BRPI9609792B1 - Epsps protein, plant change, dna sequence, chemical gene, plant transformation vector, method for the production of non-food plants and plants treatment method - Google Patents

Description

“PROTEÍNA DE EPSPS MUTADA DE PLANTA, SEQUÊNCIA DE DNA, GENE QUIMÉRICO, VETOR PARA A TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS NÃO ALIMENTÍCIAS E MÉTODO DE TRATAMENTO DE PLANTAS” A presente invenção refere-se a uma nova 5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintase (ou EPSPS) que tem uma maior tolerância em relação a herbicidas que são inibidores competitivos em relação ao piruvato de fosfoenol (PEP) da atividade da EPSPS. Essa EPSP sintase mais tolerante possui pelo menos uma substituição de "treonina por isoleucina". A invenção também se refere a um gene codificador dessa proteína, a células de plantas transformadas por construções de genes quiméricos que contêm esse gene, a plantas regeneradas dessas células, e também a plantas que são originadas do cruzamento mediante o uso dessas plantas transformadas. O glifosato, o sulfosato e a fosametina são herbicidas sistêmicos de espectro amplo da família da fosfometil glicina. Eles agem essencialmente como inibidores competitivos da 5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintase (EC 2.5.1.19), ou EPSPS, em relação ao PEP (piruvato de fosfoenol). Depois de sua aplicação à planta, eles são translocados na planta, onde se acumulam nas plantas de crescimento rápido, em particular no caulino e pontas de raízes, causando danos até o ponto de destruição de plantas sensíveis. A EPSPS de plastídios, o alvo principal desses produtos, é uma enzima de trânsito da biossíntese de aminoácidos aromáticos, a qual é codificada de um ou mais genes nucleares e sintetizada na forma de um precursor citoplásmico, e então importada para os plastídios, nos quais se acumula em sua forma madura. A tolerância das plantas ao glifosato e a produtos da família é obtida por meio da introdução estável em seu genoma de um gene de EPSPS, de origem vegetal ou bacteriana, o qual é mutado ou algo parecido em relação às características de inibição por glifosato do produto desse gene. Em vista do modo de ação do glifosato e do grau de tolerância ao glifosato do produto dos genes que são usados, é vantajoso poder expressar o produto da translação desse gene de modo que ele possa ser acumulado em quantidades substanciais nos plastídios. É conhecido, por exemplo, a partir da Patente U.S. No. 4.535.060 que é conferida a uma planta uma tolerância a um herbicida do tipo acima, em especial N-fosfono metil glicina ou glifosato, ao se introduzir ao genoma das plantas um gene codificador de uma EPSPS que contém pelo menos uma mutação que torna essa enzima mais resistente ao seu inibidor competitivo (glifosato) depois da localização da enzima no compartimento de plastídio. No entanto, essas técnicas precisam ser aperfeiçoadas, a fim de se obter uma maior confiabilidade no uso dessas plantas sob condições agrícolas.

Na presente descrição, "planta" deve ser entendido como indicativo de qualquer organismo multicelular diferenciado capaz de fotossíntese, e "célula de planta" deve ser entendido como indicativo de qualquer célula cuja origem é uma planta e é capaz de constituir tecidos não diferenciados tais como calosidades ou tecidos diferenciados tais como embriões ou partes de plantas ou sementes. O objetivo da presente invenção é a produção de plantas transformadas com maior tolerância a herbicidas da família da fosfono metil glicina, através da regeneração de células transformadas por meio de novos genes quiméricos que contêm um gene para tolerância a esses herbicidas. O objetivo da invenção também compreende um gene quimérico para conferir a plantas uma maior tolerância em relação a um herbicida que tem EPSPS como seu alvo, que compreende, na direção da transcrição: uma região de promotor, opcionalmente uma região de peptídio de trânsito, uma seqüência de um gene codificador de uma enzima de tolerância ao glifosato e uma região de sinal de poliadenilação não traduzida na extremidade 3', caracterizado pelo fato do gene de tolerância ao glifosato conter, em relação ao gene do qual é derivado, uma substituição de "treonina 102 por isoleucina" na região "aroA"(EPSPS). De preferência, ele compreende, além disso, na mesma região, uma substituição de "prolina 106 por serina". Essas substituições podem ser introduzidas ou estarem presentes em uma seqüência de EPSPS de qualquer origem, em particular de origem vegetal, bacteriana, algal ou fúngica.

