MXPA02005426A - Promotor de mip-sintasa del maiz. - Google Patents

Abstract

El gene de sintasa de 1-fosfato de mio-inositol (MIP-sintasa) del maiz, y las secuencias reguladoras, especificas para el embrion, novedosas, derivadas del gene de MIP-sintasa, son utiles en la ingenieria genetica de plantas.

Description

PROMOTOR DE MIP-SINTASA DEL MAÍZ CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención provee secuencias y construcciones de ADN que son útiles en ingeniería genética de las plantas. Más en lo particular, la invención provee una secuencia de ADN aislada que codifica la sintasa de 1-fosfato de mio-inositol (???-sintasa) y secuencias reguladoras novedosas, derivadas del gene de MIP-sintasa, que pueden ser usadas para establecer la expresión de una variedad de secuencias de ácido nucleico en el tejido embriónico de plantas transgénicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los proyectos de ingeniería genética de plantas requieren acceso a una variedad de elementos genéticos que son usados para regular la expresión de transgenes. Un ejemplo primario es el promotor que regula el inicio de la transcripción. Existe la necesidad de una variedad de promotores para uso en ingeniería genética de plantas. En particular, existe la necesidad de promotores que establezcan la expresión específicamente en tejido embriónico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ADN para la MlP-sintasa del maíz. SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos para la MlP-sintasa del maíz SEQ ID NO. 3 es la secuencia de ADN para el promotor de MlP-sintasa del maíz, específico para el embrión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee una molécula de ADN aislada, que codifica la MlP-sintasa del maíz. En otro de sus aspectos, la invención provee promotores de MlP-sintasa del maíz, específicos para el embrión, que corresponden a, o que son derivados de SEQ ID NO: 3. En otro de sus aspectos, la invención provee una construcción de ADN que comprende, operativamente enlazados en la dirección 5' a 3': a) un promotor de MlP-sintasa del maíz; b) una secuencia de ADN de interés; y c) una región 3' no trasladada (3'-UTR). En otro de sus aspectos, la invención provee un plásmido que comprende un promotor de MlP-sintasa del maíz, de preferencia de 7 a 2064 pares de bases de SEQ ID NO: 3.

