DE69635913T2

DE69635913T2 - Transgene Pflanzen mit verbesserter Toleranz gegen Herbizide der Phosphomethylglycinfamilie, die ein für mutierte 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase kodierendes Gen enthalten

Info

Publication number: DE69635913T2
Application number: DE69635913T
Authority: DE
Inventors: Michel Lebrun; Alain Sailland; Georges Freyssinet
Original assignee: Bayer CropScience SA
Current assignee: Bayer SAS
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1996-07-18
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2016-07-19
Also published as: SK6498A3; EA199800138A1; UA80895C2; US6566587B1; DK0837944T3; EP1217073A2; CA2223875C; DE69635995T2; IL122941A0; MX9800562A; PL189453B1; FR2736926B1; HU226089B1; AP9801195A0; HUP9900463A2; BG102247A; BR9609792A; CU23172A3; FR2736926A1; CN1154734C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue 5-Enolpyrovylshikimat-3-phosphatsynthase (auch EPSPS genannt), die eine erhöhnte Toleranz gegenüber Herbiziden, die kompetitive Hemmer in Bezug auf das Phosphonoenolpyruvat (PEP) der EPSPS-Aktivität darstellen, aufweisen. Diese tolerantere EPSP-Synthase weist mindestens einen Austausch "Threonin gegen Isoleucin" auf. Außerdem betrifft sie ein Gen, das für solch ein Protein codiert, Pflanzenzellen, die mit chimären Genkonstrukten, die dieses Gen enthalten, transformiert sind, die aus diesen Zellen regenerierten Pflanzen sowie Pflanzen, die aus Kreuzungen, bei denen diese transformierten Pflanzen verwendet werden, hervorgegangen sind.
Bei Glyphosate, Sulfosate oder Fosametine handelt es sich um systemische Herbizide aus der Phosphonomethylglycin-Familie mit einem breiten Wirkungsspektrum. Sie wirken im wesentlichen als kompetitive Hemmer der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EC 2.5.1.19), oder EPSPS, gegenüber PEP (Phosphoenolpyruvat). Nach ihrer Ausbringung auf die Pflanze werden sie in die Pflanze transportiert, wo sie sich in Regionen mit intensivem Wachstum, insbesondere der Sproß- und Wurzelspitze, anhäufen, wobei sie eine Veränderung oder sogar Abtötung von empfindlichen Pflanzen hervorrufen.
Bei der plastidären EPSPS, dem Hauptangriffspunkt dieser Produkte, handelt es sich um ein Enzym des aromatischen Aminosäurebiosynthesewegs, das von einem oder mehreren nukleären Genen codiert und in Form eines cytoplasmatischen Vorläufers synthetisiert und anschließend in die Plastiden importiert wird, wo es sich in seiner reifen Form anhäuft.
Die Toleranz der Pflanzen gegenüber Glyphosate und Produkten dieser Familie wird dadurch erzielt, daß man ein in bezug auf die Hemmung des Produkts dieses Gens durch Glyphosate mutiertes oder nichtmutiertes EPSPS-Gen pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs stabil in das Genom der Pflanzen einbaut. Angesichts der Wirkungsweise von Glyphosate und dem Grad der Glyphosate-Toleranz des Produkts der verwendeten Gene ist es interessant, das Produkt der Translation dieses Gens so exprimieren zu können, daß es stark in den Plastiden angehäuft werden kann.
Zum Beispiel aus dem amerikanischen Patent 4 535 060 ist es bekannt, einer Pflanze eine Toleranz gegenüber einem Herbizid des obengenannten Typs, insbesondere N-Phosphonomethylglycin oder Glyphosate, zu verleihen, und zwar dadurch, daß man in das Genom von Pflanzen ein für eine EPSPS codierendes Gen mit mindestens einer Mutation, die dieses Enzym nach der Lokalisation des Enzyms in das plastidäre Kompartiment resistenter gegen seinen kompetitiven Hemmer (Glyphosate) macht, einbringt. Um eine höhere Verläßlichkeit bei der Verwendung dieser Pflanzen unter landwirtschaftlichen Bedingungen zu erzielen, müssen diese Techniken jedoch noch verbessert werden.
EPSPSs von mutierten Pflanzen und ihre Verwendung für die Herstellung von Pflanzen mit einer verbesserten Toleranz gegenüber Glyphosate sind in den Patentanmeldungen EP 293538 , WO 91/04323 und WO 92/06201 erwähnt. In der Patentanmeldung WO 92/04449 werden sogenannte Typ-II-EPSPSs beschrieben. Weitere Gene für Toleranz gegenüber Glyphosate sind in der Patentanmeldung WO 95/06128 erwähnt.
In der vorliegenden Beschreibung versteht man unter „Pflanze" jeglichen mehrzelligen differenzierten Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, und unter „Pflanzenzelle" jegliche Zelle, die von einer Pflanze stammt und undifferenzierte Gewebe wie Kalli oder differenzierte Gewebe wie Embryonen oder Teile von Pflanzen oder Samen darstellen kann.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von transformierten Pflanzen mit einer verbesserten Toleranz gegenüber Herbiziden der Phosphonomethylglycin-Familie durch die Regeneration von mit Hilfe von neuen chimären Genen, die ein Gen für Toleranz gegenüber diesen Herbiziden enthalten, transformierten Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Gen, das für eine mutierte 5-Enolpyrovylshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) codiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens einen Threonin 102 → Isoleucin – Austausch und eine Mutation, die aus einem Austausch von Prolin 106 gegen Serin besteht, umfaßt.
Das erfindungsgemäße Gen stammt vorzugsweise aus einer Pflanze, insbesondere aus Mais.
Die Erfindung enthält ein chimäres Gen, das eine Codiersequenz sowie heterologe Regulationselemente in den Positionen 5' und 3', die in Pflanzen funktionsfähig sind, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Gen als Codiersequenz mindestens eine Sequenz eines oben beschriebenen Gens umfaßt. Das chimäre Gen umfaßt einen Pflazenviruspromotor oder einen Pflanzenpromotor (z. B. Tubulin, Histon, Introns, Actin usw.).
Außerdem betrifft die Erfindung ein chimäres Gen, das Pflanzen eine erhöhte Toleranz gegenüber einem Herbizid, das die EPSPS angreift, verleiht und das in Transkriptionsrichtung eine Promotorregion, gegebenenfalls eine Transitpeptidregion, eine Sequenz eines Gens, das für ein Glyphosatetoleranzenzym codiert und eine 3'-nichttranslatierte Polyadenylierungssignalregion umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das Glyphosatetoleranzgen im Vergleich zu dem Gen, von dem es abstammt, einen "Threonin 102 gegen Isoleucin"-Austausch in der "aroA" (EPSPS)-Region umfaßt.