Os peptídios de trânsito que podem ser usados na região de peptídio de trânsito podem ser, conhecidos 'per se', de origem vegetal, por exemplo, originários do milho, girassol, ervilhas, fumo, ou outros. O primeiro e o segundo peptídios de trânsito podem ser idênticos, semelhantes ou diferentes. Além disso, cada um deles pode compreender uma ou mais unidades de peptídio de trânsito de acordo com o Pedido de Depósito de Patente de Invenção Europeu EP 0 508 909. O papel dessa região característica consiste em permitir a liberação de uma proteína madura e selvagem, e em especial a EPSPS mutada acima, com uma eficácia máxima no compartimento de plasmídio. A região de promotor do gene quimérico de acordo com a invenção pode ser vantajosamente composta por pelo menos um promotor de gene ou fragmento de promotor que é expresso naturalmente em plantas (tubulina, introns, actina, histona). A região de sinal de terminação de transcrição não traduzida na extremidade 3' do gene quimérico pode ser de qualquer origem, por exemplo, de origem bacteriana, tal como no caso do gene de nopalina sintase, ou de origem vegetal, tal como no caso do gene H4A748 de histona de Arabidopsis thaliana de acordo com o Pedido de Depósito de Patente de Invenção Europeu (Pedido de Depósito Europeu 633 317). O gene quimérico de acordo com a invenção pode compreender, além das porções essenciais acima, pelo menos uma região intermediária (ligadora) não traduzida, a qual pode ficar localizada entre as diferentes regiões transcritas descritas acima. Essa região intermediária pode ser de qualquer origem, por exemplo, de origem bacteriana, viral ou vegetal. Isolamento de um cDNA codificador de uma EPSPS de milho: As etapas distintas que levaram à obtenção do cDNA de EPSPS de milho, que serviu como substrato para a introdução das duas mutações, estão descritas a seguir. Todas as operações descritas a seguir são fornecidas a título de exemplificação, e correspondem a uma seleção feita entre os diferentes métodos disponíveis para se chegar ao mesmo resultado. Essa seleção não tem efeito algum na qualidade do resultado e, por conseguinte, qualquer método adequado pode ser usado por um elemento versado na técnica para se chegar ao mesmo resultado. A maior parte dos métodos de engenharia de fragmentos de DNA está descrita em "Current Protocols in Molecular Biology", Volumes 1 e 2, Ausubel F.M. et al., publicado por Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989) (daqui por diante, as referências aos protocolos descritos neste trabalho serão indicadas por "ref. CPMB"). As operações relacionadas com o DNA que foram realizadas de acordo com os protocolos descritos neste trabalho são em especial as seguintes: ligação de fragmentos de DNA, tratamento com DNA polimerase de Klenow e DNA polimerase de célula T4, preparação de plasmídio e DNA de bacteriófago λ, tanto como uma mini-preparação quanto como uma maxi-preparação, e análises de DNA e RNA de acordo com as técnicas de Northern e Southern, respectivamente. Foram seguidos outros métodos descritos neste trabalho, e estão descritas a seguir apenas as modificações ou adições significativas feitas a esses protocolos.

Exemplo 1: 1. Obtenção de um Fragmento de EPSPS de Arabidopsis thauana a) Dois oligonucleotídios de 20-meros de seqüências respectivas: 5'-GCT CTGCT CAT GT CTGCT CC-3' 5-GCCCGCCCTT G ACAAAG AAA-3' foram sintetizados da seqüência de um gene de EPSPS de Arabidopsis thaliana (Klee H.J. et al., (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437-442). Esses dois oligonucleotídios ficam nas posições 1523 a 1543 e 1737 a 1717, respectivamente, da seqüência publicada, e em orientações opostas. b) O DNA total de Arabidopsis thaliana (var. columbia) foi obtido junto à Clontech (referência no catálogo: 6970-1). c) 50 nanogramas (ng) de DNA são misturados com 300 ng de cada um dos oligonucleotídios e submetidos a ciclos de 35 amplificações com um aparelho Perkin-Elmer 9600, sob as condições de meio padrão para amplificação que são recomendadas pelo fornecedor. O fragmento de 204-pb resultante constitui o fragmento de EPSPS de Arabidopsis thaliana. 2. Construção de uma Biblioteca de um cDNA de uma Linhagem Celular de Milho BMS a) Cinco gramas de células filtradas são triturados em nitrogênio líquido, e o total de ácidos nucléicos é extraído de acordo com o método descrito por Shure et al., com as modificações a seguir: - o pH do tampão da lise é ajustado em um valor de pH = 9,0; - depois da precipitação com isopropanol, a pelota é extraída em água e, depois da dissolução, ajustada em 2,5 M de cloreto de lítio. Depois da incubação por doze horas a °C, a pelota da centrifugação durante quinze minutos a 30.000 g a 4°C é ressolubilizada. A etapa de precipitação em cloreto de lítio é então repetida. A pelota ressolubilizada constitui a fração de RNA do total de ácidos nucléicos. b) a fração de poli(A)+ RNA da fração de RNA é obtida através de cromatografia em uma coluna de oligo(dT)-celulose, tal como descrito em "Current Protocols in Molecular Biology". c) Síntese de cDNA de dupla fita com uma extremidade EcoRI sintética: ela é realizada de acordo com o protocolo do fornecedor dos diferentes reagentes necessários a essa síntese na forma de um kit: o "kit de cópia" da empresa In Vitrogen.

Dois oligonucleotídios de simples fita e parcialmente complementares das respectivas seqüências: 5'-AATT CCCGGG-3' 5'-CCCGGG-3' (sendo que a segunda é fosforilada) são ligados com os cDNAs de dupla fita de extremidade plana (blunt).

Essa ligação dos adaptadores resulta na criação de sítios Smal ligados aos cDNA de dupla fita e sítios EcoRI em forma coesiva em cada extremidade dos cDNA de dupla fita. d) Criação da biblioteca: Os cDNA que possuem os sítios EcoRI coesivos artificiais em suas extremidades são ligados com cDNA de bacteriófago Àgt10 que foi cortado com EcoRI e desfosforilado de acordo com o protocolo do fornecedor New England Biolabs.

