KR19990029091A - 식물의 형질전환용으로 사용될 수 있는 키메라 유전자에서조절영역으로 사용할 수 있는 단리 디엔에이 서열 - Google Patents
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Abstract
식물의 형질전환용 키메라 유전가 개시되어 있다. 유전자는 전사방향으로 하나이상의 프로모터 영역, 하나의 트랜스유전자 및 하나의 조절 영역을 포함한다. 상기 조절 영역은 급속한 성장 영역에서 단백질의 발현을 가능케하는 식물의 히스톤 유전자의 비코딩 5' 영역에서 하나이상의 인트론 1 로 구성된다.
Description
본 발명은 전사된 식물 유전자로부터 단리된 조절 요소, 이들을 함유하는 신규 키메라 유전자의 용도 및 식물의 형질 전환을 위한 그들의 용도에 관한 것이다.
하나 이상의 유전자 인자의 발현과 관련된 여러 가지 표현형 특성들은 식물의 게놈으로 통합될 수 있으며 그러므로 이러한 형질 전환 식물은 유리한 농경법적인 성질을 부여한다. 비소모적인 양식으로, 농작물 병원제의 내성, 식물에 유해한 식물-보호 제품에 대한 내성, 규정식 물질의 생산 또는 약리학적 관여를 언급할 수 있다. 이러한 여러 가지 특성들을 코딩하는 유전자 인자의 단리 및 특성화 이외에, 적당한 발현을 확보하여야 한다. 이러한 적당한 발현은 정성 및 정량 적인 수준 모두로 있을 수 있다. 정성적인 수준에서, 예를 들어 공간적인 수준: 특정 조직에서의 선호적인 발현, 또는 일시적인 수준; 유인할 수 있는 발현; 정량적인 수준에서, 도입된 유전자 발현의 생성물의 양을 축적 하므로서 가능하다. 이러한 적당한 발현은, 특히 정성적인 및 정량적인 인자와 관련하여, 대부분이형질전환과 연관된 조절 유전자 인자의 존재에 의존한다. 이러한 적당한 조절을 확보하기 위한 주요 인자 중에서, 단일 또는 결합된 상동 또는 이질 프로모터 인자의 용도가 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 왔다. 형질전환의 조절 요소 하류의 용도는 형질전환의 정성 또는 정량적이 발현에 대하여 그들의 역할로서 예상없이, 형질전환의 전사의 목적을 정지시키도록 할 수 있는 경계선을 설정하는 목적만을 위하여 사용된다.
본 발명은 조절 요소로서 식물 유전자로부터 단리된 인트론 1, 이를 함유하는 신규 키메라 유전자의 용도 및 식물의 형절전환을 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 본발명은 식물의 형질전환에 사용될 수 있는 키메라 유전자에서 조절 요소로서 작용할 수 있으며, 특히 급성장하는 식물의 영역에서 키메라 유전자의 번역 생성물을 발현하도록 하는 단리된 DNA 서열에 있어서, 키메라 유전자의 전사 방향으로 식물 히스톤 유전자의 비코팅 5' 영역의 제 1 인트론 (인트론 1) 과 같은 하나 이상의 인트론을 함유하는 단리된 DNA 서열에 관한 것이다. 본발명은 특히 더 조절 요소로서의 인트론 1 및 동일한 식물 유전자로부터 단리된 프로모터의 동시용도에 관한 것이다. 이것은 유전자 조절을 위한 이들 인자의 조절하에 형질전환의 적당한 발현, 즉 정성 및 정량적인 발현을 허용한다. 본 발명을 사용하여 수득된 이러한 적당한 발현은 농작물 병원제의 내성, 식물에 유해한 식물-보호 생성물에 대한 내성, 규정식 물질의 생산 또는 약리학적 관여와 같은 특성에 관한 것일 수 있다. 특히, 급성장하는 식물의 영역에서 키메라 유전자의 발현 생성물의 정성 및 정량적인 우선적인 발현에 의하여 제초제에 관한 내성이 형질발현 식물에서 향상되도록 할 수 있다. 이러한 제초제 내성을 위한 유전자의 구체적인 적당한 발현은 조절 요소 프로모터 및 조절 요소로서 "H3.3-유사" 형의 히스톤 유전자인 하나 이상의 인트론을 동시에 사용하여 수득할 수 있다. 이러한 발현 패턴은 향상된 제초제 내성을 확보하도록 사용된 조절 요소와 함께, 상술한 바와 같은 관여인 모든 특성들을 얻을 수 있게 한다. 본 발명은 또한 이러한 유전자의 도움으로 형질전환된 식물 세포 및 이들 세포로 재생된 형질전환된 식물 및 이들 형질전환된 식물을 사용한 교차로부터 유도된 식물에 관한 것이다.농작물의 보호를 위해 사용되는 식물 보호 제품중에서, 침투이행성 제품은 살포된 후 식물내에 이송되어, 이들중 일부가 빠른 성장을 일으키는 부분, 특히 줄기 및 뿌리 끝에 축적되므로, 제초제인 경우 민감한 식물의 성장을 억제시키거나 파괴시키는 것을 특징으로 한다. 이러한 유형의 거동을 나타내는 제초제중 일부에 대해 주요 형태의 작용이 알려져 있는데, 그러한 작용은 대상 식물의 적절한 생장을 위해 요구되는 화합물의 생합성 경로와 관련된 특정한 효소의 불활성화로 인한 것이다. 이들 제품의 대상 효소는 각종 세포질 부분에 위치되어 있을 수 있으며, 공지된 제품 대부분의 작용형태를 관찰해보면 주로 색소체 부분에 위치되어 있다.
주요 대상이 공지된 이러한 부류의 제초제에 속하는 제품에 민감한 식물의 내성은 이들의 게놈에 제초제에 의한 유전자의 발현 생성물의 저해 특성에 대해 돌연변이되거나 그이외의 것이 일어난 계통발생적 기원의 대상 효소를 코딩하는 유전자를 안정하게 도입함으로써 수득될 수 있다.
다른 접근 방법은, 제초제를 식물의 생장에 불활성이며 비독성인 화합물로 신진대사할 수 있는 효소를 코딩하는 계통발생적 기원의 유전자를 안정한 방식으로 민감한 식물의 게놈에 도입하는 것이다.
후자의 경우, 제초제의 대상을 특정화하는 것이 필요하지 않다.
처리된 식물내에서 이러한 유형의 제품의 분포와 축적 형태를 고려할 경우, 이들 제품이 축적되는 빠르게 성장하는 식물의 부분에서 유전자의 선택적인 발현과 축적을 허용할 수 있는 유전자의 번역 생성물을 발현시키는 것이 유리하다.
더욱이, 이들 제품의 대상이 세포질 이외의 세포 부분에 위치되어 있을 경우, 이들 유전자의 번역 생성물을, 내성을 부여하는 단백질을 적절한 영역, 특히 색소체 영역에 위치시킬 수 있는 폴리펩티드 서열을 함유한 선구물질의 형태로 발현할 수 있는 것이 유리하다.
이러한 접근 방법에서 상기 제품의 예로는, 포스포노메틸글리신 계열의 광범위한 범위의 침투이행성 제초제인 글리포세이트(glyphosate), 술포세이트(sulfosate) 또는 포사메틴(fosametine)이다. 이들은 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS, EC 2.5.1.19)의 PEP(포스포에노피루베이트)에 관하여 경쟁적인 억제제로 주로 작용한다. 이들이 식물에 살포된 후, 식물내에 이송되어, 빠른 성장을 일으키는 부분, 특히 줄기 및 뿌리 끝에 축적되므로, 민감한 식물의 성장을 억제시키거나 파괴시킨다.
