JP3961566B2 - 植物の形質転換に用い得るキメラ遺伝子中で調節成分として作用し得る単離されたdna配列 - Google Patents
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Description
1種以上の遺伝子成分の発現に係わる種々の表現型特性を植物のゲノム中に組み込み、それによってこれらのトランスジェニック植物に有利な農学特性を付与することができる。該特性としては、非限定的に、植物に有害な植物保護生成物に対する耐性、食事療法用又は薬理用物質の製造を挙げることができる。これらの種々の特性をコードする遺伝子成分の単離及び特性決定に加えて、適切な発現が確実に行われるようにしなければならない。この適切な発現は、質的レベルの場合も量的レベルの場合もあり得る。質的レベルは、例えば空間レベル:特定の組織における優先的発現又は時間レベル:誘発性発現のレベルであり、量的レベルは、導入された遺伝子の発現産物の蓄積量のレベルである。この適切な発現は、大部分、特に量的及び質的成分に関してトランスジーン(変異遺伝子)に係わる調節遺伝子成分の存在に依存する。科学文献においては、この適切な調節を確実にする主要成分のうちでは、単一又は組み合わせ同種又は異種プロモーター成分の使用が広く記載されている。トランスジーンの下流の調節成分は、トランスジーンの発現の質及び量に関する該成分の役割を予想せずに、トランスジーンの転写プロセスを停止させ得る境界を設定するという目的のためのみに用いられた。
本発明は、調節成分として植物遺伝子から単離されたイントロン1の使用、イントロン1を含む新規なキメラ遺伝子の使用、及び植物を形質転換させるための該遺伝子の使用に関する。本発明は、植物の形質転換に用い得るキメラ遺伝子中で調節成分として作用し、特に植物の急速に成長する領域中でキメラ遺伝子の翻訳産物を発現させ得る、単離されたDNA配列に関する。該配列は、キメラ遺伝子の転写方向に、植物のヒストン遺伝子の非コード5′領域の第1イントロン(イントロン1)のような少なくとも1つのイントロンを含む。より特定的に言えば、本発明は、調節成分としてのイントロン1と同じ植物遺伝子から単離されたプロモーターとの同時使用に関する。該同時使用により、遺伝子を調節するためのこれらの成分の制御下に、量的及び質的なトランスジーンの適切な発現が可能になる。本発明を用いることにより得られるこの適切な発現は、農産物の病原性物質に対する耐性、植物に有害な植物保護生成物に対する耐性、食事療法用又は薬理用物質の製造のような特性に関連し得る。特に、植物の急速成長領域でキメラ遺伝子の発現産物を質的及び量的に優先的に発現させることにより、トランスジェニック植物に高除草剤耐性を付与することができる。除草剤耐性を得るための該遺伝子のこの特定の適切な発現は、プロモーター調節成分と、調節成分として「H3.3−様」タイプのヒストン遺伝子の少なくとも1個のイントロン1とを同時使用することにより得られる。そのような発現パターンは、上記特性の全てに関して、高除草剤耐性の付与に用いられる調節成分によって得ることができる。本発明はさらに、これらの遺伝子を用いて形質転換された植物細胞、これらの細胞から再生された形質転換植物、及びこれらの形質転換植物を用いた交配由来の植物に関する。
農産物の保護に用いられる植物保護生成物のうち、浸透性(systemic)生成物は、それらが施用後に植物中で運搬され、なかには、急速に成長する部分、特に茎及び根の先端に蓄積され、除草剤の場合には、感受性植物を劣化させ、最終的に破壊させるものもあることを特徴とする。このタイプの挙動を示す数種の除草剤の場合、一次作用モードは公知であり、該モードは、標的植物の正常な生育に必要な化合物の生合成経路に係わる酵素の不活化に起因する。これらの生成物の標的酵素は、種々のサブ細胞コンパートメントに存在し得るが、公知生成物の作用モードを観察すると、該酵素はしばしばプラスチドコンパートメントに存在することが示される。
この除草剤群に属する生成物に対する感受性植物の耐性、及びその一次標的は公知であり、それらは、植物のゲノムに、この遺伝子の発現産物の除草剤による阻害特性に関して変異させるか又は変異させていない、任意の植物遺伝子起源の標的酵素をコードする遺伝子を安定に導入することにより得ることができる。別の方法は、感受性植物のゲノムに、植物の生育に対して不活性且つ無毒性の化合物中に除草剤を代謝し得る酵素をコードする植物遺伝子起源の遺伝子を安定に導入することを含む。後者の場合には、除草剤の標的を特性決定する必要はない。
処理された植物中でのこのタイプの生成物の分散及び蓄積モードがわかれば、これらの生成物が蓄積する植物の急速成長領域における該生成物の優先的発現及び蓄積を可能にするように、これらの遺伝子の翻訳産物を発現させることができるのは有利である。さらに、これらの生成物の標的が細胞質以外の細胞コンパートメントに存在する場合、これらの遺伝子の翻訳産物を、適切なコンパートメント、特にプラスチドコンパートメント中に耐性付与タンパク質を誘導し得るポリペプチド配列を含む前駆体の形態で発現させ得ることは有利である。
この方法を示す例としては、ホスホノメチルグリシンファミリーの広域浸透性除草剤であるグリホサート、スルホサート(sulfosate)又はホサメチン(fosametine)を挙げることができる。該除草剤は、実質的に、5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS,EC 2.5.1.19)のPEP(ホスホエノールピルベート)に対する競合的阻害剤として作用する。植物に該除草剤を施用すると、該除草剤は植物中で運搬され、急速に成長する部分、特に、茎及び根の先端に蓄積され、感受性植物を劣化させ、破壊に至らせる。
これらの生成物の主要標的であるEPSPSは、プラスチドコンパートメントに存在する芳香族アミノ酸の生合成経路の酵素である。この酵素は、1個以上の核遺伝子によりコードされ、細胞質前駆体の形態で合成され、次いで、プラスチド中に運搬され、そこで成熟形態で蓄積される。
植物のグリホサート及び該生成物ファミリーに対する耐性は、植物のゲノムに、植物又は細菌由来のEPSPS遺伝子を、該遺伝子産物のグリホサートに阻害特性に関して変異させるか又は変異させずに安定に導入することにより得られる。グリホサートの作用モードがわかれば、この遺伝子の翻訳産物を、プラスチドや生成物が蓄積する植物の急速成長植物領域中でグリホサートが高度に蓄積されるように発現させ得ることは有利である。