Uma alíquota da reação de ligação foi encapsulada in vitro com extratos de encapsulação, ou seja, Gigapack Gold, de acordo com as instruções do fornecedor; essa biblioteca foi titulada ao se usar a bactéria E. coli C600hfl. A biblioteca obtida dessa maneira é amplificada e armazenada de acordo com as instruções do mesmo fornecedor, e constitui a biblioteca de cDNA de suspensão de células de milho BMS. 3. Triagem da Biblioteca de cDNA de Suspensão de Células de Milho BMS com a Sonda de EPSP de Arabidopsis thaliana O protocolo seguido é aquele de "Current Protocols in Molecular Biology", Volumes 1 e 2, Ausubel F.M. et al., publicado por Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience (1989) (CPMB). Em resumo, cerca de 106 fagos recombinantes são colocados em lâminas LB a uma densidade média de 100 fagos/cm2. As placas líticas são replicadas em duplicata em membranas Amersham Hybond N. O DNA foi fixado aos filtros através de tratamento UV a 1.600 kJ (Stratagene Stratalinker). Os filtros foram pré-hibridizados em leite desnatado 6xSSC/0,1%SDS/0,25 por duas horas a 65°C. A sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana foi marcada com [32P] através de marcação aleatória de acordo com as instruções do fornecedor (Kit Ready-to-Go da Pharmacia). A atividade específica obtida é da ordem de 108 cpm por micrograma de fragmento. Depois da desnaturação por cinco minutos a 100°C, a sonda é adicionada ao meio de pré-hibridização e a hibridização é continuada por catorze horas a 55°C. Os filtros são fluorografados por 48 horas a -80°C com filme XAR5 da Kodak e crivos intensificadores Amersham Hyperscreen RPN. O alinhamento dos pontos positivos no filtro com as lâminas das quais eles são originários permitem que as zonas que correspondem aos fagos que apresentam uma resposta de hibridização positiva com a zona de EPSPS de Arabidopsis thaliana sejam apanhadas da lâmina. Essa etapa de colocação, transferência, hibridização e recuperação é repetida até que todos os pontos na lâmina dos fagos purificados sucessivamente provarem ser 100% positivos na hibridização. Uma placa independente de lise de fagos é então apanhada no meio diluente λ (Tris-CI, pH = 7,5; 10 mM de sulfato de magnésio; cloreto de sódio 0,1 M; 0,1% de gelatina); esses fagos em solução constituem os clones positivos de EPSP da suspensão de células de milho BMS. 4. Preparação e Análise do DNA dos Clones de EPSPS da Suspensão de Células de Milho BMS

Cerca de 5x108 fagos são adicionados a 20 ml de bactérias C600hfl a um valor de OD6oonm de 2/ml e incubados por quinze minutos a 37°C. Essa suspensão é a seguir diluída em 200 ml de um meio de cultura de bactérias em um frasco Erlenmeyer de 1 litro, e agitada em um agitador rotativo a 250 rpm. É observada a lise quando o meio fica claro, o que corresponde à lise das bactérias turvas, e ocorre depois de cerca de quatro horas de agitação. Esse sobrenadante é então tratado tal como descrito em "Current Protocols in Molecular Biology". O DNA obtido corresponde aos clones de EPSP da suspensão de células de milho BMS.

Um a dois microgramas desse DNA são cortados com EcoRI e separados em gel de agarose LGTA/TBE a 0,8% (ref. CPMB). Uma verificação final consiste em verificar se o DNA purificado apresenta realmente um sinal de hibridização com a sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana. Depois da eletroforese, os fragmentos de DNA são transferidos para membranas Amersham Hybond N de acordo com o protocolo de Southern descrito em "Current Protocols in Molecular Biology". O filtro é hibridizado com a sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana de acordo com as condições descritas na seção 3 acima. O clone que apresenta um sinal de hibridização com a sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana e contém o fragmento EcoRI mais longo tem um tamanho estimado em gel de cerca de 1,7 kpb. 5. Obtenção do Clone pRPA-ML-71 1 Dez microgramas do clone de fago contendo o elemento de 1,7 kpb são digeridos com EcoRI e separados em gel de agarose LGTA/TBE a 0,8% (ref. CPMB). O fragmento de gel contendo o elemento de 1,7 kpb é retirado do gel através de tingimento BET (BET staining), e o fragmento é tratado com beta-agarose de acordo com o protocolo do fornecedor, New England Biolabs. O DNA purificado do fragmento de 1,7 kpb é ligado a 12°C por catorze horas com o DNA do plasmídio pUC 19 (New England Biolabs) cortado com EcoRI de acordo com o protocolo de ligação descrito em "Current Protocols in Molecular Biology". Dois microlitros da mistura de ligação acima são usados para a transformação de uma alíquota de E. coli DH10B

