CN1208464C - 与水稻肌动蛋白第一内含子相联的玉米h3c4启动子、含有它的嵌合基因及转化植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使异源性基因在单子叶植物的植物细胞中得以表达的5’端调节元件及其用途，所述5’端调节元件的特征在于，在转录方向上包含的第一DNA序列即SEQ ID NO∶1所示的玉米H3C4启动子序列；第二DNA序列即SEQ ID NO∶2所示的水稻肌动蛋白第一内含子序列。本发明还涉及包含所述DNA序列的嵌合基因及由所述基因转化的植物细胞。

Description

与水稻肌动蛋白第一内含子相联的玉米H3C4启动子、 含有它的嵌合基因及转化植物

技术领域

本发明涉及一种新的5’端调节序列，它可使与所述调节序列异源的编码感兴趣蛋白质的序列在单子叶植物中表达。本发明还涉及一种嵌合基因，该嵌合基因包含所述调节序列、编码感兴趣蛋白的异源序列，3’端调节序列，它可使单子叶植物细胞表达这一感兴趣蛋白质。本发明还涉及含有所述嵌合基因的转化单子叶植物，以及转化植物和植物细胞所必需的方法。

背景技术

在文献中，已描述过可使感兴趣蛋白质编码序列在植物中表达的多种不同启动子，而且已能开发出商品化的基因工程修饰植物。启动子序列所在基因可在植物中天然表达，特别是细菌、病毒或植物来源的启动子，如核酮糖-双磷酸羧化酶/氧化酶小亚基基因启动子(US.4962028)或植物病毒基因(如白菜花花叶病病毒基因)的启动子(US.5352605)。在植物中可表达异源基因的启动子在下列专利或专利申请中有具体描述：US 5086169，EP0353908，US5139954，US5378619，US5563328，US5589583，US5633363，US5633439，US5633440，US5633447，US5635618，US5639948，US5639952。

但这些启动子中的某些，更具体说是植物来源的启动子在单子叶植物中不能发挥功能。

如我们已知的Arabidopsis sp组蛋白启动子(专利申请EP0507698)在双子叶植物如烟草、油菜、大豆中可特别有效地表达异源基因，但在单子叶植物如玉米中不能发挥其功能。

水稻肌动蛋白启动子是已知的可在单子叶植物中表达异源基因的启动子(US5641876)，需鉴定出异源序列在单子叶植物中表达所需的新的功能性5’调节序列仍是一个有待解决的问题。

发明内容

本发明涉及一种新的DNA序列，它是可使单子叶植物细胞表达异源基因的一段5’端调节元件。按转录方向，所述DNA序列包括第一个DNA序列即玉米H3C4启动子序列的功能片段，第二DNA序列即水稻肌动蛋白第一内含子序列的功能片段，。

玉米H3C4启动子序列由Brignon(plant.Mol.Biol.，22：1007-1015，1993)具体描述过，它是H3C4启动子的AulI片段，约1kb，对应于玉米H3C4组蛋白编码序列内相对于ATG的-7到-1029碱基。

水稻肌动蛋白第一内含子序列在专利US5,641,876中有具体叙述。

根据本发明，功能性片段，指任意衍生自玉米H3C4启动子序列或水稻肌动蛋白第一内含子序列的DNA序列，它们能再现其源序列的功能。

根据本发明的一个实施例，玉米H3C4启动子序列的功能性片段包含SEQ.IO，NO：1所描述的DNA序列或该其同源序列。较好的是，所述玉米H3C4启动子序列的功能片段由SEQ.IO，NO：1所描述的DNA序列构成。

根据本发明的一个实施例，水稻肌动蛋白第一内含子功能性片段含有SEQ.ID.NO：2所描述的DNA序列或其同源序列，较好的是，所述水稻肌动蛋白第一内含子功能片段由SEQ.ID.NO：2所描述的DNA序列构成。

本发明实施方式之一是，一种使异源性基因在单子叶植物的植物细胞中得以表达的5’端调节元件，其特征在于，在转录方向上包含的第一DNA序列即SEQ IDNO：1所示的玉米H3C4启动子序列；第二DNA序列即SEQ ID NO：2所示的水稻肌动蛋白第一内含子序列。

本发明的DNA序列，即5’端调节元件在第一和第二DNA序列之间还可包含某些中性DNA片段，它们通常是构建本发明序列所必需的。这些DNA片段可包含多达30个碱基对，较好的是20个碱基对。根据本发明，这些中性DNA片段指基本上不修饰本发明序列中的第一和第二DNA序列的DNA片段。

