
							SR1	XXX	(100％)	XX(X)	(73％)	XXX	(100％)
A2	X	(28％)	-(X)	(16.5％)	X(X)	(50％)
							C3	X	(65％)	-(X)	(16.5％)	X(X)	(50％)
C8	X	(70％)	X(X)	(50％)	XX	(73.5％)

-无坏死；XXX＝严重坏死(或注射叶区域坏死的百分比)

本资料显示转化植物叶片的坏死有相当多的减少。这些结果也证明了对真菌感染引起损伤的增强抗性。实施例6过量生产铁蛋白的转化植物对假单胞菌感染有增强的抗性

基于同样的概念，我们将丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)细菌悬液注射进烟草叶片中。20小时以后，分析其坏死程度(HR)。表2总结了两个转基因株系(A2，C8)中坏死减少的结果。

                    表2

              细菌注射后坏死程度

	实验A	实验B
			SR1	100％	100％全坏死
A2	20％	30％
			C3	100％	100％
C8	30％	35％

上述数据显示最少有两个转化子(A2和C8)对细菌感染引起的损伤有大大增强的抗性。实施例7过量产生铁蛋白的转化植物对葡萄孢属和链格孢属真菌感染有增强的抗性

我们检测了依据实施例2的转基因株系对两种真菌瘤原诸如互格链格孢(Alternaria alternata)和灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)的反应。分离叶片并用真菌培养中的琼脂块(5mm直径)接种。表3总结了经处理的对照和转化植物坏死叶面积的大小。

                        表3

               真菌性病原对转化植物的效应

烟草	互格链格孢		灰色葡萄孢
					mm2	％	mm2	％
	SR1	723.4±224.0	100.0	516.9±118.4					100.0
A2					204.1±50.2	28.2	278.3±101.6	53.8
	C3	286.5±59.6	39.6	56.9±6.7					11.0
C8					198.2±85.2	27.4	290.5±89.5	56.2
	PT1	543.2±163.2	75.1	497.7±117.7					96.3
PT2					407.0±123.6	56.3	334.8±80.4	64.8
	PT5	520.1±140.1	71.9	257.5±56.5					49.8
Full4					268.9±14.5	37.2	317.1±62.8	61.3
	Full5	435.0±55.3	60.1	476.1±96.1					92.1
Full9					113.4±63.0	15.7	278.3±101.6	53.8

从以上资料，可以推出转化的烟草植物—包括全长的或截短的铁蛋白基因—在其叶中表达铁蛋白者与对照植物相比显示症状大为下降(虽然程度不同)。实施例8过量产生铁蛋白的转化植物对烟草坏死病毒(TNV)感染有增强的抗性

在用病毒感染植物的过程中氧的产生在病原发生中起到了一个重要作用。因此我们检测了转化和对照(SR1)植物在对抗烟草坏死病毒(TNV)感染中的反应(表4)。

                  表4

    转化烟草在TNV感染后损伤数目和大小的减少

      实验1

      SR1(对照)              17.4±2.5(全部损伤，cm²)

      C3(转化子)             6.4±1.4

      C8(转化子)             6.5±1.2

      A2(转化子)             6.1±1.7

      实验2                  50.0±10.0(损伤数目)

      SR1(对照)              35.8±21.7

      Pt1(转化子)            25.8±7.3

      Pt2(转化子)            12.5±8.4

      Pt5(转化子)            18.7±12.3

      Pt9(转化子)            38.3±8.6

      Full4(转化子)          45.0±19.1

      Full5(转化子)          32.0±16.8

      Full6(转化子)          46.2±6.1

      Full9(转化子)          21.7±13.7

如表4所示，在携有RUBISO小亚基启动子控制下的苜蓿铁蛋白基因的转化烟草株系，其损伤数目可见有重大下降(C3，C8和A2)。可能有功能性意义的是，在CaMV35S启动子的控制下表达铁蛋白基因的转化株系中，两个表达截短铁蛋白基因的株系在症状上显示了最显著的下降。

                          序列表(1)总的信息：(i)申请人：

   (A)名称：英国技术集团国际有限公司

   (B)街道：弗利特街道10号

   (C)城市：伦敦

   (E)国家：联合王国(大不列颠)

