KR100388121B1 - 식물의형질전환에사용될수있는키메라유전자내의터미네이터부위로서작용할수있는분리된dna서열 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물체의 형질전환에 사용될 수 있는 키메라 유전자의 터미네이티 부위로서 작용할 수 있는 분리된 DNA 서열, 터미네이터 부위가 급속한 생장을 하는 부위에서 단백질의 형질 발현을 허용하는 식물 히스톤 유전자로 부터 수득한 하나 이상의 터미네이터 부위를 함유함을 특징으로 하는, 전사 방향으로 프로모터 부위, 트랜스 유전자 및 터미네이터 부위를 함유하는, 식물체의 형질 전환을 위한 키메라 유전자 및 외래 유전자가 도입된 식물체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

식물의 형질 전환에 사용될 수 있는 키메라 유전자내의 터미네이터 부위로서 작용할 수 있는 분리된 DNA 서열{ISOLATED DNA SEQUENCE WHICH CAN SERVE AS TERMINATOR REGION IN A CHIMERIC GENE CAPABLE OF BEING USED FOR THE TRANSFORMATION OF PLANTS}
본 발명은 전사되는 식물체 유전자로 부터 분리된 터미네이터 부위, 상기 터미네이터 부위를 포함하는 신규의 키메라 유전자 및 식물체를 형질전환하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
하나 또는 수개의 유전자 요소들의 형질 발현과 관련된 수많은 표현형 특징은 식물체의 게놈내로 통합되어 이들 외부 유전자가 도입된(Trasgenic) 식물에 대해 유리한 농업적 특성을 부여할 수 있다. 상기 유리한 농업적 특성의 비광범위한 예로서, 작물의 병원성 제제에 대한 내성, 식물 독성적 식물 보호 생성물에 대한 내성, 음식물 또는 약학적 용도용 물질의 생성 등을 들 수 있다. 이들 다양한 특성을 코오딩하는 유전자 요소들의 분리 및 특성화 이외에도, 적절한 형질 발현이 제공되어야 한다. 이 적절한 형질 발현은 양적인 수준 및 질적인 수준에 둘다 관련될 수 있다. 질적인 수준은 예를 들어 공간적 수준 즉, 특정 조직내의 선택적인 형질발현; 또는 일시적 수준 즉, 유도성 형질 발현에 관한 것이다. 양적인 수준은 도입된 유전자의 형질 발현 생성물의 축적된 양에 의해 결정된다. 이 적절한 형질 발현은 다양한 분야에 대해, 트랜스 유전자 (Transgene) 와 관련된 조절성 유전자 요소의 존재, 특히 양적 및 질적 요소에 관련된 상기 유전자의 존재에 의존한다. 이 적절한 조절을 제공하는 근원적 요소 중에서, 균질적 또는 이질적 단일 또는 결합 프로모터 부위의 사용이 과학 문헌에 널리 기재되어 있다. 트랜스 유전자의 하류의 터미네이터 부위의 사용은 트랜스 유전자의 양적 또는 질적인 형질 발현에 대한 그의 역할에 대한 전제없이, 트랜스 유전자의 전사 과정을 종결시킬 수 있는 경계를 부여하는 유일한 목적을 위해 사용된다.
본 발명은 식물체가 전사한 유전자로 부터 분리된 터미네이터 부위, 터미네이터 부위를 포함하는 신규의 키메라 유전자 및 식물체를 형질 발현하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 동일한 식물체가 전사한 유전자로부터 분리된 터미네이터 부위 및 프로모터의 동시적인 사용에 관한 것이다.
본원 발명은 이들 유전자 조절성 요소의 조절하에, 트랜스 유전자의 질적 및 양적인 적절한 형질 발현을 가능하게 해준다. 본원 발명을 사용하여 수득된 적절한 형질 발현은 작물에 대한 병리학 제제에 대한 내성, 식물독성적 식물 - 보호 생성물에 대한 내성 및 음식물 또는 약학적 목적을 위한 물질의 생산과 같은 특성과 관련될 수 있다. 특히, 본 발명은 급속한 생장을 하는 식물체 부위의 키메라 유전자의 형질 발현 생성물의 선택적인 질적 및 양적 형질 발현에 의해 외부 유전자가 도입된 식물체에 대한 증가된 제초제 내성을 부여할 수 있다. 이러한 제초 내성에 대한 유전자의 적절한 특정 형질 발현은 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 로부터 수득한 H4A748 히스톤 유전자의 프로모터 및 터미네이터 부위 조절 요소의 동시적 사용에 의해 수득된다. 이러한 형질 발현 양상은 전술한 바와 같이, 증가된 제초 내성을 부여하는데 사용되는 조절 요소를 사용하여, 목적하는 모든 특성에 대해 수득될 수 있다. 또한, 본 발명은 이들 유전자에 의해 형질 전환된 식물 세포 및 이들 세포로부터 재생된 형질 전환된 식물체 뿐만 아니라, 이들 형질 전환된 식물체를 사용한 교배로 부터 유래한 식물체에 관한 것이다.