根据本发明的一个较佳实施例，本发明的DNA序列包括SEQ.ID.NO：3所表示的DNA序列或其同源序列。更好的是，本发明的序列是由SEQ.ID.NO：3所表示的DNA序列构成。

本发明的“同源”指与SEQ.ID.NO：1、2或3号描述的参比DNA序列相比，存在一处或几处序列修饰，且能再现上述序列功能的DNA序列。这些改变可按常用的突变技术得到，或者通过选择能用于所述序列制备的合成寡核苷酸而得到。有益的是，与参比序列相比，同源程度至少达到70％。宜至少80％；较好的是至少达90％。

本发明涉及一种嵌合基因(或表达盒)，它包括包括编码序列以及能在单子叶植物细胞或单子叶植物中发挥功能的位于3’端或5’端的异源性调节元件，其特征在于，所述5’端的调节元件如前文所述。

本发明的“植物细胞”指衍生自单子叶植物、能构成未分化组织(如胼胝体)；分化组织(如胚胎)；单子叶植物诸部分；单子叶植株或种子的任何细胞。

本发明的“单子叶植物”指种籽中只有一片子叶的开花植物，如小麦、大麦、燕麦、水稻、玉米、高梁、甘蔗等。

根据本发明，还可能与本发明调节性启动序列结合使用被置于编码序列和启动子之间的其它调控序列，如编码转运肽(单份或双份)的序列。此时，可被一中间序列分开，即，在转录方向上，包含一段植物质体定域酶基因的转运肽的编码序列，这是植物质体定域酶基因成熟N末端序列的一部分，接着是第二段植物质体定域酶基因的转运肽的编码序列，就如在EP0508909申请中所描述。至于转运肽，包括Cornelissen等描述的烟草PR-1a基因的信号肽。

作为调节终止序列或聚腺苷酸化序列，可利用细菌来源的任何相应序列，如根癌土壤杆菌的NOS终止子，或来源于植物的，如EP0633317申请中描述的组蛋白终止子。

本发明嵌合基因中的编码序列可包括任何希望在单子叶植物细胞或植物中表达的感兴趣蛋白质的编码序列。

这可以是编码可选择标记的基因，例如，赋予被转化单子叶植物新农学特性的基因，或改良被转化单子叶植物农学品质的基因。

在编码可选择标记的基因中，可提及的有抗生素抗性基因；耐除草剂(双丙氨酰膦、草甘膦或异噁唑类)基因；编码易鉴别酶如GUS酶的基因；编码色素或在转化细胞中调节色素产生的酶的基因。这些可选择标记基因在专利申请WO91/02071和WO95/06128中有具体描述。

在赋予被转化单子叶植物新农业特性的基因中，包括抗除草剂基因，抗杀虫剂基因、抗病基因等。这些基因在专利申请WO91/02071和WO95/06128中有具体描述。

作为调节终止子和聚腺苷酸化序列，可采用任何细菌来源的相应序列，如根癌土壤杆菌的NOS终止子，或植物来源的如组蛋白终止子。如申请EP0633317中所述。

本发明特别适合表达使被转化单子叶植物细胞和植物抗特定除草剂的基因。抗除草剂基因中，包括抗双丙氨酰膦的Bar基因，编码抗除EPSPS除草剂(如草甘膦及其盐类)的EPSPS的基因(US5094945，US4940835，US5188642，US4971908，US5145783；US5310667，US312910，US5627061，US5633435，FR2736926)，编码草甘膦氧化还原酶(US5463175)的基因，或编码抗除HPPD除草剂(如异噁唑类特别是isoxafutole(FR9506800，FR9513570)，二酮腈(EP496630，EP496631)或三酮，特别是sulcotrione(EP625505，EP625508，US5506195)等除草剂)的HPPD的基因。这些编码抗除HPPD除草剂的HPPD的基因在专利申请WO96/38567中和公布的专利申请FR9714264，(1997.11.7提交)中有描述，其内容纳入本文作参考。

在编码抗除EPSPS除草剂的EPSPS的基因中，特别应提及的有编码植物尤其是玉米EPSPS的基因，它在102和106存在两处突变，在FR2736926专利申请中有所描述，以下称双突变EPSPS，或自土壤杆菌中分离的编码EPSPS的基因，专利US5633435的ID2和ID3序列对其作了描述，以下称CP4。