   (F)邮编(ZIP)：EC4M 7SB

   (A)名称：MARIA DEAK

   (B)街道：VAG U 3/B

   (C)城市：SZEGED

   (E)国家：匈牙利

   (F)邮编(ZIP)：6724

   (A)名称：DENES DUDITS

   (B)街道：BERKERT U 36

   (C)城市：SZEGED

   (E)国家：匈牙利

   (F)邮编(ZIP)：6726

   (A)名称：KAROLYNE TOROK

   (B)街道：TAPE OSTROM U 64

   (C)城市：SZEGED

   (E)国家：匈牙利

   (F)邮编(ZIP)：6753

   (A)名称：LASZLO SASS

   (B)街道：PIHENO UT 18/A

   (C)城市：SZEGED

   (E)国家：匈牙利

   (F)邮编(ZIP)：6728

 (A)名称：BALAZS BARNA

 (B)街道：STOLLAR BELA U 16

 (C)城市：BUDAPEST

 (E)国家：匈牙利

 (F)邮编(ZIP)：1055

 (A)名称：ZOLTAN KIRALY

 (B)街道：HANKOCZY JENO U 17

 (C)城市：BUDAPEST

 (E)国家：匈牙利

 (F)邮编(ZIP)：1022(ii) 发明题目：应激和病原抗性植物(iii)序列数目：5(iv) 计算机可读形式：

 (A)媒介类型：软盘

 (B)计算机：IBM个人兼容机

 (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

 (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi) 在先申请资料：

 (A)申请号：HU 9700762

 (B)申请日期：1997-4-16(vi) 在先申请资料：

 (A)申请号：HU 9700762

 (B)申请日期：1997-9-22(vi) 在先申请资料：

 (A)申请号：HU 9700762

 (B)申请日期：1998-3-9(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

   (A)长度：1036碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：双链

   (D)拓扑学：线性(ii) 分子类型：cDNA(iii)假论：无(iv) 反义：无(vi) 最初来源：

   (A)生物：首蓿

   (B)株：L(ix) 特征：

   (A)名称/关键词：转运肽

   (B)位置：40…201(ix) 特征：

   (A)名称/关键词：CDS

   (B)位置：40…789(xi) 序列描述：SEQ ID N0：1：CTCAATTTTC TCAACGACCC TTTTTGTTAT TCTTCTTTA ATG GCT CTT TCA GCT    54

                                       Met Ala Leu Ser Ala

                                         1               5TCC AAA GTT TCG ATC TTT TCA CCA TCA CCT ATC GTG GGT CAT TTC TCA  102Ser Lys Val Ser Ile Phe Ser Pro Ser Pro Ile Val Gly His Phe Ser

             10                  15                  20AAA AAC ACC ACT TTT TCT TCT TTG AAT CTT CCT ATG GAT GGT GAT AAG  150Lys Asn Thr Thr Phe Ser Ser Leu Asn Leu Pro Met Asp Gly Asp Lys

         25                  30                  35AGG AAG AAC GTG AAG GTT CAT GCT GCT GCT GCA AAT GCA CCA ACG GCA  198Arg Lys Asn Val Lys Val His Ala Ala Ala Ala Asn Ala Pro Thr Ala

     40                  45                  50TTA ACA GGT GTT ATC TTT GAA CCG TTT GAA GAA GTC AAG AAA GAT GTT     246Leu Thr Gly Val Ile Phe Glu Pro Phe Glu Glu Val Lys Lys Asp Val

 55                  60                  65CTT GCT GTT CCT ATT GCT CAT AAT GTT TCC TTG GCT CGT CAG AAT TAT     294Leu Ala Val Pro Ile Ala His Asn Val Ser Leu Ala Arg Gln Asn Tyr70                  75                  80                  85CAA GAT GAA GTT GAA TCT GCT ATC AAT GAA CAG ATT AAT GTG GAA TAC     342Gln Asp Glu Val Glu Ser Ala Ile Asn Glu Gln Ile Asn Val Glu Tyr