작물의 보호를 위해 사용되는 식물 - 보호 생성물중에서, 시스템성 생성물은 적용 후, 식물체로 수송됨을 특징으로 하고, 이들중 일부는 급속한 생장을 하는 부위 특히, 줄기 및 뿌리 정점에 축적되어, 제초제의 경우 민감성 식물제가 파괴될 때까지 열화시킨다. 이러한 행동 양상을 보이는 제초제 중 일부에 대해, 기본적인 행동 양상이 알려져 있고, 이는 타게트 식물체의 정확한 발육에 필요한 화합물의 생합성 경로에 관련된 특징적인 효소의 불활성화에 기인한다. 이들 생성물에 대한 타게트 효소는 다양한 하부세포적 구획내에 위치할 수 있고, 공지된 생성물의 행동 양상에 대한 관찰 결과, 종종 색소체 구획내에 위치함이 알려졌다.
이들 군의 제초제에 속하는 생성물에 대해 민감하고, 그의 주요 타게트가 알려진 식물체의 내성은 임의의 계통발생학적 기원의, 타게트 효소를 코오딩하고, 이 유전자의 형질 발현 생성물의 제초제에 의한 억제 특성에 대해 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 유전자의 게놈내로의 안정한 도입에 의해 수득될 수 있다. 다른 시도 방법은 민감성 식물체의 게놈내로 제초제를 식물체의 발육에 대해 불활성 및비독성인 화합물로 대사할 수 있는 효소를 코오딩하는 임의의 계통발색학적 유래의 유전자를 안정하게 도입하는 것으로 구성된다. 후자의 경우에, 제초제의 타게트를 특정지울 필요는없다.
처리된 식물체내의 이러한 유형의 생성물의 분배 및 축적의 양상에 있어서, 이들 생성물이 축적되는 급속한 생장을 하는 식물체의 부위내에서 그의 선택적인 형질 발현 및 축적을 허용하기 위해 이들 유전자의 번역 생성물을 형질 발현할 수 있는 것이 유리하다. 또한, 이들 생성물의 타게트가 세포질 이외의 세포 구획내에 위치하는 경우, 내성 부여 단백질을 적절한 구획, 특히 색소체 구획내에 위치하도록 허용하는 폴리펩티드 서열을 함유하는 전구체 형태의 이들 유전자의 번역 생성물을 형질 발현할 수 있는 것이 유리하다.
이러한 시도의 예로서, 포스포노메틸글리신 군의 광역 시스템성 제초제인 글리포세이트, 술포세이트 또는 포사메틴을 들 수 있다. 이들은 본질적으로 PEP (포스포에놀피루베이트) 에 대해 5 - 에놀피루빌시키메이트 - 3 - 포스페이트 합성 효소 (EFSPS, EC 2.5.1.19) 의 경쟁적인 억제제로 작용한다.
식물체에 이들을 사용한 후, 이들은 급속한 생장을 하는 부위 특히, 줄기 및 뿌리 정점에서 축적되는 식물체내로 이동되어, 민감성 식물체가 파괴될 때까지 열화시킨다.
이들 생성물의 주요 타게트인 EPSPS 는 색소체 구획내에 위치하는 방향족 아미노산 생합성 경로의 효소이다. 이 효소는 하나 이상의 핵 유전자에 의해 코오딩되고, 세포질 전구체의 형태로 합성된 후, 성숙 형태로 축적되는 색소체 내로 이동된다.