在编码抗除HPPD除草剂的HPPD的基因中，特别应提及的有WO96/38567专利申请中描述的假单胞菌和Arabidopsis的HPPD。

就编码EPSPS或HPPD基因而言，更具体地说就上述基因而言，编码这些酶的序列前面最好有一段编码转运肽的序列，特别是专利US5510471或US5663448中所述的所谓优选转运肽，其内容纳入本文作参考。

根据本发明的一个优选实施例，本发明还提供如下嵌合基因，其在转录方向上，包括上述本发明的5’端调节序列，它功能性地连结一个编码融合蛋白即转运肽/感兴趣蛋白的序列，后者功能性地连接3’端调节序列；嵌合基因内的各元件如前所述，感兴趣蛋白宜为抗除草剂的酶，更佳的是上述HPPD或EPSPS型的酶。

编码转运肽/EPSPS融合蛋白的序列，特别是OTP/双突变EPSPS的序列在专利US4940835，US5633448和FR2736926中有具体描述。

对OTP/CP4融合蛋白，本领域专业人员知道如何采用专利US5633435中提到的CP4编码序列，按照专利4940835，US5633488和FR2736926或下面实施例中所述操作方法来构建相应的基因。本发明还涉及一嵌合基因，它在转录方向上，包括可保证异源基因在植物细胞中表达的5’端调节序列，它功能性地连接一个编码OTP/CP4融合蛋白的序列，后者又功能性地连接3’调节序列。该5’端调节元件不仅包括上述本发明的5’端调节元件，还包括可使异源性基因在双子叶或单子叶植物(特别是前面提到的那些植物)的植物细胞中表达的各种适宜的调节元件，这些是本领域专业已知或将知的。

编码转运肽/HPPD融合蛋白的序列在专利申请WO96/38567中有所描述。

本发明还涉及用于转化单子叶植物的克隆或表达载体，至少含有一种上述嵌合基因的转化植物细胞和植物。本发明的载体除含有上述嵌合基因外，至少还含有一个复制起始点。该载体可由通过引入本发明嵌合基因而被转化的质粒、粘粒、噬菌体或病毒组成，转化单子叶植物和植物细胞的这些载体是本领域专业人员所熟知的，文献中也有大量描述。本发明转化植物或植物细胞的载体优选质粒。

本发明又一主题是通过整合至少一个上述核酸片段或嵌合基因来转化植物细胞的方法，用本发明的载体通过任何适宜的已知方法可以得到这种转化。

所述方法包括用附着有DNA序列的颗粒轰击细胞或细胞组织。另一种方法是采用插入到根癌土壤杆菌的Ti质粒中或发根土壤杆菌的Ru质粒中的嵌合基因转移到植物中。其它方法包括显微注射、电穿孔，PEG直接沉淀法等。

本领域专业人可根据植物或植物细胞性质选择合适的方法。

本发明又一主题是被转化植物细胞或植物，它们含有至少一种上述本发明的嵌合基因。

本发明还包括含有转化细胞的植株，特别是由转化细胞再生而成的植株。可依据植物种类和性质采用合适方法可以得到这种再生。

对单子叶植物再生和植物细胞转化的方法，可具体参考Gordon-Kamm，W.J.等(玉米细胞转化和能育转基因植物再生，The Plant Cell，第2卷，603-618，1990年7月)，以及以下专利和专利申请：US5177010，US5187073，EP267159，EP604622，EP672752，US4945050，US5036006，US5100792，US5371014，US5478744，US5484956，US5508468，US5538877，US5554798，US5489520，US5510318，US204253，US5405765，EP442,174，EP486233，EP486234，EP539563，EP674725，WO91/02071和WO95/06128。

本发明还涉及由上述转化植物和转化植物的种子培养和/或杂交而得的转化植物。

当本发明的嵌合基因含有编码耐特殊除草剂的酶的序列时，本发明还涉及在所述嵌合基因所转化植物或种子种植所在区域控制杂草的方法，该方法是向所述区域施用对所述杂草有毒的除草剂，但基本不影响用所述本发明嵌合基因转化的植物或种子，所述嵌合基因中含有编码耐这种除草剂酶的序列。

本发明还涉及用本发明嵌合基因转化的植物的培养方法，该嵌合基因含有编码耐特定除草剂的酶的序列。培养方法是在适合种植所述植物的田中播种所述转化植物的种子，在这块田中，当有野草存在时，施用对野草由毒的所述特定除草剂，当达到要求的成熟度时收获所培养的植物，并任选地，从收获的植物中分离出种子。

