RO120849B1 - 5-enolpiruvilshikimat-3-fosfat sintază, genă carecodifică această proteină şi plante care conţin această genă - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o proteină mutantă 5-enolpiruvilshikimat-3-fosfat sintază (EPSPS), care prezintă toleranţă mărită faţă de erbicide care sunt inhibitori competitivi faţă de fosfoenolpiruvat (PEP) al activităţii EPSPS, la o genă care codifică o astfel de proteină şi la celule de plante transformate în constructele genei himerice, care conţin această genă.

Description

Invenția se referă la o proteină mutantă 5-enolpiruvilshikimat-3-fosfat sintază (sau EPSPS), care prezintă toleranță mărită față de erbicide, care sunt inhibitori competitivi față de fosfoenolpiruvat (PEP) al activității EPSPS. Această EPSP sintază mai tolerantă posedă cel puțin o substituție de treonină cu izoleucină. Invenția se referă, de asemenea, la o genă care codifică o astfel de proteină, la celule de plante transformate prin constructele genei himerice care conțin această genă, la plante regenerate din aceste celule și, de asemenea, la plante care provin din încrucișarea care folosește aceste plante transformate.

Glifosatul, sulfosatul și fosametina sunt erbicide sistemice cu spectru larg, din familia fosfonometilglicinei. Ele acționează, în principal, ca inhibitori competitivi ai 6-enolpiruvilshikimat-3-fosfat sintazei (EC 2.5.1.19) sau EPSPS față de PEP (fosfoenolpiruvat). După aplicarea lor pe plante, acestea sunt translocate în plante, unde se acumulează în părțile cu creștere rapidă, în special, vârfurile coulinare și rădăcinii, producând daune la punctul de distrugere al plantelor sensibile.

Plastida EPSPS, ținta principală a acestor produși, este o enzimă din calea de biosinteză a aminoacizilor aromatici, care este codificată de una sau mai multe gene nucleice și sintetizată sub forma unui precursor citoplasmic, apoi importat în plastide, unde se acumulează în forma lor matură.

Toleranța plantelor la glifosat și la produșii respectivei familii se obține prin introducerea stabilă în genomul lor a unei gene EPSPS, de origine vegetală sau bacteriană, care este mutantă, sau în alt fel față de caracteristicile de inhibare prin glifosat al produsului acestei gene. Având în vedere modul de acțiune al glifosatului și al gradului de toleranță la glifosat al produsului genelor folosite, este avantajos de a putea exprima produsul translației acestei gene, astfel încât să fie acumulată în cantități substanțiale în plastide.

Se cunoaște, de exemplu, din US 4535060, că pentru a conferi unei plante o toleranță la un erbicid de tipul de mai sus, în special, la N-fosfonometilglicină sau glifosat, prin introducerea în genomul plantelor a genei care codifică un EPSPS, care are cel puțin o mutație care face această enzimă mai rezistentă la inhibitorul său competitiv (glifosat) după localizarea enzimei în compartimentul plastid. Aceste tehnici, totuși, necesită a fi îmbunătățite pentru a obține o încredere mai mare în utilizarea acestor plante în condiții agricole.

în prezenta descriere, prin plantă se înțelege orice organism multicelular diferențiat, capabil de fotosinteză, și prin celulă de plantă se înțelege orice celulă provenită dintr-o plantă care este capabilă de a forma țesuturi nediferențiate, cum ar fi călușurile, sau țesuturile diferențiate, cum ar fi embrionii sau părți ale plantei sau ale semințelor.

Obiectul prezentei invenții îl constituie producerea de plante transformate, care au toleranță mărită la erbicide din familia fosfonometilglicinei, prin regenerarea celulelor transformate cu ajutorul genelor himerice noi care conțin o genă de toleranță la aceste erbicide.

Invenția se referă, de asemenea, la o genă himerică pentru conferirea unei toleranțe mărite plantelor față de un erbicid EPSPS, ca țintă a sa, care conține, în direcția transcrierii, o regiune promotor, eventual o regiune peptidică de tranzit, o secvență a unei gene care codifică o enzimă de toleranță la glifosat și o regiune de semnal de poliadenilare netranslatată la capătul 3', caracterizată prin aceea că gena toleranței la glifosat conține, raportat la gena din care provine, o substituție treonină 102 cu izoleucină, în regiunea aroA(EPSPS). De preferință, aceasta conține, în plus, în aceeași regiune, o substituiție prolină 106 cu serină. Aceste substituții pot fi introduse sau pot fi prezente într-o secvență EPSPS de orice origine, în special, vegetală, bacteriană, din alge sau din fungi.

Invenția cuprinde, de asemenea, un vector pentru transformarea plantelor care conțin gena himerică menționată mai sus.

RO 120849 Β1

De asemenea, invenția se referă la un procedeu de obținere a plantelor cu toleranță 1 îmbunătățită la un erbicid având EPSPS sintaze ca țintă, celule de plantă sau protoplantele fiind transformate cu o genă himerică și apoi supuse regenerării plantei întregi. 3

Peptidele de tranzit care pot fi folosite în regiunea peptidei de tranzit pot fi, cunoscute în sine, de origine vegetală, de exemplu, din porumb, floarea soarelui, mazăre, tutun ș.a. 5 Prima și a doua peptidă de tranzit pot fi identice, similare sau diferite. Acestea pot, în plus, să conțină, fiecare, una sau mai multe unități ale peptidei de tranzit, conform cererii de brevet 7 EP 050909. Această regiune caracteristică are rolul de a permite eliberarea unei proteine native și mature, și în special, EPSPS mutant de mai sus, cu eficacitate maximă în comparti- 9 mentul plasmidial.

Regiunea promotor a genei himerice, conform invenției, poate fi compusă, în mod 11 avantajos, din cel puțin o genă promotor sau fragment promotor, care este exprimată în mod natural în plante (tubulină, introni, actină, histonă). 13

Regiunea semnal de terminare a transcrierii netranslatată la capătul 3' al genei himerice poate fi de orice origine, de exemplu, de origine bacteriană, cum arfi cea a genei nopalin 15 sintazei, sau de origine vegetală, cum ar fi cea a genei histon H4A748 de la Arabidopsis thaliana, conform cererii de brevet european 633317. 17

Gena himerică, conform invenției, poate conține, pe lângă porțiunile esențiale de mai sus, cel puțin o regiune intermediară netranslatată (linker), care poate fi plasată între 19 regiunile diferite transcrise, descrise mai sus. Această regiune intermediară poate fi de orice origine, de exemplu, de origine bacteriană, virală sau vegetală. 21

Izolarea unui ADNc care codifică EPSPS de porumb în continuare sunt descrise diferitele etape care conduc la obținerea ADNc EPSPS 23 din porumb, care servește ca substrat pentru introducerea a două mutații. Toate operațiile descrise mai jos sunt cu titlu de exemplu și corespund unei alegeri făcute din diferitele me- 25 tode disponibile pentru obținerea aceluiași rezultat. Această alegere nu are efect asupra calității rezultatului, și prin urmare, orice metodă adecvată poate fi folosită de un specialist în do- 27 meniu pentru a ajunge la același rezultat. Majoritatea metodelor de inginerie a fragmentelor ADN sunt descrise în Current Protocols in Molecular Biology, vol.1 și 2, Ausubel F.M ș.a., 29 publicată de Greene Publishing Associates și Wiley-lnterscience (1989) (în continuare, referirile la protocoalele descrise în această lucrare vor fi notate ref.CPMB). Operațiile 31 referitoare la ADN, care au fost efectuate conform protocoalelor descrise în această lucrare, sunt, în special, următoarele: ligarea fragmentelor ADN, tratarea cu polimerază ADN Klenow 33 și polimerază ADN T4, prepararea plasmidei și a ADN λ bacteriofag, fie ca o minipreparare fie ca o maxipreparare, și analizele ADN și ARN conform tehnicilor Southern și Northern. 35

S-au urmat alte metode descrise în această lucrare și în continuare se descriu numai modificările semnificative sau adăugările la aceste protocoale.37

Exemplul 1.

1. Obținerea unui fragment EPSPS Arabidopsis thaliana39

a) Două oligonucleotide cu 20 meri ale secvențelor respective:

5'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3'41

5'-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3' s-au sintetizat din secvența unei gene EPSPS Arabidopsis thaliana (Klee H.J. ș.a. (1987)43

Mol. Gen. Genei., 210,437-442). Aceste două nucleotide sunt la pozițiile 1523 până la 1543 și, respectiv, la 1737 până la 1717, ale secvenței publicate și sunt în orientare opusă.45

b) ADN total de Arabidopsis thaliana (var. Columbia) s-a obținut de la Clontech (referința de catalog: 6970-1).47

RO 120849 Β1

c) 50 nanograme (ng) de ADN se amestecă cu 300 ng din fiecare dintre oligonucleotide și se supun unei reacții de amplificare, 35 de cicluri în lanț, cu un aparat Perkin-Elmer 9600, în condițiile mediului standard pentru amplificare, care sunt recomandate de furnizor. Fragmentul 204-bp rezultat constituie fragmentul EPSPS de Arabidopsis thaliana.

2. Construirea unei colecții a unui ADNc dintr-o linie de celule de porumb MS

a) 5 g celule filtrate se mărunțesc în azot lichid și acizii nucleici sunt extrași conform metodei descrise de Shure ș.a., cu următoarele modificări:

- pH-ul tamponului de liză este ajustat la pH 9,0;

- după precipitare cu izopropanol, peletul este preluat în apă și după dizolvare este ajustat la 2,5M LiCI. După incubare 12 h la 37‘C, peletul obținut după centrifugare timp de 15 min la 30000 g la 4°C este resolubilizat. Se repetă apoi etapa de precipitare LiCI. Peletul resolubilizat constituie fracția ARN a acizilor nucleici totali.

b) Fracția poli(A)⁺ ARN a fracției ARN se obține prin cromatografie pe o coloană cu oligo(dT)-celuloză, așa cum este descris în Current Protocols in Molecular Biology.

c) Sinteza ADNc dublu-catenar cu un capăt EcoRI sintetic: se efectuează conform protocolului furnizorului pentru diferiți reactanți necesari pentru această sinteză, sub forma unui echipament: copy kit de la compania In Vitrogen.

