DE69834428T2

DE69834428T2 - Promotor des h3c4 gens aus mais, verbunden mit erstem actin-intron aus reis; chimäres gen welches dieses beinhaltet und transformierte pflanzen

Info

Publication number: DE69834428T2
Application number: DE69834428T
Authority: DE
Inventors: Richard Derose; Georges Freyssinet
Original assignee: Bayer CropScience SA
Current assignee: Bayer SAS
Priority date: 1997-12-24
Filing date: 1998-12-22
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2018-12-23
Also published as: CA2315677A1; CU23254A3; US20040199944A1; ATE325198T1; US6750378B2; FR2772787B1; DE69834428D1; AU759003B2; CN1208464C; FR2772787A1; BR9814369A; JP4365025B2; EP1042491A1; BRPI9814369B1; JP2002500016A; EP1042491B1; CA2315677C; US20020104117A1; CN1284999A; WO1999034005A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue 5'-Regulationssequenz, die die Expression einer zu dieser Regulationssequenz heterologen Sequenz, die für ein interessierendes Protein codiert, in monokotylen Pflanzen ermöglicht. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein chimäres Gen, das diese Regulationssequenz, eine heterologe Sequenz, die für ein interessierendes Protein codiert, sowie eine 3'-Regulationssequenz, die die Expression des interessierenden Proteins in einer pflanzlichen Zelle einer monokotylen Pflanze gestattet, enthält, sowie eine transformierte monokotyle Pflanze, die dieses chimäre Gen enthält, und die für die Transformation von pflanzlichen Zellen und Pflanzen erforderlichen Mittel.
Es sind verschiedene Promotoren, die die Expression von Codiersequenzen für interessierende Proteine in Pflanzen ermöglichen, bekannt und in der Literatur beschrieben; sie haben bereits die Entwicklung von gentechnisch modifizierten Pflanzen zur Marktreife ermöglicht. Es handelt sich um Promotorsequenzen von Genen, die auf natürliche Weise in Pflanzen exprimiert werden, insbesondere Promotoren bakteriellen, viralen oder pflanzlichen Ursprungs, wie zum Beispiel der Promotor eines Gens der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat-carboxylase/oxygenase ( US 4,962,028 ) oder eines Pflanzenvirusgens wie zum Beispiel des Blumenkohlmosaikvirus ( US 5,352,605 ). Promotoren, die die Expression von heterologen Genen in Pflanzen ermöglichen, sind insbesondere in den folgenden Patenten und Patentanmeldungen beschrieben: US 5,086,169 , EP 0 353 908 , US 5,139,954 , US 5,378,619 , US 5,563,328 , US 5,589,583 , US 5,633,363 , US 5,633,439 , US 5,633,440 , US 5,633,447 , US 5,635,618 , US 5,639,948 und US 5,639,952 .
Trotzdem sind manche dieser Promotoren, insbesondere die Promotoren pflanzlichen Ursprungs, in Monokotylen nicht funktionsfähig.
So sind zum Beispiel Histon-Promotoren von Arabidopsis sp., die in der Patentanmeldung EP 0,507,698 beschrieben sind, bekannt, die besonders wirksam bei der Ermöglichung der Expression eines heterologen Gens in dikotyledonen Pflanzen wie Tabak, Raps oder Soja sind, jedoch in Monokotylen, wie dem Mais, nicht funktionsfähig sind.
Der Reis-Actin-Promotor ist ein Promotor, von dem bekannt ist, daß er die Expression von heterologen Genen in monokotylen Pflanzen ermöglicht ( US 5,641,876 ). Es besteht jedoch immer noch das Problem, neue 5'-Regulationssequenzen zu identifizieren, die funktionell für die Expression von heterologen Sequenzen in monokotylen Pflanzen sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue DNA-Sequenz, ein 5'-Regulationselement, das die Expression eines heterologen Gens in einer Pflanzenzelle einer monokotylen Pflanze ermöglicht, wobei diese DNA-Sequenz in Transkriptionsrichtung eine erste DNA-Sequenz, bei der es sich um ein funktionsfähiges Fragment der H3C4-Promotorsequenz aus Mais handelt, sowie eine zweite DNA-Sequenz, bei der es sich um ein funktionsfähiges Fragment der Sequenz des ersten Actin-Introns aus Reis handelt, umfaßt.
Die H3C4-Promotorsequenz aus Mais wurde insbesondere von Brignon et & Mitarb. (Plant. Mol. Biol., 22: 1007–1015, 1993) beschrieben. Es handelt sich um das AluI-Fragment des H3C4-Promoters aus Mais mit einer Größe von ungefähr 1 kB, das den Basen –7 bis –1029 in Bezug auf das ATG der für das Mais-Histon H3C4 codierenden Sequenz entspricht.
Die Sequenz des ersten Actin-Introns aus Reis ist insbesondere in dem US-Patent 5,641,876 beschrieben.
Unter funktionsfähigem Fragment versteht man erfindungsgemäß jegliche DNA-Sequenz der Sequenz des H3C4-Promotors aus Mais oder der Sequenz des ersten Actin-Introns aus Reis, die ebenfalls die Funktion der Sequenz, aus der sie stammt, ausübt.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt das funktionsfähige Fragment der Sequenz des H3C4-Promotors aus Mais die durch die Sequenzbeschreibung Nr. 1 (SEQ ID Nr. 1) beschriebene DNA-Sequenz oder eine homologe Sequenz der Sequenz. Vorzugsweise besteht das funktionsfähige Fragment der Sequenz des H3C4-Promotors aus Mais aus der durch die Sequenzbeschreibung Nr. 1 beschriebenen DNA-Sequenz.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt das funktionsfähige Fragment des ersten Actin-Introns aus Reis die durch die Sequenzbeschreibung Nr. 2 (SEQ ID Nr. 2) beschriebene DNA-Sequenz oder eine homologe Sequenz der Sequenz.