例えば、米国特許第4,535,060号から、EPSPSをプラスチドコンパートメントに挿入した後で、植物のゲノム中に、EPSPSの競合的阻害剤(グリホサート)に対する耐性を高める少なくとも1つの変異を保有する該酵素をコードする遺伝子を導入することにより、植物に、上記タイプの除草剤、特に、N−ホスホノメチルグリシン又はグリホサートに対する耐性を付与することは公知である。しかし、これらの方法には、農業条件下にこれらの生成物で処理したこれらの植物を使用する際にさらに信頼性を高めるための改良を加える必要がある。
本明細書において、「植物」とは、光合成し得る分化した多細胞生物体を意味し、「植物細胞」とは、植物を起源とし、カルスのような未分化組織、又は胚、植物の一部若しくは種子のような分化組織を構成し得る細胞を意味するものとする。「調節成分としてのArabidopsisのイントロン1」とは、コード部分の上流に位置するか又は転写遺伝子の構造部分に対応する長さが異なる単離DNA配列を意味するものとする。除草剤耐性遺伝子とは、除草剤による阻害特性に関して任意に1つ以上の変異を有する除草剤の標的酵素、又は除草剤を、植物に対して不活性且つ無毒性である化合物に代謝し得る酵素をコードする任意の植物遺伝子を起源とする任意の遺伝子を意味するものとする。植物の急速に成長する領域とは、実質的な細胞の増殖座である領域、特に頂点領域を意味するものとする。
本発明は、これらの生成物に対する耐性遺伝子を含む新規なキメラ遺伝子を用いて形質転換した細胞を再生させることにより、処理された植物の急速成長領域に蓄積する除草剤に対する耐性が高められた形質転換植物の作出に関する。本発明の主題はさらに、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対する耐性遺伝子を含む新規なキメラ遺伝子を用いて形質転換した細胞を再生させることによる、該除草剤に対する耐性が高められた形質転換植物の作出に関する。さらに本発明は、これらの新規なキメラ遺伝子、これらの植物の急速成長部分における耐性が良好であるためにより耐性が高められた形質転換植物、及びこれらの形質転換植物を用いた交配由来の植物に関する。植物のヒストンの新規なイントロン1、及び上記キメラ遺伝子を構築するための調節領域としての該イントロンの使用も本発明の主題である。
より特定的に言えば、本発明の主題は、転写方向順に、プロモーター成分、シグナルペプチド配列、ホスホノメチルグリシンファミリー生成物に対して耐性の酵素をコードする配列、及び調節成分を含む、特にEPSPSを標的とする除草剤に対する高耐性を植物に付与するキメラ遺伝子であり、該調節成分は、その起源である遺伝子中の初期配向に対して任意の配向の植物ヒストン遺伝子のイントロン1のフラグメントを含み、それによって前記除草剤の蓄積領域における除草剤耐性タンパク質の優先的発現及び蓄積を可能にすることを特徴とする。
本発明のイントロン1が由来するヒストン遺伝子は、例えば、コムギ、トウモロコシ又はコメのような単子葉植物か、又は好ましくは、例えば、アルファルファ、ヒマワリ、ダイズ、西洋アブラナ、好ましくはArabidopsis thalianaのような双子葉植物由来である。「H3.3−様」タイプのヒストン遺伝子を用いるのが好ましい。
シグナルペプチド配列には、転写方向順に、ポリペプチドのプラスチドへの運搬を誘導するシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の少なくとも1つのシグナルペプチド配列、第1のシグナルペプチドをタンパク質分解酵素で切断したときに生成する植物遺伝子の成熟N末端部位配列の一部、及びポリペプチドのプラスチドのサブコンパートメントへの運搬を誘導するシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の第2のシグナルペプチドを含む。該シグナルペプチド配列は、ヨーロッパ特許出願PCT508909号に記載の、リブロース−1,5−ビスリン酸カルオキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCo)の小型サブユニット遺伝子由来であるのが好ましい。この特定の遺伝子の役割は、プラスチドコンパートメントに、最大効率で、好ましくは天然形態で、成熟ポリペプチドを発現させることである。
本発明のキメラ遺伝子に用い得るコード配列は、任意の植物遺伝子起源の除草剤耐性遺伝子由来である。該配列は、特に、グリホサートに対する耐性を有する変異EPSPSの配列であってよい。
ヨーロッパ特許出願PCT507698号に記載のプロモーター成分は、単一、重複又は組み合わせ形態の植物中で天然に発現した遺伝子、即ち、例えば、ノパリン合成遺伝子のような細菌由来の遺伝子、カリフラワーモザイクウイルスの35S転写体のようなウイルス由来の遺伝子、好ましくは、リブロース−1,5−ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼの小型サブユニット由来の遺伝子若しくは植物のヒストン遺伝子由来の遺伝子、好ましくはArabidopsis thaliana由来の遺伝子のような植物由来の遺伝子中の任意の起源のものであってよい。「H4」タイプのヒストン遺伝子を用いるのが好ましい。
本発明のキメラ遺伝子は、上記必須部分の他に、プロモーター領域とコード領域の間及びコード領域とイントロン1の間の非翻訳中間領域(リンカー)を含み得、該領域は任意の植物遺伝子起源のものであってよい。
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明をいくつかの態様:本発明のイントロンの単離、植物の遺伝子形質転換及びこれらのイントロンを用いて形質転換した植物の異種遺伝子発現の改良された特性における該イントロンの使用に限定するものではない。「Current Protocols in Molecular Biiology」は、Greene Publishing Associates及びwiley Interscience(1989)により出版されたF.M.AusubelらのCPMBの第1巻及び第2巻を引用したものである。
実施例1:
1. Arabidopsis thaliana由来のEPSPSフラグメントの作成
(a)Arabidopsis thaliana由来のEPSPS遺伝子〔H.J.Kleeら(1987)Mol.Gen.Genet.,210,437−442〕配列から、それぞれ以下の配列:
を有する2つの20マーオリゴヌクレオチドを合成した。これら2つのオリゴヌクレオチドは、収斂配向の、公表配列のそれぞれ1523〜1543及び1737〜1717位に対応する。
(b)Arabidopsis thaliana(変種コロンビア)由来の全DNAはClontech(カタログ番号:6970−1)から得た。
(c)50ng(ナノグラム)のDNAを300ngのオリゴヌクレオチドと混合し、Perkin−Elmer9600装置を用い、供給業者により推奨された増幅用の標準媒体条件下に35回の増幅サイクルにかける。得られた204bpのフラグメントは、Arabidopsis thaliana由来のEPSPSフラグメントを構成する。
2. BMSトウモロコシ細胞系由来のcDNAライブラリーの構築
(a)濾過した細胞5gを液体窒素中で粉砕し、Shureらにより記載された方法に以下の変更を加えて全核酸を抽出する:
− 溶解緩衝液のpHをpH=9.0に調製する;
− イソプロパノールで沈降させた後、ペレットを水に入れ、溶解させた後、2.5M LiClに調製する。0℃で12時間インキュベーションした後、4℃で15分間30,000gで遠心してペレットを再溶解させる。次いで、LiCl沈降段階を繰り返す。再溶解したペレットは全核酸のRNA画分を構成する。
(b)「Current Protocols in Molecular Biology」に記載のようにオリゴ−dTセルロースカラム上のクロマトグラフィーにかけて、RNA画分のRNA−ポリA+画分を得る。
(c)EcoRI合成末端を有する二本鎖cDNAの合成:
該合成は、該合成に必要なInvitrogen社製の「コピーキット」の形態の種々の試薬の供給業者の手順に従って行う。
それぞれ以下の配列:
を有する二本鎖オリゴヌクレオチド及び部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを、平滑末端を有する二本鎖cDNAと連結する。
このアダプターの連結により、二本鎖cDNAに結合したSmaI部位と、二本鎖cDNAの各末端が付着性形態のEcoRI部位が形成される。
(d)ライブラリーの形成:
各末端に付着性の合成EcoRI部位を有するcDNAを、EcoRIで切断したλ gt10バクテリオファージcDNAに連結し、供給業者であるNew England Biolabsの手順に従って脱リン酸化する。
連結反応から得られたアリコートをキャプシド封入抽出物:供給業者の指示によるGigapack Goldを用いてin vitroでキャプシド封入し、細菌、E.coli c600hflを用いて該ライブラリーを滴定する。そのようにして得られたライブラリーを増幅し、上記供給業者の指示に従って保存する。該ライブラリーはBMSトウモロコシ細胞懸濁液由来のcDNAライブラリーを構成する。
3. BMSトウモロコシ細胞懸濁液から得たcDNAライブラリーの、Arabidopsis thaliana由来のEPSPSプローブでのスクリーニング踏襲する操作は、“Current Protocols in Molecular Biology”の操作とする。要約すると、約106個の組み換えファージを平均密度100/cm2でLBプレート上に播種する。溶解(lysis)プラークを、Amershamから入手したHybond N膜上で二重に複製する。
DNAを1600kJ UV処理によってフィルターに固定した(Stratageneから入手したStratalinker使用)。フィルターを6×SSC/0.1% SDS/0.25[laouna]脱脂粉乳中で65℃で2時間プレハイブリダイズした。Arabidopsis thaliana由来のEPSPSプローブを、供給元の指示に従いランダムプライミングを行なうことにより32P−dCTPで標識した(Pharmaciaから入手したKit Ready to Go使用)。得られた比活性は断片1μg当たり約108cpmである。100℃で5分間変性後、プローブをプレハイブリダイゼーション培地に添加し、ハイブリダイゼーションを55℃で14時間継続する。フィルターを、Kodak XARSフィルム及びAmershamから入手した増感紙Hyperscreen RPNを用いて−80℃で48時間X線間接撮影する。フィルター上の陽性スポットを、該スポットを得たプレートと位置合わせすることによって前記プレートから、Arabidopsis thaliana由来のEPSPSプローブとのハイブリダイゼーションに関して陽性の応答を示すファージに対応する区域を収集することができる。播種、転写、ハイブリダイゼーション及び回収を行なうこのステップを、連続的に精製されたファージのプレートのあらゆるスポットがハイブリダイゼーションにおいて100%陽性であると判明するまで繰り返す。その後、独立のファージ1個当たりの溶解プラークを稀釈λ培地(トリス−Cl pH=7.5; 10mM MgSO4; 0.1M NaCl; 0.1%ゼラチン)中に回収する。得られた溶解ファージは、BMSトウモロコシ細胞懸濁液由来の陽性EPSPSクローンである。
4. BMSトウモロコシ細胞懸濁液由来のEPSPSクローンのDNAの調製及び解析
OD 2(600nm/ml)において20mlのC600hf1細菌に約5×108個のファージを添加し、これを37℃で15分間インキュベートする。得られた懸濁液を1l容の三角フラスコ内で200mlの細菌用増殖培地で稀釈し、回転振盪機で250rpmで振盪する。約4時間振盪後、高密度で存在する細菌の溶解に対応して生起する培地の清澄化によって溶解を観察する。次に、上清を“Current Protocols in Molecular Biology”に述べられているように処理する。得られたDNAはBMSトウモロコシ細胞懸濁液由来のEPSPSクローンに対応する。
1〜2μgの上記DNAをEcoRIで切断し、0.8% LGTA/TBEアガロースゲル上で分離する(CPMB参照)。最終的な証明は、精製DNAがArabidopsis thaliana由来のEPSPSプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを実際に示すことの確認によって行なう。電気泳動後、DNA断片を“Current Protocols in Molecular Biology”に記載されているサザン法に従い、Amershamから入手したHybond N膜上に転写する。フィルターを、先の第3節に述べた条件に従い、Arabidopsis thaliana由来のEPSPSプローブとハイブリダイズさせる。Arabidopsis thaliana由来のEPSPSプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを示し、かつ最長のEcoRI断片を有するクローンは約1.7kbpのゲル推定寸法を有する。