글리포세이트 및 이 군의 생성물에 대한 식물체 내성은 이 유전자의 생성물의 글리포세이트 억제 특성에 관해 돌연변이되거나 또는 돌연변이되지 않은, 식물체 또는 박테리아 유래의 EPSPS 유전자의 게놈내로의 안전한 도입에 의해 수득된다. 글리포세이트의 활동 양상에 있어서, 색소체내의 높은 축적, 및 이들 생성물이 축적되는 급속한 생장을 하는 식물체의 부위내의 축적을 허용하기 위해 이들 유전자의 번역 생성물을 형질 발현할 수 있는 것이 바람직하다.
예를 들어, 미합중국 특허 제 4,535,060 호에 따르면, 그의 경쟁직인 억제제 (글리포세이트) 에 대해 보다 내성인 이 유전자에 대한 하나 이상의 돌연변이를 갖는 EPSPS 를 코오딩하는 유전자의 식물체 게놈내로의 도입에 의해, 이 효소가 색소체 구획내로 이동한 후, 상기 유형의 제초제 특히, N- 포스포노메틸글리신 또는 글리포세이트에 대한 내성을 식물체에 부여하는 방법이 공지되어 있다. 그러나, 이 기술은 농업적 조건하에서 이들생성물에 의한 처리 동안, 이들 식물체에 대한 사용의 보다 높은 확실성을 개선시킬 필요가 있다.
본 명세서에서, "식물체" 라는 용어는 광합성을 할수 있는 분화된 다세포 유기체를 의미하고, "식물 세포" 라는 용어는 식물체에서 유래하고, 유합 조직과 같은 미분화된 조직, 또는 배아 또는 식물체 부분 또는 식물체 또는 종자와 같은 분화된 조직을 구성할 수 있는 임의의 세포를 의미하는 것으로 이해된다.
"터미네이터 부위" 는 전사되는 유전자의 구조적 부분에 해당하고, 코오딩 부분의 하류에 위치하는 다양한 길이의 분리된 DNA 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 제초제 내성 유전자는 제초제에 의한 억제 특성에 대한 하나 이상의 돌연 변이를 갖거나 갖지 않는 제초제의 타게트 효소, 또는 제초제를 식물체에 대해 불활성 또는 비독성 화합물로 대사할 수 있는 효소를 코오딩하는 임의의 계통 발생학적 유래의 유전자를 의미하는 것으로 이해된다. 급속한 생장을 하는 식물체의 부위는 실질적인 세포 증식 부위 특히, 정점 부위의 위치를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명은 이들 생성물에 대한 내성 유전자를 함유하는 신규의 키메라 유전자에 의해 형질전환된 세포의 재생에 의해, 처리된 식물체내의 급속한 생장을 하는 부위에 축적된 제초제에 대해 특히 증가된 내성을 갖는 형질 전환된 식물체의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 제초제에 대한 내성 유전자를 함유하는 신규의 키메라 유전자에 의해 형질 전환된 세포의 재생에 의한, 포스포노메틸글리신 군의 제초제에 대해 증가된 내성을 갖는 형질전환된 식물체의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규의 키메라 유전자 뿐만 아니라, 식물체내에서 급속한 생장을 하는 부위내의 보다 양호한 내성에 기인한 보다 내성인 형질 전환된 식물체, 이들 형질 전환된 식물체의 교배로 부터 유래한 식물체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 키메라 유전자의 구축을 위한 신규의 터미네이터 부위에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 터미네이터 부위가 유래된 유전자내의 초기방향과 관련하여 임의의 방향의, 식물 히스톤 유전자의 터미네이터 부위의 단편으로 구성되고, 터미네이터 부위가 하기 제초제의 축적 부위에서의 제초제 내성을 위한 단백질의 선택적인 형질 발현 및 축적을 가능하게 함을 특징으로 하는, 전사 방향으로 프로모터 부위, 운송 펩티드 부위, 포스포노메틸글리신군의 생성물에 대해 내성인 효소를 코오딩하는 서열 및 터미네이터 부위를 포함하는, 타게트로서 EPSPS 를 갖는 제초제에 대해 특히 증가된 내성을 식물체에 부여하는 키메라 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 터미네이터 부위가 유래된 히스톤 유전자는 예를 들어 밀, 옥수수 또는 벼와 같은 단자엽 식물 또는 알파파, 해바라기, 콩, 평지 또는 바람직하기로는 아라비돕시스 탈리아나와 같은 쌍자엽 식물에서 유래된다. H3 형, 또는 바람직하기로는 H4 히스톤 유전자가 바람직하게 사용된다.