EPSPS, 즉 이들 생성물의 주요 대상은 색소체 부분에 위치한 방향족 아미노산의 생합성 경로의 효소이다. 이 효소는 하나이상의 핵 유전자에 의해 코딩된 것으로, 세포질 전구 물질의 형태로 합성된 다음, 성숙된 형태로 축적시키는 색소체로 유입된다.
글리포세이트 및 이러한 부류의 생성물에 대한 식물의 내성은 글리포세이트에 의한 이들 유전자 생성물의 저해 특성에 대해 돌연변이되거나 다른 것이 일어난 식물 또는 박테리아 기원의 EPSPS 유전자를 이들 게놈에 안정하게 도입함으로써 수득된다. 글리포세이트의 작용 형태를 고려할 경우, 색소체, 더욱이 이들 생성물이 축적되는 빠르게 성장하는 식물의 부분에서 높은 축적을 허용하도록 이들 유전자의 번역 생성물을 발현시키는 것이 유리하다.
예로서 미국 특허 제 4,535,060 호에는 색소체 구획 중에 효소가 자리한 후, 그 효소가 그것의 경합적 저해제 (글리포세이트) 에 대해 더욱 내성을 갖도록 하는 하나 이상의 돌연변이를 동반하는 EPSPS 의 유전자 코딩을 식물의 게놈에 도입함으로써 상기 형태의 제초제, 특히 N-포스포노메틸글리신 또는 글리포세이트에 대해 내성을 부여함을 제시한다. 그러나 이 기술은 농업 조건 하에서 상기 생성물로의 처리 기간 동안 그 식물들의 용도에 있어 더 큰 신뢰도를 얻기 위해 개선될 필요가 있다.
본 명세서에서, "식물"은 모든 광합성 가능한 분화 다세포 유기체를 의미하는 것을 간주되고, "식물 세포"는 식물로부터 발생되고 유합조직과 같은 미분화 조직 또는 배 또는 식물 부분 또는 종자와 같은 분화 조직을 구성할 수 있는 모든 세포를 의미하는 것으로 간주된다. "조절 성분으로서 아라비돕시스의 인트론 1" 은 코딩 부분과 역류하거나 전사된 유전자의 구조부분에 상응하여 위치한, 다양한 길이의 동정된 DNA 서열을 의미하는 것으로 간주된다. 제초제에 대한 내성을 위한 유전자는 제초제에 의한 저해 특성에 관해 하나 이상의 돌연변이를 임의로 갖는 제초제에 대한 목적하는 효소나, 또는 식물에 대해 불활성 또는 비독성인 화합물로 제초제를 대사화할 수 있는 효소를 코딩하는, 임의의 계통학적 근원의 임의의 유전자를 의미하는 것으로 간주된다. 급속 성장하는 식물의 영역은 실질적인 세포 복제의 자리가 되는 영역, 특히 정점 영역인 것으로 간주된다.
본 발명은 상기 생성물에 대한 내성을 위한 유전자를 함유하는 신규 키메라 유전자에 의해 형질전환된 세포의 재생에 의해 급속 성장하는 처리된 식물의 영역에 축적하는 제초제에 대한 보강된 내성을 갖는 형질전환된 식물의 생성에 관한 것이다. 또한 본 발명의 요지는 이 제초제들에 대한 내성을 위한 유전자를 함유하는 신규 키메라 유전자에 의해 형질전환된 세포의 재생으로써, 포스포노메틸글리신 계통의 제초에 대해 내성이 증가된 형질전환된 식물을 생성하는 것이다. 본 발명은 또한 상기 신규 키메라 유전자 뿐만 아니라, 급속 성장하는 상기 식물의 일부에서의 보다 나은 내성 때문에, 더욱 내성인 형질전환된 식물에 관한 것이며, 또한 상기 형질전환된 식물을 사용한 교차로부터 유도된 식물에 관한 것이다. 그 요지는 또한 식물 히스톤의 신규 인트론 1 및 상기 키메라 유전자의 구성을 위한 조절 구역으로서의 용도이다.
더욱 특별하게는 본 발명의 요지는 특히 전사 방향으로 프로모터 성분, 시그날 펩티드 서열, 포스포노메틸글리신 계통의 생성물에 대한 내성을 위한 효소를 코딩하는 서열 및 조절 요소를 포함하는, 표제로서 EPSPS를 갖는 제초제에 대해 증가된 내성을 식물에 제공하는 키메라 유전자이며, 상기 조절 요소는 상기 제초제의 축적에 대한 영역 내에서 제초제에 대한 내성을 위한 단백질의 바람직한 발현 및 축적을 허용하는, 유도된 유전자 내에서 그 초기 배향에 관련하여, 임의의 배향 내에서 식물 히스톤 유전자의 인트론 1 의 단편을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 인트론 1 이 유도되는 히스톤 유전자는 예를 들면 밀, 옥수수 또는 쌀과 같은 일-자엽 식물, 바람직하게는 예를 들면 자주개자리, 해바라기, 콩, 평지씨 또는 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)와 같은 쌍자엽 식물에서 유래된다. 바람직하게는, "H3.3-유사" 유형의 히스톤 유전자가 사용된다.
시그널 펩티드 서열은 전사 방향에서, 폴리펩티드의 색소체로의 시그널 펩티드 방향 수송을 코딩하는 식물 유전자의 하나 이상의 시그널 펩티드 서열, 제 1 시그널 펩티드를 단백질 가수분해에 의해 분열시킬 때 생성되는 식물 유전자의 성숙한 N-말단부의 서열의 일부, 및 또한 폴리펩티드의 색소체의 하위 구획으로의 시그널 펩티드 방향 수송을 코딩하는 식물 유전자의 제 2 시그널 펩티드를 포함한다. 상기 시그널 펩티드 서열은 바람직하게는 유럽 특허 출원 PCT 508 909 호에 의한 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제/옥시게나아제 (RuBisCO) 의 소형 아단위용 유전자로부터 유도된다. 상기 특성 서열의 역할은 성숙한 폴리펩티드의 색소체 구획으로의 방출을, 바람직하게는 천연 형태로 최대 효율로 일어나게 한다.
본 발명에 의한 공상적인 유전자에 사용될 수 있는 코딩 서열은 임의의 계통 발생원의 제초제-내성 유전자로부터 유래된다. 상기 서열은 특히 글리포세이트에 대해 소정의 내성을 갖는 돌연변이된 EPSPS 의 서열일 수 있다.
유럽 특허 출원 PCT 507 698 호에 의한 프로모터 요소는 식물에서 천연적으로 발현되는 유전자의 단일 또는 복제 또는 결합된 형태의 임의의 원, 즉 예를 들면 노팔린 신타제 유전자의 원과 같은 박테리아 원, 또는 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 전사의 원과 같은 바이러스 원, 또는 바람직하게는 리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제/옥시게나아제의 소형 아단위의 원 또는 바람직하게는 식물 히스톤 유전자의 원 및 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 로부터의 원과 같은 식물 원일 수 있다. 바람직하게는, "H4" 유형의 히스톤 유전자가 사용된다.
본 발명에 의한 공상적인 유전자는 상기의 필수 부분외에도, 또한 상기 프로모터 구역과 코딩 구역 사이, 및 상기 코딩 구역과 인트론 1 사이에 비-번역된 중간 구역 (링커)` 을 포함할 수 있으며, 이것은 임의의 계통 발생원 일 수 있다.