eletrocompetente; a transformação é realizada através de eletroporação ao se empregar as condições a seguir: a mistura de bactérias competentes e meio de ligação é introduzida em uma célula de eletroporação com 0,2 cm de espessura (Biorad) previamente resfriada até 0°C. As condições físicas da eletroporação mediante o uso de um eletroporador fabricado pela Biorad são: 2.500 volts, 25 μΡ e 200 Ω. Sob essas condições, o tempo médio de descarga do condensador é da ordem de 4,2 milisegundos. As bactérias são então extraídas em 1 ml de meio SOC (ref. CPMB) e agitadas por uma hora a 200 rpm em um agitador rotativo em tubos Corning de 15 ml. Depois da colocação em meio de LB/agar suplementado com 100 μg/ml de carbenicilina, minipreparados dos clones bacterianos que foram cultivados depois de uma noite a 37°C são produzidos de acordo com o protocolo descrito em "Current Protocols in Molecular BiologyDepois da digestão do DNA com EcoRI e da separação por eletroforese em gel de agarose LGTA/TBE a 0,8% (ref. CPMB), os clones contendo um elemento de 1,7 kpb são retidos. Uma verificação final consiste em verificar se o DNA purificado apresenta realmente um sinal de hibridização com a sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana. Depois da eletroforese, os fragmentos de DNA são transferidos para membranas Amersham Hybond N de acordo com o protocolo de Southern descrito em "Current Protocols in Molecular Biology". O filtro é hibridizado com a sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana de acordo com as condições descritas na seção 3 acima. O clone de plasmídio contendo um elemento de 1,7 kpb e que hibridiza com a sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana foi preparado em uma escala maior, e o DNA resultante da lise das bactérias foi purificado em um gradiente de cloreto de césio tal como descrito em "Current Protocols in Molecular Biology'. O DNA purificado foi parcialmente seqüenciado com um kit da Pharmacia de acordo com as instruções do fornecedor e empregando-se como primers os primers M13 universais direto e reverso pedidos junto ao mesmo fornecedor. A seqüência parcial produzida cobre cerca de 0,5 kpb. A seqüência de aminoácidos derivada na região da proteína madura (cerca de 50 resíduos de aminoácido) apresenta uma identidade de 100% com a seqüência de aminoácidos correspondente da EPSPS de milho maduro descrita na Patente U.S 4.971.908. Esse clone, que corresponde a um fragmento EcoRI de 1,7 kpb do DNA de EPSP da suspensão de células de milho BMS, foi indicado por pRPA-ML-711. A seqüência completa desse clone foi determinada em ambas as fitas ao se usar o protocolo do kit da Pharmacia e ao se sintetizar os oligonucleotídios complementares e aqueles de orientação oposta a cerca de cada 250 pb. A seqüência completa obtida desse clone de 1713 pb é apresentada na SEQ ID No. 1. 6. Obtenção do Clone pRPA-ML-71 5 A análise da seqüência do clone pRPA-ML-711, e em especial a comparação da seqüência de aminoácidos derivada com a do milho, revela uma extensão de seqüência de 92 pb a montante do códon GCG codificador da alanina NH2-terminal da parte madura da EPSPS do milho (Patente U.S. 4.971.908). De maneira análoga, é observada uma extensão de 288 pb a jusante do códon AAT que codifica a asparagina COOH-terminal da parte madura da EPSPS do milho (Patente U.S. 4.971.908). Essas duas partes podem corresponder, no caso da extensão de NH2-terminal à uma parte da seqüência de um peptídio de trânsito para localização de plastídio e, no caso da extensão COOH-terminal, à região 3' não traduzida do cDNA. A fim de se obter um cDNA para codificar a parte madura do cDNA de EPSPS de milho, tal como descrito na Patente U.S. 4.971.908, foram executadas as operações a seguir. a) Remoção da região 3' não traduzida: construção do pRPA-ML-712 O clone pRPA-ML-711 foi cortado com a enzima de restrição Asei, e as extremidades resultantes dessa divagem foram aparadas (rendered blunt) através de tratamento com o fragmento de Klenow da DNA polimerase I de acordo com o protocolo descrito em CPMB. Uma divagem com a enzima de restrição Sacll foi então realizada. O DNA resultante dessas operações foi separado através de eletroforese em gel de agarose LGTA/TBE a 1% (ref. CPMB). O fragmento de gel contendo o elemento "Asel-extremidades planas/Sacll" de 0,4 kpb foi retirado do gel e purificado de acordo com o protocolo descrito na seção 5 acima. O DNA do clone pRPA-ML-711 foi cortado com a enzima de restrição Hindlll no sítio Hindlll localizado no polylinker do vetor de clonagem pUC19, e as extremidades resultantes dessa divagem foram aparadas através de tratamento com o fragmento de Klenow de DNA polimerase I. Foi então executada uma divagem com a enzima de restrição Sacll. O DNA resultante dessas manipulações foi separado através de eletroforese em gel de agarose LGTA/TBE a 0,7% (ref. CPMB). O fragmento de gel contendo o elemento de Hindlll-extremidades planas/Sacll de cerca de 3,7 kpb foi retirado do gel e purificado de acordo com o protocolo descrito na seção 5 acima.