Vorzugsweise umfaßt es weiterhin in der gleichen Region einen "Prolin 106 gegen Serin"-Austausch. Diese Austausche können in einer EPSPS-Sequenz beliebigen Ursprungs, insbesondere als Pflanzen, Bakterien, Algen oder Pilze, eingeführt oder darin vorhanden sein.
Die Transitpeptide, die in der Transitpeptidregion verwendet werden können, können als solche bekannt sein und pflanzlichen Ursprungs sein, z.B. aus Mais, Sonnenblume, Erbse, Tabak oder anderem stammen. Das erste und zweite Transitpeptid können identisch, analog oder unterschiedlich sein. Sie können weiterhin jeweils eine oder mehrere Transitpeptideinheiten gemäß der Europäischen Patentanmeldung EP 0508909 enthalten. Die Rolle dieser charakteristischen Region besteht darin, die Freisetzung eines reifen nativen Proteins, insbesondere der obigen mutierten EPSPS, mit einer maximalen Wirksamkeit in das Plasmidkompartiment zu ermöglichen.
Die Promotorregion des erfindungsgemäßen chimären Gens kann vorteilhaft aus mindestens einem Genpromotor oder -fragment, der bzw. das auf natürliche Weise in Pflanzen exprimiert wird, bestehen (Tubulin, Introns, Actin, Histon).
Die 3'-nichttranslatierte Transkriptionsterminationssignalregion des chimären Gens kann beliebigen Ursprungs sein, z. B. bakteriellen Ursprungs, wie diejenige des Nopalinsynthasegens, oder pflanzlichen Ursprungs, wie diejenige des Histon-Gens H4A748 aus Arabidopsis thaliana gemäß der Europäischen Patentanmeldung (Europäische Anmeldung 633 317).
Das erfindungsgemäße chimäre Gen kann zusätzlich zu den obigen wesentlichen Teilen mindestens eine nichttranslatierte Zwischenregion (Linker), die zwischen den unterschiedlichen oben beschriebenen transkribierten Regionen liegen kann, umfassen. Diese Zwischenregion kann beliebigen Ursprungs, z. B. bakteriellen, viralen oder pflanzlichen Ursprungs, sein.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor für die Transformation von Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß dieser mindestens ein wie oben definiertes chimäres Gen umfaßt.
Außerdem betrifft sie eine pflanzliche Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß diese mindestens ein wie oben definiertes chimäres Gen umfaßt.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Pflanzen mit einem Herbizid, dessen Angriffspunkt die EPSPS ist, dadurch gekennzeichnet, daß man das Herbizid auf 30 erfindungsgemäß transformierte Pflanzen ausbringt. Bei dem Herbizid handelt es sich insbesondere um Glyphosate oder um eine Glyphosate-Vorstufe.
Isolation einer cDNA, die für eine Mais-EPSPS codiert:
Die verschiedenen Schritte, die zur Gewinnung der Mais-EPSPS-cDNA, die als Substrat für die Einführung der beiden Mutationen gedient hat, führen, sind im folgenden beschrieben. Alle die im folgenden beschriebenen Arbeiten sind beispielhaft angeführt und stellen eine unter den verschiedenen Methoden, die zur Erzielung des gleichen Ergebnisses verfügbar sind, durchgeführte Wahl dar. Diese Wahl hat keinerlei Einfluß auf die Qualität des Ergebnisses, und der Fachmann kann sich daher jeder beliebigen geeigneten Methode bedienen, um zum gleichen Ergebnis zu gelangen. Die meisten DNA-Fragment-Engineeringmethoden sind in den von Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (1989) veröffentlichten „Current Protocols in Molecular Biology", Band 1 und 2, Ausubel F.M. et al., beschrieben (im folgenden werden Hinweise auf in diesem Werk beschriebene Protokolle mit der Bezeichnung „siehe CPMB" bezeichnet werden). Bei den Arbeiten, die sich mit der DNA befassen und die nach den in diesem Werk beschriebenen Protokollen durchgeführt worden sind, handelt es sich insbesondere um folgende: Ligation von DNA-Fragmenten, Behandlung mit Klenow-DNA-
Polymerase und T4-DNA-Polymerase, Präparation von Plasmid-DNA und DNA des Bakteriophagen λ in Form einer Miniprep oder Maxiprep, DNA- und RNA-Analyse nach der Southern- bzw. Northern-Technik. Es wurde auch nach anderen in diesem Werk beschriebenen Methoden vorgegangen, und im folgenden werden nur die wesentlichen Änderungen von bzw. Hinzufügungen zu diesen Protokollen beschrieben.
Beispiel 1:
1. Gewinnung eines Arabidopsis thaliana EPSPS-Fragments

a) Ausgehend von der Sequenz eines Arabidopsis thaliana EPSPS-Gens wurden zwei 20-mer-Oligonukleotide mit den Sequenzen 5'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3' bzw. 5'-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3' synthetisiert (Klee H.J. et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437-442). Diese beiden Oligonukleotide befinden sich in Position 1523 bis 1543 bzw. 1737 bis 1717 der veröffentlichten Sequenz in konvergenter Orientierung.
b) Die Gesamt-DNA von Arabidopsis thaliana (var. columbia) wurde von Clontech bezogen (Katalog-Nr.: 6970-1)
c) 50 Nanogramm (ng) DNA werden mit 300 ng jedes Oligonukleotids vermischt und mit der Mischung werden 35 Amplifikationszyklen mit einem Perkin-Elmer-Gerät, Typ 9600, unter den vom Zulieferer empfohlenen Standardumweltbedingungen für die Amplifikation durchgeführt. Das erhaltene Fragment mit einer Größe von 204 Bp stellt das Arabidopsis thaliana-EPSPS-Fragment dar.

2. Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus einer Zellinie von BMS-Mais.