하기의 실시예는 단지 설명을 위해 제공되는 것이지, 본 발명의 각종 양태, 즉 본 발명에 의한 인트론의 단리, 식물의 유전학적 형질 전환에 대한 이들의 용도, 및 이들 인트론의 원조에 의해 변형된 식물의 이종 구조 유전자의 발현의 개선된 특성을 제한하는 것은 아니다 (문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 1 및 2] (Ausubel F.M. 등) (Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (1989) (CPMB) 에 의해 출판됨) 참조).
실시예 1 :
1. 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 단편의 제조
a) 아래 각기 서열 :
5'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3'
5'-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3'
의 두 20-mer 올리고뉴클로오티드를 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) EPSPS 유전자의 서열로부터 합성한다 (Klee H.J. 등 (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437 - 442). 상기 두 올리고뉴클레오티드는 각기 반대 배향으로, 공개 서열의 위치 1523 내지 1543, 및 1737 내지 1717 에 해당한다.
b) 아라비돕시스 탈리아나 (변종 : 콜롬비아 (colombia)) 총 DNA를 클론테크 (Clontech ; 참조 번호 : 6970-1) 로부터 수득한다.
c) 50 ng 의 DNA를 300 ng 의 각 올리고뉴클레오티드와 혼합하여, 공급자가 권하는 증폭용 표준 배지 조건 하에서 퍼어킨-엘머 9600 장치를 이용하여, 35 증폭 사이클을 실시용한다. 수득되는 204-bp 단편은 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 단편을 구성한다.
2. BMS 옥수수 세포 계열의 cDNA 라이브러리 제조
a) 5 g 의 여과된 세포를 액체 질소에 분쇄하고, 총 핵산을 Shure 등이 기재한 방법을 하기와 같이 개질하여 추출한다 :
- 용해 완충액의 pH를 pH 9.0 으로 조정하고 ;
- 이소프로판올을 이용한 침전 후, 펠렛을 물에 넣어 용해시킨 후, 2.5 M LiCl 로 조정한다. 0℃에서 12 시간 동안 인큐베이션한 후, 4 ℃에서 15 분간 30,000 g 로 원심분리하여 수득된 펠렛을 재용해시킨다. 이어서 LiCL 침전 단계를 반복한다. 재용해된 펠렛은 총 핵산의 RNA 단편을 구성한다.
b) 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology"] 에 기재된 바와 같이 올리고(dT) 셀룰로스 칼럼 상에서 크로마토그래피하여 상기 RNA 분획중 폴리(A)+RNA 분획을 수득한다.
c) 합성에 필요한 여러 시약의 공급자의 프로토콜에 따라, 합성 EcoRI 말단을 갖는 이중 나선 cDNA 의 합성을 키트 [Invitrogen 사제 "카피 키트 (copy kit)"] 를 이용하여 수행한다.
각각의 하기 서열 :
5'-AATTCCCGGG-3'
5'-CCCGGG-3' (후자는 포스포릴화됨)
을 갖는 두 개의 단일 나선 및 부분 보완 올리고뉴클레오티드를 블런트 말단을 갖는 이중나선 cDNA 에 접합시킨다.
이 아답터 (adaptor) 의 접합은 이중나선 cDNA 에 부착된 SmaI 부위 및 이중나선 cDNA 의 각 말단에 있는 접착 형태의 EcoRI 부위를 만들어낸다.
d) 라이브러리의 제조 :
각 말단에 인위적인 접착 EcoRI 부위를 갖는 cDNA 를 EcoRI 로 절단된 박테리오파지 λgt10 cDNA 에 접합시키고, 공급자 뉴 잉글랜드 바이오랩의 프로토콜에 따라 탈인산화한다.
접합 반응의 앨리콧을 공급자의 지시에 따라 인캡시데이션(encapsidation) 추출물(Gipapack Gold)로 시험관 내에서 인캡시데이션시키고 ; 이 라이브러리를 박테리아 E. coli C600hfl을 이용하여 적정한다. 상기 수득된 라이브러리를 동일한 공급자의 지시에 따라 증폭 및 저장하여, BMS 옥수수 세포 현탁액의 cDNA 라이브러리를 제조한다.
3. 아라비돕시스 탈리아나의 EPSPS 프로브로 BMS 옥수수 세포 현탁액으로부터의 cDNA 집합체 스크리닝
아래의 과정은 "Current Protocols in Molecular Biology" 과정이다. 간단히, 약 106의 재조합 파아지를 100 파아지/cm2의 밀도로 LB 플레이트 플레이트시킨다. 용해 플라크를 아멀샵(amersham)으로부터의 하이본드 N 막 (hybond N membrane)위에 이중으로 복제한다.
DNA를 1600kJ 의 UV 처리하여 필터에 고정화시킨다 (스트라타진사의 스트라타링커). 필터를 6×SSC /0.1% SDS/0.25 [lacuna] 의 탈지유에서 예비 혼성화한다. 아라비돕시스 탈리아나의 EPSPS 프로브를 공급자 (Kit Ready To Go from Pharmacia)의 지도에 따라 무작위 프라이밍(priming)으로 표식한. 얻어지는 고유활동도는 1㎍의 단편당 108cpm 정도이다. 100℃에서 5분간 변성한 후 예비 혼성화 매질에 프로브를 첨가하고, 혼성화를 55℃에서 14시간동안 계속한다. 필터를 코닥 XARS 필름과 아말샴사제의 하이퍼스크린(hyperscreen) RPN 강화 스크린으로 -80℃에서 48 시간동안 형광사진처리한다. 필터 위의 양성 반점과 유래된 플레이트의 정렬로 플레이트로 부터 당해 파지가 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS 프로브에 대해 양성 혼성화 반응을 보이는 영역을 수집할 수 있다. 연속적으로 정제된 파아지의 플레이트의 모든 반점이 혼성화에서 100% 양성이 될 때 까지 도말플레이팅, 전달, 혼성화, 회수의 과정을 반복한다. 그리고 나서 개개의 파지당 용해 플라크를 묽은 λ매질( Tris - Cl PH=7.5; 10mM MgSO4; 0.1M NaCl; 0.1% 젤라틴)내에서 수집하는데, 용액 내의 상기 파지들이 BMS 옥수수 세포 현탁액 으로부터, 양성 ESPS 클론 (clon)을 구성한다.
4. BMS 옥수수 세포 현탁액으로부터의 ESPS 클론 DNA의 제조 및 분석
약 5×108파아지를 OD 2 (600nm/ml)에서 C600hfl 박테리아 20ml에 첨가하고 37℃에서 15분간 배양한다. 그리고 나서 상기 현탁액을 1l 엘름메이어 플라스크( Erlenmeyer flask)에서 박테리아를 위한 성장매질 200ml에서 희석한다. 불투명 박테리아의 용해에 해당하는 매질의 투명화로써 용해 (lysis)가 관찰되는데, 4시간의 흔들기 후에 나타난다. 이어서, 상기의 상청액( supernatant)을 "Current Protocols in Molecular Biology"에 기술된 바와 같이 처리한다. 얻어진 DNA 가 BMS 옥수수 세포 현탁액의 EPSPS 클론에 해당한다.
상기 DNA 1 또는 2 ㎍을 EcoRI로 절단하여, 아가로오스 겔상에서 분리한다. (ref. CMPS) 최종 검증은 정제된 DNA 가 확실히 아라비돕시스 탈리아나의 EPSPS와 혼성화된 신호를 나타내는가를 확인하는 과정으로 구성되어 있다.
전기영동 후, DNA 단편을 "Current Protocols in Molecular Biology" 에 기재된 Southern 절차에 따라 아머샴 하이본드 N 막으로 옮긴다. 필터를 상기 단락 3 에 기재된 조건에 따라 아라비돕시스 탈리아나의 EPSPS 프로브로 혼성화한다. 아라비돕시스 탈리아나의 EPSPS 프로브로 혼성화 시그날을 나타내고, 가장 긴 EcoRI 단편을 함유하는 클론은 약 1.7 kbp 의 겔측정된 크기를 갖는다.