5. pRPA−ML−711クローンの製造
1.7kbp挿入部分を有するファージクローンから得た10μgのDNAをEcoRIで消化し、0.8% LGTA/TBEアガロースゲル上で分離する(CPMB参照)。1.7kbp挿入部分を含むゲル片をBET染色によってゲルから切り出し、得られた切片をβ−アガロースで、製造元New England Biolabsの指示に従い処理する。1.7kbp断片から精製したDNAを、“Current Protocols in Molecular Biology”に記載されている連結法に従い、EcoRIで切断したプラスミドpUC19(New England Biolabs)由来のDNAと12℃で14時間連結する。このようにして得られた連結混合物2μlを用いて1アリコートのエレクトロコンピテント大腸菌DH1OBを形質転換し、この形質転換は次の条件を用いるエレクトロポレーションによって行なう。コンピテント細菌と連結培地との混合物を、予め0℃に冷却した0.2cm厚のエレクトロポレーションキュベット(Biorad)内に導入する。エレクトロポレーター(Biorad社商標)を用いる場合の物理的エレクトロポレーション条件は、2500V、25μF及び200Ωである。これらの条件の下で、平均コンデンサー放電時間は約4.2ミリ秒である。次に、細菌を1mlのSOC培地(CPMB参照)中に取り、これを15ml容のCorning管に入れて、回転振盪機で200rpmで1時間振盪する。100μg/mlのカルベニシリンを補充したLB/寒天培地上への播種後、37℃で一晩増殖させた細菌クローンのミニ調製を“Current Protocols in Molecular Biology”に記載されている操作に従って行なう。EcoRIでのDNA消化、及び0.8% LGTA/TBEアガロースゲル上での電気泳動による分離(CPMB参照)後、1.7kbp挿入部分を有するクローンを保存する。最終的な証明は、精製DNAがArabidopsis thaliana由来のEPSPSプローブとのハイブリダイゼーションシグナルを実際に示すことの確認によって行なう。電気泳動後、DNA断片を“Current Protocols in Molecular Biology”に記載されているサザン法に従い、Amershamから入手したHybond N膜上に転写する。フィルターを、先の第3節に述べた条件に従い、Arabidopsis thaliana由来のEPSPSプローブとハイブリダイズさせる。1.7kbp挿入部分を有し、かつArabidopsis thaliana由来のEPSPSプローブとハイブリダイズするプラスミドクローンを比較的大規模に調製し、細菌の溶解の結果得られるDNAを“Current Protocols in Molecular Biology”に述べられているようにCsCl勾配上で精製した。精製DNAをPharmaciaキットで、製造元の指示に従い、かつプライマーとして同じ製造元が指定する順方向及び逆方向M13ユニバーサルプライマーを用いて部分的に配列決定した。得られた部分配列は約0.5kbpにわたる。成熟タンパク質の領域の推定アミノ酸配列(約50アミノ酸残基)は、米国特許第4,971,908号に開示された成熟トウモロコシEPSPSの対応するアミノ酸配列と100%の同等性を示す。BMSトウモロコシ細胞懸濁液から得られる、EPSPSをコードするDNAの1.7kbp EcoRI断片に対応するこのクローンをpRPA−ML−711と命名した。このクローンの完全配列は、Pharmaciaキットの操作を用いること、及び約250bp毎に相補的であり、また逆方向に向くオリゴヌクレオチドを合成することにより、両鎖において得られた。得られた1713bpクローンの完全配列を、配列番号1に示す。
6. クローンpRPA−ML−715の製造
クローンpRPA−ML−711の配列解析、特に推定アミノ酸配列のトウモロコシ由来アミノ酸配列との比較は、トウモロコシEPSPSの成熟部分のNH2末端アラニンをコードするGCGコドン(米国特許第4.971,907号)の上流での92bpの配列延長を示している。同様に、トウモロコシEPSPSの成熟部分のCOOH末端アスパラギンをコードするAATコドン(米国特許第4.971,907号)の下流には288bPの延長が観察される。これら二つの延長部分のうち、NH2末端延長部分はプラスチド配置前のシグナルペプチドの配列の一部に対応するかもしれず、またCOOH末端延長部分はcDNAの非翻訳3′領域に対応するかもしれない。
米国特許第4,971,908号に開示されたトウモロコシEPSPSのcDNAの成熟部分をコードするcDNAを得るべく、次の操作を行なった。
a) 非翻訳3′領域の除去: pRPA−ML−712の構築
クローンpRPA−ML−711を制限酵素AseIで切断し、この切断によって得られた末端を、CPMBに記載された操作に従いDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントで処理することにより平滑化した。次に、制限酵素SacIIでの切断を行なった。これらの操作の結果得られたDNAを1% LGTA/TBEアガロースゲル上での電気泳動によって分離した(CPMB参照)。
0.4kbpの挿入部分「AseI−平滑末端/SacII」を含むゲル片をゲルから切り出し、先の第5節に述べた操作に従って精製した。クローンpRPA−ML−711のDNAをクローニングベクターpUC19のポリリンカーに位置する制限酵素HindIIIで切断し、この切断の結果得られた末端をDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントで処理することにより平滑化した。次に、制限酵素SacIIでの切断を行なった。これらの操作の結果得られたDNAを0.7% LGTA/TBEアガロースゲル上での電気泳動によって分離した(CPMB参照)。
3.7kbpの挿入部分「HindIII−平滑末端/SacII」を含むゲル片をゲルから切り出し、先の第5節に述べた操作に従って精製した。