             90                  95                 100AAT GTT TCC TAT GTG TAC CAC TCT TTG TTT GCA TAC TTT GAC AGA GAC     390Asn Val Ser Tyr Val Tyr His Ser Leu Phe Ala Tyr Phe Asp Arg Asp

        105                 110                 115AAC GTT GCT CTC AAG GGA CTT GCC AAG TTC TTT AAG GAA TCT AGT GAG     438Asn Val Ala Leu Lys Gly Leu Ala Lys Phe Phe Lys Glu Ser Ser Glu

    120                 125                 130GAA GAA AGA GAG CAT GCT GAG AAG CTC ATG AAA TAC CAG AAT ATT CGT     486Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Tyr Gln Asn Ile Arg

135                 140                 145GGT GGA AGA GTG GTG CTG CAC CCT ATT GTG AGC CCT CCC TCG GAA TTT     534Gly Gly Arg Val Val Leu His Pro Ile Val Ser Pro Pro Ser Glu Phe150                 155                 160                 165GAT CAT GCA GAA AAG GGA GAT GCA TTA TAT GCC ATG GAA TTG GCT CTG     582Asp His Ala Glu Lys Gly Asp Ala Leu Tyr Ala Met Glu Leu Ala Leu

            170                 175                 180TCT TTG GAG AAG TTA GTA AAT GAG AAA CTT CTG AAT GTT CAC AGT GTG     630Ser Leu Glu Lys Leu Val Asn Glu Lys Leu Leu Asn Val His Ser Val

        185                 190                 195GCT GAT CGT AAC AAT GAT CCT CAA TTG GCA AAT TTC ATC GAG AGC GAG     678Ala Asp Arg Asn Asn Asp Pro Gln Leu Ala Asn Phe Ile Glu Ser Glu

    200                 205                 210TTT TTG GTA GAG CAG GTT GAA TCA ATT AAG AAG ATA TCA GAG TAT GTG     726Phe Leu Val Glu Gln Val Glu Ser Ile Lys Lys Ile Ser Glu Tyr Val

215                 220                 225ACT CAA CTG AGA TTA GTT GGA AAG GGT CAC GGT GTG TGG CAC TTT GAT     774Thr Gln Leu Arg Leu Val Gly Lys Gly His Gly Val Trp His Phe Asp230                 235                 240                 245CAG ACT CTT CTC CAT TGATTAATAT GATGTTTGAT CTTGAAGAAG CTACGTGTTG     829Gln Thr Leu Leu His

            250TTTTTACATT ACTGGAATAG TGAATAAATG AAATGTATTC TCCTAGGTAA TTTTAGAACG  889TAGAAGCTGT GTGTAATATT TTAGTTGCTT AGTAAGAATT ATGTGTAGAA GACTTGGAGC  949CATAATAACT GTTTGTAGCT TGCAGAAATT ATTTTGTTAG AAATGAAAAT GAGCTTGGCT 1009ATTACTACTA AAAAAAAAAA AAAAAAA                                     1036(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

   (A)长度：250氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ala Leu Ser Ala Ser Lys Val Ser Ile Phe Ser Pro Ser Pro Ile

 1               5                  10                  15Val Gly His Phe Ser Lys Asn Thr Thr Phe Ser Ser Leu Asn Leu Pro

            20                  25                  30Met Asp Gly Asp Lys Arg Lys Asn Val Lys Val His Ala Ala Ala Ala

        35                  40                  45Asn Ala Pro Thr Ala Leu Thr Gly Val Ile Phe Glu Pro Phe Glu Glu

    50                  55                  60Val Lys Lys Asp Val Leu Ala Val Pro Ile Ala His Asn Val Ser Leu

65                  70                  75                  80Ala Arg Gln Asn Tyr Gln Asp Glu Val Glu Ser Ala Ile Asn Glu Gln

                85                  90                  95Ile Asn Val Glu Tyr Asn Val Ser Tyr Val Tyr His Ser Leu Phe Ala

           100                 105                 110Tyr Phe Asp Arg Asp Asn Val Ala Leu Lys Gly Leu Ala Lys Phe Phe