a) 5 g abfiltrierte Zellen werden in flüssigem Stickstoff zerkleinert, und die Gesamtnukleinsäuren werden nach dem von Shure et al. beschriebenen Verfahren extrahiert, und zwar mit den folgenden Änderungen: – der pH-Wert des Lysepuffers wird auf pH = 9,0 eingestellt; – nach Fällung mit Isopropanol wird das Pellet in Wasser aufgenommen und nach dem Auflösen auf 2,5 M LiCl eingestellt. Nach 12stündiger Inkubation bei °C wird das Pellet, das durch Zentrifugation für 15 min bei 30 000 g bei 4°C erhalten wurde, wieder solubilisiert. Der LiCl-Fällungsschritt wird nun wiederholt. Das wieder solubilisierte Pellet stellt die RNA-Fraktion der Gesamtnukleinsäuren dar.
b) Die polyA⁺-RNA-Fraktion der RNA-Fraktion wird wie in „Current Protocols in Molecular Biology" beschrieben mittels Chromatographie an einer Oligo-dT-Zellulosesäule gewonnen.
c) Synthese von Doppelstrang-cDNA mit synthetischem EcoRI-Ende: diese wird gemäß dem Protokoll der Lieferfirma der verschiedenen für diese Synthese erforderlichen Reaktanten in Kit-Form durchgeführt: „copy kit" der Firma In Vitrogen. Zwei teilweise komplementäre Einzelstrang-Oligonukleotide mit den Sequenzen: 5'-AATTCCCGGG-3' bzw. 5'-CCCGGG-3' (wobei letztere phosphoryliert ist) werden mit den Doppelstrang-cDNAs mit glatten Enden ligiert. Diese Ligation von Adaptern führt zur Schaffung von an die Doppelstrang-cDNAs angehängten SmaI-Stellen und von EcoRI-Stellen in kohäsiver Form an jedem Ende der Doppelstrang-cDNAs.
d) Erzeugung der Bibliothek: Die cDNAs, die an ihren Enden die künstlichen kohäsiven EcoRI-Stellungen aufweisen, werden mit der cDNA des Bakteriophagen λgt10, der mit EcoRI geschnitten und dephosphoryliert wurde, nach dem Protokoll des Zulieferers New England Biolabs ligiert. Ein aliquoter Teil der Ligationsreaktion wurde in vitro mit Verkapselungsextrakten verkapselt, nämlich Gigapack Gold, nach den Anweisungen des Zulieferers, diese Bibliothek wurde mit dem Bacterium E. coli C600hf1. titriert. Die so erhaltene Bibliothek wird nach den Anweisungen desselben Zulieferers amplifiziert und aufbewahrt und bildet die cDNA-Bibliothek der BMS-Mais-Zellsuspension.

3. Durchmusterung der cDNA-Bibliothek der BMS-Mais-Zellsuspension mit der Arabidopsis thaliana EPSP-Sonde:
Man geht nach dem von Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (1989) veröffentlichten „Current Protocols in Molecular Biology", Band 1 und 2, Ausubel F.M. et al., (CPMB) vor. Kurz gesagt werden ungefähr 10⁶ rekombinante Phagen mit einer mittleren Dichte von 100 Phagen/cm² auf einer LB-Schale ausgestrichen. Die Plaques mit Lyse werden in zweifacher Wiederholung auf Hybond N Membran von Amersham repliziert.
h) Die DNA wurde auf den Filtern mittels UV-Behandlung mit 1600 kJ (Stratalinker von Stratagene) fixiert. Die Filter wurden 2 Stunden bei 65°C in 6 × SSC/0,1%SDS/0,25 Magermilch vorhybridisiert. Die Arabidopsis thaliana EPSPS-Sonde wurde mittels „Random Priming" nach den Anweisungen des Zulieferers mit ³²P-dCTP markiert (Ready-to-Go-Kit von Pharmacia). Die erhaltene spezifische Aktivität liegt bei ungefähr 10⁸ cpm pro μg Fragment. Nach 5minütigem Denaturieren bei 100°C wird die Sonde in das Vorhybridisierungsmedium gegeben, und es wird 14 Stunden bei 55°C hybridisiert. Die Filter werden 48 Stunden bei -80°C mit einem KodakXAR5 Film und Hyperscreen RPN-Verstärkerfolien von Amersham fluorographiert. Aufgrund der Ausrichtung der positiven Flecken auf dem Filter mit den Schalen, von denen sie stammen, kann man von der Schale Regionen, die den Phagen mit einer positiven Hybridisierungsreaktion mit der Arabidopsis thaliana EPSPS-Sonde entsprechen, entnehmen. Dieser Schritt des Ausstreichens, Übertragens, Hybridisierens und Gewinnens wird solange wiederholt, bis alle Spots der Platte mit den schrittweise aufgereinigten Phagen 100% positiv hybridisieren. Dann wird ein Plaque mit Lyse durch einen unabhängigen Phagen in λ-Verdünnungsmedium (Tris-Cl pH = 7,5; MgSO₄ 10 mM; NaCl 0,1 M; Gelatine 0,1g) umgesetzt, wobei diese in Lösung befindlichen Phagen die EPSP-positiven Klone der BMS-Mais-Zellsuspension darstellen.
4. Präparation und Analyse der DNA der EPSP-Klone der BMS-Mais-Zellsuspension
20 ml C600hf1-Bakterien werden mit ungefähr 5.10⁸ Phagen auf eine 2 OD von 600 nm/ml versetzt und 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Diese Suspension wird anschließend mit 200 ml Bakterienwachstumsmedium in einem 11 Erlenmeyer Kolben verdünnt und bei 250 U/min am Rotationsschüttler geschüttelt. Die Lyse wird aufgrund der Klärung des Mediums beobachtet, was der Lyse der trüben Bakterien entspricht und nach ungefähr 4 Stunden Schütteln stattfindet. Dieser Überstand wird nun wie in „Current Protocols in Molecular Biology" beschrieben behandelt. Die erhaltene DNA entspricht den EPSP-Klonen der BMS-Mais-Zellsuspension.
Ein bis zwei μg dieser DNA werden mit EcoRI geschnitten und auf 0,8% LGTA/TBE-Agarosegel getrennt (siehe CPMB). Eine letzte Überprüfung besteht darin, daß die aufgereinigte DNA tatsächlich ein Hybridisierungssignal mit der Arabidopsis thaliana EPSPS-Sonde gibt. Nach der Elektrophorese werden die DNA-Fragmente auf Hybond N Membran von Amersham übertragen, und zwar nach dem in „Current Protocols in Molecular Biology" beschriebenen Protokoll von Southern. Das Filter wird mit der Arabidopsis thaliana EPSPS-Sonde nach den in Abschnitt 3 oben beschriebenen Bedingungen hybridisiert. Der Klon, der ein Hybridisierungssignal mit der Arabidopsis thaliana EPSPS-Sonde aufweist und das längste EcoRI-Fragment enthält, weist eine auf Gel geschätzte Größe von ungefähr 1,7 kBp auf.