上記二つの挿入部分を連結し、2μlの連結混合物を用いて大腸菌DH1OBを、先の第5節に述べたように形質転換した。
様々なクローンのプラスミドDNA含有率を、pRPA−ML−711に関して述べた操作に従い解析した。保持されたプラスミドクローンのうちの或るものは、約1.45kbpのEcoRI−HindIII挿入部分を有する。このクローンの末端の配列は、挿入部分の5′末端がpRPA−ML−711の対応する末端に厳密に対応し、3′末端は次の配列
を有することを示している。
下線を付した配列はCOOH末端アミノ酸のアスパラギンのコドンに対応し、次のコドンは翻訳終結コドンに対応する。下流のヌクレオチドはpUC19のポリリンカーの配列成分に対応する。pRPA−ML−711の配列を成熟トウモロコシEPSPSの翻訳終結部位まで含み、その後にpUC19のポリリンカーの配列をHindIII部位まで含むこのクローンを、pRPA−ML−712と命名した。
b) pRPA−ML−712の5′末端の修飾: pRPA−ML−715の構築
クローンpRPA−ML−712を制限酵素PstI及びHindIIIで切断した。これらの操作の結果得られたDNAを0.8% LGTA/TBEアガロースゲル上での電気泳動によって分離した(CPMB参照)。1.3kbpのPstI/EcoRI挿入部分を含むゲル片をゲルから切り出し、先の第5節に述べた操作に従って精製した。得られた挿入部分を、各等モル量の、配列
を有する二つの部分相補的オリゴヌクレオチドの存在下、並びに制限酵素BamHI及びHindIIIで消化したプラスミドpUC19由来のDNAの存在下に連結した。
2μlの連結混合物を用いて大腸菌DH1OBを、先の第5節に述べたように形質転換した。様々なクローンのプラスミドDNA含有率を、先の第5節に述べた操作に従い解析後、約1.3kbpの挿入部分を有するクローンの一つを後の解析用に保存した。保持されたクローンの5′末端の配列は、この領域のDNA配列が次のような配列であることを示している。即ち、pUC19のポリリンカーの配列のEcoRI部位からBamHI部位までに、クローニングの際に用いたオリゴヌクレオチドの配列が続き、これに、pRPA−ML−712に存在する配列の残りの部分が続く配列である。このクローンをpRPA−ML−713と命名した。このクローンは成熟EPSPシンターゼのN末端アラニンコドンの上流に、NcoI部位に含まれるメチオニンコドンATGを有する。更に、N末端のアラニン及びグリシンコドンが保存されているが、これらは第三の可変塩基に修飾を受けており、即ち最初のGCGGGTがGCCGGCとなっている。
クローンpRPA−ML−713を制限酵素HindIIIで切断し、この切断の結果得られた末端をDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントで処理することにより平滑化した。次に、制限酵素SacIでの切断を行なった。これらの操作の結果得られたDNAを0.8% LGTA/TBEアガロースゲル上での電気泳動によって分離した(CPMB参照)。1.3kbpの挿入部分「HindIII−平滑末端/SacI」を含むゲル片をゲルから切り出し、先の第5節に述べた操作に従って精製した。得られた挿入部分を、制限酵素XbaIで消化し、かつこの切断の結果得られた末端をDNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントで処理することにより平滑化したプラスミドpUC19由来のDNAの存在下に連結した。次に、制限酵素SacIでの切断を行なった。2μlの連結混合物を用いて大腸菌DH1OBを、先の第5節に述べたように形質転換した。様々なクローンのプラスミドDNA含有率を、先の第5節に述べた操作に従い解析後、約1.3kbpの挿入部分を有するクローンの一つを後の解析用に保存した。保持されたクローンの末端の配列は、DNA配列が次のような配列であることを示している。即ち、pUC19のポリリンカーの配列のEcoRI部位からSacI部位までに、クローニングの際に用いたオリゴヌクレオチドの配列から先に示したオリゴヌクレオチド1の4bp GATCCが欠失したものが続き、これに、HindIII部位までのpRPA−ML−712に存在する配列の残りの部分、及びpUC19のポリリンカーの配列のXbaI部位からHindIII部位までが続く配列である。このクローンをpRPA−ML−715と命名した。
7. 成熟トウモロコシEPSPSをコードするcDNAの作製
突然変異誘発ステップは総て、Pharmaciaから入手したU.S.E.突然変異誘発キットを製造元の指示どおりに用いて実施した。この突然変異誘発系の原理は次のとおりである。プラスミドDNAを熱変性させ、これを、一方では突然変異誘発オリゴヌクレオチドをモル過剰量で存在させ、他方ではポリリンカーに存在するユニークな制限酵素部位の排除を可能にするオリゴヌクレオチドをモル過剰量で存在させて組み換える。再結合ステップ後、相補的鎖の合成を、用意した適当な緩衝液中でT4 DNAリガーゼ及び遺伝子32のタンパク質の存在下にT4 DNAポリメラーゼを作用させることによって行なう。合成産物を、その部位が突然変異誘発によって消失したと推定される制限酵素の存在下にインキュベートする。得られたDNAでの形質転換には、特にmuts突然変異を示す大腸菌株を宿主として用いる。液体培地中での増殖後、プラスミドDNA全体を調製し、先に用いた制限酵素の存在下にインキュベートする。これらの処理後、大腸菌DH1OB株を、形質転換する宿主として用いる。単離クローンのプラスミドDNAを調製し、導入した突然変異の存在を配列決定によって調べる。
A) トウモロコシEPSPSの、EPSPシンターゼ活性の競合的阻害剤である生成物に対する耐性に先天的に影響しない部位または配列修飾: pRPA−ML−715からの内部NcoI部位の排除
pRPA−ML−715の配列を、N末端アラニンコドンGCCの第一の塩基を1位とすることにより任意に番号付けする。この配列は1217位にNcoI部位を有する。部位修飾オリゴヌクレオチドは、配列
を有する。
先に挙げた参考文献に従い配列決定すると、突然変異誘発後の配列は用いたオリゴヌクレオチドの配列に対応する。NcoI部位は実際に排除され、この領域におけるアミノ酸への翻訳はpRPA−ML−715に存在する最初の配列を保存する。
このクローンをpRPA−ML−716と命名した。
このクローンの1340bp配列を、配列番号2及び3に示す。