Die DNA-Sequenz, also das erfindungsgemäße 5'-Regulationselement, kann weiterhin zwischen der ersten und zweiten DNA-Sequenz neutrale DNA-Fragmente umfassen, die im allgemeinen für die Konstruktion der erfindungsgemäßen Sequenz erforderlich sind. Es handelt sich um DNA-Fragmente mit bis zu 30 Basenpaaren, vorzugsweise bis zu 20 Basenpaaren. Unter neutralen DNA-Fragmenten versteht man erfindungsgemäß DNA-Fragmente, die die entsprechenden Funktionen der ersten und zweiten DNA-Sequenzen der erfindungsgemäßen Sequenz nicht modifizieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die erfindungsgemäße DNA-Sequenz die durch die Sequenzbeschreibung Nr. 3 (SEQ ID Nr. 3) beschriebene DNA-Sequenz oder eine homologe Sequenz dieser Sequenz aufweist. Stärker bevorzugt besteht die erfindungsgemäße Sequenz aus der durch die Sequenzbeschreibung Nr. 3 beschriebenen DNA-Sequenz.
Unter "homolog" versteht man erfindungsgemäß eine DNA-Sequenz, die im Vergleich zur Bezugs-DNA-Sequenz, die von den Sequenzbeschreibungen Nr. 1, 2 bzw. 3 beschrieben ist, eine oder mehrere Sequenzmodifikationen aufweist und weiterhin die Funktion der genannten Sequenzen ausübt. Diese Modifikationen können nach den üblichen Mutationstechniken oder auch dadurch, daß man synthetische Oligonukleotide wählt, die bei der Herstellung dieser Sequenz durch Hybridisierung verwendet werden können, wählt. Der Homologiegrad beträgt vorteilhaft mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 90%, in bezug auf eine Bezugssequenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein chimäres Gen (bzw. eine Expressionskassette), die eine Codiersequenz sowie heterologe 5'- und 3'-Regulationselemente, die in pflanzlichen Zellen von monokotylen Pflanzen funktionsfähig sind, wobei die 5'-Regulationselemente die oben definierte erfindungsgemäße DNA-Sequenz umfassen.
Unter "Pflanzenzelle" versteht man erfindungsgemäß jegliche Zelle, die von einer monokotylen Pflanze stammt und die undifferenzierte Gewebe wie Kalli, differenzierte Gewebe wie Embryonen, Teile von monokotylen Pflanzen, monokotyle Pflanzen oder Samen bilden kann.
Unter erfindungsgemäßer "monokotyler Pflanze" versteht man jeglichen mehrzelligen differenzierten Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist und dessen Samen einen Embryo mit einem einzigen Keimblatt aufweist, insbesondere Kulturpflanzen, die gegebenenfalls für die tierische oder menschliche Ernährung bestimmt sind, wie zum Beispiel Weizen, Gerste, Hafer, Reis, Mais, Sorghum, Zuckerrohr usw.
Erfindungsgemäß können in Kombination mit der erfindungsgemäßen Promotorregulationssequenz auch andere Regulationssequenzen, die zwischen dem Promotor und der Codiersequenz liegen, wie zum Beispiel einfache oder doppelte Codiersequenzen für Leitpeptide, wobei doppelte Sequenzen gegebenenfalls durch eine Zwischensequenz getrennt sind, das heißt solche, die in Transkriptionsrichtung eine Codiersequenz für ein Leitpeptid eines pflanzlichen Gens, das für ein Plastiden-Zielsteuerungsenzym codiert, einen Sequenzabschnitt des reifen N-terminalen Abschnitts eines pflanzlichen Gens, das für ein Plastiden-Zielsteuerungsenzym codiert, dann eine Sequenz, die für ein zweites Transidpeptid eines pflanzlichen Gens, das für ein Plastiden-Zielsteuerungsenzym codiert, die aus einem Sequenzabschnitt des reifen N-terminalen Teils eines pflanzlichen Gens, das für ein Plastiden-Zielsteuerungsenzym codiert, wie dies in der Anmeldung EP 0,508,909 beschrieben ist. Als Leitpeptid ist auch das von Cornelissen & Mitarbeitern beschriebene Signalpeptid des Tabak-PR-1a-Gens zu nennen.
Als Terminatorregulations- oder Polyadenylierungssequenz kann jegliche entsprechende Sequenz bakteriellen Ursprungs, wie zum Beispiel der Nos-Terminator aus Agrobacterium tumefaciens oder pflanzlichen Ursprungs, wie zum Beispiel ein wie in der EP-Anmeldung 0,633,317 beschriebener Histonterminator, verwendet werden.
Die Codiersequenz des erfindungsgemäßen des chimären Gens kann jegliche Sequenz, die für ein interessierendes Protein, das in einer Pflanzenzelle oder in einer monokotylen Pflanze exprimiert werden soll, codiert, umfassen.
Es kann sich dabei um ein Gen, das für einen Selektionsmarker codiert, wie ein Gen, das der transformierten monokotylen Pflanze neue agronomische Eigenschaften verleiht, oder um ein Gen, das die agronomische Qualität der transformierten monokotylen Pflanze verbessert.
Unter den Genen, die für Selektionsmarker codieren, sind die Gene für Resistenz gegen Antibiotika, die Gene für Toleranz gegen Herbizide (Bialaphos, Glyphosate oder Isoxazole), Gene, die für leicht identifizierbare Enzyme codieren, wie das Enzym GUS, Gene, die für Pigmente oder Enzyme, die die Produktion von Pigmenten in den transformierten Zellen regulieren, codieren, zu nennen. Solche Selektionsmarkergene sind insbesondere in den Patentanmeldungen WO 91/02071 und WO 95/06128 beschrieben.