在上述两种方法中，可在播种前，种植物出苗前和出苗后施用本发明所述特定除草剂。

较好的是，耐除草剂的酶为一种合适的EPSPS，此时除草剂是草甘膦或其盐；或酶为HPPD，除草剂则选自异噁唑类，特别是异噁氟草，二酮腈或三酮，特别是磺草酮。

附图说明

图1：pRPA-RD-195的限制性酶切图；

图2：pRPA-RD-1002的图解，其中标注了限制性酶切位点；

图3：pRPA-RD-109的图解，其中标注了限制性酶切位点。

具体实施方式

下列实施例阐明本发明而不限制本发明范围。

1.构建带有HPPD编码序列的嵌合基因

制备下列质粒以构建一个表达盒，它包括与水稻肌动蛋白基因第一内(ActI)含子5’端非翻译区组合的玉米H3C4组蛋白启动子，ActI的描述见Mc Elroy D等、植物分子生物学15：257-268.1990，它指导了荧光假单胞菌OTP-HPPD基因的表达。

pRPA-RD-195

质粒pRPA-RD-195由质粒pUC-19衍生而来，含一个修饰多克隆位点。以下互补寡核苷酸1和2在65℃杂交5分钟，随后经30分钟缓慢冷却至30℃：

Oligo 4：5’AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTACCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3’

Oligo 5：5’CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGCAGGTCGACTC TAGGG3’

用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段在制造商推荐的标准条件下延伸各寡核苷酸3’端，使杂交的寡核苷酸成为双链。将得到的双链寡核苷酸连结到预先用限制性内切酶EcoR1和HindIII消化的pUC-19质粒中，用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段使其成为钝端。如此得到一个克隆质粒，它包含一个多克隆位点，故有助于引入表达盒到根癌土壤杆菌的质粒载体中(图1)。

pRPA-RD-2010

在质粒pRPA-RD-195中插入pRPA-RD-173的“启动子H4A748-OTP-双突变EPSPS基因”。

质粒pRPA-RD-195用限制性内切酶SacI消化，用牛小肠碱性磷酸酶(New EnglandBiolabs)去磷酸化。质粒pRPA-RD-173(在专利FR2736926中有描述)用限制必酶SacI消化，并纯化含有EPSPS基因的DNA片段，连接到以上制备的质粒pRPA-RD-195中，得到的克隆含有几个独特的限制性酶位点，位于该双突变的EPSPS基因的两侧。

pRPA-RD-1002

构建一个OTP-HPPD表达盒用于单子叶植物。质粒pRP-P含有连接荧光假单胞菌HPPD’优化转运肽(OTP)，其后为胭脂氨酸合成酶的聚腺苷酸化位点，如WO96/38567专利申请中所述。质粒pRP-P的组成如下：

-优化转运肽(OTP)，见专利US5510471和US5633448中所述；该OTP由171bp的Helianthus annuus的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶小亚基转运肽构成(Waksman G等1987核酸研究15：7181)，后面是66bp的Zea masy的酮糖-1，5-二磷酸羧化酶成熟部分/氧化酶小亚基(Lebran等1987核酸研究15：4360)，其后是150bp的Zea mays核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶/小亚基转运肽，故以上组合总共是387bp。

-编码荧光假单胞菌HPFD的区域，参见专利申请WO96/38567，和

-胭脂氨酸合成酶(nos)终止子基因(分离自pTi 37的nos基因的聚腺苷酸化区，250bp，Bevan M等，核酸研究11.369-385)。

质粒pRP-P用限制性酶BstEll消化，再用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段处理成钝端，再用限制性酶NcoI消化。纯化得到含有约1.5kb的OTP-HPPD编码序列的DNA片段。前面得到的质粒pRPA-RD-2010用限制性酶BlpI消化，随后用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段处理，以得到钝端片段，再用限制性酶NcoI消化。纯化所得DNA片段，它包含质粒载体的序列，即与5’非翻译区和水稻肌动蛋白基因第一内含子组合的启动子H3C4，并纯化NOS聚腺苷酸化位点。将两个纯化片段连结以产生OTP-HPPD表达盒，它包含了玉米H3C4组蛋白启动子，与5’端外翻译区和水稻肌动蛋白基因第一内含子组合(Actl 5’UTR+内含子1)，控制结合了NOS聚腺苷酸化位点的OTP-HPPD编码区的表达。