B) トウモロコシEPSPSの、EPSPシンターゼ活性の競合的阻害剤である生成物に対する耐性の向上を可能にする配列修飾
次のオリゴヌクレオチドを用いた。
a) Thr 102→Ile突然変異
b) Pro 106→Ser突然変異
c) Gly 101→Ala及びThr 102→Ile突然変異
ATTG−3′
d) Thr 102→Ile及びPro 106→Ser突然変異
配列決定を行なってみると、突然変異誘発後に得られる三つの突然変異断片の配列は親DNA pRPA−ML−716の配列と、用いた突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列に対応する突然変異誘発領域以外同等である。これらのクローンを、Thr 102→Ile突然変異によって得られたものはpRPA−ML−717、Pro 106→Ser突然変異によって得られたものはpRPA−ML−718、Gly 101→Ala及びThr 102→Ile突然変異によって得られたものはpRPA−ML−719、Thr 102→Ile及びPro 106→Ser突然変異によって得られたものはpRPA−ML−720と命名した。
pRPA−ML−720の1340bp配列を、配列番号4及び5に示す。
1395bpのNcoI−HindIII挿入部分を、本明細書では以後「トウモロコシEPSPSの二重突然変異体」と呼称する。
実施例2: キメラ遺伝子の構築
本発明によるキメラ遺伝子の構築を、次の要素を用いて行なう。
1) 「H3.3様」の遺伝子を2個有する、Arabidopsis thaliana由来のゲノムクローン(コスミドクローンc22)を、Charbet等(J. Mol. Diol. 225, pp.569−574,1992)が述べているようにして単離した。
2) 第1イントロン
コスミドクローンc22を制限酵素DdeIで消化し、次いで末端を平滑化したDNA断片を創出するべく大腸菌由来のDNAポリメラーゼのKlenowフラグメントで製造元の指示に従い処理し、その後MseIで切断することによって418塩基対のDNA断片を精製する。精製DNA断片を、次の配列
アダプター1:
を有する合成オリゴヌクレオチドアダプターに連結する。
連結生成物を、SmaIで消化したpGEM7Zf(+)(Stratageneカタログ番号第P2251号)中へクローン化する。「第1イントロン」と呼称するこのクローンを配列決定によって確認する(配列番号6)。
3) 第2イントロン
コスミドクローンc22を制限酵素AluI及びCfoIで消化することによって494塩基対のDNA断片を精製する。精製DNA断片を、次の配列
アダプター2:
を有する合成オリゴヌクレオチドアダプターに連結する。
連結生成物を、SmaIで消化したpGEM7Zf(+)(Stratageneカタログ番号第P2251号)中へクローン化する。「第2イントロン」と呼称するこのクローンを配列決定によって確認する(配列番号7)。
4) pRA−1
このプラスミドの構築はフランス特許第9,308,029号に開示されている。このプラスミドは、大腸菌β−グルコロニダーゼ遺伝子の合成、及びノパリンシンターゼ(NOS)ポリアデニル化部位の合成を調節するArabidopsis属由来のヒストンプロモーターH4A748を有するpBI101.1(Clontechカタログ番号第6017−1号)の誘導体である。即ち、構造「H4A748プロモーター−GUS遺伝子−NOS」を有するキメラ遺伝子が得られる。
5)pCG−1
このプラスミドは、pRA−1のH4A748プロモーターとGUSコード領域の間に上記イントロンNo.1を含む。このプラスミドは、BamHIとSmaIによるコスミドクローンC22の消化で得られる。418塩基対のイントロンNo.1は、BamHIとSmaIによって消化されたpRA−1に直接連結される。
即ち、“H4A748プロモーター−イントロンNo.1−GUS遺伝子−NOS”という構造を有するキメラ遺伝子が得られる。
6)pCG−13
このプラスミドは、pRA−1のH4A748プロモーターとGUSコード領域の間に上記イントロンNo.2を含む。このプラスミドは、BamHIとSmaIによるコスミドクローンc22の消化によって得られる。494塩基対のイントロンNo.2を、BamHIとSmaIによって消化したpRA−1に直接連結させる。
即ち、“H4A748プロモータ−イントロンNo.2−GUS遺伝子−NOS”という構造を有するキメラ遺伝子が得られる。
7)pCG−15
このプラスミドは、pCG−1のH4A748プロモーターとGUSコード領域の間の上記GUSコード配列の前にイントロンNo.1だけを含む。このプラスミドは、BamHIとHindIIIによるpCG−1の消化、次に平滑末端DNA断片を作出するために製造業者の指示に従い、E.coliからのDNAポリメラーゼのクレノー断片による処理によって得られる。
このベクターを再連結し、“イントロンNo.1−GUS−NOG”という構造を有するキメラ遺伝子が得られる。
8)pCG−18
このプラスミドは、pCG−13のGUSコード配列の前に上記イントロンNo.2だけを含む。このプラスミドは、BamHIとSphIによるpCG−13の部分消化、次に、平滑末端DNA断片を作出するために、製造業者の指示に従い、T4ファージDNAポリメラーゼ断片による処理によって得られる。
次にこのベクターを再連結し、“イントロンNo.2−GUS−NOS”という構造を有するキメラ遺伝子を得るために、酵素消化でチェックする。
9)pRPA−RD−124
トウモロコシ二重突然変異EPSPS遺伝子(Thr102→Ile及びPro106→Ser)を含むクローニングカッセトの作出による、pRPA−ML−720への“nos”ポリアデニル化シグナルの付加。平滑末端を作出するために、pRPA−ML−720をHindIIIで消化し、E.coliからのDNAポリメラーゼのクレノー断片で処理する。第2の消化をNcoIで行い、EPSPS断片を精製する。次に、EPSPS遺伝子を、精製pRPA−RD−12(ノパリン合成酵素ポリアデニル化シグナルを含むクローニングカセット)と連結し、pRPA−RD−124を得る。精製した有用なベクターpRPA−RD−12を得るために、後者を前もってSalIで消化し、クレノーDNAポリメラーゼで処理し、次にNcoIによる2回目の消化を行うことが必要であった。
10)pRPA−RD−125