Unter den Genen, die den transformierten monokotylen Pflanzen neue agronomische Eigenschaften verleihen, sind die Gene, die eine Toleranz gegen gewisse Herbizide verleihen, diejenigen, die eine Toleranz gegen gewisse Insekten verleihen, diejenigen, die eine Toleranz gegen gewisse Krankheiten verleihen usw., zu nennen. Solche Gene sind insbesondere in den Patentanmeldungen WO 91/02071 und WO 95/06128 beschrieben.
Als Terminatorregulations- oder Polyadenylierungssequenz kann jegliche entsprechende Sequenz bakteriellen Ursprungs, wie zum Beispiel der Nos-Terminator aus Agrobacterium tumefaciens oder pflanzlichen Ursprungs, wie zum Beispiel ein wie in der EP-Anmeldung 0,633,317 beschriebener Histonterminator, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders für die Expression von Genen, die den transformierten monokotylen Pflanzen und pflanzlichen Zellen eine Toleranz gegen gewisse Herbizide verleihen. Unter den Genen, die eine Toleranz gegen gewisse Herbizide verleihen, sind das Bar-Gen, das eine Toleranz gegen Bialaphos verleiht, das für eine entsprechende 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-synthase (EPSPS) codierende Gen, das eine Resistenz gegen Herbizide, die die EPSPS als Angriffspunkt haben, wie Glyphosate und seine Salze, verleiht ( US 4,535,060 , US 4,76,061 , US 5,094,945 , US 4,940,835 , US 5,188,642 , US 4,971,908 , US 5,145,783 , US 5,310,667 , US 5,312,910 , US 5,627,061 , US 5,633,435 , FR 2,736,926 ), das Gen, das für die Glyphosate-oxidoreduktase codiert ( US 5,463,175 ) oder auch ein Gen, das für eine Hydroxyphenylpyruvat-dioxygenase (HPPD) codiert, das eine Toleranz gegen Herbizide, die die HPPD als Angriffspunkt haben, wie die Isoxazole, insbesondere Isoxafutol ( FR 95 06800 , FR 95 13570 ), die Diketonitrile ( EP 496 630 , EP 496 631 ) oder die Triketone, insbesondere Sulcotrion ( EP 625 505 , EP 625 508 , US 5,506,195 ), verleiht, zu nennen. Solche Gene, die für eine HPPD codieren, die eine Toleranz gegen Herbizide, die die HPPD als Angriffspunkt haben, vermitteln, sind in der Patentanmeldung WO 96/38567 und in der am 7. November 1997 eingereichten nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung FR 97 14264 beschrieben.
Unter den Genen, die für eine entsprechende EPSPS codieren, die eine Resistenz gegen Herbizide, die die EPSPS als Angriffspunkt haben, vermitteln, sind insbesondere das Gen, das für eine pflanzliche EPSPS, insbesondere eine EPSPS von Mais, die zwei Mutationen 102 und 106 aufweist, und die in der Patentanmeldung FR 2,736,926 beschrieben ist und im Folgenden EPSPS-Doppelmutante genannt wird, codieren, oder auch das Gen, das für eine aus Agrobacterium isolierte EPSPS, die durch die Sequenzen ID 2 und ID 3 des US-Patents US 5,633,435 beschrieben wird und im Folgenden CP4 genannt wird, beschrieben wird, zu nennen.
Unter den Genen, die für eine HPPD, die eine Toleranz gegen Herbizide, die die HPPD als Angriffspunkt haben, vermittelt, codieren, sind insbesondere die HPPD aus Pseudomonas und aus Arabidopsis, die in der Patentanmeldung WO 96/38567 beschrieben sind, zu nennen.
Im Fall der Gene, die für die EPSPS oder HPPD codieren, insbesondere bei den oben genannten Genen, steht vor der Codiersequenz für diese Enzyme vorteilhaft eine Codiersequenz für ein Leitpeptid, insbesondere für das Leitpeptid, das optimiertes Leitpeptid genannt wird und in den Patenten US 5,510,471 oder US 5,633,448 beschrieben ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das erfindungsgemäße chimäre Gen in Transkriptionsrichtung eine Sequenz, die für eine wie oben definierte erfindungsgemäße 5'-Regulationssequenz in operativer Verknüpfung mit einer Sequenz, die für ein Fusionsprotein Leitpeptid/interessierendes Protein codiert und die operativ mit einer 3'-Regulationsseguenz verknüpft ist, wobei die verschiedenen Elemente des chimären Gens oben definiert sind, wobei es sich bei dem interessierenden Protein vorzugsweise um ein Enzym, das eine Toleranz gegen gewisse Herbizide verleiht, insbesondere um die oben definierten Enzyme des EPSPS- oder HPPD-Typs, verleiht, handelt.
Sequenzen, die für Fusionsproteine Leitpeptid/interessierendes Protein, insbesondere OTP/EPSPS-Doppelmutante, codieren, sind in den Patenten US 4,940,835 , US 5,633,448 und FR 2 736 926 beschrieben.