5. Gewinnung des Klons pRPA-ML-711:
Zehn μg DNA des Phagenklons, der das 1,7 kBp große Insert enthält, werden mit EcoRI verdaut und auf 0,8% LGTA/TBE-Agarosegel getrennt (siehe CPMB). Das Gelfragment, das das 1,7 kBp große Insert enthält, wird mittels BET-Färbung aus dem Gel herausgeschnitten, und das Fragment wird nach dem Protokoll des Zulieferers New England Biolabs mit β-Agarase behandelt. Die aufgereinigte DNA des 1,7 kBp großen Fragments wird 14 Stunden bei 12°C mit der DNA des mit EcoRI geschnittenen Plasmids pUC 19 (New England Biolabs) nach dem in „Current Protocols in Molecular Biology" beschriebenen Ligationsprotokoll ligiert. Zwei μl der obigen Ligationsmischung werden für die Transformation eines aliquoten Teils von elektrokompetenten E. coli DH10B verwendet; die Transformation wird mittels Elektroporation durchgeführt, und zwar unter den folgenden Bedingungen: die Mischung der kompetenten Bakterien und des Ligationsmediums wird in eine 0,2 cm dicke Elektroporationsküvette (Biorad), die zuvor auf 0°C gekühlt wurde, gegeben. Die physikalischen Bedin gungen der mit einem Elektroporationsgerät Marke „Biorad" durchgeführten Elektroporation betragen 2500 Volt, 25 μ Farad und 200 Ω. Unter diesen Bedingungen beträgt die mittlere Entladungszeit des Kondensators ungefähr 4,2 Millisekunden. Die Bakterien werden dann in 1 ml SOC-Medium (siehe CPMB) aufgenommen und 1 Stunde bei 200 U/min auf einem Rotationsschüttler in 15-ml-Corning-Röhrchen geschüttelt. Nach dem Ausplattieren auf LB-Medium/Agar mit Zusatz von 100 μg/ml Carbenicillin werden mit Bakterienklonen, die nach einer Nacht bei 37°C gewachsen sind, Minipreps nach dem in „Current Protocols in Molecular Biology" beschriebenen Protokoll durchgeführt. Nach Verdauung der DNA mit EcoRI und elektrophoretischer Trennung auf 0,8% LGTA/TBE-Agarosegel (siehe CPMB) werden die Klone, die ein 1,7 kBp großes Insert aufweisen, zurückbehalten. Eine letzte Überprüfung besteht darin, daß die auf gereinigte DNA tatsächlich ein Hybridisierungssignal mit der Arabidopsis thaliana EPSPS-Sonde gibt. Nach der Elektrophorese werden die DNA-Fragmente auf Hybond N Membran von Amersham übertragen, und zwar nach dem in „Current Protocols in Molecular Biology" beschriebenen Protokoll von Southern. Das Filter wird mit der Arabidopsis thaliana EPSPS-Sonde nach den in Abschnitt 3 oben beschriebenen Bedingungen hybridisiert. Der Plasmidklon, der ein 1,7 kBp großes Insert aufweist, und mit der Arabidopsis thaliana EPSPS-Sonde hybridisiert, wurde im größeren Maßstab präpariert, und die DNA aus der Lyse der Bakterien wurde wie in „Current Protocols in Molecular Biology" beschrieben an einem CsCl-Gradienten aufgereinigt. Die aufgereinigte DNA wurde mit einem Pharmacia-Kit gemäß den Anweisungen des Zulieferers ansequenziert, und zwar unter Verwendung der vom gleichen Zulieferer bezogenen M13-Universalprimer (Vorwärts- und Rückwärtsprimer). Die erhaltene Teilsequenz deckt ungefähr 0,5 kBp ab. Die abgeleitete Aminosäuresequenz in der Region des reifen Proteins (ungefähr 50 Aminosäurereste) weist 100% Identität mit der entsprechenden Aminosequenz der in dem amerikanischen Patent USP 4 971 908 beschriebenen reifen Mais-EPSPS auf. Dieser Klon entspricht einem 1,7 kBp großen EcoRI-Fragment der DNA der EPSP der BMS-Mais-Zellsuspension und wurde mit der Bezeichnung pRPA-ML-711 versehen. Die vollständige Sequenz dieses Klons wurde an beiden Strängen bestimmt, und zwar unter Verwendung des Protokolls des Pharmacia-Kits und durch Synthese von komplementären Oligonukleotiden sowie von Oligonukleotiden in umgekehrter Orientierung ungefähr alle 250 Bp. Die vollständige Sequenz, die von diesem 1713 Bp großen Klon erhalten wurde, ist in SEQ ID Nr. 1 dargestellt.
6. Gewinnung des Klons pRPA-ML-715:
Die Analyse der Sequenz des Klons pRPA-ML-711, insbesondere der Vergleich der Sequenz der abgeleiteten Aminosäuren mit der des Mais, zeigt eine Sequenzverlängerung von 92 Bp stromaufwärts des GCG-Codons, das für das NH2-terminale Alanin des reifen Abschnitts der Mais-EPSPS codiert (amerikanisches Patent USP 4 971 908). Es wird auch eine 288 Bp große Verlängerung stromabwärts des AAT-Codons, das für das COOH-terminale Asparagin des reifen Abschnitts der Mais-EPSPS codiert (amerikanisches Patent USP 4 971 908), beobachtet. Diese beiden Abschnitte könnten im Fall der NH2-terminalen Verlängerung einen Abschnitt der Sequenz eines Transitpeptids für plastidäre Lokalisation und im Fall der COOH-terminalen Verlängerung der 3'-nichttranslatierten Region der cDNA entsprechen.
Um zu einer cDNA zu gelangen, die für den reifen Abschnitt der cDNA der Mais-EPSPS, wie sie in USP 4 971 908 beschrieben ist, codiert, wurden die folgenden Arbeitsschritte durchgeführt:
a) Entfernung der untranslatierten 3'-Region: Konstruktion von pRPA-ML-712:
Der Klon pRPA-ML-711 wurde mit dem Restriktionsenzym AseI geschnitten und die aus diesem Schnitt hervorgehenden Enden wurden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I nach dem in CPMB beschriebenen Protokoll aufgefüllt. Dann wurde ein Schnitt mit dem Restriktionsenzym SacII durchgeführt. Die aus diesen Arbeitsschritten hervorgehende DNA wurde mittels Elektrophorese an 1% LGTA/TBE-Agarosegel (siehe CPMB) getrennt.
Das Gelfragment, das das 0,4 kBp große Insert „AseI-glatte Ende/SacII" enthielt, wurde aus dem Gel herausgeschnitten und nach dem in Abschnitt 5 oben beschriebenen Protokoll aufgereinigt. Die DNA des Klons pRPA-ML-711 wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII im Polylinker des Klonierungsvektors pUC19 geschnitten und die Enden, die mit diesem Schnitt erhalten wurden, wurden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I aufgefüllt. Dann wurde ein Schnitt mit dem Restriktionsenzym SacII durchgeführt. Die DNA, die dadurch erhalten wurde, wurde mittels Elektrophorese an 0,7% LGTA/TBE-Agarosegel (siehe CPMB) getrennt.