운송 펩티드 부위는 전사 방향으로, 색소체에 위치한 효소를 코오딩하는 식물 유전자로 부터 유래한 하나 이상의 운송 펩티드, 색소체에 위치한 효소를 코오딩하는 식물 유전자의 N - 말단 성숙 부분의.일부 서열, 색소체에 위치한 효소를 코오딩하는 식물 유전자, 바람직하기로는 유럽 특허 출원 PCT 508,909 호에 따른 리불로오스 - 1,5 - 비스포스페이트 카르복실라제 / 옥시게나제(RuBisCO) 소 서브유니트 유전자로 부터 유래한 제 2 운송 펩티드를 포함한다.
이들 특징적 부위의 역할은 성숙 폴리펩티드를 최대의 효율, 바람직하기로는 천연 형태로 색소체 구획내로 운송하도록 해주는 것이다.
본 발명에 따른 키메라 유전자내에 사용될 수 있는 코오딩 서열은 임의의 계통 발생적 유래의 제초제 내성 유전자로 부터 유래한다. 이 서열은 특히 글라이포세이트에 대한 내성도를 갖는 돌연변이된 EPSPS 의 서열일 수 있다.
유럽 특허 출원 PCT 507,698 에 따른 프로모터 부위는 단일 또는 중복 형태또는 천연적으로 식물체내에서 형질발현하는 유전자와 결합된 형태로, 임의의 유래 즉, 예를 들어 노팔린 합성 효소 유전자와 같은 박테리아 유래, 또는 꽃양배추 모자이크 비루스의 35 S 전사체와 같은 비루스 유래, 또는 바람직하기로는 리불로오스 - 1,5 - 비스포스페이트 카르복실라제 / 옥시게나제 소서브유니트 또는 바람직하기로는 식물 히스톤 유전자와 같은 식물체 및 바람직하기로는 아라비돕시스 탈리아나 유래일 수 있다. H3 형 또는 바람직하기로는 H4 형 히스톤 유전자가 바람직하게 사용된다.
본 발명에 따른 키메라 유전자는 상기의 필수 부분이외에도, 임의의 계통 발생학적 유래의 프로모터 부위 및 코오딩 부위사이, 및 코오딩 부위 및 터미네이터 부위 사이의 비번역 중간 부위 (링크) 를 함유할 수도 있다.
실시예 1 : 키메라 유전자의 구축
본 발명에 따른 키메라 유전자의 구축은 하기 요소로 출발하여 수행된다 ;
1) 히스톤 유전자 프로모터 :
이 프로모터는 스트라스부르그 육종 (M.E.Chaboute, University of Strasbourg, thesis, 1987 & M.E.Chaboute et al, (1987) Plant Mol. Biol. 8,179-191) 에 의해 아라비돕시스 탈리아나의 H4A748 히스톤 클론으로 부터 분리한다. 이를 분리하기 위해 사용된 AVaI부위사이의 약 900 bp 를 포함하는 이 프로모터는 클레나우 폴리머라제를 사용하여 salI 및 AvaI 돌기형 말단을 채운 다음, 카탈로그 (Pharmacia #27-4949-01) 에 나타난 시판되는 pUC18 의 SalI 부위내로 서브클론된다. pUC18 폴리링커의 HindIII 부위와 가까운 프로모터의 5' 말단 및 pUC18 폴리링커의 XbaI 부위와 가까운 프로모터의 3' 말단을 갖는 수득된 서브클론중 하나를 다음 반응에 사용하고, 이를 prom, H4A748/AvaI/SalI-pUC18 이라 칭한다.
2) 운송 펩티드 부위 :
사용된 두개의 운송 펩티드 뿐만 아니라, 성숙 단백질 요소 및 그의 결합에 대해서는 문헌 (M.Lebrun et al., 유럽 특허 출원 PCT 508 909 호) 에 기재되어 있다. 이 부위는 약 350 bp 를 포함하고, 적정화된 운송 펩티드(0ptimzed Transit Peptide, OTP) 라 불린다.
3) 제초제 내성에 대한 CT7 유전자 :
이 유전자는 스탈커 등 (Stalker et al, (1985) J. Biol. Chem., 260, 4724-4728) 에 의해 분리된, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella thyphymurium) 에서 유래한 EPSPS 에 대한 돌연변이된 CT7 (Pro 101 내지 Ser) 유전자로 부터 유래한다. 칼젠등에 의해 제공된 pGM34-2 클론은 XbaI 으로 선형화된 다음, Vigna radiata 뉴클레아제로 처리한다. SmaI 으로 다시 절단한 후, 두개의 블런트 말단을 연결시켰다. 수득된 클론은 번역을 위한 개시 부위 ATG 상의 NcoI 부위 및, 종결 코돈의 17 bp 하류의 SalI 부위를 갖는다. 이 클론은 pRPA-BL-104 로 불린다.