Os dois elementos foram ligados, e dois microlitros da mistura de ligação foram usados para transformar E. coli DH10B tal como descrito na seção 5. O teor de DNA de plasmídio de clones diferentes foi analisado de acordo com o procedimento descrito para o pRPA-ML-711. Um dos clones de plasmídio selecionados contém um elemento de EcoRI-HinlII de cerca de 1,45 kpb. A seqüência das extremidades terminais desse clone revela que a extremidade 5' do elemento corresponde exatamente à extremidade correspondente do pRPA-ML-711, e que a extremidade terminal 3' possui a seqüência abaixo: "51-.. .AATT AAGCT CT AGAGT CGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3"'. A sequência sublinhada corresponde ao códon do aminoácido asparagina COOH-terminal, e o códon seguinte corresponde ao códon de parada da tradução. Os nucleotídios a jusante correspondem aos elementos de seqüência do polylinker pUC19. Esse clone que compreende a seqüência de pRPA-ML-711 até o sítio de parada de tradução da EPSPS de milho maduro e seguida pelas seqüências do polylinker pUC 19 até o sítio Hindlll foi indicado como pRPA-ML-712. b) Modificação da extremidade 5' do pRPA-ML-712: construção do pRPA-ML-715 O clone pRPA-ML-712 foi cortado com as enzimas de restrição Pstl e Hindlll. O DNA resultante dessas manipulações foi separado através de eletroforese em gel de agarose LGTA/TBE a 0,8% (ref. CPMB). O fragmento de gel contendo o elemento Pstl-EcoRI de 1,3 kpb foi retirado do gel e purificado de acordo com o protocolo descrito na seção 5 acima. Esse elemento foi ligado na presença de uma proporção equimolecular de cada um dos dois oligonucleotídios parcialmente complementares de seqüência: Oligo 1:5'-GAGCCGAGCT CCAT GGCCGGCGCCGAGG AGAT CGT GCT GCA-3' Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3' e também na presença do DNA de plasmídio pUC19 digerido com as enzimas de restrição BamHI e Hindlll.

Dois microlitros da mistura de ligação foram usados para transformar E. coli DH10B tal como descrito acima na seção 5. Depois da análise do teor de DNA de plasmídio de clones diferentes de acordo com o procedimento descrito acima na seção 5, um dos clones possuindo um elemento de cerca de 1,3 kpb foi retido para análises subsequentes. A seqüência da extremidade terminal 5' do clone selecionado revela que a seqüência de DNA nessa região é a seguinte: seqüência do polylinker pUC19 do sítio EcoRI ao sítio BamHI, seguida pela seqüência dos oligonucleotídios usados na clonagem, seguida pelo restante da seqüência presente no pRPA-ML-712. Esse clone foi indicado como pRPA-ML-713. Esse clone possui um códon ATG de metionina incluso em um sítio Ncol a montante do códon de alanina N-terminal da EPSP madura sintase. Além disso, os códons de alanina e glicina da extremidade N-terminal foram preservados, porém modificados na terceira base variável: GCGGGT inicial resulta em GCÇGGÇ modificado. O clone pRPA-ML-713 foi cortado com a enzima de restrição Hindlll, e as extremidades dessa divagem foram aparadas através de tratamento com o fragmento de Klenow da DNA polimerase I. Uma divagem com a enzima de restrição Saci foi então realizada. O DNA resultante dessas manipulações foi separado através de eletroforese em gel de agarose LGTA/TBE a 0,8% (ref. CPMB). O fragmento de gel contendo o elemento "Hindlll-extremidades planas/SacI" com 1,3 kpb foi retirado do gel e purificado de acordo com o protocolo descrito na seção 5 acima. Esse elemento foi ligado na presença do DNA de plasmídio pUC19 digerido com a enzima de restrição Xbal, e as extremidades dessa divagem foram aplainadas através de tratamento com o fragmento de Klenow de DNA polimerase I. Uma divagem com a enzima de restrição Saci foi então realizada. Dois microlitros da mistura de ligação foram usados para transformar E. coli DH10B tal como descrito acima na seção 5. Depois da análise do teor de DNA de plasmídio de clones diferentes de acordo com o procedimento descrito acima na seção 5, um dos clones contendo um elemento de cerca de 1,3 kpb foi retido para análises subseqüentes. A seqüência das extremidades terminais do clone selecionado revela que a seqüência de DNA é a seguinte: seqüência do polylinker pUC19 do sítio EcoRI ao sítio Saci, seguida pela seqüência dos oligonucleotídios usados na clonagem da qual foram eliminados os GATCC de 4 pb do oligonucleotídio 1 descrito acima, seguida pelo restante da seqüência presente no pRPA-ML-712 até o sítio Hindlll e da seqüência do polylinker pUC19 de Xbal para Hindlll. Esse clone foi indicado como pRPA-ML-715. 7. Obtenção de um cDNAque Codifica uma EPSPS de Milho Mutada Todas as etapas de mutagênese foram realizadas com o kit de mutagênese U.S.E. da Pharmacia de acordo com as instruções do fornecedor. O princípio desse sistema de mutagênese é tal como segue: o DNA de plasmídio é desnaturado por meio de calor e reassociado na presença de um excesso molar, por um lado do oligonucleotídio de mutagênese, e por outro lado de um oligonucleotídio que permite que um sítio de uma enzima de restrição singular presente no polylinker seja eliminado. Depois da etapa de reassociação, a síntese da fita complementar é realizada através da ação da DNA polimerase de célula T4 na presença de DNA ligase de célula T4 e de proteína de gene 32 em um tampão adequado que é fornecido. O produto da síntese é incubado na presença da enzima de restrição em que se supõe que o sítio desapareceu através da mutagênese. A linhagem de E. coli que apresenta, em particular, a mutação mutS é usada como hospedeira para a transformação desse DNA. Depois de crescer em um meio líquido, o total de DNA de plasmídio é preparado e incubado na presença da enzima de restrição usada anteriormente. Depois desses tratamentos, a linhagem de E. coli DH10B é usada como hospedeira para a transformação. O DNA de plasmídio dos clones isolados é preparado, e a presença da mutação introduzida é verificada através do seqüenciamento. A) - modificação dos sítios ou seqüências sem afetar em princípio o caráter de resistência de EPSPS do milho a produtos que são inibidores competitivos da atividade da EPSP sintase: eliminação de um sítio Ncol interno do pRPA-ML-715. A seqüência do pRPA-ML-715 é numerada arbitrariamente ao se colocar a primeira base do códon de alanina GCC N-terminal na posição 1. Essa seqüência possui um sítio Ncol na posição 1217. O oligonucleotídio de modificação de sítio apresenta a seqüência: 5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3\ Depois do seqüenciamento de acordo com as referências fornecidas acima, a seqüência lida depois da mutagênese corresponde àquela do oligonucleotídio usado. O sítio Ncol foi de fato eliminado, e a tradução para aminoácidos nessa região preserva a seqüência inicial presente no pRPA-ML-715.