Oligonucleotidele mono catenare și parțial complementare ale secvențelor respective: 5'-AATTCCCGGG-3'

5'-CCCGGG-3' (ultima fiind fosforilată) sunt ligate cu ADNc-uri dublu catenare cu capete drepte.

Această ligare a adaptorilor duce la crearea pozițiilor Smal atașate la pozițiile ADNc dublu-catenar și EcoRI în formă coezivă, la fiecare capăt al ADNc-urilor dublu catenare.

d) Crearea colecției:

ADNc-urile care au poziții EcoRI coezive artificiale la capetele lor sunt ligate cu ADNc Ăgt10 de bacteriofag care a fost scindat cu EcoRI și defosforilat conform protocolului furnizorului New England Biolabs.

O aliquotă a reacției de ligare s-a încapsidat in vitro cu extracte de încapsidare, și anume Gigapack Gold, conform instrucțiunilor furnizorului; această colecție s-a titrat cu bacteria E. coli C600hfl. Colecția astfel obținută este amplificată și stocată conform instrucțiunilor aceluiași furnizor și constituie colecția ADNc a suspensiei de celule de porumb BMS.

3. Selecția colecției ADNc a suspensiei de celule de porumb BMS cu proba EPSP Arabidopsis thaliana

Protocolul urmat este cel din Current Protocols in Molecular Biology, voi. 1 și 2, Ausubel F. M ș.a., publicat de Greene Publishing Associates și Wiley-lnterscience (1989) (CPMB). Pe scurt, aproximativ 10⁶ fagi recombinanți sunt prelevați pe plăci LB, la o densitate medie de 100 fagi/cm². Plăcile litice sunt replicate în duplicat pe membrane Amersham Hybond N.

ADN s-a fixat pe filtre prin tratament cu 1600kJ UV (Streta-gene Stratalinker). Filtrele s-au prehibridizat în lapte smântânit 6xSSC/0,1%SDS/0,25, timp de 2 h, la 65°C. Proba EPSPS Arabidopsis thaliana s-a marcat cu [³²P]dcTP prin primer aleator conform instrucțiunilor furnizorului (Pharmacia Ready to Go kit). Activitatea specifică obținută este de ordinul de 10® cpm per pg de fragment. După denaturare, timp de 5 min, la 10OT, proba se adaugă la mediul de prehibridizare și hibridizarea se continuă, timp de 14 h, la 55°C. Filtrele se fluorografiază, timp de 48 h, la -80“C, cu film Kodak XAR5 și ecrane Amersham Hyperscreen RPN. Alinierea petelor pozitive pe filtru cu plăcile din care provin dă posibilitatea zonelor corespunzătoare fagilor care prezintă un răspuns de hibridizare pozitiv cu proba EPSPS Arabidopsis să fie prelevate din placă. Această etapă de prelevare, transfer, hibridizare și

RO 120849 Β1 recuperare se repetă până toate spoturile de pe placă ale fagilor purificați succesiv se 1 dovedesc 100% pozitivi în hibridizare. O plasă independentă a lizei fagilor este apoi preluată în mediul λ de diluant (Tris-CIpH 7,5; 10 mM MgSO4; 0,1 M NaCI; 0,1% gelatină); acești fagi 3 în soluție constituie clonele pozitive EPSP ale suspensiei de celule de porumb BMS.

4. Prepararea și analiza ADN a clonelor EPSP ale suspensiei de celule de porumb 5 BMS

Aproximativ 5x10⁸ fagi se adaugă la 20 ml bacterii C600hfl, la o valoare ΟΟθθθ^ de 7 2/ml și s-au incubat, timp de 15 min, la 37’C. Această suspensie se diluează apoi în 200 ml mediu de creștere al bacteriilor, într-un vas Erlenmeyer de 1 -1 și se agită într-un agitator ro- 9 tativ la 250 rpm. Liza este notată când mediul se limpezește, corespunzătoare lizei bacteriilor tulburi și are loc după aproximativ 4 h de agitare. Supernatantul este apoi tratat în modul 11 descris în Current Protocols in Molecular Biology. ADN-ul obținut corespunde clonelor EPSP ale suspensiei de celule de porumb BMS. 13

Unul sau două pg ale acestui ADN sunt scindate cu EcoRI și separate pe gel de agaroză 0,8% LGTA/TBE (ref.CPMB). Controlul final constă în verificarea că ADN-ul purificat 15 nu prezintă un semnal de hibridizare cu proba EPSPS Arabidopsis thaliana. După electroforeză, fragmentele ADN se transferă pe membrane Amersham Hybond N, conform proto- 17 colului de Sud descris în Current Protocols in Molecular Biology. Filtrul este hibridizat cu probă EPSPS Arabidopsis thaliana, conform condițiilor descrise în secțiunea 3 de mai sus. 19 Clona care prezintă un semnal de hibridizare cu proba EPSPS Arabidopsis thaliana și care conține cel mai lung fragment EcoRI, are o mărime estimată pe gel de aproximativ 1,7 kbp. 21

5. Obținerea clonei pRPA-ML-711 pg de clonă de fagi, care conține 1,7 kbp insert, se digeră cu EcoRI și separat pe 23 gel de agaroză 0,8% LGTA/TBE (ref.CPMB). Fragmentul de gel, care conține 1,7 kbp insert, este luat de pe gel prin colorare cu BET și fragmentul este tratat cu β-agaroză, conform 25 protocolului furnizorului, New England Biolabs. ADN-ul purificat al fragmentului 1,7 kbp este ligat la 12’C, timp de 14 h, cu ADN al plasmidei pUC 19 (New England Biolabs), scindat cu 27 EcoRI, conform protocolului de ligare descris în Current Protocolsin MolecularBiology., 2 p,l din amestecul de ligare de mai sus se folosesc pentru transformarea unei părți aliquote de 29 E. coli DH10B electrocompetente, transformarea este efectuată prin electroporare, folosind următoarele condiții: amestecul de bacterii competente și mediul de ligare se introduc într-o 31 celulă de electroporare cu grosimea de 0,2 cm (Biorad), răcită în prealabil la 0°C. Condițiile fizice ale electroporării, folosind un electroporator făcut de Biorad, sunt 22500 volți, 25 pF 33 și 200 Ω. în aceste condiții, timpul de descărcare mediu al condensatorului este de ordinul a 4,2 ps. Bacteriile sunt apoi preluate în 1 ml mediu SOC (ref. CPMB) și se agită 1 h, la 200 35 rpm, pe un agitator rotativ în tuburi Cornning de 15 m. După plasare pe mediu de L/agar suplimentat cu 100 pg/ml carbenicilină, minipreparatele de clone bacteriene care au crescut 37 peste noapte la 37°C, se obțin conform protocolului descris în Current Protocols in Molecular Biology. După digestia ADN cu EcoRI și separare prin electroforeză pe gel de agaroză 0,8% 39

LGTA/TBE (ref.CPMB), se păstrează clonele care au un insert 1,7 kbp. Controlul final constă în verificarea că ADN-ul purificat nu prezintă un semnal de hibridizare cu proba EPSPS de 41 Arabidopsis thaliana. După electroforeză, fragmentele de ADN se transferă pe membrane Amersham Hybond N, conform protocolului Southern descris în Current Protocols in 43 Molecular Biology. Filtrul este hibridizat cu probă EPSPS de Arabidopsis thaliana, conform condițiilor descrise în secțiunea 3 de mai sus. Clona plasmidei care are insert 1,7 kbp și 45 hibridizează cu proba EPSPS de Arabidopsis thaliana, s-a preparat la o scară mai mare și ADN-ul rezultat din liza bacteriilor s-a purificat pe un gradient CsCI, așa cum s-a descris în 47 Current Protocols in Molecular Biology. ADN-ul purificat s-a secvențiat parțial cu un echipament Pharmacia, conform instrucțiunilor furnizorului și folosind ca primeri, primerii 49

RO 120849 Β1 universali M13 în orientare directă și inversă, de la același furnizor. Secvența parțială produsă acoperă aproximativ 0,5 kbp. Secvența de aminoacid derivată în regiunea proteinei mature (aproximativ 50 de resturi de aminoacid) prezintă identitate 100% cu secvența de aminoacizi corespunzătoare, a EPSPS de porumb matur descrisă în US 4971908. Această clonă, corespunzătoare unui fragment EcoRO 1,7 kbp a ADN-ului EPSP din suspensia de celule de porumb BMS, s-a denumit pRPA-ML-711. Secvența completă a acestei clone s-a determinat pe ambele catene, folosind protocolul echipamentului Pharmacia și sintetizând oligonucleotide complementare și cele cu orientare opusă, fiecare de aproximativ 250 bp. Secvența completă obținută a acestei clone 1713 bp este prezentată în SEQ ID nr.1.

6. Obținerea clonei pRPA-ML-715

Analiza secvenței clonei pRPA-ML-711, și în special comparația secvenței derivate de aminoacizi cu cea a porumbului, prezintă o extensie de secvențe de 92 bp în amonte de codonul GCG care codifică alanina cu NH₂ terminal al porțiunii mature a EPSPS de porumb (US 4971908). în mod similar, se observă o extensie de 288 bp în aval de codonul AAT care codifică aminoacidul aspargina cu COOH terminal al porțiunii mature a EPSPS de porumb (US 4971908). Aceste două porțiuni pot corespunde, în cazul extensiei la NH₂ terminal, unei porțiuni a secvenței unei peptide tranzit pentru localizarea plastidei și, în cazul extensiei la COOH terminal, regiunii 3' netranslatate a ADNc.