5. 클론 pRPA-ML-711 의 제조:
1.7-kbp 인서트을 포함하는 파아지 클론으로부터의 10 ㎍ DNA 를 EcoRI 로 절단하고, 0.8 % LGTA/TBE 아가로스 겔 상에서 분리한다 (ref. CPMB). 1.7-kbp 인서트를 포함하는 겔 단편을 BET 염색으로 겔로부터 절제하고, 그 단편을 공급자인 뉴 잉글랜드 바이오랩의 절차에 따라 β-아가로오스로 처리한다. 1.7-kbp 단편에서 정제된 DNA를 "Current Protocols in Molecular Biology" 에 기재된 접합 프로토콜에 따라 EcoRI 로 절단된 플라스미드 pUC 19 (뉴 잉글랜드 바이오랩) 에서 DNA 로 14 시간 동안 12 ℃에서 접합한다. 상기 접합 혼합물의 2 ㎕를 전기 수용능력을 갖는 E. coli DH10B 의 하나의 앨리콧의 개질에 사용되고 ; 형질전환은 하기 조건을 이용하여 전기천공법으로 일어난다: 수용능력을 갖는 박테리아 및 접합 매질의 혼합물을 미리 0 ℃ 로 냉각시킨 두께 0.2 cm (Biorad) 의 전기천공 세포로 도입한다. Biorad 가 제조한 전기천공기를 이용한 전기천공의 물리적 조건은 2500 볼트, 25 μF 및 200 Ω 이다. 이 조건들 하에서, 콘덴서의 평균 방출 시간은 약 4.2 밀리초이다. 이어서 박테리아를 1 ml 의 SOC 매질에 취한 후 (참고 CPMB), 15 ml 용량의 코닝(Corning) 튜브에서 회전 교반기로 200 rpm에서 1 시간 동안 교반한다. 100 ㎍/ml 의 카르베니실린으로 보충된 LB/아가 매질 상에 도말한 후, 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장한 박테리아 클론을 "Current Protocols in Molecular Biology" 에 기재된 절차에 따라 소량 제조한다. EcoRI 로 DNA를 절단한 후, 0.8 % LGTA/TBE 아가로오스 겔 상에 전기영동으로 분리하는데(ref. CPMB), 1.7 kbp 인서트를 갖는 클론은 보존된다. 최종 증명은 정제된 DNA 가 실제로 아라비돕시스 탈리아나로부터 EPSPS 프로브로 혼성화 시그날을 나타내는 것을 확인하는 것으로 이루어진다. 전기영동 후, DNA 단편을 "Current Protocols in Molecular Biology" 에 기재된 Southern 의 절차에 따라 아머샴 하이본드 N 막으로 옮긴다.
필터는 상기 단락 3 에서 기술된 조건에 따라 아라비돕시스 탈리아나로부터의 EPSPS 프로브와 혼성된다. 1.7 kbp 인서트를 가지며 아라비돕시스 탈리아나로부터의 EPSPS 프로브와 혼성한 플라스미드 클론을 대규모로 제조하였고 박테리아의 용해로부터 결과된 DNA 는 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology"]에 기술된 바처럼 CsCl 그래디언트 상에서 정제되었다. 정제된 DNA 는 부분적으로 파마시아 키트(Pharmacia kit) 으로써 정렬되었는데, 공급자의 지시에 따라 그리고 프라이머로서 동일한 공급자로부터 주문되는 직행 또는 역행 M13 보편 프라이머를 사용하였다. 생된 부분 정열은 약 0.5 kbp를 포괄한다. 성숙된 단백질의 영역으로부터 나온 유도된 아미노산 서열 (약 50 아미노산 잔기) 는 미국 특허 USP 4,971,908에 기술된 성숙한 옥수수 EPSPS 의 대응 아미노 서열과 100% 동일성을 나타낸다. 상기 클론은, BMS 옥수수 세포 현탁액으로부터의 EPSP에 대한 DNA 의 1.7 kbp EcoRI 단편에 상응하며, pRPA-ML-711 로 칭하였다. 상기 클론의 완전한 서열은 생성된 파마시아 킷을 사용함에 의한, 그리고 보충적이고 역방향인 개개의 대략 250 bp 올리고뉴클레오티드를 합성함에 의한 균주 둘다에서 수득되었다.
6. 클론 pRPA-ML-715의 제조
클론 pRPA-ML-715의 서열의 분석 및 특별하게는 유도된 아미노산 서열과 옥수수로부터의 그것의 비교는 옥수수 EPSPS (미국 특허 USP 4,971,908) 의 성숙 부분의 NH2-말단 알라닌을 코딩하는 GCC 코돈의 상류 92 bp의 서열 확장을 보여준다. 마찬가지로, 옥수수 EPSPS (미국 특허 USP 4,971,908) 의 성숙 부분의 COOH-말단 아스파라긴을 코딩하는 AAT 코돈의 하방향 288 bp의 서열 확장이 관찰된다. 이들 두가지 부분들은, NH2-말단 확장에 대해서는 색소체 로케이션 이전에 시그널 펩티드의 서열의 부위에 해당하고, COOH-말단 확장에 대해서는 cDNA의 미번역 3' 영역에 해당한다.
옥수수 EPSPS를 위한 cDNA의 성숙한 부분을 코딩하는 cDNA을 수득하기 위해서, USP 4,971,908 에 기술된 바처럼, 하기와 같은 조작을 수행하였다:
a) 미번역 3' 영역의 제거: pRPA-ML-712의 구축:
클론 pRPA-ML-712를 제한 효소 AseI 로써 절단하고 결과된 상기 절단물의 말단을 CPMB 에 기술된 절차에 따라 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편으로써 처리함으로써 평활화하게 하였다. 다음으로, 제한 효소 SacII 로써의 절단을 행하였다. 이들 조작으로부터 결과된 DNA 는 전기영동법에 의하여 1% LGTA/TBE 아가로즈 겔 (참조: CPBM) 상에서 분리하였다.
0.4 kbp의 인서트 "AseI-평활화 말단/SacII"를 함유하는 겔 단편을 겔로부터 절제하고 상기 단락 5에 기술된 절차에 따라 정제하였다. 클론 pRPA-ML-712 의 DNA를 클로닝 벡터 pUC19의 폴리링커에 위치하는 제한 효소 HindIII 으로써 절단하고, 상기 절단으로부터 결과된 말단들은 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편으로써 처리함으로써 평활화하게 하였다. 다음으로, 제한 효소 SacII 로써의 소화를 행하였다. 다음으로, 제한 효소 SacII 로써의 소화를 행하였다.
이 조작으로 수득된 DNA 를 0.7 % LGTA/TBE 아가로우스 겔 상에서 전기 영동에 의해 분리한다 (참고. CPMB).
약 3.7 kbp 의 인서트 HindⅢ-blunt 말단/SacⅡ 를 함유하는 겔 분획을 겔로부터 절제하여, 상기의 단락 5 에 기술된 방법에 따라 정제한다.
두 개의 인서트를 결찰하고, 상기의 단락 5 에 기술된 대로 2 μl 의 결찰된 혼합물로E.coliDH1OB 를 변형시킨다.
다양한 클론의 플라스미드 DNA 함량은 pRPA-ML-711 에 대해 기술된 방법에 따라 분석한다. 보유 플라스미드 클론중의 하나는 약 1.45 kbp 의 EcoRⅠ-HindⅢ 인서트를 함유한다. 이 클론의 말단부 서열은, 인서트의 5' 말단이 상응하는 pRPA-ML-711 의 말단과 정확히 상응한다는 것과 3' 말단이 하기의 서열을 갖는다는 것을 보여준다:
"5'...AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3'".