Este clone foi indicado como pRPA-ML-716. A seqüência de 1340 pb desse clone está apresentada na SEQ ID No. 2 e na SEQ ID No. 3. B) - modificações de seqüência que permitem que seja aumentado o caráter de resistência de EPSPS do milho a produtos que são inibidores competitivos da atividade da EPSP sintase.

Foram usados os oligonucleotídios a seguir: a) mutação Thr 102 -> lie. 5'-GAATGCTGGAAT CGCAATGCGGCCATT GACAGC-3' b) mutação Pro 106 -> Ser. 5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' c) mutações Gly 101 -> Ala e Thr 102 -> lie. õ^CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-S’ d) mutações Thr 102 -> lie e Pro 106 -> Ser. 5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' Depois do seqüenciamento, a seqüência lida depois da mutagênese nos três fragmentos mutados é idêntica à seqüência de DNA de pRPA-ML-716 original, com a exceção da região mutagenizada que corresponde à dos oligonucleotídios de mutagênese usados. Esses clones foram indicados como: pRPA-ML-717 para a mutação Thr 102 -> lie, pRPA-ML-718 para a mutação Pro 106 -> Ser, pRPA-ML-719 para as mutações Gly 101 -> Ala eThr 102-> lie, e pRPA-ML-720 para as mutações Thr 102 -> lie e Pro 106 -> Ser. A seqüência de 1340 pb do pRPA-ML-720 é apresentada na SEQ ID No. 4 e na SEQ ID No. 5. O elemento NCol-Hindlll de 1395 pb é a base de todas as construções usadas para a transformação de plantas para a introdução de resistência a herbicidas que são inibidores competitivos da EPSPS, e em especial a resistência ao glifosato. Esse elemento será indicado no restante da descrição como "mutante duplo da EPSPS de milho".

Exemplo 2: Tolerância ao Glifosato de Mutantes Diferentes in vitro 2.a: Extração da EPSP sintase Os diferentes genes de EPSP sintase são introduzidos na forma de um cassete de Ncol-Hindill no vetor de plasmídio pTrc99a (Pharmacia, ref: 27-5007-01) cortado com Ncol e Hindlll. Bactérias E. coli DH10B recombinantes superexpressando as EPSP sintases diferentes são submetidas à sonicação em 40 ml de tampão por 10 g de células em pelotas, e lavadas com esse mesmo tampão (200 mM de Tris-HCI, pH = 7,8, 50 mM de mercaptoetanol, 5 mM de EDTA e 1 mM de PMSF), aos quais é adicionado 1 g de polivinilpirrolidona. A suspensão é agitada por quinze minutos a 4°C e a seguir centrifugada por vinte minutos a 27.000 g e 4°C.

Sulfato de amônio é adicionado ao sobrenadante, para levar a solução a uma saturação de 40% em relação ao sulfato de amônio. A mistura é centrifugada por vinte minutos a 27.000 e 4°C. Sulfato de amônio é adicionado ao novo sobrenadante, para levar a solução a uma saturação de 70% em relação ao sulfato de amônio. A mistura é centrifugada por trinta minutos a 27.000 g e 4°C. A EPSP sintase presente nessa pelota de proteína é extraída em 1 ml de tampão (20 mM de Tris-HCI, pH = 7,8 e 50 mM de mercapto etanol). Essa solução é submetida à diálise por uma noite em dois litros desse mesmo tampão a 4°C. 2.b: Atividade enzimática A atividade de cada enzima, bem como a sua resistência ao glifosato, é medida in vitro por dez minutos a 37°C na mistura de reação a seguir: 100 mM de ácido maléico a um pH = 5,6, 1 mM de piruvato de fosfoenol, 3 mM de shikimato-3-fosfato (preparado de acordo com Knowles P.F. and Sprinson D.B. 1970. Methods in Enzymol 17A, 351-352, de linhagem de Aerobacter aerogenes ATCC 25597) e 10 mM de fluoreto de potássio. O extrato da enzima é adicionado no último momento depois da adição do glifosato, cuja concentração final varia de 0 a 20 mM. A atividade é medida testando-se o fosfato liberado de acordo com a técnica de Tausky H.A. and Shorr E. 1953. J. Biol. Chem. 202, 675-685.