Das Gelfragment, das das ungefähr 3,7 kBp große Insert „HindIII-glatte Enden/SacII" enthielt, wurde aus dem Gel herausgeschnitten und nach dem in Abschnitt 5 oben beschriebenen Protokoll aufgereinigt.
Die beiden Inserts wurden ligiert und 2 μl des Ligationsansatzes wurden zur Transformation von E. coli DH10B verwendet, wie dies oben in Abschnitt 5 beschrieben ist.
Der Plasmid-DNA-Gehalt von unterschiedlichen Klonen wird nach der für pRPA-ML-711 beschriebenen Vorgehensweise analysiert. Einer der selektierten Plasmidklone enthält ein ungefähr 1,45 kBp großes EcoRI-HindIII-Insert. Die Sequenz der terminalen Enden dieses Klons zeigt, daß das 5'-Ende des Inserts genau dem entsprechenden Ende von pRPA-ML-711 entspricht und daß das 3'-terminale Ende die folgende Sequenz aufweist:
„5'...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3'".
Die unterstrichene Sequenz entspricht dem Codon der COOH-terminalen Aminosäure Asparagin, während das folgende Codon dem Translationsstoppcodon entspricht. Die Nukleotide stromabwärts entsprechen Sequenzelementen des pUC19-Polylinkers. Dieser Klon, der die pRPA-ML-711-Sequenz bis zur Translationsterminationsstelle der reifen Mais-EPSPS und im Anschluß daran Sequenzen des pUC 19-Polylinkers bis zur HindIII-Stelle enthält, wurde mit der Bezeichnung pRPA-ML-712 versehen.
b) Modifikation des 5'-Endes von pRPA-ML-712: Konstruktion von pRPA-ML-715
Der Klon pRPA-ML-712 wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und HindIII geschnitten. Die hierdurch entstehende DNA wurde durch Elektrophorese an 0,8% LGTA/TBE-Agarosegel (siehe CPMB) getrennt. Das Gelfragment, das das 1,3 kBp große PstI/EcoRI-Insert enthielt, wurde aus dem Gel herausgeschnitten und nach dem in Abschnitt 5 oben beschriebenen Protokoll aufgereinigt. Dieses Insert wurde in Gegenwart einer äquimolaren Menge von jedem der beiden teilweise komplementären Oligonukleotide mit der Sequenz
Oligo 1: 5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3'
Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3'
sowie in Gegenwart von DNA des mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII verdauten Plasmids pUC19 ligiert.
Zwei μl des Ligationsansatzes dienten zur Transformation von E. coli DH10B, wie dies weiter oben in Abschnitt 5 beschrieben ist. Nach der Analyse des Plasmid-DNA-Gehalts von unterschiedlichen Klonen nach der oben in Abschnitt 5 beschriebenen Vorgehensweise wurde einer der Klone mit einem ungefähr 1,3 kBp großen Insert für weitere Analysen aufbewahrt. Die Sequenz des 5'-terminalen Endes des aufbewahrten Klons zeigt, daß die DNA-Sequenz in dieser Region folgendermaßen lautet: Sequenz des pUC19-Polylinkers von der EcoRI- bis zur BamHI-Stelle sowie im Anschluß daran die Sequenz der bei der Klonierung verwendeten Oligonukleotide und im Anschluß daran der Rest der in pRPA-ML-712 vorliegenden Sequenz. Dieser Klon wurde mit der Bezeichnung pRPA-ML-713 versehen. Dieser Klon weist ein ATG-Methionincodon auf, das in einer NcoI-Stelle stromaufwärts des N-terminalen Alanincolons der reifen EPSPS-Synthase vorliegt. Weiterhin wurden die Alanin- und Glycincodons des N-terminalen Endes konserviert, jedoch unter Modifikation an der dritten variablen Base: Das ursprünglich vorhandene GCGGGT ergibt das modifizierte GCCGGC.
Der Klon pRPA-ML-713 wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII geschnitten, und die Enden dieses Schnitts wurden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt. Dann wurde ein Schnitt mit dem Restriktionsenzym SacI durchgeführt. Die aus diesen Arbeitsschritten hervorgehende DNA wurde mittels Elektrophorese an 0,8% LGTA/TBE-Agarosegel (siehe CPMB) getrennt. Das Gelfragment, das das 1,3 kBp große Insert „HindIII-glatte Enden/SacI" wurde aus dem Gel herausgeschnitten und gemäß dem in Abschnitt 5 oben beschriebenen Protokoll aufgereinigt. Dieses Insert wurde in Gegenwart von DNA des mit dem Restriktionsenzym XbaI verdauten Plasmids pUC19 ligiert, und die Enden dieses Schnitts wurden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I aufgefüllt. Anschließend wurde ein Schnitt mit dem Restriktions enzym SacI durchgeführt. Zwei μl des Ligationsansatzes dienten zur Transformation von E. coli DH10B, wie dies weiter oben in Abschnitt 5 beschrieben ist. Nach der Analyse des Plasmid-DNA-Gehalts von unterschiedlichen Klonen nach der oben in Abschnitt 5 beschriebenen Vorgehensweise wurde einer der Klone mit einem ungefähr 1,3 kBp großen Insert für weitere Analysen aufbewahrt. Die Sequenz der terminalen Enden des aufbewahrten Klons zeigt, daß die DNA-Sequenz folgendermaßen lautet: Sequenz des pUC19-Polylinkers von der EcoRI- bis zur SacI-Stelle sowie im Anschluß daran die um die 4 Bp GATCC des oben beschriebenen Oligonukleotids 1 deletierte Sequenz der bei der Klonierung verwendeten Oligonukleotide und im Anschluß daran der Rest der in pRPA-ML-712 vorliegenden Sequenz bis zur HindIII-Stelle, sowie Sequenz des pUC19-Polylinkers von XbaI bis HindIII. Dieser Klon wurde mit der Bezeichnung pRPA-ML-715 versehen.