En otro de sus aspectos, la invención provee una planta transformada que comprende por lo menos una célula de planta que contiene una construcción de ADN de la presente invención. La planta puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. Las plantas preferidas son: maíz, arroz, algodón y tabaco. En otro de sus aspectos, la invención provee una semilla o grano que contiene una construcción de ADN de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La secuencia de ADN de interés, usada en las construcciones de la presente invención, puede ser cualquier gene que se desee expresar o regular en sentido descendente, en las plantas. Los genes particularmente útiles son aquellos que confieren tolerancia a los herbicidas, a los insectos o a los virus, y los genes que dan valor nutricional mejorado o características de procesamiento mejoradas, a la planta. Los ejemplos de genes agronómicamente útiles incluyen el gene insecticida procedente de Bacillus thuringiensis para conferir resistencia a los insectos, y el gene de sintasa de 3'-fosfoshikimato de 5'-enolpiruvilo (EPSPS), y cualquier variante de él, para conferir tolerancia a los herbicidas glifosato. Como lo entenderán fácilmente quienes sean expertos en la materia, se puede usar cualquier gene agronómicamente importante, que confiera una cualidad deseada o que produzca una proteína importante. La región 3' no trasladada o 3'-UTR, empleada en las construcciones de la presente invención, es una que confiere procesamiento eficiente del ARNm, mantiene la estabilidad del mensaje y dirige la adición de ribonucleótidos de adenosina al extremo 3' de la secuencia de ARNm transcrita. La 3'-UTR puede ser natural, con la región promotora, natural con el gene estructural, o se la puede derivar de otra fuente. Está disponible una gran variedad de regiones de terminación, que pueden ser obtenidas de genes capaces de expresar en anfitriones vegetales, por ejemplo, genes de bacterias, opinos, virales y de plantas. Las 3'-UTR adecuadas incluyen, pero sin limitación a ellas: La 3'-UTR per5 (WO 98/56921), el gene de la 3'-UTR de la nopalina-sintasa (nos), tml 3', ó acp 3', por ejemplo. La presente invención es generalmente aplicable a la expresión de genes estructurales tanto en plantas monocotiledóneas como en plantas dicotiledóneas. Esta invención es particularmente adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas, incluyendo, pero sin limitación a ellas: maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, ñame, cebolla, plátano, coco y dátil. Una aplicación preferida de la presente invención es en la producción de plantas de maíz transgénicas. La invención es particularmente aplicable a la familia de las gramíneas, en particular a: maíz, trigo, arroz, avena, cebada y sorgo. Las especies dicotiledóneas incluyen: tabaco, tomate, girasol, algodón, remolacha, papa, lechuga, melón, soya y nabo (colza). La presente invención incluye también secuencias de ADN que tienen homología de secuencia sustancial con las secuencias reguladoras descritas específicamente, de tal manera, que son capaces de tener el efecto descrito cuando son expresadas. Tal como se usa en la presente solicitud, el término "homología de secuencia sustancial" se usa para indicar que una secuencia de nucleótido (en caso del ADN o del ARN) o una secuencia de aminoácidos (en caso de una proteína o un polipéptido) exhibe equivalencia sustancial, funcional o estructural, con otra secuencia de nucleótido o de aminoácido. Cualesquiera diferencias funcionales o estructurales entre secuencias que tienen homología de secuencia sustancial, será de minimis; es decir, no tendrán efecto sobre la capacidad de la secuencia para funcionar como se indica en la presente solicitud. Las secuencias que tienen homología de secuencia sustancial con las secuencias descritas aquí, usualmente son variantes de la secuencia descrita; tal como mutaciones, pero también pueden ser secuencias sintéticas. En la mayoría de los casos, las secuencias que tienen 95 por ciento de homología con las secuencias específicamente descritas aquí, funcionarán como equivalentes; y en muchos casos será aceptable una homología considerablemente inferior, por ejemplo, de 75 por ciento o de 80 por ciento. Localizar las partes de esas secuencias que no son críticas, puede ser tardado, pero es una operación rutinaria y bien conocida por los expertos en la materia. Está contemplado que las secuencias que correspondan a las secuencias anotadas más arriba, contengan una o más modificaciones en las secuencias, con respecto al tipo silvestre, pero que todavía producirán los elementos respectivos, comparables con respecto a las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, como se hizo notar antes, se puede usar fragmentos. Se puede incorporar modificaciones en las secuencias aisladas, incluyendo la adición, la omisión o la sustitución no conservadora, de un número limitado de diversos nucleótidos, o la sustitución conservadora de muchos nucleótidos. Adicionalmente, la construcción de dichas moléculas de ADN puede emplear fuentes que se ha demostrado que confieren acrecentamiento de la expresión de genes heterólogos, colocados bajo su control regulador. Las técnicas ejemplares para modificar secuencias de oligonucleótidos incluyen usar mutagénesis directa al sitio, mediada por polinucleótidos. Véase Zoller y coautores (1984), DNA, 3: 479-488; Higuchi y coautores (1988), Nucí. Acids Res., 16: 7351-7367; Ho y coautores (1989), Gene, 77: 51-59; Horton y coautores (1989), Gene, 77:61; y PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989)). Las tecnologías convencionales para introducir material biológico en las células anfitrionas incluyen la electroporación (véase Shigekawa y Dower (1988), Biotechniques, 6: 742; Miller y coautores (1988), Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 856-860; y Powell y coautores (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54: 655-660; los mecanismos de captación directa de ADN (véase Mandel y Higa (1972), J. Mol. Biol., 53: 159-162; Dityatkin y coautores (1972), Biochimica et Biophysica Acta, 281: 319-323; Wigler y coautores (1979), Cell, 16:77; y Uchimiya y coautores (1982), en: Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara (ed.), Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokio, páginas 507-508); los mecanismos de fusión (véase Uchidaz y coautores (1980), en: Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Cells, Baserga y otros (eds.)> Wistar Symposium Series, 1:169-185); los agentes infecciosos (véase Fraley y coautores (1986), CRC Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46); y Anderson (1984), Science, 226: 401-409); los mecanismos de microinyección (véase Crossway y coautores (1986), Mol. Gen. Genet., 202: 179-185); y los mecanismos de proyectil de alta velocidad (véase EPO 0 405 696, de Miller, Schuchardt, Skokut y Gould (The Dow Chemical Company). El procedimiento apropiado para transformar una célula anfitriona seleccionada puede ser escogido de acuerdo con la célula anfitriona usada. Con base en la experiencia actual, parece haber poca diferencia en la expresión de los genes, una vez que son insertados dentro de las células, lo que se puede atribuir al método de transformación propiamente dicho. Una vez introducido dentro del tejido de la planta, la expresión del gene estructural puede ser analizada en un sistema de expresión transitorio, o se puede determinar después de la selección para su integración estable dentro del genoma de la planta. Se conoce las técnicas para el cultivo in vitro de tejido de plantas y, en muchos casos, para la regeneración en plantas enteras. El procedimiento apropiado para producir plantas transgénicas maduras puede ser seleccionado conforme a la especie de planta usada. La regeneración varía de una especie a otra de plantas. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo y del historial del cultivo. Una vez que se haya obtenido plantas enteras, pueden ser reproducidas sexualmente o por clonación, de tal manera que por lo menos una copia de la secuencia esté presente en las células de la progenie. Las semillas de las plantas regeneradas pueden ser recolectadas para uso futuro, y se puede desarrollar plantas a partir de esas semillas. Los procedimientos para transferir el gene introducido, de la planta originalmente transformada a los cultivos comercialmente útiles, son conocidos por los expertos en la materia. En uno de sus aspectos, se considera que la invención comprende cualquier versión omitida del promotor de MlP-sintasa, que provea un promotor de planta funcional. Dichos promotores están comprendidos dentro del término "promotor de MlP-sintasa". Se considerará que una secuencia provee un promotor "funcional", para los propósitos de la presente solicitud, si da la expresión de GUS transitoria por encima de los niveles de fondo, cuando se prueba como en el ejemplo 4. Quienes sean expertos en la materia entenderán que se puede efectuar varias omisiones en la secuencia de 2058 pares de bases (pares de bases 7-2064 de SEQ ID NO: 3), sin destruir la funcionalidad de la secuencia, como promotora. Los experimentos de omisión están dentro de los conocimientos de los expertos en la materia. De preferencia un promotor de la presente invención comprenderá 200 pares de bases contiguos que sean idénticos a los 200 pares de bases contiguos de la secuencia definida por los pares de bases 7-2064 de SEQ ID NO: 3. Es más preferible que los promotores comprendan 500 pares de bases contiguos, que sean idénticos a los 500 pares de bases contiguos de la secuencia definida por los pares de bases 7-2064 de SEQ ID NO: 3. En los siguientes ejemplos se usó métodos comunes y corrientes de purificación de ADN, digestión con enzima de restricción, análisis en gel de agarosa, aislamiento, ligación y transformación de fragmento de ADN, tal como se los describe en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, a Laboratory Manual, segunda edición. (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press), Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R., Moore, D., Smith, J., Seidman, J. y Struhl, K., editores (1987); y en Current Protocols in Molecular Biology (Nueva York, John Wiley and Sons).