Sob essas condições, a enzima do tipo selvagem (WT) já é inibida em 85% em uma concentração de glifosato de 0,12 mM. A essa concentração, a enzima mutante conhecida como Ser106 é apenas 50% inibida, e os três outros mutantes, Ile102, Ile102/Ser106 e Ala101/lle102, apresentam pouca ou nenhuma inibição. A concentração de glifosato precisa ser multiplicada por dez, o que equivale a 1,2 mM, a fim de se obter uma inibição de 50% da enzima mutante Ile102, sendo que os mutantes Ile102/Ser106, Ala/lle e Ala ainda não são inibidos.

Deve-se observar que a atividade dos mutantes Ala/lle e Ala não é inibida antes de concentrações de glifosato de 10 mM, e que a atividade do mutante Ile102/Ser106 não é reduzida nem mesmo se a concentração de glifosato for multiplicada por 2, o que equivale a 20 mM.

Exemplo 3: Resistência de Pés de Fumo Transformados 1-1- Transformação 0 vetor pRPA-RD-173 é introduzido em linhagem de Agrobacterium tumefaciens EHA101 (Hood et al., 1987) que contém o cosmídio pTVK291 (Komari et al., 1986). A técnica de transformação é baseada no procedimento de Horsh et al., (1985). 1-2- Regeneração A regeneração do fumo PBD6 (fonte: SEITA France) a partir de explante foliar é realizada em um meio basal de Murashige e Skoog (MS) que contém 30 g/l de sacarose e também 200 pg/ml de canamicina. Os explantes foliares são removidos das plantas cultivadas em estufa ou in vitro, e são transformados de acordo com a técnica de disco foliar (Science, 1985, volume 227, páginas 1229-1231) em três etapas sucessivas: a primeira compreende a indução de brotos em um meio suplementado com 30 g/l de sacarose contendo 0,05 mg/l de ácido naftilacético (NAA) e 2 mg/l de benzilaminopurina (BAP), por quinze dias. Os brotos formados durante essa etapa são então cultivados por dez dias através de cultivo em um meio de MS suplementado com 30 g/l de sacarose porém sem conter qualquer hormônio. Os brotos que se desenvolveram são então removidos e cultivados em um meio de formação de raiz de MS que tem a metade do teor de sais, vitaminas e açúcar e não contém hormônio algum. Depois de cerca de quinze dias, os brotos com raiz são transferidos para a terra. 1-3- Resistência ao glifosato Vinte plantas transformadas foram regeneradas e transferidas para a estufa para a construção do pRPA-RD-173. Essas plantas foram tratadas na estufa a um estágio de cinco folhas com uma suspensão aquosa de RoundUp, que corresponde a 0,8 kg de substância ativa de glifosato por hectare.

Os resultados correspondem à observação de índices de fitotoxicidade registrados três semanas depois do tratamento. Sob essas condições, é verificado que as plantas transformadas com a construção pRPA-RD-173 apresentam uma tolerância muito boa, enquanto que as plantas de controle não transformadas encontram-se completamente destruídas.

Esses resultados mostram claramente a melhora acarretada pelo uso de um gene quimérico de acordo com a invenção para o mesmo gene que codifica a tolerância ao glifosato.

Exemplo 4: Transformação e Seleção de Células de Milho Células de milho BMS (Black Mexican Sweet) em uma fase de crescimento exponencial são bombardeadas com a construção pRPA-RD-130 de acordo com o princípio e o protocolo descritos por Klein et al., 1987 (Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. and Stanford J.C. (1987): High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells, NATURE Vol. 327, páginas 70-73).

Dois dias depois do bombardeamento, as células são transferidas para o mesmo meio contendo 2 mM de N-(fosfonometil)-glicina.

Depois de oito semanas da seleção nesse meio, as calosidades (calluses) que se desenvolveram são selecionadas, a seguir amplificadas e analisadas através de PCR, e revelam claramente a presença do gene OTP-EPSPS quimérico.

As células não bombardeadas e cultivadas no mesmo meio contendo 2 mM de N-(fosfonometil)-glicina são bloqueadas pelo herbicida e não se desenvolvem.

As plantas transformadas de acordo com a invenção podem ser usadas como genitoras para a obtenção de linhagens e híbridos que apresentam o caráter fenotípico que corresponde à expressão do gene quimérico introduzido.