Bei dem Fusionsprotein OTP/CP4 kann der Fachmann das entsprechende Gen dadurch konstruieren, daß er von der in dem US-Patent 5,633,435 beschriebenen Codiersequenz für CP4 ausgeht und wie in den Patenten US 4,940,835 , US 5,633,448 und FR 2,736,926 oder in den Beispielen unten vorgeht. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein chimäres Gen, das in Transkriptionsrichtung eine entsprechende 5'-Regulationssequenz zur Gewährleistung der Expression eines heterologen Gens in einer pflanzlichen Zelle in operativer Verknüpfung mit einer Sequenz, die für das Fusionsprotein OTP/CP4 in operativer Verknüpfung mit einer 3'-Regulationssequenz umfaßt. Die 5'-Regulationselemente umfassen nicht nur die oben definierten erfindungsgemäßen 5'-Regulationselemente, sondern auch alle fachbekannten oder zukünftigen entsprechenden Regulationselemente, die die Expression von heterologen Genen in Pflanzenzellen von monokotylen Pflanzen gestatten, insbesondere die weiter oben beschriebenen.
Die Codiersequenzen für Fusionsproteine Leitpeptid/HPPD sind in der Patentanmeldung WO 96/38567 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Klonierungs- oder Expressionsvektor für die Transformation einer Pflanzenzelle oder einer monokotylen Pflanze, wobei die transformierten Pflanzen und Pflanzenzellen mindestens ein wie oben definiertes chimäres Gen enthalten. Der erfindungsgemäße Vektor umfaßt außer dem oben genannten chimären Gen mindestens einen Replikationsursprung. Dieser Vektor kann aus einem Plasmid, einem Cosmid, einem Bakteriophagen oder einem Virus, die durch Einbringung des erfindungsgemäßen chimären Gens transformiert worden sind, bestehen. Solche Transformationsvektoren für Pflanzenzellen und monokotyle Pflanzen sind dem Fachmann gut bekannt und ausführlich in der Literatur beschrieben. Vorzugsweise handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Transformationsvektor für Pflanzenzellen oder Pflanzen um ein Plasmid.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen durch Integration von mindestens einem wie oben definierten Nukleinsäurefragment oder chimären Gen, wobei diese Transformation auf jegliche geeignete Art und Weise mit dem erfindungsgemäßen Vektor durchgeführt werden kann.
Eine Reihe von Methoden besteht in der Beschießung von Zellen oder Zellgeweben mit Partikeln, die mit DNA-Sequenzen beschichtet sind. Eine weitere Reihe von Verfahren besteht darin, daß man als Mittel für den Transfer in die Pflanze ein in ein Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens oder ein Ri-Plasmid von Agrobacterium rhizogenes insertiertes chimäres Gen verwendet. Es können auch andere Verfahren verwendet werden, wie die Mikroinjektion, die Elektroporation oder auch die direkte Fällung mittels PEG.
Der Fachmann wird das geeignete Verfahren in Abhängigkeit von der Art der Pflanzenzelle oder der Pflanze auswählen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die transformierten Pflanzenzellen oder der Pflanzen, die mindestens ein oben definiertes erfindungsgemäßes chimäres Gen enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Pflanzen, die die transformierten Zellen enthalten, insbesondere die Pflanzen, die ausgehend von transformierten Zellen regeneriert worden sind. Die Regeneration erfolgt mit einem beliebigen entsprechenden Verfahren, das von der Art der Pflanzenspezies anhängt.
Bei den Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen und Regeneration von monokotylen Pflanzen sind insbesondere Gordon-Kamm, W.J. et al. (Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants, The Plant Cell, Bd. 2, 603–618, Juli 1990) sowie die folgenden Patente und Patentanmeldungen zu nennen: US 5,177,010 , US 5,187,073 , EP 267,159 , EP 604 662 , EP 672 752 , US 4,945,050 , US 5,036,006 , US 5,100,792 , US 5,371,014 , US 5,478,744 , US 5,484,956 , US 5,508,468 , US 5,538,877 , US 5,554,798 , US 5,489,520 , US 5,510,318 , US 5,204,253 , US 5,405,765 , EP 442 174 , EP 486 233 , EP 486 234 , EP 539 563 , EP 674 725 , WO 91/02071 und WO 95/06128.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die transformierten Pflanzen, die aus der Kultur und/oder Kreuzung von oben genannten regenerierten Pflanzen stammen, sowie die Samen von transformierten Pflanzen.
Wenn das erfindungsgemäße chimäre Gen eine Codiersequenz für ein Enzym, das eine Toleranz gegen ein bestimmtes Herbizid vermittelt, umfaßt, so betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Bekämpfung von Unkräutern in der Oberfläche eines Feldes enthaltend Samen oder Pflanzen, die mit einem chimären Gen umfassend eine Sequenz, die für ein Enzym, das eine Toleranz gegenüber ein bestimmtes Herbizid vermittelt, codiert, transformiert worden sind, wobei dieses Verfahren darin besteht, daß man in diese Oberfläche des Feldes eine Dosis dieses bestimmten Herbizids, die für diese Unkräuter toxisch ist, ohne jedoch die mit dem chimären Gen transformierten Samen oder Pflanzen wesentlich zu schädigen, ausbringt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Kultivierung von mit einem chimären Gen umfassend eine Sequenz, die für ein Enzym, das eine Toleranz gegenüber einem bestimmten Herbizid vermittelt, codiert, transformierten Pflanzen, wobei das Verfahren darin besteht, daß man die Samen dieser transformierten Pflanzen in eine Oberfläche des Felds, das sich für die Kultur dieser Pflanzen eignet, pflanzt, bei Vorhandensein von Unkräutern auf die Oberfläche des Feldes eine für die Unkräuter toxische Dosis dieses bestimmten Herbizids ausbringt, ohne daß die transformierten Samen oder Pflanzen wesentlich geschädigt werden, anschließend die kultivierten Pflanzen, nachdem diese den gewünschten Reifegrad erlangt haben, erntet sowie gegebenenfalls die Samen der geernteten Pflanzen abtrennt.