プラスミド上で標的化されたEPSPS遺伝子を含むクローニングカセットの作出による、pRPA−RD−124からの最適化されたシグナルペプチド(OSP)の添加。pRPA−RD−7(欧州特許出願公開第652286号)をSphIで消化し、T4DNAポリメラーゼで処理し、次にSpeIで消化し、OSP断片を精製する。NCoIで前もって消化し、クレノーDNAポリメラーゼで処理し、3′突出部分を除去し、次にSpeIで消化したpRPA−RD−124に、このOSP断片をクローンする。次にこのクローンを配列決定し、OSPとEPSPS遺伝子の間の正しい翻訳融合を確認する。それから、pRPA−RD−125を得る。
11)pRPA−RD−196
このプラスミドにおいて、pCG−1の“イントロンNo.1+E.coliからのβ−グルコロニダーゼ遺伝子”部分を、pRPA−RD−125から単離された、最適化シグナルペプチド、二重突然変異EPSPS遺伝子(Ile102+Ser106)及びノパリン合成酵素ポリアデニル化部位(“NOS”)を含む2キロベースのキメラ遺伝子によって置換える。pRPA−RD−196を得るために、EcoRIとBamHIによるpCG−1の消化、続いて、平滑末端DNA断片を作出するために、製造業者の指示に従い、E.coliからのDNAポリメラーゼのクレノー断片で処理を行う。二重突然変異EPSPS遺伝子(Ile102+Ser106)の最適化シグナルペプチドとノパリン合成酵素ポリアデニル化部位(“NOS”を含む2キロベースDNA断片を、NcoIとNotIによる消化、続いて、平滑末端DNA断片を作出するために、製造業者の指示に従い、E.coliからのDNAポリメラーゼの処理によってpRPA−RD−125から得る。次に、この平滑末端断片を上記製造のpCG−1に連結する。
“H4A748プロモーター−OSP−トウモロコシEPSPS遺伝子−NOS”という構造を有するキメラ遺伝子を得る。
12)pRPA−RD−197
このプラスミドにおいて、pCG−1の“E.coliからのβ−グルコロニダーゼ遺伝子”部分を、pRPA−RD−125から単離された、最適化シグナルペプチド、二重突然変異EPSPS遺伝子(Ile102+Ser106)及びノパリン合成酵素ボリアデニル化部位(“NOS”)を含む2キロベースのキメラ遺伝子によって置換える。pRPA−RD−197を得るために、EcoRIによるpCG−1の消化、続いて、平滑末端DNA断片を作出するために、製造業者の指示に従い、E.coliからのDNAポリメラーゼのクレノー断片で処理を行い、次にSmaIで切断する。最適化シグナルペプチド、二重突然変異EPSPS遺伝子(Ile102+Ser106)、及びノパリン合成酵素ポリアデニル化部位(“NOS”)を含む2キロベースDNA断片を、NcoIとNotIによる消化、続いて、平滑末端DNA断片を作出するために、製造業者の指示に従い、E.coliからのDNAポリメラーゼでの処理によってpRPAA−RD−125から得る。次に、この平滑末端断片を上記製造のpCG−1に連結する。
“H4A748プロモーター−イントロンNo.1−トウモロコシEPSPS遺伝子−NOS”という構造を有するキメラ遺伝子を得る。
13)pRPA−RD−198
このプラスミドにおいて、pCG−13の“E.coliからのβ−グルコロニダーゼ遺伝子”部分を、pRPA−RD−125から単離された、最適化シグナルペプチド、二重突然変異EPSPS遺伝子(Ile102+Ser106)及びノパリン合成酵素ポリアデニル化部位(“NOS”)を含む2キロベースのキメラ遺伝子によって置換える。pRPA−RD−198を得るために、EcoRIによるpCG−13の消化、続いて、平滑末端DNA断片を作出するために、製造業者の指示に従い、E.coliからのDNAポリメラーゼのクレノー断片で処理を行い、次にSmaIで切断する。最適化シグナルペプチド、二重突然変異EPSPS遺伝子(Ile102+Ser106)、及びノパリン合成酵素ポリアデニル化部位(“NOS”)を含む2キロベースDNA断片を、NcoIとNotIによる消化、続いて、平滑末端DNA断片を作出するために、製造業者の指示に従い、E.coliからのDNAポリメラーゼでの処理によってpRPAA−RD−125から得る。次に、この平滑末端断片を上記製造のpCG−13に連結する。
“H4A748プロモーター−イントロンNo.2−OSP−トウモロコシEPSPS遺伝子−NOS”という構造を有するキメラ遺伝子を得る。
実施例3:リポーター遺伝子活性の発現
1)形質転換と再生
Bevan M.(1984)Nucl.Acids Res.,12,8711-8721によって記載の方法により、Escherichia coli HB101中の“ヘルパー”プラスミドpRK2013を用い、3親交差により、カタログ(Clontech #6027-1)から得られるAgrobacterium tumefaciens LBS 4404の非腫瘍遺伝子株に、ベクターを導入する。
Arabidopsis thaliana L.-エコタイプC24の根移植片を用いる形質転換技術を、Valvekens D.ら、(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA,85,5536-5540に記載の方法により行った。簡単にいえば、3工程が必要である。即ち、2,4−Dとカイネチンを補充したガンボルグB5培地上でのカルス形成の誘導、2iPとIAAを補充したガンボルグB5培地上での芽の形成、ホルモン無含有MS上での根付きと種子の形成。
2)植物中のGUS活性の測定
a−組織化学的観察
10日目の遺伝子移入植物の組織化学的スポット(Jerfferson R.A.ら、(1987)EMBO J.,6,3901-3907)は、イントロンを含まないプラスミド(pRA−1)と比較して、イントロン配列を含むプラスミド(pCG−1及びpCG−13)のために組織特異的である組織化学的パターンの強度の増加を示す。特に、pCG−1とpCG−13のスポットのパターンは同じであり、構築物pRA−1と比較して、導管組織並びに分裂組織、葉及び根のスポットの強度の増加を示す。イントロンNo.1(pCG−15及びpCG−18)の配列だけを含む構築物は、頂端分裂領域にだけ非常に鮮明な組織化学的スポットを示す。
b−蛍光測定
12植物からのロゼットの花芽と葉芽の抽出物において蛍光によって測定したGUS活性(Jefferson R.A.ら、(1987)EMBO J.,6,3901-3907)は、H4A748プロモーターの活性は、イントロンNo.1と2の影響下で増大していることを示す。構築物pRA−1と比較すると、pCG−1とpCG−13のGUS活性は、花芽で少なくとも6倍、ロゼットの葉で20倍、根で26倍大きい。