4) OTP/CT7 접합 :
리딩 프레임 (reading frame) 내에서 CT7 유전자와 접합된 적정화된 운송 펩티드 (OTP) 를 함유하는 형질 발현 카세트 (B.Leroux et al., 유럽 특허 출원 PCT 507 698 호) 를 벡타 pBSII SK(-) (Stratagene catalogue #212206) 내로 클로닝한다. 이 5'-OTP/CT7-3'카세트는 그의 5'말단에 XbaI 부위 및 3' 말단에 SstI 부위를포함한다.
5) GUS 리포터 유전자:
이것은 카탈로그 (Clontech #6017-1) 에 나타난 시판되는 플라스미드 pBI 101-1 내에 존재하는 β - 글루쿠로니다제 (GUS) 를 코오딩하는 유전자이다.
6) 히스톤 터미네이터 부위 :
이것은 아라비돕시스 탈리아나로 부터 유래한 H4A748 히스톤 유전자로 부터 분리한다 (M.E.Chaboute, University of Strasbourg, thesis, 1987 & M.E.Chaboute et al. (1987) Plant Mol. Biol., 8, 179-191), 661 bp Sau3AI 단편을 분리하고, 클레나우 폴리머라제를 사용하여 처리하여 블런트 말단으로 만들고, 카탈로그 (Stratagene #212207) 로 부터 시판되는 플라스미드 pBluescriptⓡII KS (+) 의 SmaI 부위내로 서브클로닝한다. 이 단편의 서열은 하기 섹션 "서열 리스팅" 에 나타낸다. S1 지도에 의해, 이 분리된 단편은 원래의 전사 방향에서, 그의 5' 말단의 200 bp 부위내에 이 유전자의 전사로 부터 유래한 mRNA 의 폴리아데닐레이션 부위앞에 존재하는 것과 상응하는 서열을 포함함이 나타났다. 661 bp 서열중의 165 위치내의 뉴클레오티드 A 는 전사체내에 존재하는 폴리아데닐화 말단의 부가 위치에 상응한다 (Chaboute M.E.et al, (1988) Gene, 71,217-223). 두개의 서브 클론이 보존되고, 이들중 하나는 t-direct H4A748/Sau3AI/SmaI-pKS 라 불리고, SstI-EcoRI 단편 형태의, H4A748 유전자의 원래의 전사 방향으로 위치한 삽입물이고, 다른 하나는 t-inverse H4A748/Sau3AI/SmaI-pKS 라 불리고, SstI-EcoRI 단편 형태의, 역방향의 삽입물이다.
유전자의 원래의 전사 방향의 아라비돕시스 탈리아나 H4A748 히스톤의 터미네이터 부위의 661 hp 서열은 하기와 같다:
7) 터미네이터 부위 "nos" :
이 단편은 카탈로그 (Clontech #60170-I) 에서 시판되는 플라스미드 pBI 101-1 내에 존재하는 pTi37 (Bevan M.et al, (1983) Nucl. Acids. Res., 11, 369-385) 의 노팔린 합성 효소 (nos) 유전자의 터미네이터 부위에 대한 시그날을 함유하는 단편이다.
이들 요소의 결합은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 를 통해 식물체를 형질 전환시키기 위한 이중 벡타 (binary vector) , 즉 시판되는 pBI 101-1 (카탈로그 Clontech #6017-1) 의 골격에 기초한 하기 방법으로 수행된다 :
pRA-1 의 구축:
아라비돕시스 탈리아나로 부터 수득한 H4A748 히스톤 프로모터를 약 900 bp 의 HindIII/XbaI단편 형태로 플라스미드 prom. H4A748/AvaI/SalI-pUC18 로부터 절단하였다. 이 단편을 HindIII/XbaI 으로 소화시킨 플라스미드 pBI 101-1 내로 라이게이션시켜 삽입시킨다. 수득된 재조합 플라스미드는 키메라 유전자의 전사 방향으로 H4A748 프로모터 / GUS / nos 터미네이터 부위를 함유하고, pRA-1 이라 칭한다.