EJEMPLO 1 CLONACIÓN DE UN ADNc DE MAÍZ QUE CODIFICA MI P-SI NTAS A A. - Aislamiento de una sonda de ???-sintasa de maíz, utilizando sensibilizadores degenerados. Se aisló una sonda mediante amplificación por RCP de ADNc de embrión de maíz, usando sensibilizadores degenerados diseñados a partir de la secuencia de aminoácido de ???-sintasa de levadura. Para el momento únicamente se conocía la secuencia de ???-sintasa de levadura (Johnson, M y Henry, S. (1989), Biosynthesis of Inositol in Yeast: Primary Structure of Myo-lnositol-1 -Phosphate Synthase (EC 5.5.1.4) and Functional Analysis of its Structural Gene, the IN01 Locus. J. Biol. Chem., 265: 1274-1283), no fue posible identificar las regiones "conservadas" de la secuencia de proteína ???-sintasa. Como alternativa, se identificó los aminoácidos que son codificados por sólo uno o dos codones en la secuencia de la proteína de levadura. Se seleccionó tramos de cinco o más de estos aminoácidos de baja redundancia, como las regiones para el diseño de sensibilizador. Se identificó un clon (MP18) que pudo ser trasladado a la proteína, que tuvo identidad con la ???-sintasa de levadura. El inserto de MIP18 fue purificado en gel, marcado con 32P y usado para sondear un banco de ADNc de maíz lambda. B. - Aislamiento de ADNc positivos para MIP de maíz. Los protocolos para la formación de placas del fago, la purificación de las placas y las escisiones in vivo fueron como los recomienda el fabricante (Stratagene, La Jolla, CA, E. U. A.). Se introdujo algunos cambios y son los anotados a continuación: Se desarrolló E. coli XL-1 azul en medio NZY que contenía 0.2% de maltosa, a una densidad óptica de 1.0 a 520 nm. Se recogió las células mediante centrifugación a baja velocidad y se las volvió a suspender a la misma densidad en 10 mM de MgS04. Se guardó las células durante varios días a 4°C con poca pérdida en la eficiencia formadora de placa. Se preabsorbió el fago a 200 µ? de células durante 15 minutos, a la temperatura ambiente, en tubos Falcon 2059, seguidos por 15 minutos a 37°C. Se extendió en placas las células en 3 ml_ de NZY agarosa a 48°C para formar placas NZY. Se incubó las placas a 37°C durante la noche. Se enfrió las placas, se aplicó suavemente filtros de nylon de 0.22 mieras a la placa, y se dejó que absorbiera el fago durante dos minutos. Se transfirió los filtros a papel secante, saturado con 0.5 M de NaOH, 1.5 M de NaCI, durante 5 minutos. Se dejó secar los filtros durante 5 minutos, luego se los transfirió al papel secante saturado con una solución neutralizadora de 0.5M de Tris, pH 7.6, 1.5M de NaCI, durante 15 minutos. Se entrelazó entonces los filtros utilizando el entrelazador Stratagene UV, en la posición "auto". Se lavó los filtros con dos cambios de 2 x SSC, 0.1% de SDS. Se efectuó la prehibridación durante un mínimo de seis horas, en 6X de SSC, 10X de solución de Denhardt, 0.1% de SDS, 200 mg/mL de ADN a 42°C. Se aisló los fragmentos de ADN usando los métodos de purificación Qiaex, de Qiagen Inc., (Chatsworth, CA, E. U A.). Se usó el equipo marcador de ADN Randon Primed de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, E. U. A.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se retiró los nucleótidos no incorporados utilizando filtración en gel a través de una columna Stratagene PUSH, siguiendo las recomendaciones del fabricante. La solución de hibridación para la hibridación de baja exigencia fue 6X de SSC, 10X de solución de Denhardt, 0.1% de SDS, 200 mg/mL de ADN, 42°C, seis horas. Los lavados de baja exigencia fueron a 40°C, con 6X de SSC, 1% de SDS, cuatro cambios en un total de dos litros. La solución de hibridación para alta exigencia fue como la anterior, excepto que se ajustó a 50 por ciento de formamida desionizada. Las condiciones de lavado fueron 0.1% de SSC, 0.1% de SDS, 60°C, cuatro cambios en un total de dos litros. La filtración primaria produjo muchas placas positivas que aparecieron en filtros duplicados. La frecuencia de las placas positivas se aproximó al 1 por ciento, lo que indicó que el gene era expresado fuertemente en el embrión. Se recogió varias placas y se las seleccionó por segunda y por tercera vez. Se dejó ocho placas individuales de materiales puros, y se rescató los plásmidos para análisis de inserto de ADNc. Se digirió los ocho clones positivos de ???-sintasa, con endonucleasas de restricción Eco R1 y Xho I para liberar los insertos del vector. Con base en la secuencia de levadura, era de esperar un inserto de ADNc de aproximadamente 2 kb; esto incluye 500 aminoácidos de capacidad codificadora y varios cientos de pares de bases de secuencia no trasladada. Dos clones contuvieron insertos que migraron conjuntamente con el marcador de 2 kb. Los otros seis clones contuvieron insertos significativamente menores en tamaño, y no fueron caracterizados adicionalmente. Se seleccionó un clon con un inserto de ADNc de aproximadamente 2 kb, para análisis de la secuencia de ADN; se lo llamó el clon pMIP-7. C- Análisis de la Secuencia de ADN del ADNc de MIP-sintasa de maíz. La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos deducida para la M I P-sintasa de maíz, están mostradas en SEQ ID NO: 1. El ADNc tiene una longitud de 1959 nucleótidos. La ATG más hacia 5' está localizada en la posición 137, lo que da una región no codificadora 5' putativa de 136 nucleótidos. Un marco de lectura abierta grande se extiende desde la ATG en la posición 137 hasta un codón de alto en la posición 1667. El marco de lectura codifica un polipéptido de 510 aminoácidos. Un codón de alto está localizado en la posición 1667, seguido por 248 nucleótidos de la región 3' no trasladada. Un tracto poli (A) corto está localizado en la posición 1918.