Pentru a obține un ADNc care codifică porțiunea matură a ADNc EPSPS de porumb, așa cum s-a descris în US 4971908, s-au efectuat următoarele operații:

a) îndepărtarea regiunii netranslatate 3': construcția pRPA-ML-712;

Clona pRPA-ML-711 s-a tăiat cu enzimă de restricție Asel și capetele rezultate din această clivare s-au îndreptat prin tratare cu fragmentul Klenow al ADN polimerazei I, conform protocolului descris în CPMB. S-a efectuat apoi o scindare cu enzimă de restricție Sacii. ADN-ul rezultat din aceste operații s-a separat prin electroforeză pe gel de agaroză 1% LGTA/TBE- (ref. CPMB).

Fragmentul de gel care conține 0,4 kbp insert Asel-capete drepte/Sacll s-a preluat de pe gel și s-a purificat conform protocolului descris în secțiunea 5 de mai sus. ADN-ul clonei pRPA-ML-711 s-a scindat cu enzimă de restricție Hindlll la poziția HindiII plasată în polilinkerul vectorului de donare pUC19 și capetele rezultate din acest clivaj s-au îndreptat prin tratare cu fragment Klenow a ADN polimerazei I. S-a efectuat apoi o scindare cu enzimă de restricție Sacii. ADN-ul rezultat din aceste manipulări s-a separat prin electroforeză pe gel de agaroză 0,7% LGTA/TE (ref. CPMB).

Fragmentul de gel care conține insertul Hindlll-capete drepte/Sacll de aproximativ 3,7 kbp s-a preluat din gel și s-a purificat conform protocolului descris în secțiunea 5 de mai sus.

Cele două inserturi s-au ligat și 2 pl din acest amestec de ligare s-au folosit pentru transformarea DH10 de E. coli cum s-a descris în secțiunea 5.

Conținutul de ADN al plasmidei diferitelor clone s-a analizat conform procedeului descris pentru pRPA-ML-711. Una dintre clonele plasmidei selectate conține un insert EcoRIHindlll de aproximativ 1,45 kbp. Secvența capetelor terminale ale acestei clone arată că capătul 5’ al insertului corespunde exact capătului corespunzător al pRPA-ML-711 și capătul terminal 3' are următoarea secvență:

5'-...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3'

Secvența subliniată corespunde codonului asparaginei cu COOH terminal, următorul codon corespunde codonului stop de translație. Nucleotidele din aval corespund elementelor secvenței polilinkerului pUC19. Această clonă care conține secvența pRPA-ML-711 până la poziția de terminare a translației EPSP de porumb matur și urmată de secvențele polilinkerului pUC 19 până la poziția Hindlll s-a desemnat ca pRPA-ML-712.

RO 120849 Β1

b) Modificarea capătului 5' a pRPA-ML-712: construcția pRPA- 1

ML-715:

Clona pRPA-ML-712 s-a clivat cu enzimele de restricție Pstl și Hindlll. ADN-ul rezul- 3 tat din aceste manipulări s-a separat prin electroforeză pe gel de agaroză 0,8% LGTA/TBE (ref.CPMB). Fragmentul de gel care conține insert Pstl-EcoRI de 1,3-kbp s-a prelevat din gel 5 și s-a purificat conform protocolului descris în secțiunea 5 de mai sus. Acest insert s-a ligat în prezența unei cantități echimoleculare din fiecare din cele două oligonucleotide 7 complementare parțiale ale secvenței:

Oligo 1:5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3' 9

Oligo 2:5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3' cât și în prezența ADN pUC 19 al plasmidei digerat cu enzimă de restricție BamHI 11 și Hindlll.

pl amestec de ligare s-au folosit pentru a transforma DH 10B de E. coli, în modul 13 descris anterior, în secțiunea 5. După analiza conținutului de ADN al plasmidei diferitelor clone, conform procedeului descris în secțiunea 5 de mai sus, una dintre clone, având un 15 insert de aproximativ 1,3-kbp, s-a reținut pentru analizele ulterioare. Secvența capătului terminal 5' al clonei selectate arată că secvența ADN în această regiune este următoarea: 17 secvența polilinkerului pUC 19 de la pozițiile EcoRI la BamHI, urmată de secvența oligonucleotidelor folosite în donare, urmată de restul secvenței prezente în pRPA-ML-712. 19

Această clonă s-a denumit pRPA-ML-713. Această clonă are un codon ATG de metionină inclus într-o poziție Ncol în amonte de codonul alanină cu N terminal al EPSP sintazei 21 mature. în plus, codonii de alanină și glicină, ai capetelor cu N-terminal, au fost păstrați, dar modificați pe baza variabilei a treia: GCGGGT inițial dă GCCGGC modificat. 23

Clona pRPA-ML-713 s-a clivat cu enzimă de restricție Hindlll și capetele acestei scindări s-au îndreptat prin tratare cu fragment Klenow al ADN polimerază I. S-a efectuat 25 apoi o scindare cu enzimă de restricție Saci. ADN-ul rezultat din aceste manipulări s-a separat prin electroforeză pe gel de agaroză 0,8% LGTA/TBE (ref.CPMB). Fragmentul de gel 27 care conține insertul HindIIl-capete drepte/Sac” de 1,3 kbp s-a prelevat din gel și s-a purificat conform protocolului descris în secțiunea 5 de mai sus. Acest insert s-a ligat în pre- 29 zența ADN pUC 19 de plasmidă digerat cu enzimă de restricție Xbal și capetele acestei scindări s-au îndreptat prin tratare cu fragment ADN al polimerazei I. S-a efectuat apoi o 31 scindare cu enzimă de restricție Saci. 2 pl amestec de ligare s-au folosit pentru transformarea DH10B de E. cotim modul descris mai sus în secțiunea 5. După analiza conținutului 33 ADN al plasmidei diferitelor clone, conform procedeului descris mai sus în secțiunea 5, una dintre clone, care are un insert de aproximativ 1,3 kbp, s-a reținut pentru analize ulterioare. 35 Secvența capetelor terminale ale clonei selectate arată că secvența ADN este următoarea: secvența polilinkerului pUC 19 din pozițiile EcoRI la Sac, urmată de secvența oligonucleoti- 37 delor folosite în donarea de la care s-au șters 4 bp GATCC ale oligonucleotidei I descrise anterior, urmată de restul secvenței prezente în pRPA-ML-712 până la poziția Hindlll și 39 secvența poli-linkerului pUC 19 din Xbal la Hindlll. Această clonă s-a denumit pRPA-ML-715.

7. Obținerea ADNc care codifică o mutantă EPSPS de porumb 41

Toate etapele de mutageneză s-au efectuat cu echipament de mutageneză Pharmacia U.S.E, conform instrucțiunilor furnizorului. Principiul acestui sistem de mutageneză 43 este următorul: ADN-ul plasmidei este denaturat termic și reasociat în prezența unui exces molar de, pe de o parte, oligonucleotidă de mutageneză, și pe de altă parte, o oligo- 45 nucleotidă care dă posibilitatea să fie eliminată o poziție unică a enzimei de restricție prezente în polilinker. După etapa de reasociere, se efectuează sinteza catenei complementare, 47 prin acțiunea ADN polimerazei T4 în prezența ADN ligazei T4 și proteina genei 32 într-un

RO 120849 Β1 tampon adecvat, care este furnizat. Produsul de sinteză este incubat în prezența unei enzime de restricție, pentru care poziția este presupusă a fi dispărut prin mutageneză. Tulpina E. coli care are, în particular, mutația mutS, este folosită ca gazdă pentru transformarea acestui ADN. După creștere în mediu lichid, ADN-ul plasmidei totale este preparat și incubat în prezența enzimei de restricție folosită anterior. După aceste tratamente, tulpina DH10B de E. coli este folosită drept gazdă pentru transformare. Se prepară ADN-ul plasmidei clonelor izolate și prezența mutației introduse este verificată prin secvențiere.

A) - modificarea pozițiilor sau secvențelor fără a afecta, în principiu, caracterul de rezistență EPSPS a porumbului la produși care sunt inhibitori competitivi ai activității EPSP sintezei: eliminarea unei poziții interne Ncol din pRPA-ML-715.

Secvența pRPA-ML-715 este numerotată arbitrar, prin plasarea primei baze a codonului GCC de alanină cu N terminal la poziția 1. Această secvență posedă o poziție Ncol la poziția 1217. Oligonucleotida cu modificarea poziției are secvența:

S’-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-S·.

După secvențiere, conform referințelor de mai sus, secvența citită după mutageneză corespunde celei a oligonucleotidei folosite. Poziția Ncol a fost într-adevăr eliminată și translația în aminoacizii din această regiune conservă secvența inițială prezentă în pRPAML-715.

Această clonă s-a denumit pRPA-ML-716.

Secvența 1340-p a acestei clone este prezentată în SEQ. ID nr. 2 și SEQ. ID nr. 3.

B) - modificările secvenței dau posibilitatea creșterii caracterului de rezistență EPSPS a porumbului la produși care sunt inhibitori competitivi ai activității EPSP sintazei.

S-au folosit următoarele nucleotide:

a) mutația Thr 102->lle.

δ'-βΑΑΤΟΟΤΟΟΑΑΤΟΟΟΑΑΤΟΟΟΟΟΟΑΤΤΟΑΟΑΟΟ-^

b) mutația Pro 106->Ser.

5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'

c) mutațiile Gly 101-> Ala și Thr 102->lle.

5'-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3'

d) mutațiile Thr 102->lle și Pro 106->Ser.

5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'.

După secvențiere, secvența citită după mutageneză pe trei fragmente mutante este identică cu secvența ADN pRPA-ML-716 inițială, cu excepția regiunii mutagene care corespunde celei a oligonucleotidelor de mutageneză folosite. Aceste clone s-au desemnat ca: pRPA-ML-717 pentru mutația Thr 102->lle, pRPA-ML-718 pentru mutația Pro 106->Ser, pRPA-ML-719 pentru mutația Gly 101 ->Ala și Thr 102->lle și pRPA-ML-720 pentru mutațiile Thr 102 ->lle și Pro 106->Ser.