Bei den beiden oben genannten Verfahren kann das bestimmte Herbizid erfindungsgemäß vor dem Anbau, vor dem Auflaufen oder nach dem Auflaufen der Kultur ausgebracht werden.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Enzym für Toleranz gegen ein Herbizid um eine entsprechende EPSPS, wobei es sich hierbei bei dem Herbizid um Glyphosate oder seine Salze handelt, oder um eine HPPD, wobei das Herbizid aus der Reihe der Isoxazole, insbesondere Isoxafutol, der Diketonitrile oder der Triketone, insbesondere Sulcotrion, stammt.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne diese jedoch einzuschränken.
1. Konstruktion eines chimären Gens mit einer Codiersequenz für eine HPPD:
Es werden die folgenden Plasmide hergestellt, um eine Expressionskassette zu konstruieren, die einen Mais-H3C4-Histonpromoter mit der 5'-nichttranslatierten Region des ersten Actin-Introns aus Reis (ActI), wie dies von Mc Elroy D. et al. (Plant Molecular Biology 15: 257–268 (1990)) beschrieben ist, umfaßt, was zur Expression des OTP-HPPD-Gens von Pseudomonas fluorescens führt.
pRPA-RD-195
Das Plasmid pRPA-RD-195 ist ein Derivat des Plasmids pUC-19, das eine modifizierte multiple Klonierungsstelle enthält. Die komplementären Oligonukleotide 1 und 2 unten werden fünf Minuten bei 65°C hybridisiert und anschließend langsam im Verlauf von 30 Minuten auf 30°C abgekühlt:
Oligo 4: 5' AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3'
Oligo 5: 5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3'
Die hybridisierten Oligonukleotide werden doppelsträngig gemacht, wobei man das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 von E. coli verwendet, um die 3'-Enden jedes Oligos zu verlängern, wobei die vom Hersteller (New England Biolabs) empfohlenen Standardbedingungen verwendet werden. Das doppelsträngige Oligo wird anschließend in das zuvor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII verdaute Plasmid pUC-19, das unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase 1 von E. coli stumpfendig gemacht wurde, legiert. Auf diese Weise erhält man einen Klonierungsvektor, der eine multiple Klonierungsstelle enthält, um die Insertion von Expressionskassetten in einen Plasmidvektor von Agrobacterium tumefaciens zu erleichtern ( 1).
pRPA-RD-2010:
Insertion der Sequenz "H4A7480-Promoter-OTP-Gen der EPSPS-Doppelmutante" von pRPA-RD-173 in das Plasmid pRPA-RD-195.
Das Plasmid pRPA-RD-195 wird mit dem Restriktionsenzym SacI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England Biolabs) dephosphoryliert. Das (in dem Patent FR 2,736,926 beschriebene) Plasmid pRPA-RD-173 wird mit dem Restriktionsenzym SacI verdaut, und das DNA-Feragment, das das EPSPS-Gen enthält, wird aufgereinigt und in das zuvor vorbereitete Plasmid pRPA-RD-195 ligiert. Der erhaltene Klon enthält mehrere unikäre Restriktionsstellen, die das Gen der EPSPS-Doppelmutante umrahmen.
pRPA-RD-1002
Erzeugung einer OTP-HPPD-Expressionkassete für Monokotyledone. Das Plasmid pRP-P enthält das optimierte Leitpeptid (OTP) in Verknüpfung mit der HPPD aus Pseudomonas fluorescens, gefolgt von der Polyadenylierungsstelle der Nopalinsynthase, wie in der Patentanmeldung WO 96/38567 beschrieben. Die Elemente des Plasmids pRP-P sind:

– das in den Patenten US 5,510,471 und US 5,633,448 beschriebene optimierte Leitpeptid (OTP); dieses OTP besteht aus den 171 Bp des Leitpeptids der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/oxygenase aus Helianthus annuus (Waksman G. et al. 1987. Nucleics Acids Res. 15: 7181) sowie anschließend daran 66 Bp des reifen Abschnitts der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/oxygenase aus Zea mays (Lebrun et al. 1987. Nucleics Acids Res. 15: 4360), sowie im Anschluß daran 150 Bp des Leitpeptids der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/oxygenase aus Zea mays Lebrun et (al. 1987. Nucleics Acids Res. 15: 4360); das Ganze ist also 387 Bp; lang;
– die in der Patentanmeldung WO 96/38567 beschriebene Codierregion der HPPD aus Pseudomonas fluorescens; sowie
– der Terminator des Gens der Nopalinsynthase (nos) (Polyadenylierungsregion des nos-Gens isoliert aus M. et pTi 37, 250 Bp; Bevan al. Nucleics Acids Res. 11: 369–385).

Das Plasmid pRP-P wird mit dem Restriktionsenzym BstEII verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 aus E. coli behandelt, um das Fragment stumpfendig zu machen, und anschließend mit dem Restriktionsenzym NcoI verdaut. Das erhaltene ungefähr 1,5 kB DNA-Fragment, das die OTP-HPPD Codierregion enthält, wird aufgereinigt. Das zuvor erhaltene Plasmid pRPA-RD-2010 wird mit dem Restriktionsenzym BlpI verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli behandelt, um zu einem stumpfendigen Fragment zu gelangen, und anschließend mit dem Restriktionsenzym NcoI verdaut. Das erhaltene DNA-Fragment, das die Sequenzen des Plasmidvektors, den H3C4-Promotor in Kombination mit der 5'-nichttranslatierten Region sowie das erste Intron des Actin-Gens aus Reis umfaßt; wird aufgereinigt, und die NOS-Polyadenlierungsstelle wird aufgereinigt. Die beiden aufgereinigten DNA-Fragmente werden so ligiert, daß man eine OTP-HPPD-Expressionskassette, die den H3C4-Histonpromotor aus Mais (Brignon & Mitarb.) umfaßt, in Kombination mit der 5'-nichttranslatierten Region und das Intron des Actin-Gens aus Reis (ActI) (ActI 5' UTR + Intron 1) erhält, um die Expression der OTP-HPPD-Codierregion, die die NOS-Polyadenylierunsstelle beinhaltet (NOS polyA) zu kontrollieren (2).