EJEMPLO 2 ANÁLISIS DE PATRONES ESPECÍFICOS PARA EL TEJIDO Y DE DESARROLLO EN LA SEMILLA Se desarrolló genotipos de maíz, propiedad de Mycogen, CS608, H01, CQ806, OQ414 y H i 11 , así como un híbrido B73, obtenible comúnmente, bajo condiciones comunes y corrientes de invernadero. Para el análisis de la expresión de gene específico para el tejido, del promotor de MlP-sintasa, se cosechó tejidos en los tiempos de desarrollo en los que se tuvo interés, y se los congeló a -70°C hasta la extracción del ARN. Parra determinar el patrón de expresión temporal de MIP en los embriones de semilla, se disecó los granos de mazorcas de CQ806 y H01, en diferentes días después de la polinización (DAP). Después de la cosecha se disecó inmediatamente los granos; se recogió los embriones y se los congeló en tubos cónicos de 50 ml_, sobre hielo seco. Se extrajo ARN y se lo preparó para análisis Northern, utilizando técnicas comunes y corrientes. Se preparó una sonda de hibridación de MlP-sintasa a partir del plásmido pMIP7 (para su descripción, véase el ejemplo 1), mediante digestión con Eco R1 y Xho1, seguida por purificación en gel de un inserto de aproximadamente 1950 pares de bases. Se marcó veinticinco nanogramos del fragmento purificado en gel, con 50 pCi de [oc-32P]-dCTP (NEN Research Products) usando los gránulos marcadores READY-TO-GO (Pharmacia), de acuerdo con el fabricante, y se los purificó sobre columnas de empuje NUCTRAP (Stratagene). Se desnaturalizó la sonda marcada poniendo a ebullición durante cinco minutos; se enfrió sobre hielo durante 5 minutos, y se añadió directamente a las manchas previamente hibridadas. Se llevó a cabo la hibridación en bolsas SEAL-A-MEAL (DAZEY Corp., Industrial Airport, KA, E. U. A.) a 42°C durante 16 horas. Se lavó los manchados seis veces durante 30 minutos, en un gran exceso (500 mL) de solución de lavado previamente tibiada [20 mM de fosfato de sodio, pH 6.5, 50 mM de NaCI, 1 mM de EDTA y 0.1% de SDS] a 60°C. Los resultados de la hibridación indicaron que se expresaba M I P-sintasa en los tejidos de embrión de cada uno de los genotipos de maíz probados. Se observó la máxima expresión en los embriones 18-27 DAP. No se observó expresión significativa en hojas ni en raíces. Estos datos sugirieron que la expresión de la M I P-sintasa era regulada preferencialmente en los tejidos de embrión.

EJEMPLO 3 CLONACIÓN DE LAS REGIONES 5' NO TRASLADADAS DEL GENE DE MI P-SINTASA DE MAÍZ Se aisló las secuencias flanqueadoras 5' de MlP-sintasa de maíz, del ADN genómico de maíz, variedad OQ414 (línea propiedad de Agrigenetics Inc., denominadas comercialmente semillas Mycogen). Se obtuvo la secuenciación de ADN usando el equipo secuenciador de ADN ABI Prism, con la polimerasa FS AmpliTaq®, como lo describe el fabricante (Perkin Elmer/Applied Biosystems División, Foster City, CA, E. U. A.). Se llevó a cabo las reacciones de secuenciación en el secuenciador de ADN Applied Biosystem 373A (Perkin Elmer/Applied Biosystems División). La secuencia de ADN para el promotor de MlP-sintasa está dada en SEQ ID NO: 3.

DESCRIPCIÓN DE LOS VECTORES Se construyó cuatro vectores de expresión que incorporaron el promotor de MlP-sintasa corriente arriba del gene de ß-glucuronidasa (GUS) en un esqueleto pUC19. Se designó pMipGP339-1 y pMipGN345-1 para probar la expresión de GUS en análisis transitorios. La diferencia entre estos dos vectores fue que se usó diferentes secuencias 3'-no trasladadas como terminadores de la transcripción: pMipGP339-1 usó la 3'-UTR per5; pMipGN345-1 usó la 3'-UTR nos. pMipGP341 y pMipGN350-1 son derivados de pMipGP339-1 y de pMipGN345-1 , que añaden un gene marcador seleccionable (gene de fosfinotricin-acetiltransferasa (BAR) de Streoptomyces hygroscopicus (White y coautores (1989), Nucleic Acids Res., 18:1062)), impulsado por un promotor 35S doblemente acrecentado. Se usó pMipGP341 y pMipGN350-1 para probar las fusiones de promotor de MIP-sintasa/GUS en embriones de maíz transformados de manera estable. Se usó el plásmido UGP232-4 como control positivo en los estudios de expresión transitoria. UGP232-4 es similar a pMipGP939, excepto que el gene GUS está impulsado por el promotor ubiquitin 1 (ubi) y el intrón I del maíz, en lugar de por el promotor de MlP-sintasa.

Se usó el plásmido pDAB305 como control en los estudios de expresión transitoria para estandarizar la expresión de GUS a través de experimentos múltiples. pDAB305 es similar a pMipGN345-1, pero utiliza el promotor 35S doblemente acrecentado, usado en pMipGN350-1 para impulsar la expresión del gene GUS. La producción de la proteína GUS a partir de genes controlados por diferentes versiones de promotor, frecuentemente se comparó con relación a un gene de control interno que produjo luciferasa de luciérnaga (De Wet y coautores (1987), Mol. Cell. Biol., 7(2) 725-37). Se adquirió de CLONTECH (Palo Alto, CA, E. U. A.), un plásmido (pT3/T7-1 LUC) que contenía la región codificadora de luciferasa (LUC), y se modificó la región codificadora en sus extremos 5' y 3', mediante métodos comunes y corrientes, para permitir el aislamiento de la región codificadora de luciferasa intacta en un fragmento de 1702 pares de bases, después de digerir con Ncol y B g 11I. Se usó este fragmento para reemplazar el gene GUS del plásmido pDAB305, de modo que se expresó la región codificadora de luciferasa desde el promotor 35S acrecentado, lo que dio por resultado el plásmido pDeLux.