2.构建带有编码双突变体EPSPS序列的嵌合基因。

pRPA-RD-1010

构建OTP-双突变EPSPS表达盒用于单子叶植物。

质粒pRPA-RD-109含有大肠杆菌β-葡糖苷酸酶(GUS)基因，该基因受与McElroy D描述(植物分子生物学(5：257-268.1990)的水稻肌动蛋白基因第一内含子和5’端非翻译区相组合的玉米H3C4组蛋白启动子的控制。该质粒模式图见图3。用限制性酶NcoI和EcoRI消化质粒pRPA-RD-109，纯化得到含有该载体序列、GUS基因，NOS聚腺苷酸化位点的大DNA片段(约5kb)。用限制性酶NcoI和EcoRI消化质粒pRPA-RD-2010，纯化得到含有与5’端非编码区和水稻肌动蛋白基因第一内含子相组合的H3C4启动子的DNA片段(约1.6kb)。连结此二个纯化DNA片段，产生OTP-双突变EPSPS表达盒，它包括与5’端非翻译区和水稻肌动蛋白基因第一内含子(ActI)组合的玉米H3C4组蛋白启动子(Brignon等)，控制结合了NOS聚腺苷酸化位点的OTP-双突变EPSP编码区的表达。

3.构建抗phosphinothricin基因(bar基因)的嵌合基因

由bar基因编码的phosphinothricin乙酰转移酶(PAT)是一种能灭活除草剂phosphinothricin(PPT)的酶。PPT抑制谷氨酰胺合成，引起细胞内氨的迅速堆积，导致细胞死亡(Tachibana等1986)。

用于引入耐受作为选择剂的phosphinothricin的质粒是通过将嵌合基因pDM 302插入从Promega公司购得的含有抗氨苄青霉素基因的2462pb载体pSP72(Genbank/DDBJ数据库登录号X65332)并而得到的。

质粒pDM 302，4700bp，由CaoJ等Plant Cell Report 11：586591.(1992)所描述。

该质粒各的组分是：

-McElroy D(Plant Molecular Biology 15：257-268 1990)描述的水稻肌动蛋白基因的启动子，840bp

-840bp的水稻肌动蛋白基因第一外显子

-450bp的水稻肌动蛋白第一内含子；

-White J等(Nus.Acids Res.18：1862(1990)描述的从质粒pIJ41404切下的600bp的bar基因编码区；

-胭脂氨酸合成酶(NOS)基因终止子，分离自质粒pTi 37的NOS基因的聚腺苷酸化区域，250pb。(Bwvan M等核酸研究11：369-385)

4.玉米细胞的转化

用颗粒轰击技术引入基因构建物。根据Klein方法(Nature 327：70-73，1987)在Qiagen柱上纯化质粒，然后共沉淀到钨M10颗粒上。

将金属颗粒，pRPA-RD-1002质粒和上述实施例3中的质粒混合，然后按照Gordon-Kamm W J等(玉米细胞的转化和多产转基因植物的再生。The Plant Cell第二卷603-618页1990年7月)描述的方案，经轰击进入玉米胚胎细胞。

5.基因和以bar基因作为选择剂

在草铵膦上选择轰击过的胼胝体，直到出现绿色的部分。抗草铵膦的阳性胼胝体然后转变为机体胚，然后根据Gordon-Kamm，WJ等所述的操作条件(The PlantCell第二卷603-618页1990年7月)，将其置于有利于发芽的条件下。然后将幼植株移进暖房以结籽。

6.分析转化植物的后代

上面所得转化植物可算作部分转基因植物，含有一个编码OTP/HPPD的异源基因，使植物获得耐异噁唑类(如异噁氟草)的特性。这些转化植物产生花粉，使非转基因野生玉米的胚珠受精。经异噁氟草处理后在沙土上选择所得的种子。

选择方案如下：

将800ml Fontainebleau沙置于15×20cm盘中，浇水，加入每升水含5ml的Quinoligo(Quinoline提供)的营养液，维持湿润度。每盘种20粒玉米种子，用异噁氟草喷洒处理，剂量为每公顷100g活性物质(每盘300μg)。然后收盘置于暧室中培养。栽培后测定植物毒性作用。按上述条件，非转化植物表现出100％植物毒性，而转化植物不表现植物毒性。