밑줄친 서열은 COOH-말단의 아미노산 아스파라긴의 코돈에 상응하고, 이어지는 코돈은 번역을 위한 정지 코돈에 상응한다. 뉴클레오티드 하류는 pUC19 의 폴리링커(polylinker) 의 서열 성분에 상응한다. 성숙한 옥수수 EPSPS 의 번역 종료 위치까지 pRPA-ML-711 의 서열을, 그리고 이어서 HindⅢ 위치까지 pUC19 의 폴리링커 서열을 함유하는 이 클론은 pRPA-ML-712 로 불려진다.
b) pRPA-ML-712 의 5' 말단의 변형: pRPA-ML-715 의 제조
pRPA-ML-712 클론을 제한 효소 PstⅠ 및 HindⅢ 로 절단한다. 이 조작으로 수득된 DNA 를 0.8 % LGTA/TBE 아가로우스 겔 상에서 전기 영동에 의해 분리한다 (참고. CPMB). 약 1.3 kbp 의 PstⅠ/EcoRⅠ 인서트을 함유하는 겔 분획을 겔로부터 절제하여, 상기의 단락 5 에 기술된 방법에 따라 정제한다.
제한 효소 BamHⅠ 및 HindⅢ 로 소화된 플라스미드 pUC19 로부터 나온 DNA, 그리고 각각 하기의 서열을 갖는 동량의 두 개의 부분 보완적인 올리고뉴클레오티드의 존재하에, 이 인서트를 결찰한다:
올리고 1 : 5'-GAGCCGAGCTCCATGGCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3'
올리고 2 : 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3'.
상기의 단락 5 에 기술된 대로 2 μl 의 결찰된 혼합물로E.coliDH1OB 를 변형시킨다. 상기의 단락 5 에 기술된 방법에 따라 다양한 클론의 플라스미드 DNA 함량을 분석한 후, 약 1.3 kbp 의 인서트를 갖는 클론중의 하나를 이후의 분석을 위해 보존한다. 보유 클론의 5' 말단의 서열은 이 영역에서 DNA 서열이 하기임을 보여준다: BamHⅠ 위치에 EcoRⅠ 의 pUC19 의 폴리링커 서열, 이어서 클론을 만드는 동안 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열, 이어서 pRPA-ML-712 에 존재하는 나머지 서열. 이 클론은 pRPA-ML-713 이라 불린다. 이 클론은 성숙한 EPSP 신타제의 N-말단 알라닌 코돈의 NcoⅠ 위치 상류에 포함된 메티오닌 코돈 AGT 를 갖는다. 또한, N-말단의 알라닌 및 글리신 코돈은 보존되나, 제 3 변이 염기상에서 변형된다. 초기 GCGGGT는 변형된 GCCGGC를 제공한다.
클론 pRPA-ML-713을 제한 효소 HindIII 로 절단하고 이 절단의 말단을 DNA 폴리머라아제 I 의 클레나우 단편으로 처리하여 평활화 되도록한다. 그리고 나서 A를 제한 효소 SacI 로 절단한다. 이러한 조작으로 얻어진 DNA를 0.8 % LGTA/TBE 아가로스 겔(참고.CPMB)에서 전기 영동으로 분리한다. 1.3 kbp 의 "HindIII-평활화 말단/SacI" 인서트를 함유하는 겔 단편을 겔로부터 절제하여 상기 단락 5에서 기술한 방법으로 정제한다. 제한 효소 XbaI 로 소화된 플라스미드 pUC19 및 DNA 폴리머라아제 I 의 클레나우 단편으로 처리되어 평활화된 이 절편의 말단에서 나온 인서트를 DNA 존재하에 접합한다. 그리고 나서 제한 효소 SacI 로 절단한다. 상기 단락 5에서 기술한대로 접합 혼합물 2 μl로E.coliDH10B를 변형시킨다. 상기 단락 5 의 과정에 따라 다양한 클론의 플라스미드 DNA 함량을 분석한 후에, 약 1.3 kbp 의 인서트를 갖는 클론 중 하나를 이후의 분석을 위해 보존한다. 보유 클론의 말단의 서열은 DNA 서열이 하기와 같음을 알 수 있다 : SacⅠ 위치에 EcoRⅠ 의 pUC19 의 폴리링커 서열, 이어서 클론을 만드는 동안 사용되는, 위에서 삭제된 올리고뉴클레오티드의 4 bp GATCC 로부터의 올리고뉴클레오티드 서열, 이어서 pRPA-ML-712에서 HindIII 위치에 존재하는 나머지 서열 및 XbaI 로부터 HindIII 까지의 pUC19 의 폴리링커의 서열. 이 클론은 pRPA-ML-715 라 불린다.
7) 숙성 옥수수 EPSPS를 암호화하는 cDNA 의 제조
공급자의 지시에 따라, 파마시아(Pharmacia)로부터 U.S.E. 돌연변이유발로 모든 돌연변이유발 단계를 실행한다. 이 돌연변이유발 시스템의 원칙은 하기와 같다: 플라스미드 DNA를 열변성하고 한 편으로 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 및 다른 한 편으로 폴리링커(polylinker)에 존재하는 독특한 제한효소를 제거할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 몰과량의 존재하 재결합시킨다. 재결합 단계후, T4 DNA 리가제 및 제공된 적당한 완충용액에서 유전자 32 의 단백질의 존재하 T4 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 보충 가닥의 합성을 실행한다. 합성 생성물을 제한효소의 존재하 배양하고, 돌연변이유발로 이 부위를 사라지게 한다. 특히 뮤츠(muts) 돌연변이를 나타내는E.coli균주를 이 DNA 의 형질전환을 위한 숙주로서 사용한다. 액상매질에서 성장후, 전체 플라스미드 DNA 를 제조하고 상기 사용된 제한효소의 존재하 배양시킨다. 이들 처리후, 형질전환을 위한 숙주로서E.coliDH1OB 균주를 사용한다. 단리된 클론의 플라스미드 DNA를 제조하고 도입된 돌연변이의 존재는 배열에 의해 체크한다.
A) 옥수수 EPSPS 의 내성 특성상에 미리 EPSP 신타아제 활성의 경쟁적 억제제인 생성물에 효과없는 부위 또는 배열 수식: pRPA-ML-715 로부터 내부 NcoI 의 제거.
pRPA-ML-715 의 배열은 1 위치내 N-말단 알라닌 암호문의 일차 염기 배치에 의해 임의적으로 번호를 매긴다. 부위 수식 올리고뉴클레오티드는 하기 배열을 갖는다:
5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3'.
상기 주어진 참조에 따라 배열한 후, 돌연변이유발후 판독된 배열은 사용된 올리고뉴클레오티드의 배열에 대응한다. NcoI 부위를 실제로 제거하고 이 구역에서 아미노산으로의 번역은 pRPA-ML-715 에 존재하는 개시 배열을 유지한다.
이 클론을 pRPA-ML-716 으로 불리운다.
이 클론의 1340 bp 배열은 SEQ ID No. 2 및 SEQ ID No. 3 으로 나타낸다.
B) EPSP 신타아제 활성의 경쟁적 억제제인 생성물에 옥수수 EPSPS 의 내성 특성을 증가시키는 배열 수식.
하기 올리고뉴클레오티드를 사용한다:
a) Thr 102 ⇒ Ile 돌연변이.
5'-GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3'
b) Pro 106 ⇒ Ser 돌연변이.