EJEMPLO 4 PRUEBA TRANSITORIA DE CONSTRUCCIONES DE MIP-SINTASA- GUS A.- Expresión histoquímica transitoria de GUS en embriones. Se usó tres plásmidos de gene individuales para probar la expresión transitoria de GUS, impulsada por el promotor de MIP-sintasa en embriones de maíz. pUGP232-4 (que codifica el promotor ubiquitin del maíz, fundido a GUS con la 3'-UTR per5), sirvió como control positivo. pMipGP339-1 y pM¡pGN345-1 contenían una fusión de promotor de MIP-sintasa-GUS, con los extremos per5 y Nos 3', respectivamente. Se cosechó embriones zigóticos inmaduros del genotipo "Hi-ll" (Armstrong y coautores (1991), Maize Genet. Coop. News Lett., 65:92-93), a los 12, 18 y 20 días después de la polinización (DAP). Se cultivó los embriones uno o dos días en un medio de iniciación de callo 15Ag10, que consistió de sales N6 y vitaminas (Chu y coautores (1978), The N6 médium and its application to another culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, 43-56), 1.0 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 25 mM de L-prolina, 100 mg/L de hidrolisado de caseína, 10 mg/L de AgN03, 2.5 g/L de GELRITE (Schweizerhall, South Plainfield, NJ, E. U. A.) y 20 g/L de sacarosa, con un pH de 5.8, antes del tratamiento en autoclave. Antes de la transformación, se transfirió los embriones a medio 15Ag10 + SM (15Ag10 con 0.2M de sorbitol y 0.2M de mannitol) durante cuatro horas de pretratamiento osmótico. Para descarga con helio, se dispuso 12 embriones en un área de blanco de aproximadamente 1 centímetro cuadrado sobre el medio de descarga y se cubrió con una pantalla de acero inoxidable de malla de 230 µ??. El medio de descarga difirió del medio 15Ag10 + SM en que careció de nitrato de plata; únicamente contenía 6 mM de L-prolina y se lo solidificó con 20 g/L de agar TC (PhytoTechnology Laboratories, LLC, Shawnee Mission, KS, E. U. A.). Se preparó ADN para descarga usando cantidades molares iguales de los plásmidos GUS. Se diluyó un total de 70 pg de ADN, ADN probado más ADN Bluescript™ (Stratagene, La Jolla, CA, E. U. A.)> cuando fue necesario, en agua estéril, a un volumen de 50 pL. Se añadió el ADN y el agua a 30 mg de partículas esféricas de oro de 1.0 µ?, superficialmente esterilizadas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, E. U. A.)- Se agitó hasta formar vértice la mezcla, brevemente (durante alrededor de 15 segundos) antes de añadir 37 pL de 2.5M de cloruro de calcio y 15 pL de 0.1 M de espermidina (base libre). Después de agitar hasta formar vórtice durante 30 segundos, se dejó que el ADN y el oro precipitaran de la solución. Se retiró el sobrenadante y se usó 1 mL de etanol. Se diluyó la mezcla de ADN/oro 1:4 antes de usarla para transformación. La descarga con helio aceleró las partículas de oro suspendidas, revestidas con ADN, hacia y dentro de los blancos de tejido preparados. El dispositivo usado fue un prototipo más antiguo que el descrito en la patente estadounidense No. 5,141,131, la cual queda incorporada aquí mediante esta referencia. Se colocó los tejidos bajo un vacío parcial de 635 mm de Hg en la cámara del dispositivo. Se aceleró las partículas de oro revestidas con ADN en cada blanco de embrión una vez, usando una presión de helio de 10.33 MPa, suministrando cada descarga 20 µ?_ de la suspensión de ADN/oro. Después de la descarga se transfirió nuevamente los embriones a medio 15Ag10 + SM y se incubó en la oscuridad a 27°C durante 18-24 horas, antes del análisis histoquímico de GUS. Se sometió los embriones a análisis histoquímico de GUS (Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep., 5: 387-405), colocando en placas de microtitulador, de 24 concavidades, que contenían 250-500 µ?_ de regulador de análisis [0.1 M de fosfato de sodio, pH 8.0, 0.5 mM de ferricianuro de potasio, 0.5 mM de ferrocianuro de potasio, 10 mM de EDTA disódico, 0.95 mM de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucuronida y 0.6% (en volumen/volumen) de TRITON X-100] por concavidad. Se impulso un vacío parcial durante 2-15 horas, antes de incubar en la oscuridad durante 24-48 horas a 37°C. La Tabla 3 resume los resultados de tres experimentos que prueban la expresión transitoria de GUS del promotor de MIP-sintasa, en comparación con un control de ubiquitin del maíz. Se descargó de tres a cinco blancos (12 embriones por blanco) por construcción, en cada experimento. Aunque no tan intenso como el control, la construcción de ???-sintasa con la 3'-UTR per5 dio por resultado la expresión de GUS en embriones cosechados a 12, 18 y 20 DAP. El plásmido de ???-sintasa con el extremo 3' Nos, también demostró actividad de GUS en embriones de 20 DAP. En conclusión, se observó niveles moderados de expresión transitoria con el promotor de ???-sintasa, en embriones zigóticos inmaduros del maíz.

TABLA 3 EXPRESIÓN TRANSITORIA DE GUS DE CONSTRUCCIONES DE MIP- SINTASA-GUS EN EMBRIONES DE MAÍZ B.- Expresión cuantitativa transitoria de GUS en callo regenerabie de maíz. Se probó los plásmidos pMipGP339-1 y pMipGN345-1 en callo de maíz regenerabie, para una indicación del nivel al que el promotor de ???-sintasa impulsa la expresión constitutiva. Se usó como control una construcción de promotor 35S modificado/GUS (pDAB305) que es expresada fuertemente en el maíz. La expresión de GUS impulsada por pMipGP339-1 o por pMipGN345-1 fue determinada como un porcentaje de GUS impulsado por pDAB305. Cada uno de pMipGP339-1 y pMipGN345-1 dio por resultado la expresión de 3 por ciento de pDAB305, lo que fue estadísticamente diferente del control. Conjuntamente con los datos de embrión anteriores, la expresión constitutiva insignificante indica fuertemente que la M I P-sintasa es un promotor específico para el embrión.

