BR112015023285B1 - Cassete de expressão, célula hospedeira bacteriana e método para controlar uma praga de planta do tipo coleóptero - Google Patents

Abstract

cassete de expressão, célula hospedeira, célula vegetal, planta ou parte de planta, semente transgênica, método para controlar uma praga de planta do tipo coleóptero e polinucleotïdeo isolado. a presente invenção refere-se a métodos e composições que empregam um elemento silenciador que, quando ingerido por uma praga, como uma praga de planta do tipo coleóptero ou diabrotica, diminui a expressão de uma sequência-alvo na praga. a presente invenção apresenta vários polinucleotídeos-alvo descritos em qualquer uma das seq id nos aqui reveladas (mas não incluindo os primers na direção (5'-3') ou na direção (3'-5')) ou variantes ativas e fragmentos das mesmas ou complementos das mesmas, sendo que uma diminuição na expressão de uma ou mais das sequências na praga-alvo controla a praga (isto é, tem atividade inseticida). são apresentadas, também, plantas, partes de planta, bactérias e outras células hospedeiras que compreendem os elementos silenciadores ou uma variante ativa, ou fragmento da mesma, da presente invenção.

Description

Referência remissiva a pedidos de depósito correlatos

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório de patente US n° 61/785.680, depositado em 14 de março de 2013, e Pedido de Utilidade US n° 13/831.230, depositado em 14 de março de 2013, estando ambos aqui incorporados, a título de referência, em sua totalidade.

Campo da invenção

[0002] A presente invenção refere-se, de modo geral, a métodos de biologia molecular e silenciamento de genes para controlar pragas.

Referência a uma listagem de sequência submetida como um arquivo de texto via efs-web

[0003] A Listagem de Sequência submetida em 14 de março de 2014, como um arquivo de texto com o nome “36446_0007P1_ST25.txt,” criado em 14 de março de 2104, e tendo o tamanho de 697.429 bytes está aqui incorporada, por referência de acordo com 37 C.F.R. § 1.52(e)(5).

Antecedentes

[0004] Pragas de insetos são um problema sério na agricultura. Elas destroem milhões de acres de colheitas comerciais como milho, soja, ervilha e algodão. Anualmente, estas pragas causam mais de 100 bilhões de dólares em prejuízos a safras apenas nos EUA. Em uma contínua batalha sazonal, os fazendeiros precisam aplicar bilhões de galões de pesticidas sintéticos para combater essas pragas. Outros métodos usados no passado resultaram em atividade inseticida por microorganismos, ou por genes derivados de microorganismos expressos em plantas transgênicas. Por exemplo, certas espécies de microorganismos do gênero Bacillus apresentam atividade pesticida contra uma ampla gama de pragas de insetos, inclusive Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e outros. De fato, os pesticidas microbianos, particularmente aqueles obtidos a partir de cepas de Bacillus, desempenharam um importante papel na agricultura como alternativas ao controle químico de pragas. Os cientistas agrícolas desenvolveram plantas para culturas agrícolas com resistência aumentada a insetos, mediante a engenharia genética das ditas plantas para produção de proteínas inseticidas oriundas de Bacillus. Por exemplo, plantas de milho e algodão geneticamente modificadas para produzir toxinas Cry (consulte, por exemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3):775-806) são atualmente usadas amplamente na agricultura americana e têm fornecido aos agricultores uma alternativa aos métodos de controle de insetos tradicionais. Entretanto, essas proteínas Bt inseticidas só protegem as plantas contra uma variedade relativamente restrita de pragas. Além disso, esses modos de atividade inseticida apresentam níveis variáveis de especificidade e, em alguns casos, causaram consequências ambientais significativas. Portanto, há uma necessidade imediata por métodos alternativos para controlar pragas.

Breve sumário da invenção

[0005] São apresentados métodos e composições que empregam um elemento silenciador que, quando ingerido por uma praga, como praga de plantas do tipo coleóptero inclusive uma praga de plantas do tipo Diabrotica, é capaz de reduzir a expressão de uma sequência-alvo na dita praga. Em modalidades específicas, a redução na expressão da sequência-alvo controla a praga e, assim, os métodos e composições são capazes de limitar os danos a uma planta. A presente invenção fornece vários polinucleotídeos-alvo conforme apresentados nas SEQ ID NOs: 1, 4, 5 , 8, 9, 12 , 13, 16, 17, 20, 21 , 24, 25, 28, 29, 32 , 33, 36, 37, 40, 4 1, 44 , 45, 48, 49, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 60 , 61, 64, 65, 68, 69, 72 , 73, 76, 77, 80, 81 , 84, 85, 88, 89, 92 , 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas, ou complementos das mesmas, em que uma redução na expressão de uma ou mais sequências na praga-alvo controla a praga (ou seja, tem atividade inseticida). São apresentados, adicionalmente, elementos silenciadores que, quando ingeridos pela praga, diminuem o nível de expressão de um ou mais dos polinucleotídeos-alvo. São apresentadas, também, plantas, partes de planta, células de planta, bactérias e outras células hospedeiras compreendendo os elementos silenciadores ou uma variante ativa, ou fragmento da mesma, da presente invenção. Também são fornecidas formulações de agentes silenciadores pulverizáveis para aplicações tópicas em pragas de inseto ou substratos onde as pragas de inseto podem ser encontradas.

[0006] Em outra modalidade, é apresentado um método para controlar uma praga, como uma praga de plantas do tipo coleóptero ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica. O método compreende alimentar uma praga com uma composição que compreende um elemento silenciador, sendo que o dito elemento silenciador, quando ingerido pela praga, reduz o teor de uma sequência-alvo na mesma, controlando assim a dita praga. São apresentados, adicionalmente, métodos para proteger uma planta contra uma praga. Esses métodos compreendem introduzir na planta ou na parte de planta um elemento silenciador da invenção. Quando a planta expressando o elemento silenciador é ingerida pela praga, o teor da sequência-alvo é diminuído e a praga é controlada.

Breve descrição dos desenhos

[0007] A Figura 1 é uma tabela, Tabelas 1A e 1B, que identifica alvos ativos de RNAi em um ensaio de dieta usando dsRNA produzidos por transcrição in vitro (IVT).

[0008] A Figura 2 é uma tabela, Tabela 2, que mostra o desenho e a identificação dos fragmentos ativos de RNAi.

[0009] A Figura 3 é uma tabela, Tabela 3, que lista os alvos ativos de RNAi das pragas-alvo, pragas expandidas e nenhum inseto-alvo. As sequências homólogas de RNAi ativos selecionados foram identificadas a partir da análise do transcriptoma do verme da raiz do milho ocidental (WCRW, Diabrotica virgifera), verme da raiz do milho setentrional (NCRW, Diabrotica barberi), verme da raiz do milho meridional (SCRW, Diabrotica undecimpunctata), besouro do feijão mexicano (MBB, Epilachna varivestis), besouro da batata do Colorado (CPB, Leptinotarsa decemlineata), percevejo predador (Orius, Orius insidiosus) e joaninha predadora (CMAC, Coleomegilla maculate).

[0010] A Figura 4 é um gráfico mostrando um alinhamento de sequências das sequências de aminoácidos de WCRW Ryanr (SEQ ID NO: 730) e Drosophila Ssk (SEQ ID NO: 731).

[0011] A Figura 5 é uma ilustração esquemática dos fragmentos PAT3 usados no experimento de otimização do gene e construto.

[0012] A Figura 6 é uma ilustração esquemática mostrando a região transgênica de um construto revelado representativo, PHP58050 (SEQ ID NO: 729).

[0013] A Figura 7 é uma tabela, a Tabela 4, que mostra a atividade inseticida representativa contra os vermes da raiz do milho de plantas de milho que compreendem construtos representativos da presente invenção. Os construtos representativos usados no estudo para transformar plantas de milho foram conforme mostrado e descrito na tabela.