2. Konstruktion eines chimären Gens mit einer Codiersequenz für die EPSPS-Doppelmutante
pRPA-RD-1010:
Erzeugung einer OTP-EPSPS-Doppelmutante-Kassette für Monokotyledone.
Das Plasmid pRPA-RD-109 enthält das β-Glucuronidase (GUS)-Gen aus E. coli unter Kontrolle des H3C4-Histonpromoters aus Mais (Brignon & Mitarb.) in Kombination mit der 5'-nichttranslatierten Region und dem von Mc Elroy D. et al. (Plant Molecular Biology 15: 257–268, 1990) beschriebenen ersten Intron des Actin-Gens aus Reis (ActI). Ein Diagramm dieses Plasmids ist in 3 dargestellt. Das Plasmid pRPA-RD-109 wird mit den Restriktionsenzymen NcoI und EcoRI verdaut, und das große DNA-Fragment (mit einer Größe von ungefähr 5 kb), das Sequenzvektor, GUS-Gen und NOS-Polyadenylierungsstelle enthält, wird aufgereinigt. Das Plasmid pRPA-RD-2010 wird mit den Restriktionsenzymen NcoI und EcoRI verdaut, und das DNA-Fragment (mit einer Größe von ungefähr 1,6 kb), das den H3C4-Promoter in Kombination mit der 5'-nichttranslatierten Region und dem ersten Intron des Actin-Gens aus Reis (ActI) enthält, wird aufgereinigt. Die beiden auf gereinigten DNA-Fragmente werden ligiert, wodurch man zu einer OTP-EPSPS-Doppelmutante-Kassette gelangt, die den H3C4-Histonpromoter aus Mais (Brignon & Mitarb:) in Kombination mit der 5'-nichttranslatierten Region und dem ersten Intron des Actin-Gens aus Reis (ActI) enthält, um die Expression der Codierregion OTP-EPSPS-Doppelmutante, die die NOS-Polyadenylierungsstelle beinhaltet, zu kontrollieren.
3. Konstruktion eines Phosphinotricin-Toleranzgens (bar-Gen):
Bei der von dem bar-Gen codierten Phosphinotricinacetyltransferase (PAT) handelt es sich um ein Enzym, das ein Herbizid, nämlich Phosphinotricin (PPT), inaktiviert. Das PPT hemmt die Glutaminsynthese und führt zu einer raschen Akkumulation von Ammoniak in den Zellen, was zu deren Absterben führt (Tachibana et al. 1986).
Das für die Einschleusung der Phosphinotricintoleranz als Selektionsagens verwendete Plasmid wird durch Insertion des in dem Plasmid pDM 302 enthaltenen chimären Gens in den 2462 Bp großen Verktor pSP72, der von Promega Corp. (Genbank/DDBJ Databank Zugangsnummer X65332) im Handel erhältlich ist und das Gen für Ampicillinresistenz enthält, erhalten.
Das 4700 Bp große Plasmid pDM 302 wurde von Cao, J., et al. Plant Cell Report 11: 586–591 (1992) beschrieben.
Bei den verschiedenen Elementen des in diesem Plasmid enthaltenen chimären Gens sind:

– der Promotor des von Mc Elroy D. et al. Plant Molecular Biology 15: 257–268 (1990) beschriebenen Actin-Gens aus Reis, der aus 840 Bp besteht;
– das erste Exon des Actin-Gens aus Reis, das aus 80 Bp besteht;
– das erste Intron des Actin-Gens aus Reis, das aus 450 Bp besteht;
– die aus dem von White J. et al. Nuc. Acids Res. 18: 1862 (1990) beschriebenen Plasmid pIJ41404 herausgeschnittene 600 Bp große Codierregion des bar-Gens
– der Terminator des Nopalinsynthasegens (nos) (Polyadenylierungsregion des nos-Gen, isoliert aus pTi 37, 250 Bp; (Bevan M. et al. Nucleics Acids Res. 11: 369–385).

4. Transformation von Maiszellen:
Für die Einschleusung der Genkonstruktion wird die Methode des Beschusses mit der Genkanone verwendet. Die Plasmide werden auf einer Qiagen-Säule gereinigt, und mit beiden gemeinsam wurden M10-Wolframpartikel nach dem Verfahren von Klein (Nature 327: 70–73, 1987) mittels Niederschlagsbildung beschichtet.
Mit einer Mischung aus Metallpartikeln, dem Plasmid pRPA-RD-1002 und dem oben in Beispiel 3 beschriebenen Plasmid werden anschließend nach der von Gordon-Kamm, W.J. et al. (Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants, The Plant Cell, Bd. 2, 603–618, Juli 1990) beschriebenen Vorschrift embryogene Maiszellen beschossen.
5. Regeneration und Verwendung des bar-Gens als Selektionsmittel:
Die beschossenen Kalli werden bis zum Erscheinen von grünen Zonen auf Glufosinate selektiert. Die positiven Kalli, die glufosinateresistent sind, werden nun in somatische Embryos umgewandelt und anschließend unter Bedingungen, die die Sproßbildung begünstigen, unter den von Gordon-Kamm, W.J. et al. (Transformation of Maize Cells and Regeneration of Fertile Transgenic Plants, The Plant Cell, Bd. 2, 603–618, Juli 1990) beschriebenen Arbeitsbedingungen gehalten. Die Jungpflanzen wurden zur Samenbildung ins Gewächshaus umgestellt.