pRA-2 의 구축 :
아라비돕시스 탈리아나로 부터 수득한 H4A748 터미네이터 부위를 약 670 bp 의 SstI/EcoRI 단편 형태로 플라스미드 t - directH4A748/Sau3AI/SmaI-pKS로 부터 절단하였다. 이 단편은 SstI/EcoRI 으로 플라스미드 pRA-1 을 소화시킨 후, nos 터미네이터 부위 대신 라이게이션에 의해 삽입시킨다. 수득된 재조합 플라스미드는 키메라 유전자의 전사 방향으로 H4A748 프로모터 / GUS / H4A748 터미네이터 부위를 정방향으로 함유하고, pRA-2 라 불린다.
pRA-3 의 구축 :
아라비돕시스 탈리아나로 부터 수득한 H4A748 터미네이터 부위를 약 670 bp 의 SstI/EcoRI 단편 형태로 플라스미드 t - inverseH4A748/Sau3AI/SmaI-pKS 로 부터 절단하였다. 이 단편은 SstI/EcoRI 으로 플라스미드 pRA-1 을 소화시킨 후, nos 터미네이터 부위 대신 라이게이션에 의해 삽입시킨다. 수득된 재조합 플라스미드는 키메라 유전자의 전사 방향으로 H4A748 프로모터 / GUS / H4A748 터미네이터 부위를 역방향으로 함유하고, pRA-3 라 불린다.
pRPA-RD-146 의 구축 :
플라스미드 pRA-1 을 XbaI/SstI 으로 소화시킨 다음, GUS 유전자 대신에 OTP/CT7 을 함유하는 약 1.75 kbp 의 XbaI/SstI 단편을 라이게이션으로 삽입시킨다. 수득한 재조합 플라스미드는 키메라 유전자의 전사 방향으로 H4A748 프로모터 / OTP / CT7 / nos 터미네이터 부위를 함유하고 pRFA-RD-146 이라 칭한다.
pRPA-RD-147 의 구축 :
플라스미드 pRA-2 을 XbaI/SstI 으로 소화시킨 다음, GUS 유전자 대신에 OTP/CT7 을 함유하는 약 1.75 kbp 의 XbaI/SstI 단편을 라이게이션으로 삽입시킨다. 수득한 제조합 플라스미드는 키메라 유전자의 전사 방향으로 H4A748 프로모터 / OTP / CT7 / H4A748 터미네이터 부위를 정방향으로 함유하고 pRPA-RD-147 이라 칭한다.
pRPA-RD-148 의 구축 :
플라스미드 pRA-3 을 XbaI/SstI 으로 소화시킨 다음, GUS 유전자 대신에 OTP/CT7 을 함유하는 약 1.75 kbp 의 XbaI/SstI 단편을 라이게이션으로 삽입시킨다. 수득한 재조합 플라스미드는 키메라 유전자의 전사 방향으로 H4A748 프로모터 / OTP / CT7 / H4A748 터미네이터 부위를 역방향으로 함유하고 pRPA-RD-148 이라 칭한다.
실시예 2: 리포터 유전자의 활성의 형질 발현
1) 형질 전환 및 재생
카탈로그 (Clontech #6027-1) 에 나타난 시판되는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404 의 비종양성 균주내로 문헌 (Bevan M.(1984) Nucl. Acids Res., 12,8711-8721) 에 기재된 절차에 따라 에스케리키아 콜리 HB101 내의 "헬퍼" 플라스미드 pRK 2013 에 의한 삼양친성 교배에 의해 벡타를 도입한다.
아라비돕시스 탈리아나 L.생태형 C24 유래의 뿌리 외식체를 사용하여 출발하는 형질 전환 기술은 문헌 (Valvekens D. et al. (1988) Pros. Natl. Acad, Sci. USA, 85,5536-5540) 에 기재된 방법에 따라 수행한다. 간단히 요약하면, 3 단계 즉, 2,4-D 및 카이네틴을 첨가한 Gamborg B5 배지상에 유합조직의 형성을 유도하는 단계; 2iP 및 IAA 을 첨가한 Gamborg B5 배지상에 싹의 형성 단계 ; 및 호르몬이 없는 MS 배지상에 종자의 뿌리내림 및 형성 단계를 필요로 한다.