EJEMPLO 5 PRODUCCIÓN DE CALLO DE MAÍZ TRANSFORMADO DE MANERA ESTABLE Se inició cultivos de callo tipo II a partir de embriones zigóticos inmaduros del genotipo "Hi-M" (Armstrong y coautores (1991), Maize Genet. Coop. Newslett., 65: 92-93). Se aisló los embriones de mazorcas desarrolladas en invernadero, de cruces entre el antecesor A de Hi-ll y el antecesor B de Hi-ll, o embriones F2 derivados de una autopolinización o sib-polinización de una planta Hi-ll. Se cultivó los embriones inmaduros (1.5 a 3.5 mm) en un medio de iniciación de callo 15Ag10, como se describe aquí. Después de cuatro a seis semanas se subcultivo el callo en un medio de mantenimiento de callo (medio de iniciación en el que se omitió el AgN03 y se redujo la L-prolina a 6 mM). Tuvo lugar la selección del callo tipo II durante alrededor de 12-16 semanas. Se transformó independientemente los plásmidos pMipGN350-1 y pMipGP341 a tejido de callo embriógeno. En la preparación de descarga de helio, se precipitó 140 pg de ADN plásmido sobre 60 mg de partículas de oro esféricas, enjuagadas con alcohol, (1.5-3.0 pm de diámetro, Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, Wl, E. U. A.), añadiendo 74 pL de 2.5M de CaCI2.H20 y 30 pL de 0.1M de espermidina (base libre) a 300 pL de ADN plásmido y H20. Inmediatamente se agitó la solución hasta formar vórtice y se dejó que sedimentaran las partículas de oro revestidas con ADN. Se retiró el sobrenadante claro resultante y se volvió a suspender las partículas de oro en 1 ml_ de etanol absoluto. Se diluyó esta suspensión con etanol absoluto para obtener 15 mg de oro revestido con ADN por mililitro. Se esparció aproximadamente 600 mg de tejido de callo embriogeno sobre la superficie de un medio osmótico de tipo II, tal como se describe aquí. Después de un tratamiento previo de cuatro horas, se transfirió el tejido a platos de cultivo que contenían el medio de descarga que se describe aquí. Se descargó individualmente los blancos con la mezcla de ADN/oro usando el dispositivo de descarga con helio descrito en la presente. Se cubrió los tejidos con una malla de acero inoxidable (aberturas de 104 pm) y se colocó bajo un vacío parcial de 635 mm de Hg en la cámara del dispositivo. Se diluyó adicionalmente las partículas de oro revestidas con ADN 1:1 con etanol absoluto, antes de someter a descarga, y se aceleró en los blancos de callo cuatro veces, usando una presión de helio de 10.33 MPa, suministrando cada descarga 20 µ?_ de la suspensión de ADN/oro. Se hizo girar los blancos 180 grados después de cada descarga. También se mezcló el tejido a la mitad del procedimiento, para exponer el callo no sometido a descarga. Inmediatamente después de la descarga, se transfirió el tejido nuevamente al medio osmótico de tipo II durante un periodo de recuperación de 16 a 24 horas. Posteriormente se dividió el tejido a trozos pequeños y se los transfirió a medio de selección (medio de mantenimiento que carece del hidrolizado de caseína y L-prolina, pero que contiene 30 mg/L de BASTA® (AgrEvo, Berlín, Alemania)). Cada cuatro semanas, durante tres meses, se transfirió no selectivamente trozos de tejido a medio de selección. Después de 9 semanas y hasta 21 semanas en la selección, se retiró y aisló los sectores de callo que se encontró que proliferaron contra un fondo de tejido con desarrollo inhibido. El tejido resistente a BASTA®, resultante, fue subcultivado bisemanalmente en medio de selección fresco.

EJEMPLO 6 DESARROLLO DE EMBRIONES SOMÁTICOS MADUROS. Y REGENERACIÓN DE PLANTAS TRANSGÉ ICAS De estos cultivos transformados de manera estable, se indujo a desarrollarse embriones somáticos, como embriones de semilla, mediante el callo embríógeno en desarrollo, sobre medio basal de Murashige y Skoog, en lo sucesivo denominado medio MS (Murashige y Skoog, Physiol. Plant. (1962) 15: 473-497) que contenía 60 g/L de sacarosa. Se desarrolló el callo durante siete días, y luego se transfirió individualmente los embriones somáticos a medio MS que contenía 60 g/L de sacarosa y 10 µ? de ácido abscísico, en lo sucesivo denominado ABA, durante otros 7 días adicionales. Después de 14 días de maduración, se analizó los embriones somáticos de diferentes líneas transgénicas, en cuanto a la expresión histoquímica del gene GUS, colocándolos en aproximadamente 400 µ?_ de solución de GUS, tal como se describió en la presente, excepto que sin imponer un vacío. Se identificó las líneas que expresan GUS y las líneas que no expresan GUS, y se las transfirió a medios de regeneración. Se inició la regeneración transfiriendo el tejido de callo embriogeno a medio de inducción a base de citocinina, medio MS que contenía 30 g/L de sacarosa, 100 mg/L de mio-inositol, 30 g/L de mannitol, 5 mg/L de 6-bencilaminopurina, en lo sucesivo denominada BAP, 0.025 mg/L de 2,4-D, 30 mg/L de BASTA® y 2.5 g/L de GELRITE a pH 5.7. Se colocó los cultivos en poca luz (1,345.78 lux) durante una semana, y luego una semana en mucha luz (3,498.26 lux). Después de un periodo de inducción de dos semanas, se transfirió no selectivamente el tejido a medio de regeneración libre de hormonas, que fue idéntico al medio de inducción, excepto que carecía de 2,4-D y de BAP, y se mantuvo en mucha luz. Se retiró plántulas (3-5 cm) y se las colocó en tubos de cultivo de 150 x 25 mm que contenían sales de Schenk y Hildebrandt y vitaminas; posteriormente medio SH (Schenk y Hildebrandt (1972), Can. J. Bot., 50: 199-204), 10 g/L de sacarosa, 100 mg/L de mio-inositol y 2.5 g/L de GELRITE, pH 5.8). Se sacrificó por lo menos una plántula individual de cada línea regenerable, para análisis histoquímico de GUS. Se colocó las plántulas intactas (3-10 cm) en tubos de centrífuga cónicos de 15 mL, y se los sumergió en aproximadamente 5-10 mL de regulador de análisis GUS y se incubó como se describió aquí. Se transfirió las plántulas no analizadas a macetas redondas de 12 cm, que contenían aproximadamente 0.25 kg de METRO-MIX 360 (The Scotts Co., Marysville, OH), en el invernadero, tan pronto como exhibieron crecimiento y desarrollaron un sistema de raíz suficiente. Se las desarrolló con un periodo de luz de 16 horas, complementado por una combinación de lámparas de sodio de alta presión y de halogenuro de metal, y se las regó cuando fue necesario con una combinación de tres formulaciones independientes de fertilizante de Peters Excel (Grace. -Sierra Horticultural Products Company, Milpitas, CA, E. U. A.). En la etapa de 6-8 hojas, se trasplantó las plantas de macetas de 19 litros, que contenían aproximadamente 4 kg de METRO-MIX 360, y se las dejó crecer hasta su madurez. Se efectuó el cruzamiento de los regenerantes primarios con la línea de cruce élite OQ414. Se recogió la semilla R aproximadamente seis semanas después de la polinización.