Descrição das Construções dos Plasmídios pRPA-RD-124: Adição de um sinal de poliadenilação "nos" ao pRPA-ML-720 com a criação de um cassete de clonagem que contém o gene de EPSPS mutante duplo de milho (Thr 102 -> lie e Pro 106 -> Ser). O pRPA-ML-720 é digerido com Hindlll e tratado com o fragmento de Klenow de DNA polimerase I de E. coli para produzir uma extremidade aplainada. Uma segunda digestão é realizada com Ncol, e o fragmento de EPSPS é purificado. O gene de EPSPS é então ligado com pRPA-RD-12 purificado (um cassete de clonagem que contém o sinal de poliadenilação da nopalina sintase), para resultar no pRPA-RD-124. Para se obter o vetor pRPA-RD-12 purificado útil, foi necessário que este último fosse digerido antecipadamente com Sall, tratado com DNA polimerase de Klenow, e a seguir digerido uma segunda vez com Ncol. pRPA-RD-125: Adição de um peptídio de trânsito otimizado (OTP) ao pRPA-RD-124 com a criação de um cassete de clonagem que contém o gene de EPSPS visado nos plasmídios. O pRPA-RD-7 (Depósito de Patente Europeu EP 652.286) é digerido com Sphl, tratado com DNA polimerase de célula T4 e a seguir digerido com Spel, e o fragmento de OTP é purificado. Esse fragmento de OTP é clonado em pRPA-RD-124 que foi digerido anteriormente com Ncol, tratado com DNA polimerase de Klenow para remover a parte 3' protuberante, e a seguir digerido com Spel. Esse clone é então seqüenciado a fim de assegurar a fusão translacional correta entre o OTP e o gene de EPSPS. É então obtido o pRPA-RD-125. pRPA-RD-130: Adição do promotor de histona de milho H3C4 e de seqüências do íntron 1 de adhl de pRPA-RD-123 (Depósito de Patente EP 507.698) ao pRPA-RD-125 com a criação de um cassete para expressão em plantas para a expressão do gene de EPSPS mutante duplo nos tecidos de monocotiledôneas. O pRPA-RD-123 (um cassete contendo o promotor de histona de milho H3C4 fundido com o íntron 1 de adhl) é digerido com Ncol e Saci. O fragmento de DNA contendo o promotor derivado de pRPA-RD-123 é então purificado e ligado com o pRPA-RD-125 que foi digerido anteriormente com Ncol e Saci. pRPA-RD-159: Adição do promotor duplo de histona de Arabidopsis H4A748 (Depósito de Patente EP 507.698) ao pRPA-RD-125 com a criação de um cassete para a expressão, em plantas, para a expressão do gene "gene de EPSPS mutante duplo de OTP" nos tecidos de dicotiledôneas. O pRPA-RD-132 (um cassete contendo o promotor duplo H4A748 (Depósito de Patente EP 507.698)) é digerido com Ncol e Saci. O fragmento de promotor purificado é então clonado em pRPA-RD-125 que tinha sido digerido com Ecol e Saci. pRPA-RD-173: Adição do gene "gene de EPSPS mutante duplo de OTP-promotor H4A748" de pRPA-RD-159 ao plasmídio pRPA-BL-150A (Depósito de Patente EP 508.909) com a criação de um vetor de transformação de Agrobacterium tumefaciens. O pRPA-RD-159 é digerido com Notl e tratado com polimerase de Klenow. Esse fragmento é então clonado em pRPA-BL-150A com Smal.

Reivindicações

Claims (13)

1. PROTEÍNA EPS PS MUTADA DE PLANTA, caracterizada pelo fato de compreender a sequência de peptídeo representada peia SEQ iD NO:5.

2. SEQUÊNCIA DE DNA, caracterizada pelo fato de compreender a porção codificadora da sequência SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de DNA degenerada da mesma que codifica a sequência de polipeptídeo definida na SEQ ID NO: 5,

3. GENE QUIMÉRICO, compreendendo uma sequência codificadora bem como elementos reguladores heterólogos nas posições 5' e 3', que são funcionais em plantas, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma sequência de DNA como definida na reivindicação 2.

4. GENE QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o elemento regulador na posição 5' é uma região promotora composta de pelo menos um promotor ou fragmento de promotor de um gene que é expresso naturalmente em plantas,

5. GENE QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreender um promotor de vírus de planta.

6. GENE QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de compreender um promotor de pianta.

7. GENE QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato da região promotora compreender um fragmento de um promotor de um gene que é natural mente expresso em plantas.

8. GENE QUIMÉRICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região codificadora de um peptídeo de trânsito.

9. GENE QUIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato do peptídeo de trânsito compreender uma ou mais unidades de peptídeo de trânsito.

10. VETOR PARA A TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um gene quimérico conforme definindo em qualquer uma das reivindicações 3 a 9.

11. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PLANTAS NÃO ALIMENTÍCIAS, com tolerância aperfeiçoada a um herbicida que tem EPSPS sintase como seu alvo, caracterizado pelo fato de que células de plantas ou protoplastos são transformados com um gene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 9.

12. MÉTODO DE TRATAMENTO DE PLANTAS, com um herbicida que tem EPSPS como seu alvo, caracterizado pelo fato de que o herbicida é aplicado a plantas compreendendo a sequência de DNA como definida na reivindicação 2 ou um gene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicação 3 a 9.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o herbicida é glifosato ou um precursor de glifosato.