2) 식물체내의 GUS 활성의 측정
a. 조직화학적 관찰
외부 유전자가 도입된 다양한 식물 기관내의 GUS 활성에 대한 관찰 (Jefferson R.A.et al., (1987) EMBO J., 6,3901-3907) 결과, 분열 조직 부분의 선택적인 형질 발현은 구축물 pRA-2 및 pRA-3 를 사용함으로써 보존된다는 것을 보여준다. 또한, 구축물 pRA-2 은 구축물 pRA-1 을 사용하면 나타나지 않는 성체 조직 (잎, 뿌리, 이삭) 내의 활성 관찰을 가능하게 해준다.
b. 형광 분석 측정
구축물 pRA-1,2 및 3 각각에 대해, 각각의 형질 전환에 상응하는 12 개의 식물체로 부터 작은 장미의 화아 (花芽) 및 잎의 외식체에 대한 형광 분석으로 GUS활성을 측정한다 (Jefferson R.A. et al (1987) EMBO. J., 6,3901-3907).
pmol MU/min.mg prot. 으로 표시한 누적 평균값은 하기와 같다 :
이 측정 결과는 정방향 또는 역방향의 H4A748 터미네이터 부위가 특히, 급속한 생장을 하는 식물체 부위에서 키메라 유전자의 형질 발현의 활성의 증가를 유도함을 분명하게 보여준다.
실시예 3: 제초제에 대한 외부 유전자가 도입된 식물체의 내성
1) 형질 전환 및 재생
카탈로그 (Clontech #6027-1) 로 시판되는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404 의 비종양성 균주내로 문헌 (Bevan M. (1984) Nucl. Acids Res., 12,8711-8721) 에 기재된 절차에 따라 에스케리키아 콜리 HB101 내의 "헬퍼" 플라스미드 pRK 2013 에 의한 삼양친성 교배에 의해 벡타를 도입한다.
담배 엽상 외식체를 사용하여 출발한 형질 전환 기술은 문헌 (Horsh R.et al. (1985) Science, 227, 1229-1231) 에 기재된 방법에 기초하여 수행한다. 엽상 외식체로 부터 PBD6 담배 (원료 SEITA-France) 의 재생은 30 g/l 의 사카로오스 및 200 μg/ml 의 카나마이신을 함유하는 Murashige and Skoog (MS) 배지상에서 세개의 연속 단계로 수행된다. 즉, 첫번째 단계는 0.05 mg 의 나프틸아세트산 (NAA) 및벤질아미노푸린 (BAP) 2 mg/l 을 함유하는 사카로오스 30 g 을 첨가한 MS 배지상의 15 일간의 새싹 유도 단계를 포함한다. 이어서, 이 단계 동안 형성된 새싹은 30 g/l 의 사카로오스를 첨가하나 호르몬을 함유하지 않은 MS 배지상에서 10 일간 배양하여 발육시킨다. 이어서, 발육된 새싹을 수거하고, 염류, 비타민 및 설탕을 절반의 함량으로 함유하나, 호르몬을 함유하지 않은 1/2 로 희석된 MS 뿌리 내림 배지에서 배양한다. 약 15 일 후, 뿌리내린 새싹을 토양에 심는다.
2) 글리포세이트에 대한 내성의 측정:
각각의 구축물 pRPA-RD-A,B 및 C 에 대해, 20 개의 형질 전환된 식물체를 재생하고, 온실로 옮긴다. 5 엽 단계의 이들 식물체를 온실에서 헥트아르당 글리포세이트 활성 물질 0.8 kg 에 상응하는 RoundUP 수성 현탁액으로 처리한다. 처리 3 주 후, 수득한 결과는 관찰한 식물 독성치의 관측 결과와 상응하였다. 이러한 조건하에서, 상기 구축물로 형질 전환된 식물체는 평균적으로 허용가능한 내성 (pRPA-RD-146) 또는 심지어 양호한 내성(pRPA-RD-147 및 148) 을 보인 반면, 비형질 전환 조절된 식물체는 완전히 파괴되었음을 관찰하였다. 이 결과는 글리포세이트에 대한 내성을 코오딩하는 동일한 유전자에 대한 본 발명에 따른 키메라 유전자의 사용에 의해 제공된 분명한 개선 효과를 보여준다.
본 발명에 따라 형질 전환된 식물체는 도입된 키메라 유전자의 형질 발현에 상응하는 표현형 특성을 갖는 계통 및 하이브리드의 생산을 위한 양친으로서 사용될 수 있다.