Secvența 1340 bp a pRPA-ML-720 este prezentată în SEQ ID nr. 4 și SEQ ID nr. 5. Insertul 1395-bp Ncol-Hind111 este baza tuturor constructelor folosite pentru transformarea plantelor în sensul introducerii rezistenței la erbicide care sunt inhibitori competitivi ai EPSPS și, în special, rezistență la glifosat. Acest insert va fi desemnat în restul descrierii mutant dublu EPSPS de porumb.

Exemplul 2. Toleranța la glifosat a diferiților mutanți in vitro

2.a. Extracția EPSP sintazei

Diferite gene de EPSP sintază s-au introdus sub forma unei casete Ncol-HindllI în vectorul plasmidă pTrc99a (Pharmacia, ref: 27-5007-01) scindat cu Ncol și Hindlll. Bacteriile DH10B E. coli recombinante, care supraexprimă diferite EPSP sintaze, sunt sonicate în 40 ml tampon per 10 g celule peletizate și se spală cu același tampon (200 mM Tris-HCI pH 7,8, 50 mM mercaptoetanol, 5mM EDTA și 1 mM PMSF), la care se adaugă Ig polivinilpirolidonă. Suspensia se agită, timp de 15 min, la 4°C și apoi se centrifughează, timp de 20 min, la 27000 g și 4°C.

RO 120849 Β1

La supernatant se adaugă sulfat de amoniu, pentru a aduce soluția la o saturare de 1

40% față de sulfatul de amoniu. Amestecul se centrifughează, timp de 20 min, la 27000 g și 4°C. La noul supernatant se adaugă sulfat de amoniu, pentru a aduce soluția la o saturare 3 de 70% față de sulfatul de amoniu. Amestecul se centrifughează, timp de 30 min, la 27000 g și 4°C. EPSP sintaza prezentă în acest pelet de proteină este preluată în 1 ml tampon 5 (20 mM Tris-HCL pH 7,8 și 50 mM mercaptoetanol). Această soluție se dializează peste noapte față de doi litri din același tampon, la 4’C. 7

2.b. Activitatea enzimei

Activitatea fiecărei enzime, cât și rezistența ei la glifosat se măsoară in vitro, timp de 9 min, la 37*C, în următorul amestec de reacție: 100 mM acid maleic, pH 5,6, ImM fosfoenolpiruvat, 3 mM shikimat 3-fosfat (preparat conform lui Knowles P.F. și Sprinson D.B. 11 1970, Methods în Enzymol 17A, 351-352, din tulpina ATCC 25597 de Aerobacter aerogenes) și 10 mM fluorură de potasiu. Extractul de enzimă se adaugă în ultimul moment, după adău- 13 garea glifosatului a cărui concentrație finală variază de la 0 la 20 mM. Activitatea se măsoară prin evaluarea fosfatului eliberat conform tehnicii lui Tausky H.A. și Shorr E. 1953, J. Biol. 15 Chem. 202, 675-685.

în aceste condiții, enzima de tip sălbatic (WT) este inhibată 85%, la o concentrație 17 de glifosat de 0,12 mM. La această concentrație, enzima mutantă, cunoscută ca Serl06, este inhibată numai 50% și ceilalți trei mutanți, Ile102, lle102/Ser 106 și Alal01/llel02, prezintă 19 inhibare mică sau deloc.

Concentrația de glifosat trebuie înmulțită cu 10, adică 1,2 mM, pentru a produce o 21 inhibare de 50% a enzimei mutante lle102, mutanții lle102/Ser106, Ala/lle și Ala nefiind inhibați. 23

Trebuie remarcat că activitatea mutanților Ala/lle și Ala nu este inhibată până la concentrații de glifosat de 10 mM, și cea a mutantului He102/Ser106 nu este redusă chiar 25 dacă concentrația de glifosat este dublată, adică este de 20 mM.

Exemplul 3. Rezistența plantelor de tutun transformate 27

1-1- Transformarea

Vectorul pRPA-RD-173 este introdus în tulpina EHA101 de Agrobacterium 29 tumefaciens (Hood ș.a., 1987), care are cosmida pTVK291 (Komari ș.a.,1986). Tehnica de transformare se bazează pe procedeul lui Horsh ș.a. (1985). 31

-2- Regenerarea

Regenerarea tutunului PBD6 (sursă SEITA Franța) din explante de frunze se efec- 33 tuează pe un mediu Murashige și Skoog (MS) care conține 30g/l sucroză și 200 pg/ml canamicină. Explantele de frunze se îndepărtează din plantele cultivate în seră sau in vitro și sunt 35 transformate conform tehnicii discului de frunze (Science, 1985, voi. 227, pp. 1229-1231) în trei etape succesive: prima cuprinde inducerea de lăstari pe un mediu suplimentat cu 30 g/l 37 sucroză, care conține 0,05 mg/l acid naftilacetic (NAA) și 2 mg/l benzilaminopurină (BAP), timp de 15 zile. Lăstarii formați în această etapă sunt apoi dezvoltați timp de 10 zile, prin 39 cultură pe un mediu MS suplimentat cu 30 g/l sucroză, dar care nu conține nici un hormon.

Lăstarii dezvoltați s-au îndepărtat și cultivat pe un mediu de înrădăcinare MS, care are 41 jumătate din conținutul de săruri, vitamine și zahăr, și care nu conține nici un hormon. După aproximativ 15 zile, lăstarii cu rădăcini se transferă în soluție. 43

1-3 Rezistența la glifosat plante transformate s-au regenerat și transferat într-o seră pentru constructul 45 pRPA-RD-173. Aceste plante s-au tratat în seră la etapa de a 5-a frunză, cu o suspensie apoasă corespunzătoare la 0,8 kg substanță activă glifosat la hectar. 47

RO 120849 Β1

Rezultatele corespund observării indicilor de fitotoxicitate înregistrați la 3 săptămâni după tratament. în aceste condiții s-a identificat că plantele transformate cu constructul pRPA-RD-173 prezintă toleranță foarte bună, în timp ce plantele de control netransformate sunt distruse complet.

Aceste rezultate prezintă clar îmbunătățirea conferită de folosirea unei gene himerice conform invenției, care genă codifică toleranța la glifosat.

Exemplul 4. Transformarea și selecția celulelor de porumb

Celulele de porumb BMS (Black Mexican Sweet) într-o fază de creștere exponențială sunt bombardate cu construcția pRPA-RD-130, conform principiului și protocolului descrise de Klein ș.a. 1987 (Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. și Sandford J.C. (1987): “Microproiectile cu viteză înaltă pentru furnizarea acizilor nucleici în celulele vii”, Nature, voi. 327 pg.70-73).

La două zile după bombardament, celulele sunt transferate într-un același mediu care conține 2 mM N-(fosfonometil)-glicină.

După 8 săptămâni de la selecția pe acest mediu, se selectează călușurile formate, apoi se amplifică și analizează prin PCR, și se evidențiază clar prezența genei himerice OTP-EPSPS.

Celulele nebombardate și crescute pe același mediu care conține 2mM N-(fosfonometil)glicină sunt blocate de erbicid și nu se dezvoltă.

Plantele transformate conform invenției pot fi folosite pentru obținerea liniilor și hibrizilor cu caracter fenotip corespunzător expresiei genei himerice introduse.

Descrierea construcției plasmidelor pRPA-RD-124: Adăugarea unui semnal de poliadenilare nos la pRPA-ML-720, cu crearea unei casete de donare care conține gena EPSPS dublu mutantă de porumb (Thr 102->lle și Pro 106-> Ser). pRPA-ML-720 se digeră cu Hindll și se tratează cu fragment Klenow de ADN polimerază I de E. coli, pentru a obține un capăt drept. A doua digestie se face cu Ncol și fragmentul EPSPS se purifică. Gena EPSPS este apoi ligată cu pRPA-RD-12 purificat (o casetă de donare care conține semnalul de poliadenilare al nopalin sintazei), obținându-se pRPA-RD-124. Pentru a obține vectorul purificat pRPA-RD-12, a fost necesar ca acesta să fie digerat în prealabil cu Sall, tratat cu ADN polimerază Klenow și apoi digerat a doua oară cu Ncol.

pRPA-RD-125: Adăugarea unei peptide de tranzit optimizate (OTP) la pRPA-RD-124, cu crearea unei casete de donare conținând gena EPSPS orientată pe plasmide. pRPA-RD7 (cerere de brevet european EP 652 286) este digerat cu Aphl, tratat cu ADN polimerază T4 și apoi digerat cu Spel și fragmentul OTP este purificat. Acest fragment OTP este donat în pRPA-RD-124, care a fost în prealabil digerat cu Ncol, tratat cu ADN polimerază Klenow, pentru îndepărtarea porțiunii proeminente 3' și apoi digerat cu Spel. Această clonă este apoi secvențiată pentru a asigura fuziunea de translația corectă între OTP și gena EPSPS. Se obține apoi pRPA-RD-125.

pRPA-RD-130: Adăugarea promotorului histon de porumb H3C4 și a secvențelor de intron 1 adhl ale pRPA-RD-123 (EP 507698) la pRPA-RD-125, cu crearea unei casete pentru expresie în plante pentru exprimarea genei EPSPS dublu mutante în țesuturile monocotiledonatelor. pRPA-RD-123 (o casetă care conține promotorul histonic de porumb H3C4 cu adhl intron 1) este digerat cu Ncol și Saci. Fragmentul ADN care conține promotorul derivat de la pRPA-RD-123 este apoi purificat și ligat cu pRPA-RD-125, care s-a digerat în prealabil cu Ncol și Saci.