Se sometió a descarga un total de 312 blancos de callo tipo II, con pMipGN350-1 y pMipGP341. Se recuperó treinta y seis aislados de callo, resistentes a Basta®, de la selección; sin embargo, solamente veintinueve fueron inducidos a formar embriones somáticos maduros como se describió aquí. Veinticuatro de esos eventos produjeron algún nivel de tinción de azul, después del análisis histoquímico de GUS, tal como se describe en la presente, que varía desde un azul muy débil hasta un azul índigo intenso. Se regeneró trece de estos expresantes, más un control positivo de maíz ubiquitin/GUS/Nos y un control negativo transgénico (sin GUS). Se regeneró aproximadamente 16 plantas R0 de cada una de estas líneas. Diez de los 13 regenerantes MIP produjeron semilla Ri.

EJEMPLO 7 ANÁLISIS DE GUS DE PLANTAS TRANSGÉNICAS A.- Análisis de GUS de los embriones. Se cosechó embriones de pMipGP341 -06.06, pMipGN350-05.01, pMipGN350-14.01 , 1817-02.11 (control transgénico negativo), Whisker-12.12 y Whisker-12.14 (controles positivos de maíz ubiquitin-GUS), de 10 a 30 días después de la polinización (DAP) a intervalos de cinco días. Se cosechó hasta 10 granos por mazorca en cada cosecha, dependiendo de la semilla fijada de las plantas R0. De acuerdo con el método de Jefferson (1987), Plant Mol. Biol. Rep., 5: 387-405, como se describe aquí, se examinó histoquímicamente los embriones para la expresión de GUS. No se observó expresión de GUS en los embriones del control transgénico negativo (1817-02.11). Inesperadamente, no se detectó GUS en los embriones de los controles de ubiquitin positivos (Whisker-12.12 y Whisker-12.14). Se detuvo el crecimiento de estas plantas y la producción de semilla fue pobre. Sin embargo, cada uno de los tres eventos de ???-sintasa demostró expresión de GUS en los embriones R^ En pMipGP341 -06.06 se observó expresión apenas 10 días después de la polinización. Para los eventos con p350, se detectó GUS primeramente a los 15 DAP. La expresión en todas las líneas continuó hasta la madurez, a los 30 DAP. La segregación siguió generalmente los patrones hereditarios mendelianos. B.- Análisis de GUS en raíces y hojas. Se sacrificó en diferentes etapas de desarrollo dos plantas por evento transgénico, así como dos controles no transformados (OQ414), controles negativos transformados (1817-02 plantas) y controles positivos que expresan GUS impulsado por maíz Ubiquitin (eventos Whisker-12). Se cosechó una planta por evento en las etapas V6 (seis hojas) y VT (cabellos que comienzan a brotar), y se reunió separadamente las hojas y las raíces para su análisis. Adicionalmente se recogió la sexta hoja de varias plantas por evento, en la etapa V6, y se evaluó individualmente en cuanto a la expresión de GUS. No se detectó actividad de GUS en las hojas ni en las raíces de los controles no transformados (OQ414) ni en los controles negativos transformados (1817-02). Se observó expresión de GUS variable, pero significativa, en el control positivo (evento Whisker-12, siete plantas), que varió desde 0.45 a 2.34 ng de equivalente de GUS/ g de proteína en las hojas, y 0.28 a 0.47 en las raíces. Los eventos transgénicos de MIP-sintasa-GUS no demostraron actividad de GUS significativa ni en hojas ni en raíces, lo que lleva a la conclusión de que el promotor de ???-sintasa es específico del embrión.