[0014] A Figura 8 mostra os dados do Nodal Corn Rootworm Nodal Injury Score (escala de lesão nodal do verme da raiz do milho “CRWNIS”) para milho com os construtos descritos na Figura 7. Descrição detalhada da invenção

[0015] A presente invenção será agora descrita em mais detalhes com relação aos desenhos em anexo, nos quais são mostradas algumas, mas não todas, modalidades da invenção. De fato, essas descrições podem ser incorporadas sob muitas formas diferentes e não devem ser interpretadas como limitações às modalidades aqui apresentadas; ao invés disso, essas modalidades são fornecidas de modo que essa revelação satisfaça às exigências legais aplicáveis. Números iguais referem-se a elementos iguais em todo este documento.

[0016] Muitas modificações e outras modalidades da invenção aqui apresentadas ocorrerão ao versado na técnica ao qual esta invenção pertence, tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições anteriormente mencionadas e desenhos associados. Portanto, deve ser compreendido que a invenção não deve ser limitada às modalidades específicas reveladas e que as modificações e outras modalidades são destinadas a serem incluídas dentro do escopo das reivindicações em anexo. Embora termos específicos sejam empregados na presente invenção, eles são usados apenas em um sentido genérico e descritivo e não para fins de limitação.

I. Visão geral

[0017] Frequentemente, métodos para descoberta de RNAi dependem da avaliação de classes conhecidas de genes sensíveis (fatores de transcrição, genes de manutenção, etc.). Em contraste, os polinucleotídeos-alvo aqui apresentados foram identificados somente com base em triagens de alta velocidade de todos os singletons e representantes de todos os grupos de genes de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de recém-nascidos e/ou de larvas de 3° ínstar do verme da raiz do milho ocidental. Essa triagem permitiu a descoberta de muitas sequências inovadoras, muitas das quais têm homologia extremamente baixa ou mesmo nula com as sequências conhecidas. Esse método proporciona a vantagem de não se ter um viés embutido em genes que são, com frequência, altamente conservados de um táxon a outro. Como resultado, foram identificados muitos alvos inovadores para RNAi, bem como genes conhecidos anteriormente não mostrados como sensíveis a RNAi.

[0018] Assim, são apresentados métodos e composições que empregam um ou mais elementos silenciadores que, quando ingeridos por uma praga, como uma praga de plantas do tipo coleóptero ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica, são capazes de reduzir a expressão de uma sequência-alvo na dita praga. Em modalidades específicas, a diminuição na expressão da sequência-alvo controla a praga e, desse modo, os métodos e composições são capazes de limitar os danos a uma planta ou parte de planta. A presente invenção fornece polinucleotídeos- alvo conforme apresentados nas SEQ ID NOs : 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17 , 20, 21, 24, 25, 28 , 29, 32, 33, 36, 37 , 40, 41, 44, 45, 48 , 49, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 60, 61, 64 , 65, 68, 69, 72, 73 , 76, 77, 80, 81, 84 , 85, 88, 89, 92, 93 , 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas, incluindo, por exemplo, SEQ ID NOS: 1 , 9, 37, 45, 49, 61, 65, 77, 101, 113, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas e SEQ ID NOS : 4, 140, 144, 148, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. São apresentados elementos silenciadores compreendendo sequências, sequências complementares, fragmentos ativos ou variantes desses polinucleotídeos-alvo que, quando ingeridos por ou em contato com a praga, reduzem a expressão de uma ou mais das sequências-alvo e, assim, controlam a praga (isto é, têm atividade inseticida).

[0019] Para uso na presente invenção, os termos “controlar uma praga” ou “controla uma praga” referem-se a qualquer efeito sobre uma praga que resulte na limitação aos danos causados pela dita praga. O controle de uma praga inclui, mas não se limita a, exterminar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou crescimento da praga de forma tal que a praga fornece menos dano à planta, reduzir o número de descendentes produzidos, produzir pragas menos aptas, produzir pragas mais suscetíveis ao ataque de predadores ou desencorajar as pragas de se alimentarem da planta.

[0020] A redução do nível de expressão, na praga, do polinucleotídeo-alvo ou do polipeptídeo codificado pelo mesmo, resulta na supressão, no controle e/ou no extermínio da praga invasora. A redução do nível de expressão da sequência-alvo da praga reduzirá os danos da praga em pelo menos cerca de 2% a pelo menos cerca de 6%, de pelo menos cerca de 5% a cerca de 50%, de pelo menos cerca de 10% a cerca de 60%, de pelo menos cerca de 30% a cerca de 70%, de pelo menos cerca de 40% a cerca de 80%, ou de pelo menos cerca de 50% a cerca de 90% ou mais. Assim, os métodos da invenção podem ser usados para controlar pragas, particularmente, uma praga de plantas do tipo coleóptero ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica.

[0021] Os testes que medem o controle de uma praga são de conhecimento comum no estado da técnica, tal como os métodos para registrar a escala de danos nodais. Consulte, por exemplo, Oleson et al. (2005) J. Econ. Entomol., 98:1-8. Consulte, por exemplo, os exemplos abaixo.

[0022] A invenção se refere a composições e métodos para proteção de plantas contra uma praga de plantas, como pragas de plantas do tipo coleóptero ou Diabrotica, ou para indução de resistência em uma planta contra uma praga de plantas, como pragas de plantas do tipo coleóptero ou Diabrotica. Para uso na presente invenção, o termo “praga de plantas do tipo coleóptero” é usado para referir-se a qualquer membro da ordem Coleoptera. Outras pragas de plantas que podem ser alvo dos métodos e composição da presente invenção incluem, mas não se limitam a, besouro do feijão mexicano (Epilachna varivestis) besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata).

[0023] Como usado aqui, o termo “praga de plantas do tipo Diabrotica” é usado para referir-se a qualquer membro do gênero Diabrotica. Da mesma forma, as composições e métodos também são úteis em proteger plantas contra qualquer praga de plantas do tipo Diabrotica, incluindo, por exemplo, Diabrotica adelpha; Diabrotica amecameca; Diabrotica balteata; Diabrotica barberi; Diabrotica biannularis; Diabrotica cristata; Diabrotica decempunctata; Diabrotica dissimilis; Diabrotica lemniscata; Diabrotica limitata (incluindo, por exemplo, Diabrotica limitata quindecimpuncata); Diabrotica longicornis; Diabrotica nummularis; Diabrotica porracea; Diabrotica scutellata; Diabrotica sexmaculata; Diabrotica speciosa (incluindo, por exemplo, Diabrotica speciosa speciosa); Diabrotica tibialis; Diabrotica undecimpunctata (incluindo, por exemplo, verme da raiz do milho meridional (Diabrotica undecimpunctata), Diabrotica undecimpunctata duodecimnotata; Diabrotica undecimpunctata howardi (besouro manchado do pepino); Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata (besouro manchado do pepino ocidental); Diabrotica virgifera (incluindo, por exemplo, Diabrotica virgifera virgifera (verme da raiz do milho ocidental) e Diabrotica virgifera zeae (verme da raiz do milho mexicano); Diabrotica viridula; Diabrotica wartensis; Diabrotica sp. JJG335; Diabrotica sp. JJG336; Diabrotica sp. JJG341; Diabrotica sp. JJG356; Diabrotica sp. JJG362 e Diabrotica sp. JJG365.

[0024] Em modalidades específicas, a praga de plantas do tipo Diabrotica compreende D. virgifera virgifera, D. barberi, D. virgifera zeae, D. speciosa ou D. undecimpunctata howardi.