Claims (21)

  1. 전사방향으로 적어도 프로모터 부위, 제초제 내성 유전자 서열 및 터미네이터 부위를 포함하는 식물체의 형질 전환을 위한 키메라 유전자로, 터미네이터 부위가 특히 급속한 생장을 하는 식물체 부위내에서 키메라 유전자의 번역 생성물의 발현을 가능하게 해주는 하기 서열을 가지는 아라비돕시스 탈리아나 (Arakidopsis thaliana) H4A748 히스톤 유전자의 터미네이터 부위를 함유하는 것을 특징으로 하는 키메라 유전자:
  2. 제 1 항에 있어서, 프로모터 부위가 식물 히스톤 유전자 프로모터로부터 수득됨을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 프로모터 부위가 터미네이터 부위와 같은 식물 히스톤 유전자로부터 수득됨을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  4. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 프로모터 부위가 중복 식물 히스톤 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  5. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 프로모터 부위가 식물체내에서 천연적으로 발현될 수 있는 유전자로부터 유래한 다른 프로모터와 결합된 식물 히스톤 유전자의 하나 이상의 프로모터를 함유함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  6. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 코오딩 유전자가 제초제에 대한 증가된 내성을 식물체에 부여할 수 있음을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  7. 제 6 항에 있어서, 제초제 내성 유전자가 하부 세포적 구획내에서 제초제 내성 유전자의 번역 생성물의 축적을 허용하는 운송 펩티드 부위를 코오딩하는 DNA 서열과 결합되어 있음을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  8. 제 7 항에 있어서, 운송 펩티드 부위가 색소체 구획내에서 제초제 내성 유전자의 번역 생성물의 축적을 허용함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  9. 제 7 항에 있어서, 운송 펩티드 부위는 전사 방향으로 색소체에 위치하는 효소를 코오딩하는 식물 유전자로부터의 하나 이상의 운송 펩티드, 임의로 색소체에 위치하는 효소를 코오딩하는 식물 유전자의 N - 말단 성숙 부분의 서열 일부, 및 이어서 임의로 색소체에 위치하는 효소를 코오딩하는 식물 유전자로부터의 제 2 운송 펩티드를 함유함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  10. 제 2 항에 있어서, 제초제 내성 유전자가 그의 타게트인 EPSPS 인 제초제에 대해 활성인 효소를 코오딩함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  11. 제 10 항에 있어서, 제초제 내성 유전자가 글리포세이트에 대해 활성인 효소를 코오딩함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  12. 제 10 항에 있어서, 제초제 내성 유전자가 임의의 계통 발생적 기원임을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  13. 제 2 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 키메라 유전자를 함유함을 특징으로 하는 식물체의 형질 전환용 벡타.
  14. 제 12 항에 따른 벡타를 함유함을 특징으로 하는 아그로박테리움 종(Agrobacterium sp.) 의 균주.
  15. 제 1 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 키메라 유전자를 함유함을 특징으로 하는 형질전환된 식물 세포.
  16. 제 15 항에 따른 세포로부터 수득되며 그의 잎 외식체를 통하여 무성번식하는 형질 전환된 식물체.
  17. 제 1 항에 있어서, 터미네이터 부위가 이것이 유래된 유전자의 전사 방향의 최초의 방향에 대하여 정방향 또는 역방향 양식으로 키메라 유전자의 전사 방향으로 위치함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  18. 제 1 항에 있어서, 터미네이터 부위가 여러개의 결합된 터미네이터 부위 요소들을 포함함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  19. 제 1 항에 있어서, 터미네이터 부위가 식물체내에서 천연적으로 발현될 수 있는 유전자의 터미네이터 부위와 결합된 히스톤 유전자 터미네이터 부위를 포함함을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  20. 제 1 항에 있어서, 터미네이터 부위가 식물체내의 제초제의 축적 부위내에서제초제 내성 유전자 생성물의 발현을 가능하게 해줌을 특징으로 하는 키메라 유전자.
  21. 제 1 항, 제 17 항 및 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 식물 히스톤 유전자로부터의 터미네이터 부위, 하나 이상의 운송 펩티드 부위 및 하나 이상의 트랜스 유전자 (transgene) 및 프로모터 부위를 각각 분리하고, 이어서 트랜스 유전자의 전사 방향으로 조립함을 특징으로 하는 제 2 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 키메라 유전자의 구축 방법.
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