进行了一个比较性研究，采用20行本发明转化的玉米和20行用相应基因(其中编码水稻肌动蛋白第一内含子的序列被编码玉米adh I内含子的序列替代)转化的玉米。用很大剂量即每公顷200g活性物质(600μg活性物质/盘)异噁氟草处理后，得到如下结果：

本发明水稻肌动蛋白内含子：8/20行耐受

玉米adh I内含子：         3/20行耐受

与用本领域所知其它内含子与同一玉米H3C4启动子组合相比，以上结果表明在转化的单子叶植物中，本发明玉米H3C4启动子与水稻肌动蛋白第一内含子的组合可显著增加感兴趣蛋白质的表达。

                           序列表

  (iii)序列数：5

(2)I SEQ ID NO：1的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：1021碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (ix)特征：

    (A)名称/编码：玉米H3C4启动子

    (B)位置：1..1021

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

CTTATGTGCA CCATTTACTG TAATGCATAA TCATTTAATT GAATAGCAAA CTTTTCTATT     60

ACTTCTTTAC TAACATAATT CTTGGTTTTA AAATTCAGTC CTCAACATTC ATTGCTCAAG    120

TATAAGTTGA GACTGTCAAA ATTTACTATT TTATTTCTTC ATATTTTTTT TCCTTATACA    180

CATTTTGGGC CTTACAATCC ATCATCTATA TCCATCCTTT CCGGTGTCCT CTAAAAGATT    240

CCATCCTCTG AATCTTATTC CTCTCCAATA ACGTTCTCTA AATCAGGTCT CTATAAGCAA    300

TACCTATATT AGAGACATTT TTTATTTTTT GTACATACAT ATTTGTCATA CTCTCAAATG    360

CATTATACAT ATTTAGTTTT ACTAAACCGA TTATTTAAAG TATTCAAACG GATGAAGAAC    420

TGTTTAGATA AATTCTATAT ATAGAGAATC CAGTAGCGTT CTCTAAATTT AGATGATTAT    480

TTAGAGGACG CTGTTAGAAA ACGTAAAAAA TTCTTTGATT ATTTTATTTT AGGGTAGAGT    540

AGCCTTTATC CTTTATAGAT CTTTGGTGGA CCCAGCCTTA TACCGGTTAT TTTCGCGATT    600

GCGCCTCTCA TTTTCACTCC AGCGCCCCAC ATTTTCACGT TTTCACCGAA GCGCCCAGCC    660

TGCCTAACCA ACAAATTGGT ACGGTGGCGC GGTTTTCAAA AGAAGTCGGA AACCATCTGC    720

ACCCACCGAC TAGTAGGCCC TCGGATCCTC CCTGATTAAG TCCTAGCCAA TAGGAGCCCA    780

GAACCACCCA TCACGCGCAT CGTCCCTACG CTTCCACCTC ATCGGCGCCG TCCATCTCCA    840

TCCAACACCT ATTCCGTTAC CTTGCCCATC CTCCGAAAAA ATTCTCGGCT CGCGCTCCGC    900

ACCTACTACA AATACCCATC CCATGACGAC GCATCGCATC ACTGCCAAAT CCCCCAGAAA    960

ATCAACACCT CCCAATTCCA CGCTGCCACC AACTCGCCGT CCTCCGCGCC AAGCACCAAA    1020

G                                                                    1021

(2)SEQ ID NO：2的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：454碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (ix)特征：

    (A)名称/编码：水稻肌动蛋白内含子1

    (B)位置：1..454

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

GTAACCACCC CGCCCCTCTC CTCTTTCTTT CTCCGTTTTT TTTTTCGTCT CGGTCTCGAT     60

CTTTGGCCTT GGTAGTTTGG GTGGGCGAGA GCGGCTTCGT CGCCCAGATC GGTGCGCGGG    120

AGGGGCGGGA TCTCGCGGCT GGCGTCTCCG GGCGTGAGTC GGCCCGGATC CTCGCGGGGA    180

ATGGGGCTCT CGGATGTAGA TCTGATCCGC CGTTGTTGGG GGAGATGATG GGGCGTTTAA    240

AATTTCGCCA TGCTAAACAA GATCAGGAAG AGGGGAAAAG GGCACTATGG TTTATATTTT    300

TATATATTTC TGCTGCTGCT CGTCAGGCTT AGATGTGCTA GATCTTTCTT TCTTCTTTTT    360

GTGGGTAGAA TTTGAATCCC TCAGCATTGT TCATCGGTAG TTTTTCTTTT CATGATTTGT    420

GACAAATGCA GCCTCGTGCG GAGCTTTTTT GTAG                                454

(2)SEQ ID NO：3的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：1565碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑：线性