II. Sequências-alvo

[0025] Para uso na presente invenção, uma “sequência-alvo” ou um “polinucleotídeo-alvo” compreendem qualquer sequência, na praga, da qual se deseja reduzir o nível de expressão. Em modalidades específicas, diminuir o teor da sequência-alvo na praga controla a dita praga. Por exemplo, a sequência-alvo pode ser essencial para crescimento e desenvolvimento. Embora a sequência-alvo possa ser expressa em qualquer tecido da praga, em modalidades específicas as sequências-alvo para supressão na praga são expressas em células do tecido intestinal da praga, células no intestino médio da praga, e células que revestem o lúmen do intestino ou o intestino médio. Essas sequências-alvo podem estar envolvidas, por exemplo, no metabolismo, na proliferação ou na diferenciação de células do intestino. Exemplos não limitadores de sequências-alvo da invenção incluem um polinucleotídeo apresentado nas SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44 45, 48, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 68, 69, 72 73, 76, 77, 80, 81, 84, 85, 88, 89, 92 , 93 , 96 , 97, 100, 101 104, 129, 156, 181, 208, 233, 260, 285, 312, 337, 364, 389, 416, 441, 468, 493, 520, 545, 566, 579, 592, 605, 618, 631, 644, 657, 105, 132, 157, 184, 209, 236, 261, 288, 313, 340, 365, 392, 417, 444, 469, 496, 521, 548, 567, 580, 593, 606, 619, 632, 645, 658, 108, 133, 160, 185, 212, 237, 264, 289, 316, 341, 368, 393, 420, 445, 472, 497, 524, 549, 568, 581, 594, 607, 620, 633, 646, 659, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720 , 721 , 724 , 725 , 726 , 727, 72 8 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas, incluindo, por exemplo, SEQ ID NOS: 1, 9, 37, 45, 49 , 61, 65, 77, 101, 113, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688 , 689, 690, 691, 692, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas e SEQ ID NOS : 4, 140, 144, 148, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. Conforme exemplificado em outra parte do presente documento, diminuir o nível de expressão de uma ou mais dessas sequências-alvo em uma praga de plantas do tipo coleóptero ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica controla a praga.

III. Elementos silenciadores

[0026] O termo “elemento silenciador” se refere a um polinucleotídeo que, quando em contato ou ingerido por uma praga, é capaz de reduzir ou eliminar o nível ou a expressão de um polinucleotídeo-alvo ou do polipeptídeo codificado pelo mesmo. O elemento silenciador usado pode reduzir ou eliminar o nível de expressão da sequência-alvo, influenciando o teor do transcrito de RNA-alvo ou, alternativamente, influenciando a tradução e, assim, afetando o teor do polipeptídeo codificado. Os métodos para teste quanto a elementos silenciadores funcionais que são capazes de reduzir ou eliminar o teor de uma sequência de interesse são apresentados em outra parte do presente documento. Um único polinucleotídeo usado nos métodos da invenção pode compreender um ou mais elementos silenciadores para polinucleotídeos-alvo iguais ou diferentes. O elemento silenciador pode ser produzido in vivo (isto é, em uma célula hospedeira como uma planta ou um microorganismo) ou in vitro.

[0027] Em modalidades específicas, um elemento silenciador pode compreender uma molécula de construção quimérica que compreende duas ou mais sequências da presente invenção. Por exemplo, a construção quimérica pode ser em forma de grampo (hairpin) ou dsRNA, conforme aqui revelado. Uma quimera pode compreender duas ou mais sequências da presente invenção. Em uma modalidade, uma quimera contempla duas sequências complementares aqui apresentadas tendo algum grau de não pareamento entre as sequências complementares de modo que duas sequências não são complementos perfeitos uma da outra. Fornecer ao menos duas sequências diferentes em um único elemento silenciador pode permitir o alvejamento de múltiplos genes usando um elemento silenciador e/ou, por exemplo, um cassete de expressão. O alvejamento de genes múltiplos pode permitir a redução da possibilidade da resistência da praga, e fornecer a capacidade de múltiplos alvos em uma molécula expressa pode reduzir a carga da expressão da planta transformada ou do produto da planta ou fornecer tratamentos tópicos que são capazes de alvejar hospedeiros múltiplos com uma aplicação.

[0028] Em modalidades específicas, a sequência-alvo não é endógena à planta. Em outras modalidades, embora o elemento silenciador controle as pragas, de preferência o elemento silenciador não tem qualquer efeito sobre a planta ou parte de planta normal.

[0029] Conforme discutido com mais detalhes abaixo, os elementos silenciadores podem incluir, mas não se limitam a, um elemento de supressão senso, um elemento de supressão antissenso, um RNA de fita duplo, um siRNA, um amiRNA, um miRNA, ou um elemento de supressão do tipo hairpin. Os elementos silenciadores da presente invenção podem compreender uma quimera onde duas ou mais sequências da presente invenção ou fragmentos ativos ou variantes ou complementos das mesmas são encontrados na mesma molécula de RNA. Adicionalmente, uma sequência da presente invenção ou fragmento ativo ou variante ou complemento da mesma podem estar presentes em mais de uma cópia em um construto de DNA, elemento silenciador, molécula de DNA ou molécula de RNA. Em um uma molécula de RNA em forma de grampo (hairpin) ou dsRNA, a localização de uma sequência senso ou antissenso na molécula, por exemplo, na qual a sequência é transcrita primeiro ou é localizada em uma terminação específica da molécula de RNA não é limitadora da invenção, e a invenção não deve ser limitada por revelações na presente invenção de uma localização específica dessa sequência. Exemplos não limitadores de elementos silenciadores que podem ser empregados para reduzir a expressão dessas pragas de plantas do tipo coleóptero ou sequências de pragas de plantas do tipo Diabrotica compreendem fragmentos ou variantes dessa sequência senso ou antissenso ou consistem da sequência senso ou antissenso da sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36 , 37, 40, 41, 44, 45 , 48, 49, 52, 53, 54 , 55, 56, 57, 60, 61 , 64, 65, 68, 69, 72 , 73, 76, 77, 80, 81 , 84, 85, 88, 89, 92 , 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas, incluindo, por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 9 , 37, 45, 49, 61, 65, 77, 101, 113, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692 e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas e SEQ ID NOs: 4, 140, 144, 148, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. O elemento silenciador pode compreender, adicionalmente, sequências adicionais que afetam vantajosamente a transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Por exemplo, os elementos silenciadores podem compreender pelo menos um resíduo de timina na extremidade 3'. Isso pode auxiliar na estabilização. Assim, os elementos silenciadores podem ter pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de timina na extremidade 3'. Conforme discutido com mais detalhes abaixo, os elementos amplificadores e supressores podem também se usados em conjunto com os elementos silenciadores apresentados na presente invenção.

[0030] O termo“reduz” ou “redução” do nível de expressão de um polinucleotídeo ou de um polipeptídeo codificado pelo mesmo destina-se a significar que o teor do polinucleotídeo ou polipeptídeo da sequência-alvo é estatisticamente mais baixo que o teor de polinucleotídeo ou polipeptídeo da mesma sequência-alvo em uma praga de controle adequada, que não foi exposta ao elemento silenciador (isto é, não o ingeriu nem teve contato). Em modalidades específicas da invenção, a redução do teor de polinucleotídeo e/ou do teor de polipeptídeo da sequência-alvo em uma praga de acordo com a presente invenção resulta em menos que 95%, menos que 90%, menos que 80%, menos que 70%, menos que 60%, menos que 50%, menos que 40%, menos que 30%, menos que 20%, menos que 10%, ou menos que 5% do teor de polinucleotídeo, ou do teor do polipeptídeo codificado pelo mesmo, da mesma sequência-alvo em um controle adequado para pragas. Os métodos para testar quanto ao teor do transcrito de RNA, o teor do polipeptídeo codificado, ou a atividade do polinucleotídeo ou polipeptídeo são discutidos em outra parte do presente documento.