7) Gewinnung einer cDNA, die für eine mutierte Mais-EPSPS codiert
Alle Mutageneseschritte wurden mit dem U.S.E.-Mutagenesekit von Pharmacia durchgeführt, wobei den Anweisungen des Zulieferers gefolgt wurde. Das Prinzip dieses Mutagenesesystems lautet folgendermaßen: die Plasmid-DNA wird hitzedenaturiert und in Gegenwart eines molaren Überschusses von erstens dem Oligonukleotid der Mutagenese und zweitens einem Oligonukleotid, mit dem eine einzelne in dem Polylinker vorhandene Restriktionsenzymstelle entfernt werden kann, reassoziieren gelassen. Nach dem Reassoziationsschritt wird die Synthese des Komplementärstrangs durch Einwirkung der T4-DNA-Polymerase in Gegenwart der T4-DNA-Ligase und des Proteins von Gen 32 in einem bereitgestellten geeigneten Puffer durchgeführt. Das Syntheseprodukt wird in Gegenwart des Restriktionsenzyms, dessen Stelle während der Mutagenese verschwinden sollte, inkubiert. Der E. coli-Stamm, der insbesondere die mutS-Mutation trägt, wird als Wirt für die Transformation dieser DNA verwendet. Nach Wachstum im Flüssigmedium wird die Plasmid-Gesamt-DNA präpariert und in Gegenwart des zuvor verwendeten Restriktionsenzyms inkubiert. Nach diesen Behandlungen verwendet man den E. coli-Stamm DH10B als Wirt für die Transformation. Die Plasmid-DNA der isolierten Klone wird präpariert, und das Vorhandensein der eingeführten Mutation wird durch Sequenzierung überprüft.

A) – Modifikationen von Stellen oder Sequenzen ohne im Prinzip den EPSPS-Resistenzcharakter von Mais gegenüber Produkten, die kompetitive Hemmer der EPSP-Synthaseaktivität darstellen, zu beeinflussen: Elimination einer internen NcoI-Stelle aus pRPA-ML-715.

Die Sequenz von pRPA-ML-715 wird willkürlich dadurch numeriert, daß man die erste Base des N-terminalen Alanin-Codons GCC als Position 1 betrachtet. Diese Sequenz weist eine NcoI-Stelle in Position 1217 auf. Das stellenmodifizierte Oligonukleotid weist die folgende Sequenz auf:
5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'.
Nach Sequenzierung gemäß den oben angegebenen Literaturstellen entspricht die nach der Mutagenese gelesene Sequenz derjenigen des verwendeten Oligonukleotids. Die NcoI-Stelle ist tatsächlich eliminiert worden, und die Translation in dieser Region in Aminosäuren konserviert die ursprünglich auf pRPA-ML-715 vorliegende Sequenz.
Dieser Klon wurde mit der Bezeichnung pRPA-ML-716 versehen.
Die 1340 Bp große Sequenz dieses Klons ist in SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 3 dargestellt.

B) Sequenzmodifikationen, mit Hilfe deren der EPSPS-Resistenzcharakter von Mais gegen Produkte, bei denen es sich um kompetitive Hemmer der EPSP-Synthaseaktivität handelt, verstärkt werden kann.

Es wurden die folgenden Oligonukleotide verwendet:

a) Mutation Thr 102 → Ile. 5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'
b) Mutation Pro 106 → Ser. 5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
c) Mutationen Gly 101 → Ala und Thr 102 → Ile. 5'-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3'
d) Mutationen Thr 102 → Ile und Pro 106 → Ser. 5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'

Nach der Sequenzierung ist die nach Mutagenese an den drei mutierten Fragmenten gelesene Sequenz identisch mit der pRPA-ML-716-Eltern-DNA-Sequenz, mit Ausnahme der mutagenisierten Region, die derjenigen der verwendeten Mutageneseoligonukleotide entspricht. Diese Klone wurden dann mit den folgenden Bezeichnungen versehen: pRPA-ML-717 für die Mutation Thr 102 → Ile, pRPA-ML-718 für die Mutation Pro 106 → Ser, pRPA-ML-719 für die Mutationen Gly 101 → Ala und Thr 102 → Ile sowie pRPA-ML-720 für die Mutationen Thr 102 → Ile und Pro 106 → Ser.
Die 1340 Bp große Sequenz von pRPA-ML-720 ist in SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 dargestellt.
Das 1395 Bp große NcoI-HindIII-Insert bildet die Grundlage für alle Pflanzentransformationskonstrukte, die für die Einschleusung von Resistenz gegen Herbizide des Typs kompetitive EPSPS-Hemmer, insbesondere Resistenz gegen Glyphosate, verwendet werden. In den folgenden Beschreibungen wird dieses Insert „Mais-EPSPS-Doppelmutante" genannt werden.
Beispiel 2:
Glyphosatetoleranz von unterschiedlichen Mutanten in vitro.
2.a: Extraktion der EPSP-Synthase.
Die verschiedenen Gene für EPSP-Synthasen werden in Form einer NcoI-HindIII-Kassette in dem mit NcoI und HindIII geschnittenen Plasmidvektor pTrc99a (Pharmacia, Nr.: 27-5007-01) eingeführt. Die rekombinanten E. coli DH10B, die die verschiedenen EPSP-Synthasen überexprimieren, werden in 40 ml Puffer pro 10 g Zellpellett mit Ultraschall behandelt und mit dem gleichen Puffer (Tris-HCl 200 mM pH 7,8, Mercaptoethanol 50 mM, EDTA 5 mM und PMSF 1 mM), der mit 1 g Polyvinylpyrrolidon versetzt wird, gewaschen. Die Suspension wird 15 Minuten bei 4°C geschüttelt und anschließend 20 Minuten bei 27 000 g und 4°C zentrifugiert.
Der Überstand wird mit Ammoniumsulfat versetzt, um die Lösung zu 40% mit Ammoniumsulfat zu sättigen. Der Ansatz wird 20 Minuten bei 27 000 g und 4°C zentrifugiert. Dieser Überstand wird mit Ammoniumsulfat versetzt, um die Lösung auf 70% Sättigung mit Ammoniumsulfat zu bringen. Der Ansatz wird 30 Minuten bei 27 000 g und 4°C zentrifugiert. Die EPSP-Synthase, die in dem Proteinpellet vorliegt, wird in 1 ml Puffer (Tris-HCl 20 mM pH 7,8 und Mercaptoethanol 50 mM) aufgenommen. Diese Lösung wird eine Nacht gegen zwei Liter des gleichen Puffers bei 4°C dialysiert.
2.b: Enzymaktivität
Die Aktivität jedes Enzyms sowie seine Resistenz gegen Glyphosate wird in vitro 10 Minuten bei 37°C in der folgenden Reaktionsmischung bestimmt: Maleinsäure 100 mM pH 5,6, Phosphorenolpyruvat 1 mM, Shikimat-3-phosphat 3 mM (Herstellung gemäß Knowles P.F. und Sprinson D.B. 1970, Methods in Enzymol 17A, 351-352 aus Aerobacter aerogenes Stamm ATCC 25597) sowie Kaliumfluorid 10 mM. Der Enzymextrakt wird im letzten Moment nach der Zugabe von Glyphosate, dessen Endkonzentration im Bereich von 0 bis 20 mM liegt, zugegeben.