LI STADO DE S EC U E N C IAS <110i- Armstrong, Katherine Hey, Timothy D Folkerts, Otro Smith, Kelley A Hopkins, Hicolc L <12Ü PROM°TOR DE MIP-SINTASA DEL MAÍZ <130> S0597 <1 0> <141> <150> OS 60/168,612 <151? 1990-12-02 <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1959 <212> DNA <213> Zea mays <220> <221> CDS <222> (137) .. (1699) <40Q> 1 gaattcggca caagcaaagg agcgcggcgg eccctccttc cttcctccca ettetetege 60 gcggcgeteg cttacctcgc ctcgcattcc gttcgagcag gggag ggca gtgagaaggg 120 agggaartaa ggcaag atg tte atc gag age ttc cgc gtc gag age cec cac 172 Met Phe lie Glu Ser Phe Arg Val Slu Ser Pro His 1 5 10 gtg cgg tac gge ceg acg gag ate gag teg gag tac cgg tac gac acg 220 Val Arg Tyr Gly Pro Thr Glu lie Glu Ser Glu Tyr Arg Tyr Asp TJir 15 2(? 25 acg gag c g gtg cac gag gcc aag gac ggc gcc tcc cgc tgg g c gte 268 Thr Glu Leu Val His Glu Ala Lys Asp Gly Ala Ser Arg Trp Val Val 30 35 40 cgc ecc aag tcc gto aag tac aac ttc cgg acc age ace gcg gtc ecc 316 Arg Pro Lys ser Val Lys Tyr Asn Phe Arg thr se* Thr Ala Val Pro 45 50 55 60 aag ette ggg gtc atg ett gtg ggg tgg gga gg aac aac gg tcc acg 364 Lys Leu Gly Val Met Leu Val Gly írp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr 65 70 75 ctg acg gct ggg gtc att gcc aac agg gag ggg are tea tgg gcg acc 412 Leu Thr Ala Gly Val He Ala Asn Arg Glu Cly He Ser Trp Ala Thr 80 B5 90 aag g&c aag 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cttttgecaa acaag^agaa aatggaaccg ctccttaaaa aacoattete 360 acatcgctgg gtgetgaata aaactgaaaa cattagettt ttatagctct cgctctctgc 420 tagtatgtgt tataaaatca ttttaccaat taccttttta aataactgta cgtagttrca 4B0 tcagtagaac tactcacgga gctaaaacaa aaaaagttgt tctactgata aaagcagaga 540 tgatgtatga ccgtgaccgt gagctaaagt ccaaaaaaaa aaactgctcc acaataacga 600 caaaacaaag ttgtattgta tggcctaaat tacagcacac tgacaccaca cgtatattat 660 tctctctcca ttateacagg atgtaactgt aaaaattttg tatgttaaac atttgtagta 720 aatattgcta gcatttacgt ctacggaatt tattgaaaaa atgtagtatt gttttatarca 780 attttaataa aactgtaaat cgtctggctt cgtttctgga tggaggataa atagtgaata 840 cgaatgggaa acaccacaac aaccaregceg ctgegttctg cgaatcacat gagcgatcag 900 tgccttgetg ttccgtgaac ttgcaqgcaa ggacgagagc ctttctgcct ttgcatgcaa 960 ggacaagagt ctttacatgc aaggacaaat aactcccacg cgccccaccg tgctttggca 1020 agecacatgg caceetgccg atcacaattc acaggcccag gcttccggtg gtcgcgtgcc 1080 gtgagtctga caccgcacca catggccgcc gtaggccgtg cctacg acc aaggcgactc 1140 gtgg gccag gctctcggcg gctttggagt cggrgccatg ccgcggggtc cgtggaccgc 1200 tcctaggggc caggacgaag 6tgcaccgca caagcgggcc gcgcgtgact ccgtgaccgt 1260 gaggcgggcg taaccaggag cttccgccac gcttgagacc acgtgacggc gcagaggagc 1320 tccacgcgat caaaagcgcc cgccacttct aaaggtcagg ggtcttgcgt tctgeccctc 1380 gtgettcctt caaattctgg acctagtgga tcaatttacg tacacctcag caaccgatgc 1440 agccagtatg atgagcacga ttgtgacgtg ttgggggtca Cggtcaatgg caaecgagca 1500 cgaattggta gtgtctgc^t tttgtacacg tgatagcatt tgattcgttc atteaatttg 1560 aactgtttaa acttatatat gtagagaaat t gtccaact catgcttaat aaaaagtata 1620 aaacccatcg aatttatgaa ttatgatagc aggtatccta tccattgtca tCgctcacag 1680 tcacagaggt agccactgcc gaeggccgac ggectcccat ttcgctcccc tcctactcct 1740 atgctgcggt eeagcaaaag ttcgggcctt ccggcaatcc gccggcgccc gtcggctcaa 1800 ategcateta ccgcggctag aagctctctc ttcctccctc cgatccggtg gggtccattt 1860 ccttcaat£g tggcagtggc ggtctcgaac cctctataaa tcecccaccc cggacaccct 1920 tccccgacca cacagcccaa caacaaggag cgcggcggcc cctccttcct tcctcccaet 1980 tctetcgcgc ggcgctcgct tacetcgect cgcattccgt tcgagcaggg gagcggcagt 2040 gagaagggag ggaattaagg caaccatgg 2069

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. - Una molécula de ADN aislada, caracterizada porque comprende un promotor de MlP-sintasa.

2. - Una molécula de ADN aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque comprende los pares de bases 7 a 2064 de SEQ ID NO: 2, o un fragmento, una variante genética o una omisión de dicha secuencia, que retiene la capacidad de funcionar como promotor en las células de planta.

3. - Un fragmento, una variante genética o una omisión de la molécula de la reivindicación 2, caracterizados porque comprenden por lo menos 200 pares de bases consecutivos, idénticos a 200 pares de bases consecutivos de la secuencia definida por los pares de bases 7 a 2064 de SEQ ID NO: 2.

4. - Una molécula de ADN aislada, caracterizada porque tiene una porción de nucleótido de 20 pares de bases, de secuencia idéntica a una porción de 20 pares de bases consecutivos de la secuencia señalada en los pares de bases 7 a 2064 de SEQ ID NO: 2.

5. - Una construcción de ADN, caracterizada porque comprende un promotor enlazado operablemente a una secuencia de ácido nucleico heterólogo; donde el promotor se híbrida selectivamente a SEQ ID NO: 2.

6. - Una construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el promotor comprende los pares de bases 7 a 2064 de SEQ ID NO: 2.

7. - Un método para expresar una secuencia de ácido nucleico heterólogo en una planta, caracterizado porque comprende: a) introducir en una célula de planta un vector que comprende un promotor de MlP-sintasa, enlazado operablemente a la secuencia de ácido nucleico heterólogo; y b) regenerar una planta a partir de esa célula.

8. - Un método para producir semilla, caracterizado porque comprende: a) introducir en una célula de planta un vector que comprende un promotor de MlP-sintasa, enlazado operablemente a una secuencia de ácido nucleico heterólogo; b) regenerar una planta a partir de esa célula; y c) transmitir sexualmente el promotor de MlP-sintasa, enlazado operablemente a la secuencia de ácido nucleico heterólogo, a la progenie.

9. - El método para producir semilla de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque incluye el paso adicional de recolectar la semilla producida por dicha progenie.

10. - Una planta transformada, caracterizada porque comprende por lo menos una célula de planta que contiene una construcción de ADN de la reivindicación 5.

11. - Semilla o grano que contiene una construcción de ADN de la reivindicación 5.