制御配列として使用した“H3.3様”タイプのArabidopsisヒストン遺伝子のイントロンNo.1と2は、キメラ遺伝子の発現の活性の増加を誘導することを上記測定は明白に示す。
実施例4:除草剤に対する遺伝子移入植物の耐性
1)形質転換と再生
Bevan M.(1984)Nucl.Acids Res.,12,8711-8721によって記載の方法により、Escherichia coli HB101中の“ヘルパー”プラスミドpRK2013を用い、3親交差により、カタログ(Clontech #6027-1)から得られるAgrobacterium tumefaciens LBS 4404の非腫瘍遺伝子株に、ベクターを導入する。
タバコの葉移植片を用いる形質転換技術は、Horsh R.ら、(1985)Science,227,1229-1231に記載の方法に基づく。葉移植片からのPBD6タバコ(起源SEITA−France)の再生を、スクロース30g/L、カナマイシン200μg/mLを含むMurashigeとSkoog(MS)基礎培地で3つの連続的工程で行う。即ち、最初の工程は、ナフチル酢酸(NAA)0.05mgとベンジルアミノプリン(DAP)2mg/Lを含む、スクロース30gを補充したMS培地上で15日間の発芽の誘導である。この工程で形成される新芽は、スクロース30g/Lを補充するがホルモンを含まないMS培地上で10日間培養することによって発育させる。次に生育した新芽を回収し、1/2に希釈した(塩、ビタミン及び糖の含量の半分を有するが、ホルモンを含まない)MS根用培地で培養する。約15日後、根の生えた若芽を土壌に植える。
2)グリホセートに対する耐性の測定
20個の形質転換植物を再生させ、構築物pRPA−RD−196、pRPA−RD−197、及びpRPA−RD−198の各々のために、温室に移した。これらの植物を温室で、5−葉段階で、ラウンドアップという商品名で市販の除草剤の水懸濁液で処理した(ヘクタール当り活性物質グリホセート0.8kgに対応)。
結果は、処理3週間後、注目した植物毒性値の観察に対応する。これらの条件下、構築物で形質転換した植物は平均して、許容できる耐性(pRPA−RD−196)又は良好な耐性(pRPA−RD−197とpRPA−RD−198)を有するが、非形質転換対照植物は完全に破壊されることが観察される。
これらの結果は、グリホセートへの耐性をコードする同一の遺伝子のために、本発明のキメラ遺伝子の使用によって改善がなされることを明白に示す。
本発明の形質転換植物は、導入されたキメラ遺伝子の発現に対応する表現形質を有する系列とハイブリッドを産生させるために親として用いることができる。
【配列表】
配列番号:1
配列
配列番号:2
配列
配列番号:3
配列
配列番号:4
配列
配列番号:5
配列
配列番号:6
配列
配列番号:7
配列
Claims (14)
- 特に急速に生長する植物の部分で使用でき、発現されるキメラ遺伝子であって、H3.3型植物ヒストン遺伝子の非コード5’領域の最初のイントロン(イントロン1)に相当するイントロンを少なくとも一つ含み、該イントロンが、配列番号6または配列番号7に示す配列からなるDNAであることを特徴とする前記キメラ遺伝子。
- 前記キメラ遺伝子が、植物ヒストン遺伝子のプロモーター配列をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載のキメラ遺伝子。
- プロモーター領域が、請求項1に記載のイントロンと同じ植物ヒストン遺伝子由来であることを特徴とする請求項2に記載のキメラ遺伝子。
- 前記キメラ遺伝子が、除草剤耐性遺伝子をさらに含み、植物に除草剤耐性の増強を付与することができることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
- 除草剤耐性遺伝子が、細胞内コンパートメントで除草剤耐性遺伝子の翻訳産物の蓄積を可能とするシグナルペプチドをコードするDNA配列と融合していることを特徴とする請求項4に記載のキメラ遺伝子。
- シグナルペプチド領域が、プラスチッドコンパートメントで除草剤耐性遺伝子の翻訳産物の蓄積を可能とすることを特徴とする請求項5に記載のキメラ遺伝子。
- シグナルペプチド配列が、転写方向で、プラスチッドへポリペプチドを輸送させるシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の少なくとも一つのシグナルペプチド配列を含み、場合によっては、最初のシグナルペプチドがタンパク質分解酵素によって開裂されたときに産生される植物遺伝子の成熟N末端の配列の一部を含み、更に場合によっては、プラスチッドのサブコンパートメントに該ポリペプチドを輸送させるシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の第2のシグナルペプチドを含むことを特徴とする請求項6に記載のキメラ遺伝子。
- 除草剤耐性遺伝子が、標的がEPSPSである除草剤に活性を有する酵素をコードすることを特徴とする請求項4〜7のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子。
- 除草剤耐性遺伝子が、グリホセートに活性を有する酵素をコードすることを特徴とする請求項8に記載のキメラ遺伝子。
- 植物の形質転換のためのベクターであって、請求項1〜9のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする該ベクター。
- 請求項10に記載のベクターを含むことを特徴とするアグロバクテリウム属の種の株。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする形質転換された植物細胞。
- 請求項12に記載の細胞から得られる形質転換植物又は植物の部分。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子の構築方法であって、請求項1に記載のイントロン、プロモーター配列、シグナルペプチド、及び少なくとも一つのトランス遺伝子を単離し、並びにトランス遺伝子の転写方向に上記順序でそれらを組立てることを特徴とする該方法。
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