I. Elementos de supressão senso

[0031] Para uso na presente invenção, um “elemento de supressão senso” compreende um polinucleotídeo projetado para expressar uma molécula de RNA que corresponde a pelo menos uma parte de um RNA mensageiro-alvo na orientação “senso”. A expressão da molécula de RNA que compreende o elemento de supressão senso reduz ou elimina o teor do polinucleotídeo-alvo ou do polipeptídeo codificado pelo mesmo. O polinucleotídeo que compreende o elemento de supressão senso pode corresponder a toda ou parte da sequência do polinucleotídeo-alvo, a toda ou parte da região não-traduzida 5' e/ou 3' do polinucleotídeo- alvo, a toda ou parte da sequência de codificação do polinucleotídeo-alvo, ou a toda ou parte tanto da sequência de codificação como das regiões não-traduzidas do polinucleotídeo- alvo.

[0032] Tipicamente, um elemento de supressão senso tem uma identidade de sequência substancial com o polinucleotídeo-alvo, tipicamente mais que cerca de 65% de identidade de sequência, mais que cerca de 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Consulte as patentes US n°s 5.283.184 e 5.034.323; aqui incorporadas por referência. O elemento de supressão senso pode ter qualquer comprimento, desde que permita a supressão da sequência-alvo. O elemento de supressão senso pode ter, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 nucleotídeos, ou mais longos, que os polinucleotídeos-alvo apresentados em qualquer das SEQ ID NOs: 1, 4 , 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20 21, 24, 25, 28, 29 , 32, 33, 36, 37, 4 0, 41 , 44, 45, 48, 49, 52 , 53, 54, 55, 56, 57 , 60, 61, 64, 65, 68, 69 , 72, 73, 76, 77, 80 , 81, 84, 85, 88, 89 , 92, 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas, incluindo, por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 9, 37, 45, 49, 61, 65, 77 , 101, 113, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687 , 688 , 689, 690, 691, 692 e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas e SEQ ID NOs: 4, 140 , 144, 148, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727 , 728 , e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. Em outras modalidades, o elemento de supressão senso pode ser, por exemplo, cerca de 15 a 25, 19 a 35, 19 a 50, 25 a 100, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 350, 350 a 400, 450 a 500, 500 a 550, 550 a 600, 600 a 650 , 650 a 700, 700 a 750, 750 a 800, 800 a 850, 850 a 900, 900 a 950, 950 a 1.000, 1.000 a 1.050, 1.050 a 1. 100, 1.100 a 1.200 , 1.200 a 1.300, 1.300 a 1.400, 1.400 a 1. 500, 1.500 a 1.600, 1.600 a 1.700, ou 1.700 a 1.800 nucleotídeos , ou mais longo, que os polinucleotídeos-alvo apresentados em qualquer das SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9 , 12, 13, 16, 17 , 20, 21, 24, 25, 28, 29 , 32, 33, 36, 37, 40, 41 , 44, 45, 48, 49 , 52, 53, 54, 55, 56, 57 , 60, 61, 64, 65, 68, 69 , 72, 73, 76, 77 , 80, 81, 84, 85, 88, 89, 92, 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726 , 727 , 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das me smas, incluindo , por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 9, 37, 45, 49 , 61 , 65, 77, 101, 113, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692 e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas e SEQ ID NOs: 4, 140, 144, 148, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas.

II. Elementos de supressão antissenso

[0033] Para uso na presente invenção, um “elemento de supressão antissenso” compreende um polinucleotídeo que é projetado para expressar uma molécula de RNA complementar ao todo ou parte de um RNA mensageiro-alvo. A expressão do elemento de supressão de RNA antissenso reduz ou elimina o teor do polinucleotídeo-alvo. O polinucleotídeo para uso na supressão antissenso pode corresponder ao todo ou parte do complemento da sequência codificadora do polinucleotídeo-alvo, ao todo ou parte do complemento da região não-traduzida 5' e/ou 3' do polinucleotídeo-alvo, do todo ou parte do complemento da sequência de codificação do polinucleotídeo-alvo, ou todo ou parte do complemento tanto da sequência de codificação como das regiões não-traduzidas do polinucleotídeo-alvo. Além disso, o elemento de supressão antissenso pode ser totalmente complementar (isto é, ser 100% idêntico ao complemento da sequência-alvo) ou parcialmente complementar (isto é, ser menos que 100% idêntico ao complemento da sequência-alvo) ao polinucleotídeo-alvo. Em modalidades específicas, o elemento de supressão antissenso compreende pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de complementaridade de sequência com o polinucleotídeo-alvo. Supressão antissenso pode ser usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta. Consulte, por exemplo, a patente US n° 5.942.657. Além disso, o elemento de supressão antissenso pode ser complementar a uma porção do polinucleotídeo-alvo. De modo geral, sequências de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25, 50, 100, 200, 300, 400 ou 450 nucleotídeos, ou maiores , da sequência apresentada em qualquer das SEQ ID NOs: 1, 4, 5 , 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21 , 24, 25, 28 , 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45 , 48, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 68, 69, 72, 73, 76 , 77, 80, 81, 84 , 85, 88, 89, 92, 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas, incluindo, por exemplo, SEQ ID NOs: 1 , 9, 37, 45 , 49, 61, 65, 77 , 101, 113 , 137, 141, 145, 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692 e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas e SEQ ID NOs: 4, 140, 144, 148 , 693, 694 , 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 72 8 e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas podem ser usados. Métodos de uso da supressão antissenso para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos, por exemplo, em Liu et al (2002) Plant Physiol. 129:1732 a 1743 e nas patentes US n° 5.759.829 e 5.942.657, cada uma das quais está aqui incorporada por referência.

III. Elemento de supressão de RNA de fita dupla

[0034] Um “elemento silenciador de RNA de fita dupla” ou “dsRNA” compreende pelo menos um transcrito que é capaz de formar um dsRNA antes ou depois da ingestão por uma praga. Desse modo, um “elemento de silenciamento de dsRNA” inclui um dsRNA, um transcrito ou um polirribonucleotídeo capaz de formar um dsRNA ou mais do que um transcrito ou um polirribonucleotídeo capaz de formar um dsRNA. “RNA de fita dupla” ou “dsRNA” refere-se a uma estrutura de polirribonucleotídeo formada ou por uma única molécula de RNA autocomplementar ou uma estrutura de polirribonucleotídeo formada pela expressão de pelo menos duas fitas de RNA distintas. A molécula ou moléculas de dsRNA empregadas nos métodos e composições da invenção mediam a redução da expressão de uma sequência-alvo, por exemplo, pela mediação da interferência por RNA, “RNAi”, ou por silenciamento de genes de maneira específica para uma sequência. No contexto da presente invenção, o dsRNA é capaz de reduzir ou eliminar o nível de expressão de um polinucleotídeo-alvo, ou do polipeptídeo codificado pelo mesmo, em uma praga.

[0035] O dsRNA pode reduzir ou eliminar o nível de expressão da sequência-alvo mediante influência no nível do transcrito de RNA-alvo, influência na tradução de modo a afetar o nível do polipeptídeo codificado, ou influência na expressão no nível pré-transcricional (isto é, pela modulação da estrutura de cromatina, do padrão de metilação, etc., para alterar a expressão gênica). Consulte, por exemplo, Verdel et al. (2004) Science 303:672-676; Pal-Bhadra et al. (2004) Science 303:669672; Allshire (2002) Science 297:1818-1819; Volpe et al. (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein (2002) Science 297:2215-2218; e Hall et al. (2002) Science 297:2232-2237. Os métodos para testar dsRNA funcionais que são capazes de reduzir ou eliminar o teor de uma sequência de interesse são apresentados em outra parte do presente documento. Consequentemente, para uso na presente invenção o termo “dsRNA” se destina a abranger outros termos usados para descrever as moléculas de ácido nucléico que são capazes de mediação na interferência por RNA ou no silenciamento de genes inclusive, por exemplo, RNA de interferência curto (siRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), micro- RNA (miRNA), hairpin RNA, hairpin RNA curto (shRNA), RNA silenciador de genes pós-transcricional (ptgsRNA) e outros.