Die Aktivität wird durch quantitative Bestimmung des freigesetzten Phosphats nach der Methode von Tausky H.A. und Shorr E. 1953, J. Biol. Chem. 202, 675-685 bestimmt.
Unter diesen Bedingungen wird das Wildtyp(WT)-Enzym von der Konzentration 0,12 mM Glyphosate schon zu 85% gehemmt. Bei dieser Konzentration wird die unter der Bezeichnung Ser106 bekannte Enzymmutante nur zu 50% gehemmt, und die drei anderen Mutanten Ile102, Ile102/Ser106, Ala101/Ile102 werden nicht oder nur wenig gehemmt.
Um die Enzymmutante Ile102 zu 50% zu hemmen, muß die Glyphosatekonzentration mit 10 multipliziert werden, was 1,2 mM ergibt, wobei die Mutanten Ile102/Ser106, Ala/Ile und Ala noch immer nicht gehemmt werden.
Es ist anzumerken, daß die Aktivität der Mutanten Ala/Ile und Ala bis zu Glyphosatekonzentrationen von 10 mM nicht inhibiert wird und diejenige der Mutante Ile202/Ser106 nicht reduziert wird, auch wenn die Glyphosatekonzentration mit 2 multipliziert wird, also 20 mM beträgt.
Beispiel 3
Resistenz von transformierten Tabakpflanzen
1-1- Transformation
Der Vektor pRPA-RD-173 wird in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA 101 (Hood et al., 1987), der das Cosmid pTVK291 (Komari et al., 1986) trägt, eingeführt. Die Transformationsmethode beruht auf der Vorgehensweise von Horsh et al. (1985).
1-2- Regeneration
PBD6-Tabak (Herkunft: SEITA, Frankreich) wird ausgehend von Blattexplantaten auf einem Medium, das auf Murashige und Skoog (MS) basiert und 30 g/l Saccharose sowie 200 μg/ml Kanamycin enthält, regeneriert. Die Blattexplantate werden von im Glashaus oder in vitro kultivierten Pflanzen entnommen und mittels der Blattscheibentechnik (Science, 1985, Band 227, S. 1229-1231) in drei aufeinanderfolgenden Schritten transformiert: der erste umfaßt die Induktion von Sprossen auf einem Medium, das mit 30 g/l Saccharose versetzt wurde und 0,05 mg/l Naphthylessigsäure (NAA) sowie 2 mg/l Benzylaminopurin (BAP) enthält, über einen Zeitraum von 15 Tagen. Die während dieses Abschnitts gebildeten Sprosse werden anschließend 10 Tage durch Kultur auf einem MS-Medium, das mit 30 g/l Saccharose versetzt worden ist, jedoch keine Hormone enthält, entwickeln gelassen. Anschließend entnimmt man entwickelte Sprosse und kultiviert sie auf MS-Bewurzelungsmedium mit einem halben Gehalt an Salzen, Vitaminen und Zucker in Abwesenheit von Hormonen. Nach ungefähr 15 Tagen werden die bewurzelten Sprosse in Erde umgesetzt.
1-3- Resistenz gegen Glyphosate
Für das Konstrukt pRPA-RD-173 wurden zwanzig transformierte Pflanzen regeneriert und ins Glashaus umgesetzt. Diese Pflanzen wurden im Glashaus im 5-Blatt-Stadium mit einer wäßrigen RoundUp-Suspension, die 0,8 kg Glyphosate-Wirkstoff pro Hektar entspricht, behandelt.
Die Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung von 3 Wochen nach der Behandlung aufgetretenen Phytotoxizitätsindizes überein. Unter diesen Bedingungen findet man, daß die mit dem Konstrukt pRPA-RD-173 transformierten Pflanzen eine sehr gute Toleranz aufweisen, während die untransformierten Kontrollpflanzen völlig abgestorben sind.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich die durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen chimären Gens verursachte Verbesserung im Vergleich zu dem gleichen, für Glyphosatetoleranz codierenden Gen.
Beispiel 4:
Transformation und Selektion von Maiszellen
Zellen von BMS-Mais (Black Mexican Sweet) in der exponentiellen Wachstumsphase werden nach dem von Klein et al. 1987 (Klein TM, Wolf ED, Wu R und Sandford JC (1987): High Velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells [Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektile für die Abgabe von Nukleinsäuren in lebende Zellen] NATURE, Band 327, S. 70-73) beschriebenen Prinzip und Protokoll mit dem Konstrukt pRPA-RD-130 beschossen.
Zwei Tage nach dem Beschuß werden die Zellen auf das gleiche Medium, das 2 mM N(Phosphomethyl)glycin enthält, umgesetzt.
Nach 8 Wochen Selektion auf diesem Medium werden sich entwickelnde Kalli selektiert und anschließend mittels PCR amplifiziert und analysiert und zeigen deutlich das Vorhandensein des chimären Gens PTO-EPSPS.
Die nicht beschossenen Zellen, die auf dem gleichen Medium, das 2 mM N(Phosphomethylglycin) enthält, gezüchtet werden, werden durch das Herbizid blockiert und entwickeln sich nicht.
Die erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen können als Eltern für die Gewinnung von Linien und von Hybriden mit dem phänotypischen Merkmal, das der Expression des eingeführten chimären Gens entspricht, verwendet werden.
Beschreibung der Konstruktion von Plasmiden
pRPA-RD-124: Hinzufügung eines „nos"-Polyadenylierungssignals zu pRPA-ML-720 führt zu einer Klonierkassette, die das doppelt mutierte Mais-EPSPS-Gen (Thr 102 → Ile und Pro 106 → Ser) enthält. pRPA-ML-720 wird mit Hind III verdaut, mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I behandelt, wodurch ein glattes Ende erzeugt wird. Es wird ein zweiter Verdau mit Nco I durchgeführt, und das EPSPS-Fragment wird auf gereinigt. Das EPSPS-Gen wird anschließend mit dem gereinigten pRPA-RD-12 ligiert (eine Klonierungskassette, die das Polyadenylierungssignal der Nopalinsynthase enthält), wodurch man zu pRPA-RD-124 gelangt. Zur Gewinnung des nützlichen aufgereinigten Vektors pRPA-RD-12 mußte dieser zuvor mit SalI verdaut, mit Klenow-DNA-Polymerase behandelt und anschließend ein zweites Mal mit NcoI verdaut werden.