5'-GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
c) Gly 101 ⇒ Ala 및 Thr 102 ⇒ Ile 돌연변이.
5'-CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3'
d) Thr 102 ⇒ Ile 및 Pro 106 ⇒ Ser 돌연변이.
5'-GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3'
배열후, 돌연변이된 부분상에 돌연변이유발후 판독된 배열은 사용된 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드의 배열에 대응하는 돌연변이유발 구역을 제외하고 모 DNA pRPA-ML-716 의 배열과 동일하다. 이들 클론을 하기로 불리운다: Thr 102 에 대한 pRPA-ML-717 ⇒ Ile 돌연변이, Pro 106 에 대한 pRPA-ML-718 ⇒ Ser 돌연변이, Gly 101 에 대한 pRPA-ML-719 ⇒ Ala 및 Thr 102 ⇒ Ile 돌연변이 및 Thr 102 에 대한 pRPA-ML-720 ⇒ Ala 및 Pro 106 ⇒ Ser 돌연변이.
pRPA-ML-720 의 1340 bp 배열은 SEQ ID 4 및 SEQ ID 5 로서 나타낸다.
1395 bp 의 NcoI-HindIII 인서트는 "옥수수 EPSPS 의 이중 돌연변이체" 명세서의 나머지에서 불리울 것이다.
실시예 2: 키메라 유전자의 구축
본 발명에 따르는 키메라 유전자의 구축은 하기 요소들을 사용하여 수행된다:
1) "H3.3-유사" 형의 두 유전자를 함유하는, 아라비돕시스 탈리아나로부터 게놈 클론 (코스미드 클론 c22)은 문헌 (Chaubet et al, J. Mol. Biol., 1992, 225, 569-574)에 기재된 방법에 따라 분리한다.
2) 인트론 No.1:
418 염기쌍의 DNA 단편은 평활화된 DNA 단편을 생성하기 위한 제조자의 지시에 따라, 코스미드 클론 c22를 제한 효소 DdeI로 소화한 후,E.coli로부터 DNA 폴리머라아제의 클레나우 단편으로 처리하여 정제하고, MseI로 절단한다. 이 정제된 DNA 단편은 하기의 서열을 가진 합성 올리고뉴클레오티드 아답터에 접합시킨다:
아답터 1: 5' TAATTTGTTGAACAGATCCC 3'
TAAACAACTTGTCTAGGG
접합 생성물을 SmaI로 소화된 pGEM7Zf(+) (스트라타겐 카탈로그 No. P2251)에 클론시킨다. "인트론 No.1"이라고 명명되는 이 클론을 서열화하여 검사한다 (SEQ ID No.6).
3) 인트론 No.2:
494 염기쌍의 DNA 단편은 코스미드 클론 c22를 제한 효소 AluI 및 CfoI로 소화하여 정제한다. 이 정제된 DNA 단편은 하기의 서열을 가진 합성 올리고뉴클레오티드 아답터에 접합시킨다:
아답터 2: 5' CAGATCCCGGGATCTGCG 3'
GCGTCTAGGGCCCTAGACGC
접합 생성물을 SmaI로 소화된 pGEM7Zf(+) (스트라타겐 카탈로그 No. P2251)에 클론시킨다. "인트론 No.2"이라고 명명되는 이 클론을 서열화하여 검사한다 (SEQ ID No.7).
4) pRA-1
이 플라스미드의 구축은 프랑스 특허 제 9,308,029 호에 기재되어 있다. 이 플라스미드는E.coliβ-글루코로니다아제 유전자 및 노팔린 신타아제 ("NOS") 폴리아데닐화 위치의 합성을 조절하는ArabidopsisH4A748로부터 히스톤 프로모터를 함유하는 pBI 101.1 (클론테크 카탈로그 No. 6017-1)의 유도체이다. 따라서, 하기 구조를 가진 키메라 유전자가 수득된다:
"H4A748 프로모터-GUS 유전자 NOS"
5) pCG-1
이 플라스미드는 H4A748 프로모터 및 Pra-1의 GUS 코딩 영역 사이에 위치한 상기 인트론 No.1을 함유한다. 이 플라스미드는 코스미드 클론 c22를 BamHI 및 SmaI로 소화하여 수득한다. 418 염기쌍의 인트론 No.1은 BamHI 및 SmaI로 소화된 pRA-1에 직접 접합시킨다.
따라서, 하기 구조를 가진 키메라 유전자가 수득된다:
"H4A748 프로모터-인트론 No. 1-GUS 유전자-NOS"
6) pCG-13
이 플라스미드는 H4A748 프로모터 및 pRA-1의 GUS 코딩 영역 사이에 위치한 상기 인트론 No.2를 함유한다. 이 플라스미드는 코스미드 클론 c22를 BamHI 및 SmaI로 소화하여 수득한다. 494 염기쌍의 인트론 No.2는 BamHI 및 SmaI로 소화된 pRA-1에 직접 접합시킨다.
따라서, 하기 구조를 가진 키메라 유전자가 수득된다:
"H4A748 프로모터-인트론 No.2-GUS 유전자-NOS"
7) pCG-15
이 플라스미드는 H4A748 프로모터 및 pCG-1의 GUS 코딩 영역 사이에 위치한 상기 GUS 코딩 서열 전의 인트론 No.1 만을 함유한다. 이 플라스미드는 평활화된 DNA 단편을 생성하기 위한 제조자의 지시에 따라, pCG-1을 BamHI 및 HindIII로 소화한 후,E.coli로부터 DNA 폴리머라아제의 클레나우 단편으로 처리하여 수득한다.
그 다음 이 벡터를 재라이게이션시켜 다음 구조를 갖는 키메라 유전자를 만든다: " 인트론 No.1-GUS-NOS "
8) pCG-18
이 플라스미드는 pCG-13 의 GUS 코딩 서열앞에 오직 상기 인트론 No.2 만을 함유한다. 이 플라스미드는 pCG-13을 BamHⅠ 및 SphⅠ으로 부분 소화한 후, 편활-말단 DNA 단편을 만들기 위해 제조자의 지시서에 따라 T4 파지 DNA 폴리머라제의 단편으로 처리함으로써 얻어진다.
그 다음 이 벡터를 재라이게이션하고 효소 분해로 체크하여 다음 구조를 갖는 키메라 유전자를 만든다: " 인트론 No.2-GUS-NOS "
9) pRPA-RD-124
pRPA-ML-720에 "nos" 폴리아데닐화 신호를 첨가하여 옥수수 이중 돌연변이 EPSPS 유전자를 함유하는 클로닝 카세트를 생성한다(Thr102→Ile 및 Pro106→Ser). pRPA-ML-720을 HindⅢ로 소화하고E.coli유래의 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편으로 처리하여 평활 말단을 생성한다. NcoⅠ으로 제 2 소화를 실시하고 EPSPS 단편을 정제한다. 그 다음 EPSPS 유전자를 정제된 pRPA-RD-12 (노팔린 신타제 폴리아데닐화 신호를 함유하는 클로닝 카세트)와 라이게이션시켜 pRPA-RD-124를 만든다. 정제된 유용한 벡터 pRPA-RD-12를 얻기위해서는 후자를 미리 SalⅠ으로 소화하고 클레나우 DNA 폴리머라제로 처리한 후 NcoⅠ으로 제 2 소화하는 것이 필요하다.