[0036] Em modalidades específicas, pelo menos uma fita da região duplex ou de fita dupla do dsRNA compartilha identidade de sequência ou complementaridade de sequência suficiente com o polinucleotídeo-alvo para permitir que o dsRNA reduza o nível de expressão da sequência-alvo. Para uso na presente invenção, a fita que é complementar ao polinucleotídeo-alvo é a “fita antissenso”, e a fita homóloga ao polinucleotídeo-alvo é a “fita senso”.

[0037] Em outra modalidade, o dsRNA compreende um RNA em forma de grampo (hairpin). Um RNA hairpin compreende uma molécula de RNA que é capaz de dobrar-se sobre si mesma para formar uma estrutura de fita dupla. Múltiplas estruturas podem ser usadas como elementos de grampo. Em modalidades específicas, o elemento de supressão do dsRNA compreende um elemento grampo que compreende, na seguinte ordem, um primeiro segmento, um segundo segmento e um terceiro segmento, sendo que o primeiro e o terceiro segmentos compartilham complementaridade suficiente para permitir que o RNA transcrito forme um estrutura haste-laço de fita dupla.

[0038] O “segundo segmento” do grampo compreende um “laço” ou uma “região de laço”. Esses termos são usados como sinônimos na presente invenção, e devem ser interpretados amplamente para compreender qualquer sequência de nucleotídeos que confira flexibilidade suficiente para permitir a ocorrência de autopareamento entre regiões complementares de um polinucleotídeo (isto é, segmentos 1 e 3 que formam a haste do grampo). Por exemplo, em algumas modalidades a região do laço pode ser substancialmente de fita simples, e agir como um espaçador entre as regiões autocomplementares da estrutura haste-laço do grampo. Em algumas modalidades, a região de laço pode compreender uma sequência de nucleotídeos aleatória ou sem sentido e, portanto, compartilhar a identidade de sequência com um polinucleotídeo-alvo. Em outras modalidades, a região de laço compreende uma sequência de RNA senso ou antissenso, ou fragmento da mesma, que compartilha a identidade com um polinucleotídeo-alvo. Consulte, por exemplo, a publicação de patente internacional n° WO 02/00904, aqui incorporada a título de referência. Em modalidades específicas, a região de laço pode ser otimizada para ser tão curta quanto possível, ao mesmo tempo em que ainda proporciona suficiente flexibilidade intramolecular para permitir a formação da região de haste pareada por base. Consequentemente, a sequência de laço é geralmente menor que 1.000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 10 nucleotídeos, ou menos.

[0039] O “primeiro” e o “terceiro” segmentos da molécula de hairpin RNA compreendem a haste pareada por base da estrutura do grampo. O primeiro e o terceiro segmentos são repetições invertidas um do outro, e compartilham suficiente complementaridade para permitir a formação da região de haste pareada por base. Em modalidades específicas, o primeiro e o terceiro segmentos são totalmente complementares um ao outro. Alternativamente, o primeiro e o terceiro segmentos podem ser parcialmente complementares um ao outro, contanto que sejam capazes de hibridizar um com o outro para formar uma região de haste pareada por base. A quantidade de complementaridade entre o primeiro e o terceiro segmentos pode ser calculada com uma porcentagem do segmento como um todo. Portanto, o primeiro e o terceiro segmentos do hairpin RNA geralmente compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, até 100% inclusive, de complementaridade.

[0040] O primeiro e o terceiro segmentos têm um comprimento de pelo menos cerca de 1.000, 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 40, 30, 25, 22, 20, 19, 18, 17, 16, 15 ou 10 nucleotídeos. Em modalidades específicas, o comprimento do primeiro e/ou do terceiro segmentos é de cerca de 10 a 100 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 75 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 35 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos, ce rca de 10 a cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 19 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 20 nucleotídeos, ce rca de 19 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos a cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeo a cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 700 nucleotídeos, cerca de 800 nucleotídeos, cerca de 900 nucleotídeos, cerca de 1. 000 nucleotídeos, cerca de 1 .100 nucleotídeos, cerca de 1. 200 nucleotídeos, 1 .300 nucleotídeos , 1.400 nucleotídeos, 1. 500 nucleotídeos, 1 .600 nucleotídeos , 1.700 nucleotídeos, 1. 800 nucleotídeos, 1. 900 nucleotídeos, 2.000 nucleotídeos ou mais longo. Em outras modalidades, o comprimento do primeiro e/ou do terceiro segmentos compreende pelo menos de 10 a 19 nucleotídeos, 10 a 20 nucleotídeo s; 19 a 35 nucleotídeos, 2 0 a 35 nucleotídeos; 30 a 45 nucleotídeos; 40 a 50 nucleotídeos; 50 a 100 nucleotídeos; 100 a 300 nucleotídeos; cerca de 50 0 a 700 nucleotídeos; cerca de 700 a 900 nucleotídeos; cerca de 900 a 1.100 nucleotídeos; cerca de 1.300 a 1.500 nucleotídeos; cerca de 1.500 a 1.700 nucleotídeos; cerca de 1.700 a 1.900 nucleotídeos; cerca de 1.900 a 2.100 nucleotídeos; cerca de 2.100 a 2.300 nucleotídeos; ou cerca de 2.300 a 2.500 nucleotídeos. Consulte, por exemplo, a publicação internacional n° WO 0200904.

[0041] As moléculas do grampo ou moléculas de RNA de fita dupla da presente invenção podem ter mais de uma sequência da presente invenção ou fragmentos ativos ou variantes ou complementos da mesma, encontrados na mesma porção da molécula de RNA. Por exemplo, em uma estrutura de grampo quimérica, o primeiro segmento de uma molécula de grampo compreende duas seções de polinucleotídeo, cada com uma sequência diferente da presente invenção. Por exemplo, lendo a partir de uma terminação do grampo, o primeiro segmento é composto de sequências de dois genes separados (A seguido de B). O primeiro segmento é seguido do segundo segmento, a porção de laço do grampo. O segmento do laço é seguido do terceiro segmento, em que as fitas complementares das sequências no primeiro segmento são encontradas (B* seguido de A*) na formação da estrutura haste-laço, grampo, a haste contém a SeqA-A* na extremidade distal da haste e SeqB-B* proximal à região do laço.

[0042] Em modalidades específicas, o primeiro e o terceiro segmentos compreendem pelo menos 20 nucleotídeos tendo pelo menos 85% de complementaridade com o primeiro segmento. Em ainda outras modalidades, o primeiro e o terceiro segmentos que formam a estrutura haste-laço do grampo compreendem 3' ou 5' regiões protuberantes com resíduos de nucleotídeo não- pareados.