pRPA-RD-125: Hinzufügung eines optimierten Transitpeptids (OTP) zu pRPA-RD-124 führt zur Erzeugung einer Klonierungskassette, die das an die Plasmide zielgesteuerte EPSPS-Gen enthält. pRPA-RD-7 (europäische Patentanmeldung EP 652 286 ) wird mit Sph I verdaut, mit der T4-DNA-Polymerase behandelt und anschließend mit Spe 1 verdaut, und das OTP-Fragment wird aufgereinigt. Dieses OTP-Fragment wird in den zuvor mit NcoI verdautem pRPA-RD-124 kloniert, mit Klenow-DNA-Polymerase behandelt, um den hervorstehenden 3'-Abschnitt zu entfernen, und anschließend mit Spe I verdaut. Dieser Klon wird nun sequenziert, um eine korrekte translationelle Fusion zwischen OTP und dem EPSPS-Gen zu gewährleisten. Auf diese Weise erhält man pRPA-RD-125.
pRPA-RD-130: Hinzufügung des H3C4-Histonpromotors aus Mais und von adh1 Intron 1 Sequenzen aus pRPA-RD-123 (europäische Patentanmeldung EP 507 698 ) zu pRPA-RD-125 führt zur Erzeugung einer Pflanzenexpressionskassette für die Expression der EPSPS Gen-Doppelmutante in den Geweben von Monokotyledonen. pRPA-RD-123 (eine Kassette, die den H3C4-Histonpromotor von Mais in Fusion mit dem Intron 1 adhl enthält) wird mit Nco I und Sac I verdaut. Das DNA-Fragment, das den von pRPA-RD-123 abgeleiteten Promotor enthält, wird anschließend aufgereinigt und mit dem zuvor mit Nco I und Sac I verdauten pRPA-RD-125 ligiert.
pRPA-RD-159: Hinzufügung des H4A748-Histon-Doppelpromotors von Arabidopsis (europäische Patentanmeldung EP 507 698 ) zu pRPA-RD-125 führt zur Erzeugung einer Pflanzenexpressionskassette für die Expression des Gens „OTP – doppelt mutiertes EPSPS-Gen" in den Geweben von Dikotyledonen. pRPA-RD-132 (eine Kassette, die den H4A748-Doppelpromotor (europäische Patentanmeldung EP 507 698 ) enthält) wird mit Nco I und Sac I verdaut. Das aufgereinigte Fragment des Promotors wird anschließend in den mit Eco I und Sac I verdauten kloniert.
pRPA-RD-173: Hinzufügung des Gens „H4A748-Promotor OTP – doppelmutiertes EPSPS – Gen" von pRPA-RD-159 zu dem Plasmid pRPA-BL-150A (europäische Patentanmeldung 508 909) führt zu einem Agrobacterium tumefaciens Transformationsvektor. pRPA-RD-159 wird mit Not I verdaut und mit Klenow-Polymerase behandelt. Dieses Fragment wird anschließend mit Sma I in pRPA-BL-150A kloniert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transformierte Pflanze mit einer verbesserten Toleranz gegen Herbizide der Phosphormethylglycinfamilie, wobei man diese Pflanze durch Regeneration von transformierten Zellen, die ein chimäres Gen, das in Transkriptionsrichtung eine Promotorregion, die sich aus mindestens einem Promotor oder Promotorfragment eines Gens, das auf natürliche Weise in den Pflanzen exprimiert wird, zusammensetzt, eine Leitpeptidregion, die das Targeting eines reifen Proteins in das plastidäre Kompartiment gestattet, eine Sequenz eines Gens, das für ein Glyphosate-Toleranzenzym codiert, sowie eine 3'-untranslatierte Transkriptionsterminationssignalregion, umfaßt, enthalten, erhält, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Glyphosate-Toleranzenzym um eine mutierte 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) pflanzlichen Ursprungs, die mindestens eine Substitution von Threonin 102 durch Isoleucin und eine Substitution von Prolin 106 durch Serin umfaßt.
Pflanze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die EPSPS aus Mais stammt.
Pflanze nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die EPSPS die durch SEQ ID Nr. 5 dargestellte Peptidsequenz umfaßt.
Pflanze nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz eines Gens, das für ein Glyphosate-Toleranzenzym codiert, den Codierabschnitt der durch SEQ ID Nr. 4 dargestellten DNA-Sequenz umfaßt.
Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotorregion einen Pflanzenviruspromotor umfaßt.
Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotorregion einen Pflanzenpromotor umfaßt.
Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotorregion ein Fragment eines Promotors eines Gens, das natürlicherweise in den Pflanzen exprimiert wird, umfaßt.
Pflanze nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fragment eines Promotors, der natürlich in diesen Pflanzen exprimiert wird, um ein Aktin-Intron handelt.
Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Leitpeptidregion eine oder mehrere Leitpeptideinheiten umfaßt.
Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die 3'-untranslatierte Transkriptionsterminationssignalregion aus der des Nopalinsynthasegens oder der des Histon-Gens H4A748 von Arabidopsis thaliana gewählt wird.
Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit verbesserter Toleranz gegen ein Herbizid, der die EPSP-Synthase als Angriffsort dient, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzenzellen oder protoplasten mit einem definierten Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 transformiert und die transformierten Zellen regeneriert.
Pflanze mit einer verbesserten Toleranz gegen Herbizide der Phosphomethylglyceninfamilie, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Kreuzung, bei der die transformierten Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder die nach dem Verfahren nach Anspruch 11 erhaltenen Pflanzen verwendet werden, hervorgeht, wobei sich die Pflanze aus Zellen zusammensetzt, die ein chimäres Gen, das in Transkriptionsrichtung eine Promotorregion, die sich aus mindestens einem Promotor oder Promotorfragment eines Gens, das auf natürliche Weise in den Pflanzen exprimiert wird, zusammensetzt, eine Leitpeptidregion, die das Targeting eines reifen Proteins in das plastidäre Kompartiment gestattet, eine Sequenz eines Gens, das für ein Glyphosate-Toleranzenzym codiert, sowie eine 3'-untranslatierte Transkriptionsterminationssignalregion, umfaßt, umfassen, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Glyphosate-Toleranzenzym um eine mutierte 5-Enolpyrovylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) pflanzlichen Ursprungs, die mindestens eine Substitution von Threonin 102 durch Isoleucin und eine Substitution von Prolin 106 durch Serin umfaßt.
Verfahren zur Behandlung von Pflanzen mit einem Herbizid, dem die EPSPS als Angriffspunkt dient, dadurch gekennzeichnet, daß man das Herbizid auf Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 oder 12 oder Pflanzen, die nach dem Verfahren nach Anspruch 11 erhalten wurden, ausbringt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Herbizid um Glyphosate oder eine Glyphosate-Vorstufe handelt.