10) pRPA-RD-125
pRPA-RD-124로부터 최적 시그널 펩티드 (OSP)를 첨가하여 플라스미드상에 표적화된 EPSPS 유전자를 함유하는 클로닝 카세트를 생성한다. pRPA-RD-7 (유럽 특허 출원 EP 652 286)을 SphⅠ으로 소화하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하고 SpeⅠ으로 소화한 후, OSP 단편을 정제한다. 미리 NcoⅠ으로 소화하고 3' 돌출부를 제거하기 위해 클레나우 DNA 폴리머라제로 처리한 후 SpeⅠ으로 소화시킨 pRPA-RD-124에 이 OSP 단편을 클로닝한다. 그 다음 이 클론을 서열결정하여 OSP 와 EPSPS 유전자간의 정확한 번역 융합을 확인한다. 결국 pRPA-RD-125를 얻는다.
11) pRPA-RD-196
이 플라스미드에서는, pCG-1의 "인트론 No.1 +E.coli유래 β-글루코로니다제 유전자" 부분이 pRPA-RD-125에서 분리된 최적 시그널 펩티드, 이중 돌연변이 EPSPS 유전자 (Ile102+ Ser106) 및 노팔린 신타제 폴리아데닐화 부위 ("NOS")를 함유하는 2 킬로베이스의 키메라 유전자에 의해 치환된다. pRPA-RD-196을 얻기위하여, EcoRⅠ 및 BamHⅠ으로 pCG-1의 소화를 실시한 후, 제조자의 지시서에 따라E.coli유래 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편으로 처리하여 평활말단 DNA 단편을 만든다. NcoⅠ 및 NotⅠ으로 소화한 후, 제조자의 지시서에 따라E.coli유래 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활말단 DNA 단편을 생성함으로써, pRPA-RD-125로부터 최적 시그널 펩티드, 이중 돌연변이 EPSPS 유전자 (Ile102+ Ser106) 및 노팔린 신타제 폴리아데닐화 부위 ("NOS")를 함유하는 2-킬로베이스 DNA 단편이 얻어진다. 그 다음 이 편평-말단 단편을 상기와 같이 제조된 pCG-1에 라이게이션시킨다.
그래서 다음 구조를 갖는 키메라 유전자가 얻어진다: "H4A748 프로모터-OSP-옥수수 EPSPS 유전자-NOS"
12) pRPA-RD-197
이 플라스미드에서는, pCG-1의 "E.coli유래 β-글루코로니다제 유전자" 부분이 pRPA-RD-125에서 분리된 최적 시그널 펩티드, 이중 돌연변이 EPSPS 유전자 (Ile102+ Ser106) 및 노팔린 신타제 폴리아데닐화 부위 ("NOS")를 함유하는 2 킬로베이스의 키메라 유전자에 의해 치환된다. pRPA-RD-197을 얻기위하여, EcoRⅠ으로 pCG-1의 소화를 실시한 후, 제조자의 지시서에 따라E.coli유래 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편으로 처리하여 편평-말단 DNA 단편을 만든 다음, SmaⅠ으로 절단한다. NcoⅠ 및 NotⅠ으로 소화한 후, 제조자의 지시서에 따라E.coli유래 DNA 폴리머라제로 처리하여 편평-말단 DNA 단편을 생성함으로써, pRPA-RD-125로부터 최적 시그널 펩티드, 이중 돌연변이 EPSPS 유전자 (Ile102+ Ser106) 및 노팔린 신타제 폴리아데닐화 부위 ("NOS")를 함유하는 2-킬로베이스 DNA 단편이 얻어진다. 그 다음 이 편평-말단 단편을 상기와 같이 제조된 pCG-1에 라이게이션시킨다.
그래서 다음 구조를 갖는 키메라 유전자가 얻어진다: "H4A748 프로모터-인트론 No.1-옥수수 EPSPS 유전자-NOS"
13) pRPA-RD-198
이 플라스미드에서는, pCG-13의 "E.coli유래 β-글루코로니다제 유전자" 부분이 pRPA-RD-125에서 분리된 최적 시그널 펩티드, 이중 돌연변이 EPSPS 유전자 (Ile102+ Ser106) 및 노팔린 신타제 폴리아데닐화 부위 ("NOS")를 함유하는 2 킬로베이스의 키메라 유전자에 의해 치환된다. pRPA-RD-198을 얻기위하여, EcoRⅠ으로 pCG-13의 소화를 실시한 후, 제조자의 지시서에 따라E.coli유래 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편으로 처리하여 편평-말단 DNA 단편을 만든 다음, SmaⅠ으로 절단한다. NcoⅠ 및 NotⅠ으로 소화한 후, 제조자의 지시서에 따라E.coli유래 DNA 폴리머라제로 처리하여 편평-말단 DNA 단편을 생성함으로써, pRPA-RD-125로부터 최적 시그널 펩티드, 이중 돌연변이 EPSPS 유전자 (Ile102+ Ser106) 및 노팔린 신타제 폴리아데닐화 부위 ("NOS")를 함유하는 2-킬로베이스 DNA 단편이 얻어진다. 그 다음 이 평활-말단 단편을 상기와 같이 제조된 pCG-13에 라이게이션시킨다.
그래서 다음 구조를 갖는 키메라 유전자가 얻어진다: "H4A748 프로모터-인트론 No.2-OSP-옥수수 EPSPS 유전자-NOS"
실시예 3: 리포터 유전자 활성의 발현
1) 형질전환 및 재발생
Bevan M. (1984) Nucl. Acids Res., 12, 8711-8721에 기재된 방법에 따라E.coliHB101중의 "헬퍼" 플라스미드 pRK 2013을 이용한 삼모(triparental) 크로싱법에 의해 카탈로그(클론테크 # 6027-1)에서 구입가능한 아그로박테리움 투메퍼시언스 (Agrobacterium tumefaciens)LBA 4404의 비발암성 균주내로 벡터를 도입시킨다.
Valvekens D. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5536-5540에 기재된 방법에 따라 아라비돕시스 탈리아나 L.-에코형 C24의 뿌리 외식편을 이용한 형질전환 기술을 실시하였다. 요약하면 다음 3단계가 필수적이다: 2,4-D 및 키네틴으로 보충된 Gamborg B5 배지상에서 캘리(calli) 형성의 유도; 2iP 및 IAA로 보충된 Gamborg B5 배지상에서 발아의 형성; 호르몬 없는 MS상에서 뿌리내림 및 종자형성.
2) 식물내 GUS 활성의 측정
a-조직화학적 관찰
10일 유전자전환 식물상에서 조직화학적 스폿(Jefferson R.A. et al. (1987) EMBO J., 6, 3901-3907)에 의한 GUS 활성의 가시화는 인트론이 없는 것(pRA-1)에 비해 인트론 서열을 함유하는 플라스미드(pCG-1 및 pCG13)에 대해 조직-특이성인 조직화학적 패턴 강도의 증가를 보여준다. 특히, pCG-1 및 pCG-13에 대한 스폿 패턴은 동일하여, 구조체 pRA-1에 비해 유관 및 분열조직, 잎 및 뿌리에 대한 스폿 강도의 증가를 보여준다. 오직 인트론 No.1의 서열만을 함유하는 구조체(pCG-15 및 pCG-18)는 오직 정상 분열조직 영역에서만 매우 명백한 조직화학적 스폿을 보여준다.
b-형광 측정
12 식물로 부터 장미의 꽃봉우리 및 잎싹의 추출물상에서 형광법에 의해 측정된 GUS 활성은 H4A748 프로모터의 활성이 인트론 No. 1 및 2의 영향하에 증가한다는 것을 보여준다. 구조체 pRA-1에 비해, pCG-1 및 pCG-13의 GUS 활성은 적어도 꽃봉우리에서 6배, 장미의 잎에서 20배 그리고 뿌리에서 26배 더 크다.
이들 측정은 조절요소로 사용된 "H3.3-유사"형의 Arabidopsis 히스톤 유전자의 인트론 No.1 및 2가 키메라 유전자의 발현 활성의 증가를 유도한다는 것을 명백히 보여준다.