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (ix)特征：

    (A)名称/编码：玉米H3C4启动子

    (B)位置：27..1047

  (ix)特征：

    (A)名称/编码：水稻肌动蛋白内含子1

    (B)位置：1102..1555

  (ix)特征：

    (A)名称/编码：合成克隆位点

    (B)位置：1..26

  (ix)特征：

    (A)名称/编码：合成结合序列

    (B)位置：1048..1069

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

GAATTCCTGC AGGTCGACGG ATCCCCCTTA TGTGCACCAT TTACTGTAAT GCATAATCAT      60

TTAATTGAAT AGCAAACTTT TCTATTACTT CTTTACTAAC ATAATTCTTG GTTTTAAAAT     120

TCAGTCCTCA ACATTCATTG CTCAAGTATA AGTTGAGACT GTCAAAATTT ACTATTTTAT     180

TTCTTCATAT TTTTTTTCCT TATACACATT TTGGGCCTTA CAATCCATCA TCTATATCCA     240

TCCTTTCCGG TGTCCTCTAA AAGATTCCAT CCTCTGAATC TTATTCCTCT CCAATAACGT     300

TCTCTAAATC AGGTCTCTAT AAGCAATACC TATATTAGAG ACATTTTTTA TTTTTTGTAC     360

ATACATATTT GTCATACTCT CAAATGCATT ATACATATTT AGTTTTACTA AACCGATTAT     420

TTAAAGTATT CAAACGGATG AAGAACTGTT TAGATAAATT CTATATATAG AGAATCCAGT     480

AGCGTTCTCT AAATTTAGAT GATTATTTAG AGGACGCTGT TAGAAAACGT AAAAAATTCT     540

TTGATTATTT ATATTTAGGG TAGAGTAGCC TTTATGCTTT ATAGATCTTT GGTGGACCCA     600

GCCTTATACC GGTTATTTTC GCGATTGCGC CTCTCATTTT CACTCCAGCG CCCCACATTT     660

TCCACGTTTC ACCGAAGCGC CCAGCCTGCC TAACCAACAA ATTGGTACGG TGGCGCGGTT     720

TTCAAAAGAA GTCGGAAACC ATCTGCACCC ACCGACTAGT AGGCCCTCGG ATCCTCCCTG     780

ATTAAGTCCT AGCCAATAGG AGCCCAGAAC CACCCATCAC GCGGATCGTC CCTACGCTTC     840

CACCTCATCG GCGCCGTCCA TCTCCATCCA ACACCTATTC CGTTACCTTG CCCATCCTCC     900

GAAAAAATTC TCGGCTCGCG CTCCGCACCT ACTACAAATA CCCATCCCAT CACGACGCAT     960

CGCATCACTG CCAAATCCCC CAGAAAATCA ACACCTCCCA ATTCCACGCT GCCACCAACT    1020

CGCCGTCCTC CGCGCCAAGC ACCAAAGGAA TTGGCCGCCA CCGCGGTGGA GCTCCTCCGC    1080

CCTCCCCCTC CGCCGCCGCC GGTAACCACC CCGCCCCTCT CCTCTTTCTT TCTCCGTTTT    1140

TTTTTTCGTC TCGGTCTCGA TCTTTGGCTT TGGTAGTTTG GGTGGGCGAG AGCGGCTTCG    1200

TCGCCCAGAT CGGTGCGCCG GAGGGGCGGG ATCTCGCGGC TGGCGTCTCC GGGCGTGAGT    1260

CGGCCCGGAT CCTCGCGGGG AATGGGGCTC TCGGATGTAG ATCTGATCCG CCGTTTTTGG    1320

GGGAGATGAT GGGGCGTTTA AAATTTCGCC ATGCTAAACA AGATCAGGAA GAGGGGAAAA    1380

GGGCACTATG GTTTATATTT TTATATATTT CTGCTGCTGC TCGTCAGGCT TAGATGTGCT    1440

AGATCTTTCT TTCTTCTTTT TGTGGGTAGA ATTTGAATCC CTCAGCATTG TTCATCGGTA    1500

GTTTTTCTTT TCATGATTTG TGACAAATGC AGCCTCGTGC GGAGCTTTTT TGTAGGTAGA    1560

CC ATG                                                               1565

(2)SEQ ID NO：4的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：85碱基对

    (B)类型：合成寡核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC   60

CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC                                         85