[0043] Em modalidades específicas, as sequências usadas no primeiro, no segundo e/ou no terceiro segmentos compreendem domínios que são projetados para terem identidade de sequência suficiente com um polinucleotídeo-alvo de interesse e, assim, têm a capacidade de diminuir o nível de expressão do polinucleotídeo-alvo. A especificidade dos transcritos de RNA inibitório é, portanto, geralmente conferida por esses domínios do elemento de silenciamento. Portanto, em algumas modalidades da invenção, o primeiro, segundo e/ou terceiro segmentos do elemento silenciador compreendem um domínio tendo pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos 1.000, ou mais de 1.000 nucleotídeos que compartilham identidade de sequência suficiente com o polinucleotídeo-alvo, para permitir uma diminuição nos níveis de expressão do polinucleotídeo-alvo quando expressos em uma célula adequada. Em outras modalidades, o domínio tem entre cerca de 15 a 50 nucleotídeos, cerca de 19 a 35 nucleotídeos, cerca de 20 a 35 nucleotídeos, cerca de 25 a 50 nucleotídeos, cerca de 19 a 75 nucleotídeos, cerca de 20 a 75 nucleotídeos, cerca de 40 a 90 nucleotídeos, cerca de 15 a 100 nucleotídeos, de 10 a 100 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 75 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 40 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 35 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 19 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos a cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos a cerca de 200 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotídeos a cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos a cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 300 nucleotídeos a cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos a cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos a cerca de 500 nucleotídeos, ou mais. Em outras modalidades, o comprimento do primeiro e/ou do terceiro segmentos compreende pelo menos de 10 a 20 nucleotídeos, pelo menos de 10 a 19 nucleotídeos, 20 a 35 nucleotídeos, 30 a 45 nucleotídeos, 40 a 50 nucleotídeos, 50 a 100 nucleotídeos, ou cerca de 100 a 300 nucleotídeos.

[0044] Em modalidades específicas, o domínio do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmentos tem 100% de identidade de sequência com o polinucleotídeo-alvo. Em outras modalidades, o domínio do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmentos tendo homologia com o polipeptídeo-alvo têm pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência, ou mais, com uma região do polinucleotídeo-alvo. A identidade de sequência dos domínios do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmentos com o polinucleotídeo-alvo só precisa ser suficiente para diminuir a expressão do polinucleotídeo-alvo de interesse. Consulte, por exemplo, Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini et al. BMC Biotechnology 3:7, e publicação de patente US n° 20030175965; sendo cada uma aqui incorporada, por referência. Um teste temporário da eficiência de construtos hpRNA para silenciar a expressão gênica in vivo foi descrito por Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135 a 140, aqui incorporado por referência.

[0045] A quantidade de complementaridade compartilhada entre o primeiro, o segundo e/ou o terceiro segmentos e o polinucleotídeo-alvo, ou a quantidade de complementaridade compartilhada entre o primeiro segmento e o terceiro segmento (isto é, a haste da estrutura de grampo) pode variar dependendo do organismo em que a expressão gênica será controlada. Alguns organismos ou tipos de célula podem requerer pareamento exato ou 100% de identidade, enquanto outros organismos ou tipos de célula podem tolerar alguns erros de pareamento. Em algumas células, por exemplo, um único erro de pareamento do nucleotídeo com a sequência-alvo suspende a capacidade de suprimir a expressão gênica. Nessas células, os cassetes de supressão da invenção podem ser usados para se ter como alvo a supressão de genes mutantes, por exemplo oncogenes cujas transcrições compreendem mutações pontuais e, portanto, podem ser especificamente visados com o uso dos métodos e composições da invenção, sem alterar a expressão do alelo de tipo selvagem restante. Em outros organismos, a variabilidade da sequência holística pode ser tolerada desde que uma região de 22 nucleotídeos da sequência seja representada com 100% de homologia entre o polinucleotídeo-alvo e o cassete de supressão.

[0046] Qualquer região do polinucleotídeo-alvo pode ser usada para projetar o domínio do elemento de silenciamento que compartilha identidade de sequência suficiente para permitir a expressão da transcrição do grampo de modo a diminuir o teor do polinucleotídeo-alvo. Por exemplo, o domínio pode ser projetado para compartilhar identidade de sequência com a região não traduzida 5' dos um ou mais polinucleotídeos-alvo, com a região não traduzida 3' dos um ou mais polinucleotídeos-alvo, regiões exônicas dos um ou mais polinucleotídeos-alvo, regiões intrônicas dos um ou mais polinucleotídeos-alvo, e qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades específicas, um domínio do elemento silenciador compartilha suficiente homologia com pelo menos cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 25 ou 30 nucleotídeos consecutivos, de cerca dos nucleotídeos 1 a 50, 25 a 75, 75 a 125, 50 a 100, 125 a 175, 175 a 225, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 225 a 275, 275 a 325, 250 a 300, 325 a 375, 375 a 425, 300 a 350, 350 a 400, 425 a 475, 400 a 450, 475 a 525, 450 a 500, 525 a 575, 575 a 625, 550 a 600, 625 a 675, 675 a 725, 600 a 650, 625 a 675, 675 a 725, 650 a 700, 725 a 825, 825 a 875, 750 a 800, 875 a 925, 925 a 975, 850 a 900, 925 a 975, 975 a 1.025, 950 a 1.000, 1.000 a 1.050, 1.025 a 1.075, 1.075 a 1.125, 1.050 para otimizar as sequências siRNA empregadas no grampo, o de oligodesoxirribonucleotídeo sintético/RNAse H pode ser usado para determinar sítios no mRNA-alvo que estão em uma conformação que é suscetível ao silenciamento por RNA. Consulte, por exemplo, Vickers et al. (2003) J. Biol . Chem 278:7108-7118 e Yang et al . (2002) Proc. Natl. Acad. Sci . USA 99:9442-9447, aqui incorporado por referência. Esses estudos indicam que há uma correlação significativa entre os sítios sensíveis a RNase-H e os sítios que promovem uma degradação eficaz do mRNA dirigida por siRNA.

[0047] O elemento silenciador de grampo pode, também, ser projetado de modo que a sequência senso ou a sequência antissenso não corresponda a um polinucleotídeo-alvo. Nessa modalidade, as sequências senso e antissenso ladeiam uma sequência de laço que compreende uma sequência de nucleotídeo correspondente ao todo ou parte do polinucleotídeo-alvo. Dessa forma, é a região de laço que determina a especificidade da interferência por RNA. Consulte, por exemplo, WO 02/00904, aqui incorporado a título de referência.

[0048] Além disso, o silenciamento de genes transcricional (TGS) pode ser realizado mediante o uso de um elemento de supressão do grampo, no qual a repetição invertida do grampo compartilha a identidade de sequência com a região promotora de um polinucleotídeo-alvo a ser silenciado. Consulte, por exemplo, Aufsatz et al. (2002) PNAS 99 (Suppl. 4):16499-16506 e Mette et al. (2000) EMBO J 19(19):5194-5201.

[0049] Em outras modalidades, o elemento silenciador pode compreender um RNA pequeno (sRNA). sRNAs podem compreender tanto micro RNA (miRNA) e RNA de interferência pequena (siRNA) (Meister and Tuschl (2004) Nature 431:343-349 e Bonetta et al. (2004) Nature Methods 1:79-86). miRNAs são agentes regulatórios que consistem em cerca de 19 a cerca de 24 ribonucleotídeos de comprimento que são altamente eficientes na inibição da expressão de polinucleotídeos-alvo. Consulte, por exemplo, Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263, aqui incorporado por referência. Para interferência por miRNA, o elemento silenciador pode ser projetado para expressar uma molécula de dsRNA que forma uma estrutura de grampo que contém uma sequência de 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25r que é complementar ao polinucleotídeo-alvo de interesse. O miRNA pode ser sinteticamente produzido, ou transcrito como um RNA mais longo que é subsequentemente clivado para produzir o miRNA ativo. Especificamente, o miRNA pode compreender 19 nucleotídeos da sequência que tem homologia com um polinucleotídeo-alvo na orientação senso, e 19 nucleotídeos de uma sequência antissenso correspondente que é complementar à sequência senso. O miRNA pode ser um “miRNA artificial” ou “amiRNA” que compreende uma sequência de miRNA que é sinteticamente projetada para silenciar uma sequência-alvo.