RO 120849 Β1 pRPA-RD-159: Adăugarea promotorului dublu histonic H4A748 de Aradiposis 1 (EP 507 698) la pRPA-RD-125, cu crearea unei casete pentru expresie în plante, pentru exprimarea genei OTP-genă EPSPS dublu mutantă în țesuturile dicotiledonatelor. pRPA- 3

RD-132 (o casetă care conține promotorul dublu H4A748 (EP 507 698)) este digerat cu Ncol și Saci. Fragmentul de promotor purificat este apoi donat în pRPA-RD-125 care s-a digerat 5 cu Ecol și Saci.

pRPA-RD-173: Adăugarea genei promotor H4A748-OTP-genă EPSPS dublu 7 mutantă a pRPA-RD-159 la plasmida pRPA-BL-150A (EP 508 909), cu crearea unui vector de transformare Agrobacterium tumefaciens. pRPA-RD-159 este digerat cu Notl și tratat cu 9 polimerază Klenow. Acest fragment este apoi donat în pRPA-BL-150A cu Smal.

LISTA DE SECVENȚE (1) INFORMAȚII GENERALE:

(1) SOLICITANT: Lebrun, Michael15

De Rose, Richard T

Sailland, Alain17 (ii) TITLUL INVENȚIEI: 5-enol piruvilshikimat-3-fosfat sintază, genă codantă pentru această proteină și plante transformate conținând această genă19 (iii) NUMĂRUL SECVENȚELOR: 5 (iv) ADRESA PENTRU CORESPONDENȚĂ:21 (A) DESTINATAR: Francois Chrcticn (B) STRADA: 1420 me Pierre Baizet23 (C) ORAȘ: Lyon Cedex 09 (E) ȚARA: Franța.25 (F) COD: 69263 (v) FORMA DE CITIRE DE PE CALCULATOR:27 (A) TIP DE MEDIU: Floppy disk (B) CALCULATOR: IBMPC compatibil29 (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS-MS+DOS (D) SOFT: Patent in Release#1.0, Versiunea #1.2531 (vi) DATELE CURENTE ALE CERERII:

(A) NUMĂRUL CERERII33 (B) DATA DE ÎNREGISTRARE (C) CLASIFICARE35 (viii) MANDATAR-INFORMAȚII AGENT:

(A) NUME: Chretien, Francois37 (ix) INFORMAȚII PRIN TELECOMUNICAȚII (A) TELEFON: (33)72-29-26-4639 (B) TELEFAX: (33) 72-29-28-43 (2) INFORMAȚII DESPRE SEQ ID nr. 1:41 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 1713 perechi de bază43 (B) TIP: acid nucleic (C) TIP DE CATENĂ: dublă45 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP DE MOLECULĂ: cADN47

RO 120849 Β1 (vi) SURSĂ INIȚIALA:

(A) ORGANISM: porumb Zea (B) TULPINĂ: Black Mexican Sweet (F) TIP DE ȚESUT: Callus (vii) SURSĂ DIRECTĂ:

(A) COLECȚIA: lambda gt 10 (B) CLONA: pRPA-ML-711 i«ii scqudkx auaurrzcKi «ca xo mo>i>

AAtCAAÎTtC WCACCAM CASCTXWC ATCCGOCCGC CQCMSCCOCQ CCQCCCCTQC CCATCAAGGA GATCTCDQGC ACCGTCAAGC tcctcctact axaxxxrn ταχΜΧΟΟΛ ACGATCTOCA CTACATOCTC CCGGCCTTOA AACCTOOCAA AAGAGCTGTA <» Γ TC'l ZBOCT aasacgaact gogctcttc ττβααοΑΛτα CTGTTACTOC TGCTCCTQGA AATGCAACTT «XUKXXAT T<wzTi*crrr· '.-TTSTcrxLAT -rcTTT’>:cAC TCAcr.-crr^A ~rTTt rorrr. A«>rro\A»KrT <Γτστ·-·χτΓ?3 *tOv«agtc ~rrTzxrrcT Τ'·-·^-ζ·„ι_Τ(,τύ-, caoatt'îaaa tîthaatgac αγγ''-k^.ttg A-rxiAcecrr <WCACXfiATT CTACATTAAS GBACGTCAAA MOCTGAtCC CTCAAGCGCA «eCTATTtCt TGACTGTGGA «CTTCKSC AOCACCAeTT TCGAGATOAT GGCAOCOAAO OTTACATCGA CCC&OOAGCC ATTTGCGAaC AAACACCTCA CTCATCTCGC CATGACTCTT OCTCTWHTQ GAGACGTGGC TfOCTOGAGA OTAAAGGAOA TAACCMAGCT GGGAGCATCT GTTBAGCmAAQ agaagctgaa cstcaoqccq atcgacacgt con CGCCGC CTGTGCOÎAa CTCXXXStrîCA ccrracexA ctacttcsat cTacTOAacA ACTACCACCC AGCrtOATM ΑΛΟΤΟΑΖΛΟα ctg't 111 ’.cr crrrcAosca attaastttt TTTCTATTTC CGATCTTAAG TTTCTGCACr GTTGGAATAA TAASAATAAT AAATTAOSTT ΑΛΑΑΑΛΑΑΑΑ ΑΑΑΑΛΑΛΛΛΛ AACCCGCGAA

CXTGATEACa AATTCOQQCC ΟΟΟΟΟΟΟΤ» AcacaoOTQC cgaosmasC srocracMC TOOOGCGCTC CAMHOGCTT TCCAAOCGGA ouw^araar tgaxaaocto craAAoara GGACtCTTCa TCTCîCTWTC GAAGCCGACA ΟΤΟσΤαΟΑΑΑ mCOCMtTt OAOOATGCtA CTtXUACTQC AATOOOGCCA TTVOCOO ACU roci ΓΟΑ TQGMttACCA acaaswcqg tqahxmkt T'xrrtx^vTA-r m-rnATTCTT ZCAAtCGA.Vt OCCArXZZTTA CCTCGTG3CA AiTTACTTGAG TnCCTTnCT<·. AirZXCtGCTC tCATTGA-rAA ATTAATSm: ATTCnTTAOS TTCCTCTGAA AGOfiACCA-t TCTGATASCT AATACAAGTC «XCTAAAAAT GCCTATCTTS TGGCTGGTGC ZGCAATTACT «GAOSOACTa TGCAGGGTGA τατΟΑΑβΓΠ CCTOAGOZAC CCGAOACTAC CGTAACTCTT ACTCOCCXAC AGGOSATTSA TVTCAACXXCI AACAACATOC azrcrna: csatogcccs acacocmca CCSAGACBAT QffnQCSATC OMAC3GA0C OOCCGGACtA CTQCKXCATC ACCKXOOCQS ACGMSMKA OGSOATCCCC ASCCCCTTCT cxswxxaoA cccraamac accogoamsa CTTTCOTCAA OAATtAAXAA AOCCTOCSAS· CTTOTGCTCA GGAAATACAT TXCrTTtOTÎ OAGÎCrCrtAA OSrtAOTTGT TWTAGCAAG GTAMXXAAA TTrCATTTCA ACACTCCrTC TCASTOAAAA ΑΑΑΑΑΑΛΑΑΑ ΑΛΑΛΛΑΑΛΛΑ TTC «o

1ZO îao z«o

300

340 «20 «•0

MO •500

4-0

740 «40

840 *40

1020 io«o

1140

1200

1240

1320

1340

1440

1300

13*0

1420

14*0 :H3 (2) INFORMAȚII DESPRE SEQ ID nr. 3 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 1340 perechi de bază (B) TIP: acid nucleic (C) TIP DE CATENĂ: dublă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP DE MOLECULĂ: cADN (vi) SURSĂ INIȚIALĂ (A) ORGANISM: porumb Zea (B) TULPINĂ: Black Mexican Sweet

RO 120849 Β1 (vii) SURSĂ DIRECTĂ:1 (B) CLONA: pRPA-ML-711 (ix) CARACTERISTICĂ:3 (A) NUME/COD/CDS (B) LOCALIZARE: 6...13375 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID nr. 2:

ccktg ax eoc ax a*a ana ktc στα era oa cac ktc am om atc·τ

M· Gly Al· Glu aiu 11« Vel L»u ala rro II· Lr· alu II·

TOC GGC ••r «ly 15 CTC CTA

ACC GTC Thr ν·1

AM CTG OCG GGG

toc am rea crr TOC am «a

ATC Xla 30 CTG Leu

•5

Ly» GCC Ala 35

Leu »m Gly

•er Ly» tar Leu »«r 15 GGG AGA AGA GTC GTT

Aan Ar? GAT AAC

ta CTG Leu

TOC GM

143

11

CTC Le\l

GCC Ala

leu

Leu

tar

Glu

Gly

Thr 40

Thr

V·!

Val

Α·ρ

Aen 45

CTG

AAC

ACT

GAG

GAT

CTC

CM

TAC

ATC

CTC

GOG

OOC

TTG

MO

ACT

crr

191

13

Leu

Αλλ

•ar

Glu

A*P

Val

Ml·

Tyr

Met

Va?

Gly

Al·

Va?

Ar?

Thr

IM

s«

35

•âC

15

ere

TGT

<7C

ΛΑΑ

rxr.

GAC

AAA

GCT

ncc

AAA

AGA

C2GT

«JTA

'TT?

rrrt

2J·

r.i/

Lru

3*r ♦»··

Ό 1

Giu

Aia

Ajp

Ly* 10

Ala

Ala

Lyv

Ar?

Aia t\

Val

Val

val

T'7T

r-re

AAG

TTC

cca

CTT

GMX

GAT

GCT

AAA

f>î

'^*A

W.

ca;

:a>

17

'17

-Τ'-

Gi /

U /

Lys

Fna

Pcu

Val

Glu

A-'P

Ala

L74

Glu

Glu

Vil

vin

40

95

90

CTC

ne

TTG

GGC

AAT

GCT

GGA

ACT

CCA

ATG

OGG

CCA

TTG

ACA

GCA

GCT

335

19

Leu

Ph·

Leu

Gly

Aaa

Ala

Gly

Thr

Ala

Mat

Ax?

Pro

leu

Thr

Ala

Al·

«5

IOC

105

UO

GTT

ACT

GCT

GCT

GGT

GGA

AAT

GCA

ACT

TAC

GTG

CTT

GAT

GGA

GTA

C01

3«3

Vil

mc

AX»

Ala

Gly

Gly

Aen

Ala

mr

tyr

Val

Leu

Aep

Gly

Val

Pro

21

115

120

12$

AGA

ATG

AGG

GAG

AGA

COC

ATT

GGC

GAC

TTG

GTT

GTC

GGA

TTG

AM

CM

4 31

Ax?