(2)SEQ ID NO：5的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：66碱基对

    (B)类型：合成寡核苷酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑：线性

  (ii)分子类型：DNA

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC    60

TAGAGG                                                               66

Claims (19)

1.使异源性基因在单子叶植物的植物细胞中得以表达的5’端调节元件，其特征在于，在转录方向上包含的第一DNA序列是SEQ ID NO：1所示的玉米H3C4启动子序列；第二DNA序列是SEQ ID NO：2所示的水稻肌动蛋白第一内含子序列。

2.根据权利要求1所述的调节元件，其特征在于，在所述第一DNA序列和第二DNA序列之间含有一段中性DNA片段。

3.使异源性基因在单子叶植物的植物细胞中得以表达的5’端调节元件，其特征在于，由SEQ ID NO：3所表示的DNA序列构成。

4.一种嵌合基因，包括编码序列以及能在单子叶植物细胞或单子叶植物中发挥功能的位于3’端和5’端的异源性调节元件，其特征在于，所述5’端的调节元件如权利要求1至3中任一项所述。

5.根据权利要求4所述的嵌合基因，其特征在于，所述编码序列所编码的基因选自抗除草剂基因、抗杀虫剂基因和抗病基因。

6.根据权利要求5所述的嵌合基因，其特征在于，所述抗除草剂基因选自：抗双丙氨酰膦的Bar基因，EPSPS基因，所述EPSPS基因赋予针对以EPSPS为目标的除草剂的抗性，编码草甘膦氧化还原酶的基因和HPPD基因，所述HPPD基因赋予针对以HPPD为目标的除草剂的抗性。

7.根据权利要求6所述的嵌合基因，其特征在于，所述抗除草剂基因选自编码所述EPSPS的基因和编码所述HPPD的基因。

8.根据权利要求7所述的嵌合基因，其特征在于，所述编码EPSPS的基因选自双突变EPSPS和CP4，所述双突变EPSPS包含102位的异亮氨酸取代苏氨酸和106位的脯氨酸取代丝氨酸。

9.根据权利要求7或8所述的嵌合基因，其特征在于，所述编码EPSPS或HPPD的序列前面有一段编码转运肽的序列。

10.根据权利要求9所述的嵌合基因，其特征在于，所述编码转运肽的序列包含编码两段来自质体-定域酶的转运肽肽段的序列。

11.一种嵌合基因，在转录方向上包含权利要求1至3中任一项所述的5’端调节元件，它功能性地连接编码由转运肽和感兴趣蛋白构成的融合蛋白的序列，后者功能性地连接3’端调节序列。

12.根据权利要求11所述的嵌合基因，其特征在于，所述感兴趣的蛋白是权利要求6～8中任一项中所述的抗除草剂基因所编码的蛋白。

13.根据权利要求11所述的嵌合基因，其特征在于，所述编码由转运肽和感兴趣蛋白构成的融合蛋白的序列选自编码由OTP和双突变EPSPS所构成融合蛋白的序列和编码由OTP和CP4所构成融合蛋白的序列，所述双突变EPSPS包含102位的异亮氨酸取代苏氨酸和106位的脯氨酸取代丝氨酸。

14.一种用于转化植物细胞或植物的克隆或表达载体，其特征在于，除了权利要求4所述的嵌合基因外，还包含至少一个复制起点。

15.根据权利要求14所述的载体，其特征在于，该载体是一种质粒。

16.一种植物细胞，其特征在于，它至少包含一个权利要求4所述的嵌合基因。

17.控制区域内杂草的方法，所述区域植有被权利要求6所述嵌合基因转化的种籽和植物，所述方法包括向所述区域施用根据权利要求6所述嵌合基因内抗除草剂基因选择的除草剂，所述除草剂选自双丙氨酰膦、以EPSPS为目标的除草剂，草甘膦氧化还原酶和以HPPD为目标的除草剂。

18.培养被嵌合基因转化的植物的方法，该嵌合基因如权利要求6所述，该法包括在适合培养所述植物的区域播种所述转化植物的种子，并向所述区域施用特定除草剂，该除草剂对杂草有毒但不影响所述种子或所述转化植物，然后当植物到达希望的成熟度时，收割培养的植物，并任选地从收割的植物中分离出种子。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述特定除草剂的施用在播种前、植物出苗前和出苗后进行。

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