[0050] Ao expressar um miRNA, o miRNA final (maduro) está presente em um dúplex em uma estrutura de cadeia principal precursora, sendo as duas cadeias chamadas de miRNA (a cadeia que vai se parear com o alvo) e miRNA* (sequência asterisco). Foi demonstrado que os miRNAs podem ser expressos de forma transgênica e os genes-alvo de interesse eficientemente silenciados (Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D. Plant Cell. 2006 May; 18(5):1121-33. Epub 2006 Mar 10 & Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Niu QW, Lin SS, Reyes JL, Chen KC, Wu HW, Yeh SD, Chua NH. Nat Biotechnol. 2006 Nov; 24(11):1420-8. Epub 2006 Oct 22. Erratum in: Nat Biotechnol. 2007 Feb; 25(2):254.)

[0051] O elemento silenciador da interferência do miRNA compreende uma sequência primária do miRNA. A sequência primária do miRNA compreende uma sequência de DNA tendo as sequências miRNA e estrela separadas por um laço, assim como sequências adicionais flanqueando a região que é importante para o processamento. Quando espressa como RNA, a estrutura do mRNA primário é tal que permite a formação da estrutura do RNA em forma de grampo (hairpin) que pode ser processada em miRNA maduro. Em algumas modalidades, a cadeia principal do miRNA compreende uma sequência precursora genômica ou cDNA miRNA, em que a dita sequência compreende uma nativa primária em que o miRNA maduro (artificial) heterólogo e a sequência asterisco são inseridos.

[0052] Como usado aqui, uma “sequência estrela” é a sequência dentro de uma cadeia principal precursora de miRNA que é complementar ao miRNA e forma um dúplex com o miRNA para formar a estrutura em haste de um RNA em grampo. Em algumas modalidades, a sequência asterisco pode compreender menos que 100% de complementaridade com a sequência de miRNA. Alternativamente, a sequência asterisco pode compreender complementaridade de sequência de ao menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% ou menos com complementariedade de sequência com a sequência do miRNA desde que a sequência asterisco tenha complementariedade suficiente com a sequência de miRNA para formar uma estrutura de fita dupla. Em ainda outras modalidades, a sequência asterisco compreende uma sequência tendo 1, 2, 3, 4, 5 ou mais correspondências erradas com a sequência de miRNA e ainda tem complementaridade suficiente para formar uma estrutura de fita dupla com a sequência de mRNA resultando na produção de miRNA e supressão da sequência-alvo.

[0053] As cadeias principais precursoras do miRNA podem ser de qualquer planta. Em algumas modalidades, a cadeia principal do precursor do miRNA é de uma monocotiledônea. Em algumas modalidades, a cadeia principal do precursor do miRNA é de uma dicotiledônea. Em outras modalidades, a cadeia principal é de milho ou soja. As cadeias principais precursoras do microRNA foram descritas anteriormente. Por exemplo, US20090155910A1 (WO 2009/079532) mostra as seguintes cadeias principais precursoras do miRNA: 156c, 159, 166b, 168c, 396b e 398b, e US20090155909A1 (WO 2009/079548) mostram as seguintes cadeias principais precursoras do miRNA de milho: 159c, 164h, 168a, 169r e 396h. Cada uma dessas referências é incorporada por referência na sua totalidade.

[0054] Dessa forma, o miRNA primário pode ser alterado para permitir a inserção eficiente do miRNA heterólogo e das sequências asterisco dentro da cadeia principal do precursor do miRNA. Nessas instâncias, o segmento de miRNA e o segmento asterisco da cadeia principal do precursor de miRNA são substituídos pelo miRNA heterólogo e as sequências asterisco heterólogas, projetadas para alvejar qualquer sequência de interesse, usando uma técnica de PCR e clonada em um construto de expressão. É reconhecido que pode haver alterações na posição na qual o miRNA artificial e as sequências asterisco são inseridos na cadeia principal. Métodos detalhados de inserção do miRNA e da sequência asterisco na cadeia principal precursora do miRNA são descritos, por exemplo, nos pedidos de patente US 20090155909A1 e US20090155910A1, aqui incorporados na íntegra, a título de referência.

[0055] Ao projetar uma sequência de miRNA e sequência asterisco, várias escolhas de design podem ser feitas. Consulte, por exemplo, Schwab R, et al. (2005) Dev Cell 8: 517-27. Em modalidades não-limitadoras, as sequências miRNA reveladas na presente invenção podem ter um “U” na extremidade 5', um “C” ou “G” na 19a posição de nucleotídeo e um “A” ou “U” na 10a posição de nucleotídeo. Em outras modalidades, o design do miRNA é tal que o miRNA tem um delta-G livre alto, conforme calculado usando o algoritmo ZipFold (Markham, N. R. & Zuker, M. (2005) Nucleic Acids Res. 33: W577-W581.) Opcionalmente, uma alteração de um par de base pode ser adicionada dentro da porção 5' do miRNA de modo que a sequência difere da sequência-alvo em um nucleotídeo.

[0056] Os métodos e composições da invenção empregam elementos silenciadores que, quando transcritos, “formam” uma molécula de dsRNA. Consequentemente, o polinucleotídeo heterólogo sendo expresso não precisa formar o dsRNA por si só, mas pode interagir com outras sequências na célula vegetal ou nos intestinos da praga, após a ingestão, para permitir a formação do dsRNA. Por exemplo, um polinucleotídeo quimérico que pode silenciar seletivamente o polinucleotídeo-alvo pode ser gerado mediante a expressão de um construto quimérico compreendendo a sequência-alvo de um miRNA ou siRNA para uma sequência correspondente a todo ou parte dos um ou mais genes a serem silenciados. Nessa modalidade, o dsRNA é “formado” quando o alvo do miRNA ou siRNA interage com o miRNA presente na célula. O dsRNA resultante pode, então, reduzir o nível de expressão dos um ou mais genes a serem silenciados. Consulte, por exemplo, a publicação de pedido US 2007-0130653, intitulada “Methods and Compositions for Gene Silencing”, aqui incorporada a título de referência. O construto pode ser projetado para ter um alvo de um miRNA endógeno ou, alternativamente, um alvo de um miRNA heterólogo e/ou sintético pode ser usado no construto. Se for usado um miRNA heterólogo e/ou sintético, o mesmo pode ser introduzido na célula no mesmo construto de nucleotídeo do polinucleotídeo quimérico, ou em um construto separado. Conforme discutido em outra parte do presente documento, qualquer método pode ser usado para introduzir o construto compreendendo o miRNA heterólogo.

IV. Variantes e fragmentos

[0057] O termo “fragmento” se destina a definir uma porção do polinucleotídeo ou uma porção da sequência de aminoácidos e, portanto, a proteína codificada pelo mesmo. Os fragmentos de um polinucleotídeo podem codificar fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína nativa. Alternativamente, fragmentos de um polinucleotídeo que são úteis como um elemento silenciador não precisam codificar fragmentos de proteína que retenham atividade biológica. Assim, fragmentos de uma sequência de nucleotídeo podem estar na faixa de pelo menos cerca de 10, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19 nucleotídeos, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 22 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 75 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300 nucleotídeos, 400 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 600 nucleotídeos, 700 nucleotídeos e até o polinucleotídeo de comprimento completo empregado na invenção. Alternativamente, fragmentos de uma sequência de nucleotídeo podem estar na faixa de 1-50, 25-75, 75-125, 50-100, 125-175, 175-225, 100-150, 100-300, 150-200, 200-250, 225-275, 275-325, 250-300, 325-375, 375-425, 300-350, 350-400, 425-475, 400-450, 475-525, 450-500, 525-575, 575-625, 550-600, 625-675, 675-725, 600-650, 625-675, 675-725, 650-700, 725-825, 825-875, 750-800, 875-925, 925-975, 850-900, 925-975, 975-1.025, 950-1.000, 1. 000-1.050, 1.025 -1.075, 1.075-1.125, 1.050-1.100, 1.125- 1.175 , 1.100-1. 200, 1.175-1.225, 1.225- 1.275, 1.200-1.300, 1.325-1.375, 1.375- 1.425, 1.300-1.400, 1.425-1.475, 1.475- 1.525 , 1.400-1. 500, 1.525-1.575, 1.575- 1.625, 1.625-1.675, 1.675-1.725, 1.725- 1.775, 1.775-1.825, 1.825-1.875, 1.875- 1.925 , 1.925-1. 975, 1.975-2.025, 2.025- 2.075, 2.075-2.125, 2.125-2.175, 2.175- 2.225, 1.500-1.600, 1.600-1.700, 1.700-1 .800, 1.800-1.900, 1.900-2.000 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41 , 44, 45, 48, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 68 , 69, 72, 73, 76, 77, 80, 81, 84, 85, 88, 89, 92, 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas, incluindo, por exemplo , SEQ ID NOs: 1, 9, 37 , 45, 49, 61, 65, 77 , 101 , 113 , 137 , 141 , 145 , 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688 , 689, 690 , 691, 692 e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas e SEQ ID NOs: 4, 140, 144, 148, 693 , 694 , 695 , 696, 697 , 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. Os métodos para testar a atividade de um elemento silenciador desejado são descritos em outra parte do presente documento.