6. Nachkommenschaftsanalyse der transformierten Pflanzen:
Von den oben erhaltenen transformierten Pflanzen wird angenommen, daß sie zum Teil transgen sind und ein heterologes Gen, das für OTP/HPPD codiert und eine Toleranz gegen Isoxazole wie Isoxafutol vermittelt, enthalten. Diese transformierten Pflanzen haben Pollen erzeugt, mit denen die Eizellen eines nichttransgenen Wildtyp Mais befruchtet wurden. Die erhaltenen Samen werden nach Behandlung mit Isoxaflutol auf Sand selektiert.
Diese Lektionsvorschrift lautet folgendermaßen:
800 ml Fontainebleau-Sand wurden in ein Kästchen mit einer Seitenlänge von 15 × 20 cm gegeben. Die Kästchen werden nun mit Wasser begossen und durch Zuführen einer Nährlösung, die aus 5 ml Quinoligo^® (La Quinoléine) pro Liter Wasser besteht, feuchtgehalten. Es werden 20 Maissamen auf die Kästchen ausgelegt, und diese werden nun mit einer Spritzbehandlung von 100 g Aktivsubstanz pro Hektar (300 μg Aktivsubstanz pro Kästchen) behandelt. Die Kästchen werden nun im Gewächshaus kultiviert. Die Phytotoxizität wirkt 14 Tage nach dem Pflanzenbeschnitt. Unter den oben genannten Bedingungen wird bei den nichttransformierten Pflanzen eine Phytotoxizität von 100% beobachtet, während bei den transformierten Pflanzen keine Phytotoxizität beobachtet wird.
Es wurde mit 20 erfindungsgemäß transformierten Maislinien und 20 Maislinien, die mit einem entsprechenden Gen, bei dem die Codiersequenz für das erste Actin- Intron aus Reis durch die Codiersequenz für das Mais-Intron adh I ersetzt wurde, transformiert wurden, eine Vergleichsstudie durchgeführt. Nach Spritzbehandlung mit sehr hohen Isoxafutoldosen von 200 g Aktivsubstanz pro Hektar (600 μg Aktivsubstanz pro Kästchen) werden die folgenden Ergebnisse erzielt:

erfindungsgemäßes

Actin-Intron aus Reis: 8 von 20 Linien sind tolerant

Mais-Intron adh I: 3 von 20 Linien sind tolerant
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die Kombination des H3C4-Promoters aus Mais mit dem ersten Actin-Intron aus Reis die Expression eines interessierenden Proteins in den transformierten monokotylen Pflanzen im Vergleich zur Kombination des gleichen H3C4-Promoters aus Mais mit einem anderen Introns des Stands der Technik wesentlich verbessert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Sequenz, bei der es sich um ein 5'-Regulationselement, das die Expression eines heterologen Gens in einer Pflanzenzelle von monokotylen Pflanzen ermöglicht, handelt, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Transkriptionsrichtung eine erste DNA-Sequenz, bei der es sich um ein funktionfähiges Fragment der H3C4-Promotorsequenz aus Mais handelt, sowie eine zweite DNA-Sequenz, bei der es sich um ein funktionsfähiges Fragment der Sequenz des ersten Actin-Introns aus Reis handelt, umfaßt.
Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Sequenz des H3C4-Promotors aus Mais um das AluI-Fragment des H3C4-Promotors aus Mais handelt.
Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das funktionsfähige Fragment der Sequenz des H3C4-Promotors aus Mais die durch die Sequenzbeschreibung Nr. 1 (SEQ ID Nr. 1) beschriebene DNA-Sequenz oder eine homologe Sequenz mit einem Homologiegrad von mindestens 70% in bezug auf diese Sequenz umfaßt.
Sequenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das funktionsfähige Fragment der Sequenz des H3C4-Promotors aus Mais aus der durch die Sequenzbeschreibung Nr. 1 beschriebenen DNA-Sequenz besteht.
Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das funktionsfähige Fragment der Sequenz des ersten Actin-Introns aus Reis die durch die Sequenzbeschreibung Nr. 2 (SEQ ID Nr. 2) beschriebene DNA-Sequenz oder eine homologe Sequenz mit einem Homologiegrad von mindestens 70% in bezug auf diese Sequenz umfaßt.
Sequenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das funktionsfähige Fragment der Sequenz des ersten Actin-Introns aus Reis aus der durch die Sequenzbeschreibung Nr. 2 beschriebenen DNA-Sequenz besteht.
DNA-Sequenz, bei der es sich um ein 5'-Regulationselement, das die Expression eines heterologen Gens in einer Pflanzenzelle von monokotylen Pflanzen ermöglicht, handelt, dadurch gekennzeichnet, daß sie die durch die Sequenzbeschreibung Nr. 3 (SEQ ID Nr. 3) beschriebene DNA-Sequenz oder eine homologe Sequenz mit einem Homologiegrad von mindestens 70% in bezug auf diese Sequenz aufweist, umfaßt.
Sequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der durch die Sequenzbeschreibung Nr. 3 beschriebenen DNA-Sequenz besteht.
Chimäres Gen, das eine Codiersequenz sowie heterologe 5'- und 3'-Regulationselemente, die in Monokotylen-Pflanzenzellen oder in monokotylen Pflanzen funktionsfähig sind, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die 5'-Regulationselemente die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfassen.