*·«.

Ar?

Glu

Ar?

Fro

XI·

Gly Xwp

Leu

Val

Val

Gly

Leu

Vy·

Gin

23

130

115

L4Q

CTT

GGT

GCA

GAT

GTT

GAT

TGT

TTC

CTT

GGC

ACT

GAC

TCC

CCA

OCT

GTT

47»

Leu

Gly

Al·

Aarp

Val

Aep

Cy·

m·

Leu

Gly

Thr

Aep

Cy·

Frt>

Pro

ν·ι

US

130

15)

25

COT

GTC

AAT

GGA

ATC

GGA

GGG

CTA

OCT

GGT

GGC

AM

GTC

AM

CTG

TCT

$27

Ar?

Vel

Aan

Gly

Ila

Gly

Gly

Leu

Pro

Gly

Gly

Vy»

Val

Ly·

Leu

•ar

K0

1«

170

27

GGC

TOC

ATC

ACC

AGT

CM

TAC

TTG

ACT

GCC

TTG

CTG

ATG

GCT

GCT

OCT

575

Gly

9«C

Ila

S«

tar

Gin

Tyr

Leu

•ar

Ala

Leu

Leu

Mat

Ala

Ala

Pro

IM

100

1·$

190

TTG

GCT

CTT

GGG

GAT

GTG

GM

ATT

GAA

ATC

ATT

GAT

AAA

TTA

ATC

TCC

423

29

Uu

Al»

Leu

Gly

Aap

Val

Glu

ZI·

Glu

Xle

XI·

Aep

Ly·

leu

Ila

••r

195

ZOO

20$

ATT

CCG

TAC

GTC

GAA

ATG

ACA

TTG

AGA

TTG

ATG

GM

COT

TTT

GGT

GTG

471

31

11«

fCG

Tyr

Val

Glu

Mat

Thr

Leu

Ar?

Leu

Met

Glu

Ar?

Pha

Gly

v«l

TIO

21$

220

AAA

GCA

GAG

CAT

TCT

GAT

AGC

TGG

GAG

aga

ttc

TAC

ATT

AM

GGA

GGT

71»

Lyw

Ala

Glu

Hla

Sac

Aap

•ar

Trp

Aap

Ar?

Pha

Tyr

XI·

Lyw

Gly

□ly

33

223

230

235

CAA

AAA

TAC

AAG

TOC

CT?

AAA

AAT

GCC

TAT

GTT

GAA

GOT

GAT

GCC

TOk

747

Gin

Ly.

Tyr

Lya

«ar

Pro

Lya

Am

Ala

Tyr

ν·1

Glu

Gly

Arp

Ala

•ar

140

24$

250

35

AGC

GCA

AGC

TAT

TTC

TTG

GCT

GOT

GCT

GCA

ATT

ACT

GGA

GGG

ACT

GTG

• 15

»ar

AU

Sar

Tyr

Pha

Leu

Ala

Gly

Ala

Ala

Ila

mr

Gly

Gly

Thr

Val

255

240

245

2TQ

37

ACT

CTG

GAA

GGT

TOT

GGC

ACC

ACC

AGT

TTG

CAG

GGT

GAT

GTG

AM

TTT

• 43

ΤΓκτ

Val

Glu

Gly

Gly

Thr

Thr

•ar

Leu

GLn

Gly

Aep

Val

Lya

Ph·

27$

x»o

291

GCT

GAG

GTA

CTG

GM

ATG

ATG

GGA

GCO

AM

GTT

AGA

ταα

AOC

GM

ACT

911

39

Ala

Glu

Val

Leu

Glu

Mat

Met

Gly

Ala

Lyw

Val

Thr

Trp

Thr

Glu

Thr

290

29$

300

AGC

GTA

ACT

GTT

ACT

GGC

OCA

CCG

COG

GAG

CCA

TTT

OGG

A»

AAA

CM

»3»

41

«•r

V«1

Thr

Val

Thr

Gly

Pro

Pro

Ac?

Glu

Prw

fh·

Gly

Ax?

Ly·

Mia

JOS

310

315

ere

AM

cas

ATT

GAT

GTC

AAC

ATC

AAC

AAG

ATG

COT

GAT

CTC

GCC

ATG

1007

Leu

tyw

AU

Xla

A*p

Val

Aert

Nat

Aer»

Lya

Met

Pru

Aep

Val

Al·

Mat

43

320

32$

330

ACT

CTT

GCT

<FTG

GTT

GCC

CTC

ttt

GCC

GAT

GGC

CCG

AOk

GCC

ATC

MA

1035

mc

Leu

Ala

Val

Val

Ala

Leu

Pha

Ala

Aarp

Gly

Pro

TMr

Ala

Xla

Ar?

45

135

340

54$

350

GM

OTG

GCT

TCC

TGG

AGA

GTA

AM

GM

AX

GM

MG

ATG

GTT

GOG

ATC

1103

Aep

Val

Ala

Sar

Trp

Ar?

Val

Ly·

Glu

Thr

Glu

Ar?

Met

Val

AX·

Xla

355

340

345

47

CCG

AGO

GAG

CTA

ACC

AM

CTG

GGA

GCA

TCT

GTT

GM

GAA

GOG

COQ

GAC

1151

Ar?

mc

Glu

Leu

Thr

Lyw

Leu

Gly

Ala

•ar

Val

Glu

Glu

aiy

Prw

Aep

RO 120849 Β1

JN

m

100

TCC

ATC

ATC

AQ.

csc

ca:

GAG

AAG

CTG

AAC

GTC

ACT

CCC

ATC

GAC

U··

r/r

Cy-

(Ic

tiv

Ibr

Pt>

Pcj

Glu

Ly»

Lau

Aan

Vjl

Thr

AU

11«

«ap

JM·.

l'M

n·.

T*C

gac

t<ac

CAZ

A5G

ATG

GCC

ATO

GCC

TTC

T“

-tt

CCC

GCC

TOT

rr.c

tyr

A. p

Mir

Arj

Ha*

Ala

Nvl

Ala

ta·

Sar

Lru

AU

Al*

Cy«

<00

<05

410

GCC

GAG

GTC

CCC

GTC

ACC

ATC

CCG

cm:

OCT

GOG

TOC

ACC

CGG

AAG

«CC

1245

Al·

Glu

Vel

Pro

Val

Thr

ri·

Arg

Aap Tro

Gly Cy»

Thr

Arg

Ly»

Thr

<15

<10

<15

430

TTC

CCC

GAC

TAC

TTC

GAT

στα

CTG

AGC

ACT

TTC

GTC

AM

AAT

1331

Ph·

Pro

A*p

Tyr

A*P

Val

Lau

•ar

Ttir

ta»

Val

Ly»

Aan

os

440

TAA 1140 (2) INFORMAȚII DESPRE SEQ ID nr. 3 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 444 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP DE MOLECULĂ: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚELOR SEQ ID nr. 3:

Ala 1

Gly

Ala

Glu

Glu 5

11·

Val

Lau

Gin

Pro 10

Ila

Ly»

Glu

Ila

Sar ÎS

Gly

Thr

v»l

Ly·

Leu 20

Pro

Gly

Sar

Ly»

Sar 25

Uu

Sar

Aan

Arg

XI· 30

Leu

Leu

Lau

Al»

Al· 35

Leu

Sar

Glu

Gly

Thr 40

Thr

Val

Val

Aap

Aan <5

Lau

Lau

Aan

Sar

Glu 50

Aap

V«1

HI»

Tyr

Met 55

Lau

Gly

Ala

Lau

Arg «0

Thr

L«u

Gly

Leu

S«r 65

v«l

Glu

Al·

Aap

Ly« 70

Al·

Ala

Ly»

Axg

Ala TS

Val

ν·ι

Val

Gly

Cy» ao

Gly

Gly

Lya

Ph·

Pro 85

v«l

Glu

Aap

Ala

Lya 90

Glu

Glu

Val

Gin

Lau >5

rn·

Lau

Giy

Aan

Al· 100

Gly

Thr

Al·

Hat

Arg 105

Pro

Lau

Thr

Ala

Ala 110

Val

Thr

Ala

Al·

Gly 115

Gly

Aan

Al·

Thr

Tyr 120

Y«1

Lau

Aap

Gly

Val 125

Pro

Arg

Mat

Arg

Glu 110

Arg

Pro

Ila

Gly

Aap 135

Lau

Val

Val

Gly

Lau 140

Ly»

Gin

Leu

Gly

Ala 145

Aap

Val

Aap

Cy»

Phe 150

Leu

Gly

Thr

Aap

Cy» 155

Pro

Pro

Val

Arg

Val l«0

A*n

Gly

Ila

Gly

Gly 185

Leu

Pro

Gly

Gly

Ly· 170

Val

Ly»

Lau

Sar

Gly 17*

•ar

ii·

Ser

Sar

Gin iso

Tyr

Leu

Ser

Ala

Lau 1*5

Lau

Net

Ala

Ala

Pro 190

Leu

Ala

Uu

Gly

Aap 195

Val

Glu

Ila

Glu

Ila 200

lle

Aap

Ly»

Lau

Ila 20S

Sar

lle

Pro

Tyr

V«1 210

Glu

Met

Thr

Leu

Arg 215

Leu

Mat

Glu

Arg

Ph» 220

«ly

Val

Ly»

Ala

Glu 225

Hi»

3·Γ

Aap

Sar

Trp 210

Aap

Arg

Phe

Tyr

Ila 255

Ly»

Gly Gly

Gin

Ly» 240

τγτ

Ly»

hr

Pro

Lr» 245

Aen

Ala

Tyr

Val

Glu 250

Gly

Aap

Ala

•ar

tar 255

Ala

RO 120849 Β1

Tyr

Cv

r-»o '•17

Al » Thr

Thr

Al Λ .“ur

Ala Luu ’»»0

(1« Thr

G|y Gly Thr

Val 3*0 Phe

Thr Ala

Va l cu 3

2rS G In

Gly

Aep

val

Lyu

»

U-»

« · I ·

Gly

Ala

Ly

Val

Thr

Trp

Thr

•i; j

Thf

Suc

: ·

C ’*♦

JOV

5

Th c

Va 4

The

'1 /

Pro

Pro

Ar?