실시예 4: 제초제에 대한 유전자전환 식물의 내성
1) 형질전환 및 재발생
Bevan M. (1984) Nucl. Acids Res., 12, 8711-8721에 기재된 방법에 따라E.coliHB101중의 "헬퍼" 플라스미드 pRK 2013을 이용한 삼모(triparental) 크로싱법에 의해 카탈로그(클론테크 # 6027-1)에서 구입가능한 아그로박테리움 투메퍼시언스 LBA 4404의 비발암성 균주내로 벡터를 도입시킨다.
담배의 잎 외식편을 이용한 형질전환 기술은 Horsh R. et al. (1985) Science, 227, 1229-1231에 기재된 방법에 기초한다. 잎 외식편으로부터 PBD6 담배(SEITA-프랑스 기원)의 재발생은 다음 연속 3 단계로 30 g/l의 수크로즈뿐만아니라 200 ㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 Murashige 및 Skoog (MS) 기초 배지상에서 실시한다: 제 1 단계는 15일간 0.05 mg의 나프틸아세트산 (NAA) 및 2 mg/l의 벤질아미노퓨린 (BAP)을 함유하는 30 g의 수크로즈로 보충된 MS 배지상에서 새싹의 유도를 포함한다. 이 단계동안 형성된 새싹은 그 다음 10일간 어떤 호르몬도 함유하지 않고 30 g/l의 수크로즈로 보충된 MS 배지상에서 배양함으로써 발생된다. 그 다음 발생된 새싹을 제거하고, 그들을 어떤 호르몬도 함유하지 않고 절반 함량의 염, 비타민 및 당을 갖는 절반으로 희석된 MS 루팅 배지상에서 배양한다. 약 15일후, 뿌리내린 새싹을 토양에 이식한다.
2) 글리포세이트에 대한 내성의 측정
20개의 형질전환된 식물을 재발생시키고 각각의 구조체 pRPA-RD-196, pRPA-RD-197 및 pRPA-RD-198에 대해 온실로 옮겼다. 온실에서 이들 식물을 5-잎 단계에서 헥타르당 0.8 kg의 활성물질 글리포세이트에 해당하는 제초제(상표 RoundUp) 수성 현탁액으로 처리했다.
그 결과는 처리 3주후 밝혀진 식물독성치의 관찰에 해당한다. 이들 조건하에 구조체로 형질전환된 식물은 평균적으로 허용가능한 내성 (pRPA-RD-196) 또는 심지어 양호한 내성 (pRPA-RD-197 및 pRPA-RD-198)을 가지는 반면, 비형질전환된 대조 식물은 완전히 파괴되는 것이 관찰된다.
이들 결과는 글리포세이트에 대한 동 유전자 암호화 내성에 대해 본 발명에 따른 키메라 유전자를 사용함으로써 얻어진 개선을 명백히 보여준다.
본 발명에 따른 형질전환 식물은 도입된 키메라 유전자의 발현에 해당하는 표현형 특성을 갖는 계통 및 혼성체를 생성하기 위한 모체로서 사용될 수도 있다.
서열목록
Claims (24)
- 식물 히스톤 유전자의 비코딩 5' 영역의 제 1 인트론 (인트론 1) 과 같은 하나이상의 인트론을 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물의 형질전환을 위하여 사용할 수 있는 키메라 유전자에서 조절요소로서 역할을 할 수 있고 특히 식물이 급속히 성장하는 영역에서 키메라 유전자의 번역 산물을 발현시킬 수 있는 단리 DNA 서열.
- 제 1 항에 있어서, 히스톤 인트론 1 이 "H3.3-유사" 형의 식물 히스톤 유전자로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 DNA 서열.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 히스톤 인트론 1 이 쌍자엽성 식물로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 DNA 서열.
- 제 3 항에 있어서, 히스톤 인트론 1 이 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 DNA 서열.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 히스톤 인트론 1 이 단자엽성 식물로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 DNA 서열.
- 제 5 항에 있어서, 히스톤 인트론 1 이 지 메이(Zea mays)로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 DNA 서열.
- 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서, 인트론 1 이, 키메라 유전자의 전사방향에서, 유래된 유전자의 전사방향에서 최초 배향에 대해 그대로 또는 역방식으로 배향된 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
- 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한항에 있어서, 조절 요소가 동일하거나 상이한 결합된 두개의 인트론 1 을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
- 전사 방향에서, 프로모터 서열, 제초제 내성 유전자의 서열 및 조절요소를 포함하는 하나이상의 조절요소를 포함하는 식물의 형질전환용 키메라 유전자에 있어서, 조절 요소는 또한 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한항에 따른 인트론 1 을 포함하는 것을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 9 항에 있어서, 프로모터 서열이 식물 히스톤 유전자의 프로모터로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 키메라 유전자.
- 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 프로모터 영역이 인트론 1 과 동일한 식물 히스톤 유전자에서 유래됨을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 9 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 서열이 복제된 식물 히스톤용 프로모터를 포함함을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 9 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 서열이 식물에서 자연적으로 발현될 수 있는 유전자로부터 유래된 다른 프로모터와 결합된 식물 히스톤 유전자의 프로모터 1 개 이상을 포함함을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 9 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 코딩 유전자가 제초제에 대한 향상된 내성을 식물에 부여하는 것을 가능케함을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 14 항에 있어서, 제초제 내성 유전자가 세포하 분획내에 제초제 내성 유전자의 번역 생성물의 축적을 허용하는 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 서열과 융합되어 있음을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 15 항에 있어서, 시그널 펩티드 영역이 색소체 분획내에 제초제 내성 유전자의 번역 생성물의 축적을 허용함을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 16 항에 있어서, 시그널 펩티드 서열이, 폴리펩티드를 색소체에 전달하도록 지시하는 시그널 펩티드를 코딩하는 식물 유전자의 시그널 펩티드 서열 1 개 이상을 전사 방향으로 포함하고, 제 1 의 시그널 펩티드가 단백질 가수분해 효소에 의해 절단되었을 때 생성된 식물 유전자의 숙성 N-말단 부분의 서열 일부를 포함할 수 있으며, 또한, 폴리펩티드를 색소체의 하-분획에 전달하도록 지시하는 시그널 펩티드를 코딩하는 식물 유전자의 제 2 의 시그널 펩티드를 포함할 수 있음을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 9 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 있어서, 제초제 내성 유전자가, 표적이 EPSPS 인 제초제에 대해 활성이 있는 효소를 코딩함을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 18 항에 있어서, 제초제 내성 유전자가 글리포세이트에 대해 활성이 있는 효소를 코딩함을 특징으로하는 키메라 유전자.
- 제 9 항 내지 제 19 항중 어느 한 항에 따르는 키메라 유전자를 포함함을 특징으로하는, 식물의 형질 전환용 벡터.
- 제 20 항에 따르는 벡터를 함유함을 특징으로하는아그로박테리움종(Agrobacteriumsp.) 균주.
- 제 9 항 내지 제 19 항중 어느 한 항에 따르는 키메라 유전자를 함유함을 특징으로하는 형질전환 식물 세포.
- 제 22 항에 따르는 세포로부터 얻어진 형질전환 식물 또는 식물 부분.
- 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에서 규정된 바와 같은 식물 히스톤 유전자, 프로모터 서열, 시그널 펩티드 및 1 개 이상의 트랜스유전자로부터 인트론 1을 분리하고, 트랜스유전자(transgene) 의 전사 방향으로 상기 순서로 이들을 조합하는 것을 포함하는, 제 9 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 따르는 키메라 유전자의 구축 방법.
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