Chimäres Gen nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Codiersequenz aus der Gruppe Gen, das für einen Selektionsmarker codiert, Gen, das der transformierten monokotylen Pflanze neue agronomische Eigenschaften verleiht und Gen zur Verbesserung der agronomischen Qualität der transformierten monokotylen Pflanze stammt.
Chimäres Gen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, das den transformierten monokotylen Pflanzen neue agronomische Eigenschaften verleiht, aus der Gruppe Gen, das eine Toleranz gegenüber gewissen Herbiziden verleiht, Gen, das eine Toleranz gegenüber gewissen Insekten verleiht und Gen, das eine Toleranz gegenüber gewissen Krankheiten verleiht, stammt.
Chimäres Gen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, das eine Toleranz gegenüber gewissen Herbiziden verleiht, aus der Gruppe Bar-Gen, das eine Toleranz gegenüber Bialaphos verleiht, Gen, das für ein geeignetes 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) -Enzym, das eine Resistenz gegenüber Herbiziden, denen die EPSPS als Angriffspunkt dient, vermittelt, das Gen, das für die Glyphosat-Oxidoreduktase codiert und Gen, das für eine Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD), die eine Toleranz gegenüber Herbiziden, denen die HPPD als Angriffspunkt dient, vermittelt, codiert, stammt.
Chimäres Gen nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, das eine Toleranz gegenüber gewissen Herbiziden verleiht, aus der Gruppe Gen, das für eine EPSPS codiert und Gen, das für eine HPPD codiert, stammt.
Chimäres Gen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen, das für eine EPSPS codiert, aus der Reihe EPSPS-Doppelmutante und CP4 stammt.
Chimäres Gen nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Sequenz, die für eine EPSPS oder eine HPPD codiert, eine Sequenz, die für ein Leitpeptid codiert, vorangestellt ist.
Chimäres Gen nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Sequenz, die für ein Leitpeptid codiert, um eine Sequenz handelt, die für ein doppeltes Leitpeptid codiert und die in Transkriptionsrichtung eine Sequenz, die für ein Leitpeptid eines pflanzlichen Gens, das für ein Enzym für plastidäre Lokalisierung codiert, codiert, einen Sequenzabschnitt des reifen N-terminalen Abschnitts eines pflanzlichen Gens, das für ein Enzym für plastidäre Lokalisierung codiert, anschließend eine Sequenz, die für ein zweites Transidpeptid eines pflanzlichen Gens, das für ein Enzym für plastidäre Lokalisierung codiert, codiert, umfaßt.
Chimäres Gen, dadurch gekennzeichnet, daß es in Transkriptionsrichtung eine 5'-Regulationssequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in operativer Verknüpfung mit einer Sequenz, die für ein Fusionsprotein Leitpeptid/interessierendes Protein codiert und die operativ mit einer 3'-Regulationssequenz verknüpft ist, umfaßt.
Chimäres Gen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem interessierenden Protein um ein Enzym nach einem der Ansprüche 12 bis 14, das eine Toleranz gegenüber gewissen Herbiziden vermittelt, handelt.
Chimäres Gen nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Fusionsprotein Leitpeptid/interessierendes Protein codierende Sequenz aus der Reihe Sequenz, die für das Fusionsprotein OTP/EPSPS-Doppelmutante codiert und Sequenz, die für das Fusionsprotein OTP/CP4 codiert, stammt.
Klonierungs- oder Expressionsvektor für die Transformation einer Pflanzenzelle oder einer Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß er außer dem chimären Gen nach einem der Ansprüche 9–19 mindestens einen Replikationsursprung umfaßt.
Vektor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Plasmid handelt.
Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 9–19 integriert.
Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 9–19 enthält.
Transformierte Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Zellen nach Anspruch 23 regeneriert wird.
Transformierte Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Kultur und/oder einer Kreuzung einer transformierten Pflanze nach Anspruch 24 entstanden ist.
Samen einer transformierten Pflanze nach Anspruch 24 oder 25.
Verfahren zur Bekämpfung von Unkräutern in der Oberfläche eines Feldes enthaltend Samen oder Pflanzen, die mit einem chimären Gen umfassend eine Sequenz, die für ein Enzym, das eine Toleranz gegenüber ein bestimmtes Herbizid vermittelt, codiert, transformiert worden sind, wobei dieses Verfahren darin besteht, daß man in diese Oberfläche des Feldes eine Dosis dieses bestimmten Herbizids, die für diese Unkräuter toxisch ist, ohne jedoch die mit dem chimären Gen transformierten Samen oder Pflanzen wesentlich zu schädigen, ausbringt, dadurch gekennzeichnet, daß das chimäre Gen nach einem der Ansprüche 12–19 definiert ist.
Verfahren zur Kultivierung von mit einem chimären Gen umfassend eine Sequenz, die für ein Enzym, das eine Toleranz gegenüber einem bestimmten Herbizid vermittelt, codiert, transformierten Pflanzen, wobei das Verfahren darin besteht, daß man die Samen dieser transformierten Pflanzen in eine Oberfläche des Felds, das sich für die Kultur dieser Pflanzen eignet, pflanzt, bei Vorhandensein von Unkräutern auf die Oberfläche des Feldes eine für die Unkräuter toxische Dosis dieses bestimmten Herbizids ausbringt, ohne daß die transformierten Samen oder Pflanzen wesentlich geschädigt werden, anschließend die kultivierten Pflanzen, nachdem diese den gewünschten Reifegrad erlangt haben, erntet sowie gegebenenfalls die Samen der geernteten Pflanzen abtrennt, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem chimären Gen um ein chimäres Gen nach einem der Ansprüche 12–19 handelt.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man das bestimmte Herbizid vor dem Anbau, vor dem Auflaufen oder nach dem Auflaufen der Kultur ausbringt.