       115                 120                 125Lys Glu Ser Ser Glu Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys

   130                 135                 140Tyr Gln Asn Ile Arg Gly Gly Arg Val Val Leu His Pro Ile Val Ser145                 150                 155                 160Pro Pro Ser Glu Phe Asp His Ala Glu Lys Gly Asp Ala Leu Tyr Ala

               165                 170                 175Met Glu Leu Ala Leu Ser Leu Glu Lys Leu Val Asn Glu Lys Leu Leu

        180                 185                 190Asn Val His Ser Val Ala Asp Arg Asn Asn Asp Pro Gln Leu Ala Asn

    195                 200                 205Phe Ile Glu Ser Glu Phe Leu Val Glu Gln Val Glu Ser Ile Lys Lys

210                 215                 220Ile Ser Glu Tyr Val Thr Gln Leu Arg Leu Val Gly Lys Gly His Gly225                 230                 235                 240Val Trp His Phe Asp Gln Thr Leu Leu His

            245                 250(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

    (A)长度：27碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑学：线性(ii) 分子类型：其他核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”(iii)假论：无(iv) 反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CCGAATTCCA TGGCTCTTTC AGCTTCC                                               27(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：

    (A)长度：27碱基对

    (B)类型：核酸

    (C) 链型：单

    (D) 拓扑学：线性(ii) 分子类型：其他核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”(iii)假论：无(iv) 反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GGGAATTCCA TGGATGGTGA TAAGAGG                                           27(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：

    (A)长度：27碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单

    (D)拓扑学：线性(ii) 分子类型：其他核酸

    (A)描述：/desc＝“合成寡核苷酸”(iii)假论：无(iv) 反义：无(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CGGATCCATG GACTACAAGG ACGAGGA

                                                            27

Claims (19)

1.一种植物细胞，其特征在于它过量产生铁结合蛋白。

2.权利要求1的植物细胞，其特征在于与野生型植物相比对氧化应激有增强的抗性。

3.权利要求1或2的植物细胞，其特征在于其铁结合蛋白是铁蛋白。

4.权利要求1到3中任一项的植物细胞，其通过导入的编码表达铁结合蛋白的核酸而被转化。

5.权利要求1到4中任一项的植物细胞，其通过导入编码铁蛋白表达的核酸而被转化。

6.权利要求1到5中任一项的植物细胞，其特征在于其铁结合蛋白是具有SEQ ID No 2的氨基酸序列的铁蛋白，或是其功能性变异体。

7.权利要求1到6中任一项的植物细胞，其特征在于其铁结合蛋白与具有SEQ ID No 2的氨基酸序列的铁蛋白的至少有50％的序列同源性。

8.权利要求1到7中任一项的植物细胞，其特征在于其铁结合蛋白与具有SEQ ID No 2氨基酸序列的铁蛋白至少有90％的序列同源性。

9.植物或植物的一部分，包含权利要求1到8中任一项的细胞。

10.权利要求9的植物或植物的一部分，其特征在于它是转基因的。

11.权利要求9或10的植物或其一部分，其叶片的光合反应强度在用10μM百草枯处理70小时之后下降不超过10％。

12.权利要求11的植物，其特征在于其光合反应强度在处理之后并不下降。

13.权利要求8到12中任一项的植物和植物部分，其特征在于它对萎蔫酸处理和/或病毒和/或细菌和/或真菌来源的感染有增强的抗性。

14.权利要求8到13任一项的植物，其特征在于其铁结合蛋白在营养组织中异位表达。

15.编码具有SEQ ID No 1序列的苜蓿铁蛋白或其功能性变异体的核苷酸序列在制备权利要求1到7任一项的植物细胞或制备权利要求8到14任一项的植物或植物部分中的应用。

16.分离的，富集的，无细胞的和/或重组核酸，包括SEQ ID No1的序列或与其具有至少90％的同源性或与这些序列互补的序列。

17.权利要求16的核酸，与之至少有95％的同源性或与之互补的序列。

18.权利要求16或17的核酸，形式是DNA。

19.权利要求16到18任一项的核酸，其不包括来自苜蓿的铁蛋白引导序列。

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