Glu

Γγο

Ph*

Gly

Arg

Ly

HLa

Lau

Ly

30!»

310

315

120

Al·

ti·

Aap

Aen

Met

Aen

Ly

Mat

Pro

Aap

Val

Ala

Mat

Thr

Lav

7

32$

330

335

Al·

Val

v«L

Ala

Lau

Pha

Ala

Aap

Gly

Pro

Thr

Ala

XI·

Arg

Aarp

Val

340

345

350

9

Ala

9«r

Trp

Arg

Val

ty

Glu

Thr

Glu

Arg

Mat

Val

Ala

XI·

Arg

Thr

335

340

3<5

11

Glu

Lau

Thr

Ly»

Lau

Gly

Ala

Sar

Val

Glu

Glu

Gly

Pro

Aap

Tyr

°y

3*o

3*5

3S0

Xla

XL·

Thr

Pro

Pro

Glu

Ly

Lau

Aen

Val

Thr

Ala

XI· An>

Thr

Tyr

4 O

las

390

395

400

Io

A»p

Aap

HI·

Arg

Mat

Ala

N«t

Ala

Ph«

S«r

Leu

Ala

Ala

cy·

Ala

Glu

405

410

*

419

15

ν·1

Pro

Val

Thr

11·

Arg

Aap

Pro

Gly

Cy

Thr

Arg

Ly

Thx

Phe

Pro

4 20

425

oa

Aap

Tyr

Ph·

Aap

Val

Lau

Sar

Thr

Ph·

Val

Ly

Aan

17

433

440

(2) INFORMAȚII DESPRE SEQ ID nr. 4:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 1340 perechi de bază (B) TIP: acid nucleic (C) TIP DE CATENĂ: dublă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP DE MOLECULĂ: cADN (vi) SURSĂ INIȚIALĂ:

(A) ORGANISM: porumb Zea (B) TULPINĂ: Black Mexican Swcct (vii) SURSĂ DIRECTĂ:

(B) CLONA: pRPA-ML-720 (ix) CARACTERISTICĂ:

(A) NUME/COD: CDS (B) LOCALIZARE: 6...1337 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID nr. 4:

CCATG QCC GGC GCC GAG <JAG ATC GTG CTG GAG CCC ATC AA3 GAG ATC 4*

Al· Gly Al· Glu Glu XI· Val Leu Gin Pro Xla Ly Glu XI· i s 10 39

TCC

GGC

ACC

CTC

AMJ

CTG

CCG

QGG

TCC

AAG

TOG

CTT

TOC

AAC

CCG

ATC

95

Jar

ciy

Thr

v«x

Ly

Leu

Pro

Gly

Sar

Ly

Sar

Lau

S«r

Aen

Arg

Xla

15

20

25

30

41

CTC

CTA

CTC

GCC

GCC

CTG

TCC

GAG

GOG

ACA

ACA

ora

GTT

GAT

AAC

CTG

143

Leu

Leu

Leu

Ala

Ala

Uu

Sar

Glu

Gly

Thr

Thr

Val

Val

Aep

Aen

Leu

33

40

45

43

CTG

AAZ

AGT

GAG

GAT

GTC

CAC

TAC

ATG

CTC

GGG

GCC

TTG

AGG

ACT

CTT

1S1

Lau

Aen

S«r

Glu

Aap

Val

HI a

Tyr

Mat

Lau

Gly

Ala

Leu

Arg

Thr

Lau

50

55

<0

45

GGT

CTC

TCT

GTC

GAA

GOG

SAC

AAA

GCT

GCE

AAA

AGA

GCT

GTA

GTT

GTT

239

Gly

L«u

Ser

v»l

Glu

Ala

Aep

Ly

Ala

Ala

Ly Arg

Al·

Val

Val

Val

43

20

75

RO 120849 Β1

3

t > '«C • a ✓

rrr crrr

ΓΓΑ. <;iv

W. LV

TTC *T»e

OCA ?Γ3 4S

CTT va 1

<VU‘. ·} Iu

CAT A.<p

rxrr AH

AAA GAC GAA

GTG «« l

CAG Cin

Tal

C’/- H'l

<M V

Ly-J no

Glu

5

rrc

ΓΤ1.

·>-»

AAf

'CT

'-<CA

ATC

•K>

AT*·,

tc:

tt;

ACA

<X7A

ncr

JJ5

-··*

rtv·

(c·.

Η V

A

A l j

Gir

( Ir

Aii

Met

An

Sec

I..KJ

Trvr

A l \

Ala

»

1«ιΠ

l js

110

7

ACT

GCT

<CT

<X7T

GGA

AAT

GCA

ACT

TAC

CTG

ctt

GAT

GGA

GTA

CTA

383

i

Tnr

AU

Ale

Gly

Gly

Aen

Ale

7nr

Tyr

Vel

Leu

Aep

Gly

val

Pro

115

120

i:s

9

AGA

ATG

ACG

gag

AGA

cec

ATT

CCC

GAC

TTG

GTT

CTC

GGA

TTG

AAG

CAG

431

Arg

Met

Arg

Glu

Arg

PctS

XI.

Gly

Aep

Leu

Val

Val

Gly

Leu

Ly»

Gin

130

135

140

11

crr

GCT

GCA

GAT

GTT

GAT

TCT

TTC

crr

GGC

ACT

GAC

TGC

OCA

CCT

GTT

41»

Leu

Gly

Ale

Aep

Vel

Aep

Cyw

Phe

Leu

Gly

Thr

Aep

Cy»

Pro

Pro

Val

145

130

155

13

CCT

CTC

AAT

GGA

ATC

GGA

GGG

CTA

CCT

GCT

GGC

AAG

CTC

AAG

CTG

TCT

323

Arg

ν·1

Aer»

Gly

Xle

Giy

Gly

Leu

Pro

Gly

Gly

Lyw

Val

Ly»

Leu

Ser

140

163

170

15

GGC

TCC

ATC

AGC

act

CAG

TAC

TTG

ACT

GCC

TTG

CTG

ATG

GCT

GCT

CCT

373

Gly

Ser

XI.

Ser

Ser

Gin

Tyr

Leu

Ser

Al·

Leu

Leu

M«C

Al·

Ala

Pro

173

ιβο

ies

l»0

17

TTG

GCT

CTT

GGG

GAT

CTG

GAG

ATT

GAA

ATC

ATT

GAT

AAA

TTA

ATC

TCC

«23

Leu

Ale

Leu

Gly

Aep

Vel

Glu

Xle

Glu

XI·

XI.

Aep

Ly»

Leu

XX·

Ser

193

200

203

19

ATT

CCG

TAC

arc

GAA

ATG

ACA

TTG

AGA

ττα

ATG

GAG

CCT

TTT

GGT

GTG

«71

Ile

Pro

Tyr

Vel

Glu

M.t

Thr

Leu

Arg

Leu

Met

Glu

Arg

Pha

Gly

Val

210

215

220

21

AAA

OCA

GAG

CAT

TCT

GAT

AGC

TGG

GAC

AGA

TTC

TAC

ATT

AAG

GGA

GCT

71»

Lys

Ale

Glu

Hls

Ser

Aep

s.c

Trp

Aep

Arg

Phe

Tyr

Xle

Ly»

Gly

Gly

223

Z30

233

23

CAA

AAA

TAC

AAG

TCC

CCT

AAA

AAT

GCC

TAT

CTT

GAA

GGT

GAX

GOC

TCA.

7«7

Gin

Ly»

Tyr

Ly·

Ser

Pro

Ly·

Aen

Al>

Tyr

V.l

Glu

Gly

Aep

Ala

Ser

240

243

250

25

AGC

GCA

AGC

TAT

TTC

TTG

GCT

GOT

GCT

GCA

ATT

ACT

GGA

GGG

ACT

GTG

815

Ser

Al·

Ser

Tyr

Phe

Leu

Al.

Gly

Al·

Ala

XX.

Thr

Gly

Gly

Thr

Val

255

260

265

270

27

ACT

CTG

GAA

GCT

TOT

GGC

AOC

ACC

AGT

TTG

CAG

GGT

GAT

GTG

AAG

TTT

8«3

Thr

Vel

Glu

Gly

cy»

Gly

Thr

Thr

Ser

Leu

Gin

Gly

Aep

Val

Lye

Phe

27 S

280

283

9Q

GCT

GAG

GTA

CTG

GAG

ATG

ATG

GGA

GCG

AAG

GTT

ACA

TGG

ACC

GAG

ACT

911

Ζ\7

Al·

Glu

Val

Lou

Glu

Met

Met

Gly

Al·

Ly»

Val

Thr

Trp

Thr

Glu

Thr

230

2S5

300

οι

AGC

CTA

ACT

CTT

ACT

GGC

OCA

cea

CCG

GAG

CCA

TTT

GGG

AGG

AAA

CAC

»3»

O I

S.r

Vel

Thr

Vel

Thr

Gly

Pro

Pro

Arg

Glu

Pro

Phe

Gly Arg

Ly»

HI»

303

310

313

QO

CTC

AAG

GOG

ATT

GAT

CTC

AAC

ATG

AAC

AAG

ATG

OCT

GAT

CTC

GCC

Ατα

1007

Leu

Ly.

Ale

XI.

Aep

Vel

Aen

Met

Aen

Ly·

Met

Pro

Aep

val

Ala

Mat

320

325

330

ACT

CTT

GCT

CTG

GTT

GCC

CTC

TTT

GCC

GAS

GGC

CCG

ACA

acc

ATC

AGA

1055

Thr

Leu

Ale

Vel

Val

Al.

Leu

Ph«

Al·

Aep

Gly

Pro

Thr

Ala

Xle

Arg

333

340

343

330

O 7

GAC

CTG

GCT

TCC

TOG

AGA

CTA

AAG

G*C

ACC

GM

AGO

ATG

GTT

GCS

ATC

1103

01

A»p

Vei

Ale

Ser

Trp

Arg

v.i

Ly

Glu

Thr

Glu

Arg

N«e

Val

Ala

Ile

355

3<0

3<S

ΩΩ

CCG

ACG

GAG

CTA

ACC

AAG

CTG

GGA

OCA

TCT

GTT

GAG

GAA

GGG

003

GAC

1151

jy

Arg

Thr

Glu

Leu

Thr

Ly.

leu

Gly

Al·

sar

Val

Glu

Glu

Gly

Pro

Aep

370

375

380

A 1

TAC

TGC

ATC

ATC

ACG

CCG

CCG

GAG

AAG

CTG

AAC

GTG

ΛΟ3

GCG

ATC

GAC

11»«

4 1

Tyr

Cyw

11«

Ile

Thr

Pro

Pro

Glu

Ly»

Leu

Aen

V«1

Thr

Ala

Ile

A»p

3«3

390

333

RO 120849 Β1

fAC GAC

*;ac cac αλτ;

ΑΤΠ Kwț. «<n

OCT» Ala

ATG Met

GCC TTC TOC

CTT CCC L«ru Ala

CCC TGT

1217 3

Tyr ion

A* P

Axp

»<1.4

Arg

Aia

Phe

Sar 410

A4a

Cyw

ΛΛΓ.

στ:

CCC

**?C

*cc

ATC

ax

GAC

CCT

GfX

TCC

ACC

σζ

AAG

ACC

ll«5

;ι·4

Ό l

Pn

V 91

Thr

I 1«

Arg

A^p

Pro

<îtr

Cy»

Thr

Arg

Lr»

Thr

«20

42)

<10

5

CCC

GAC

TAC

TTC

GAT

GTG

CTG

AGC

ACT

TTC

GTC

AAG

AAT

11J7

Pro

Aap

Tyr

Phe

Aap

Val

Leu

Sar

Thr

Phe

val

Ly*

Ama

05

«40

7

1J40

9

INFORMAȚII DESPRE SEQ ID nr. 5:	11
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 444 aminoacizi	13
(B) TIP: aminoacid
(D) TOPOLOGIE: liniară	15
(ii) TIP DE MOLECULĂ: proteină
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID nr. 5:	17

Kla Gly Ala Glu

Glu XI· Val

Lau Gir* Ly» Ser 25

Pro Xle 10 Leu Ser

Ly» Aen

Glu Xle

Sar Gly 15

1

Leu 20

5 Pro Gly

s«r

Arg

11« 30

Thr

val Ly»

Lau

Lau

21

Leu

Ala

Ala

Leu

Ser

Glu

Gly

Thr

Thr

Val

Val

Aep

Aen

Leu

Uu

Asn

OQ

35

40

45

Sar

Glu

Aap

Val

HI»

Tyr

Met

Leu

Gly

Ala

Leu

Arg

Thr

Leu

Gly

Lau

50

ss

<0

25

Ser

Val

Glu

Ala

Asp

Ly·

Ala

Ale

Ly»

Arg

Ala

Val

Val

Vsl

Gly Cy»

«5

10

75

•0

Gly

Gly

Lyw

Phe

Pro

Val

Glu

Aep

Al·

Ly»

Glu

Glu

Val

Gin

Lau

Pha

27

as

»0

95

Lau

Gly

Asn

Ala

Gly

11·

Ala

Met

Arg·

Ser

Leu

Thr

Ala

Al»

Val

Thr

29

100

105

110

Al.

Al.

Gly

Gly

Aer

Ala

Thr

Tyr

Val

Leu

Aep

Gly

Val

Pro

Arg

Net

115

120

125

31

Arg

Glu

Arg

Pro

Ile

Gly

A<p

Leu

Val

Val

Gly

Leu

Ly»

Gin

Leu

Gly

150

135

140

Ala

Aep

Val

Asp

Cy·

Phe

Leu

«ly

Thr

Aap

cy»

Pro

Pro

Vsl

Axg

Val

33

145

150

155

1*0

Asn

Gly

11·

Gly

Gly

Leu

Pro

Gly

Gly

Ly»

Val

Ly»

Iau

Ser

Gly

Sec

1*5

170

175

35

XI·

Sar

Ser

Gin

Tyr

Lej

Ser

Ala

Leu

Lau

Net

Ala

Ala

Pro

Lau

Ala

100

105

190

37

Leu

Gly

Asp

Val

Glu

11«

Glu

Xle

Xle

Aep

Ly»

Leu

11»

Ser

Ile

Pro

195

200

205

Tyr

Val

Glu

Net

Thr

Leu

Arg

Lau

Net

Glu

Arg

Phe

Gly

Vsl

Ly·

Ala

39

210

215

220

Glu

HI·

Ser

Aap

Ser

Trp

Aap

Arg

Phe

Tyr

Xle

Ly»

Gly Gly

Gin

Ly»

225

230

235

240

41

Tyr

Ly»

Ser

Pro

Lyw

Aer»

Ala

Tyr

Vel

Glu

Gly Aep

Ala

Sar

Sar

Ala

24$

250

253

43

Ser

Tyr

Phe

Leu

Ala

Gly

Ala

Ala

Xle

Thr

Gly Gly

Thr

Val

Thr

Val

2<0

2*5

290

Glu

Gly

Cy·

Gly

Thr

Thr

Ser

Leu

Gir»

Gly

Asp

Val

Ly»

Phe

Al·

Glu

rs 2ao 2«s

RO 120849 Β1

Vil Lvu Glu Mvt Met Gly Al· Lyw Val Thr Trp Thr 'îlu Thr Ser Val 2>O ζ·5 JOO

Thr *-il Thr eru Pro Arq Glu Pro Pha Gly Arg Lyj Hla Leu Lys J0'· Jio 315 j;o

Al i

. Ir

*. L

·< ·»

Mat

Aen

Ly»

Mrt

Pr-j

Aep

Val

AU

Mat

Thr

Leu

JJO

335

Al»

v«l

Val

Al»

Lau

Phe

Ala

Aap

Gly

Pro

Thr

Ala

Ile

Arg

Aep

v«l

J<0

345

350

Al·

Sar

Trp

Arg

Val

Ly»

Glu

Thr

Glu

Arg

Hat

Val

Ala

Ile

Arg

Thr

355

340

345

Glu

L»U

Thr

Ly·

Lau

Gly

Ala

Ser

Val

Glu

Glu

Gly

Pro

Aap

Tyr

Cy»

370

375

3«O

11·

XI·

Thr

Pro

Pro

Glu

Ly.

Leu

Aen

Val

Thr

Ala

Ila

Aep

Thr

Tyr

385

390

395

4 00

Aap

Aep

Hi·

Arg

Mat

Ala

Nat

Ala

Pha

Ser

Uu

Ala

Ala

Cya

Ala

Glu

405

410

•

415

Val

Pro

ν·ι

Thr

11«

Arg

Arp

Pro

Gly

Cy»

Thr

Arg

Ly»

Thr

Pha

Pro

420

425

430

Aep

Tyr

Pha

A«p

Val

Lau

Sar

Thr

Pha

Val

Ly»

Aan

435

440

Revendicări

Claims (14)

1. Proteină mutantă 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfat sintază (EPSPS), caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde cel puțin una din substituțiile treoninei la izoleucină, la treonina care corespunde poziției 102 a secvenței EPSPS de la porumb, și o substituție a pralinei la serină, la pralina care corespunde poziției 106 a secvenței EPSPS de la porumb.

2. Proteină mutantă EPSPS de plantă, în conformitate cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că este reprezentată de secvența SEQ ID nr. 5.

3. Secvență ADN de plantă, ce codifică pentru proteina mutantă EPSPS, în conformitate cu revendicarea 1 sau 2.

4. Secvență ADN de plantă, în conformitate cu revendicarea 3, caracterizată prin aceea că provine de la porumb.

5. Secvență ADN de plantă, în conformitate cu oricare din revendicările 3 sau 4, caracterizată prin aceea că este reprezentată de SEQ ID nr. 4.

6. Genă himerică, cuprinzând o secvență de codificare, precum și elemente reglatoare la pozițiile 5’ și 3’, care sunt heteroloage și sunt capabile să funcționeze în plante, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde, ca secvență de codificare, cel puțin o secvență ADN descrisă în oricare din revendicările 3 la 5.

7. Genă himerică, în conformitate cu revendicarea 6, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde un promotor de virus vegetal.

8. Genă himerică, în conformitate cu revendicarea 6, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde un promotor de origine vegetală, de exemplu: α-tubulina, histone, introni, actina etc.

9. Vector pentru transformarea plantelor, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde cel puțin o genă himerică, în conformitate cu revendicările 6 la 8.

10. Celulă de plantă, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde cel puțin o genă himerică, în conformitate cu revendicările 6 la 8.

RO 120849 Β1

11. Plantă caracterizată prin aceea că se obține prin regenerarea unei celule de 1 plantă, conform revendicării 10.

12. Procedeu de obținere a plantelor cu toleranță îmbunătățită la un erbicid, având 3

EPSPS sintaza ca țintă, caracterizat prin aceea că celulele de plantă sau protoplastele sunt transformate cu o genă, în conformitate cu una din revendicările 1 la 8, și că celulele 5 transformate sunt supuse regenerării.

13. Procedeu pentru tratamentul plantelor cu un erbicid având EPSPS ca țintă, 7 caracterizat prin aceea că erbicidul se aplică plantelor, în conformitate cu revendicarea 11.

14. Procedeu în conformitate cu revendicarea 13, caracterizat prin aceea că se 9 aplică glifosatul sau un precursor de glifosat.