[0058] O termo “variantes” se destina a significar sequências substancialmente similares. Para polinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ou uma adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios internos no polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Uma variante de um polinucleotídeo que é útil como elemento silenciador reterá a capacidade para reduzir a expressão do polinucleotídeo-alvo e, em algumas modalidades, controlar assim uma praga de interesse. Para uso na presente invenção, um polinucleotídeo ou polipeptídeo “nativo” compreende uma sequência de nucleotídeos ou sequência de aminoácidos de ocorrência natural, respectivamente. Para polinucleotídeos, as variantes conservadoras incluem aquelas sequências que, devido à degeneração do código genético, codificam a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos empregados na presente invenção. Os polinucleotídeos variantes incluem, também, polinucleotídeos sinteticamente derivados, como aqueles gerados, por exemplo mediante o uso de mutagênese sítio-dirigida, mas continuam a reter a atividade desejada. Em geral, variantes de um polinucleotídeo particular da invenção (ou seja, um elemento silenciador) terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, de identidade de sequência com aquele polinucleotídeo específico, conforme determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outra parte do presente documento.

[0059] As variantes de um polinucleotídeo específico da invenção (isto é, o polinucleotídeo de referência) também podem ser avaliadas por comparação do percentual de identidade de sequência entre o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. O percentual de identidade de sequência entre quaisquer dois polipeptídeos pode ser calculado com o uso dos programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outro local no presente documento. Quando qualquer par de polinucleotídeos empregados na invenção é avaliado por comparação do percentual de identidade de sequência compartilhado pelos dois polipeptídeos que eles codificam, o percentual de identidade de sequência entre os dois polipeptídeos codificados é de pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência ou mais.

[0060] Os seguintes termos são usados para descrever as relações de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos: (a) “sequência de referência”, (b) “janela de comparação”, (c) “identidade de sequência” e (d) “porcentagem de identidade de sequência”. (a) Para uso neste pedido, “sequência de referência” é uma sequência definida usada como uma base para a comparação entre as sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência especificada; por exemplo, como um segmento de uma sequência de gene ou cDNA de comprimento total, ou a sequência de gene ou cDNA completa. (b) Para uso na presente invenção, o termo “janela de comparação” faz referência a um segmento contíguo e especificado de uma sequência de polinucleotídeo, sendo que a sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreendem adições ou deleções) para alinhamento ótimo dos dois polinucleotídeos. Em geral, a janela de comparação tem pelo menos 20 nucleotídeos contíguos em comprimento e, opcionalmente, pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais. Os versados na técnica compreendem que para evitar uma alta similaridade a uma sequência de referência devido à inclusão de lacunas na sequência de polinucleotídeos, uma penalidade por lacuna é tipicamente introduzida e é subtraída do número de pareamentos.

[0061] Exceto onde especificado em contrário, os valores de identidade/similaridade de sequência fornecidos no presente documento referem-se ao valor obtido com o uso de GAP versão 10 usando dos seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade com uma sequência de nucleotídeos com o uso do Peso de Lacuna de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade com uma sequência de aminoácidos com o uso do Peso de Lacuna de 8 e Peso de Comprimento de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62 ou qualquer programa equivalente do mesmo. O termo “programa equivalente” refere-se a qualquer programa para comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem pareamentos de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos e um percentual de identidade de sequência idêntico em comparação ao alinhamento correspondente gerado pelo programa GAP Version 10. (c) Para uso na presente invenção, “identidade de sequência” ou “identidade” no contexto de duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo refere-se aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhados para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada. Quando a porcentagem de identidade de sequência é usada com relação a proteínas, reconhece-se que posições de resíduo que não são idênticas, frequentemente diferem em substituições de aminoácidos conservativas, quando os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservadoras, o percentual de identidade de sequência pode ser ajustado para cima para compensar a natureza conservativa da substituição. Diz-se que sequências que diferem em tais substituições conservativas possuem “similaridade de sequência” ou “similaridade”. Os meios de ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica. Isto envolve tipicamente pontuar uma substituição conservativa como um desemparelhamento parcial ao invés de total aumentando, assim, a porcentagem de identidade de sequência. Desta forma, por exemplo, quando uma pontuação de 1 é dada a um aminoácido idêntico e uma pontuação zero é dada a uma substituição não conservativa, uma pontuação entre zero e 1 será dada a uma substituição conservativa. A pontuação das substituições conservativas é calculada, por exemplo, conforme implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA). (d) Para uso na presente invenção, “porcentagem de identidade de sequência” significa o valor determinado pela comparação de duas sequências alinhadas idealmente ao longo de uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais ocorre uma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido idênticos em ambas as sequências para gerar o número de posições pareadas, dividindo-se o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se o resultado por 100 para obter a porcentagem de identidade de sequência.

[0062] Adicionalmente, é apresentado um método para identificar um elemento silenciador a partir dos polinucleotídeos-alvo apresentados nas SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28 , 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 54, 55, 56 , 57, 60, 61, 64, 65, 68, 69, 72, 73, 76, 77, 80, 81, 84, 85, 88, 89, 92, 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721 , 724 , 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas e fragmento s das mesmas e complementos das me smas, incluindo, por exemplo, SEQ ID NOs : 1, 9, 37, 45, 49 , 61 , 65, 77, 101, 113, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692 e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas e SEQ ID NOs: 4, 140, 144, 148, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719 , 720 , 721 , 724 , 72 5, 72 6, 727, 72 8, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas. Esses métodos compreendem a obtenção de um fragmento candidato de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 68, 69, 72, 73, 76, 105, 132, 157, 184, 209, 236, 261, 288, 313, 340, 365, 392, 417, 444, 469, 496, 521, 548, 567, 580, 593, 606, 619, 632, 645, 658, 671, 684, 7, 80, 81, 84, 85, 113, 88, 116, 89, 92, 93, 96, 97, 124, 100, 125, 101, 128, 104, 129, 108, 109, 112, 117, 120, 121, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas, incluindo, por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 9, 37, 45, 4 9, 61 , 65, 77, 101, 113, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas e SEQ ID NOs: 4, 140, 144, 148, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas que tem um comprimento suficiente para agir como um elemento silenciador e, assim, reduzir a expressão do polinucleotídeo-alvo, e/ou controlar uma praga de interesse; expressar o dito fragmento de polinucleotídeo candidato em um cassete de expressão adequado para produzir um elemento silenciador candidato e determinar se o dito fragmento de polinucleotídeo candidato tem a atividade de um elemento silenciador e pode, assim, reduzir a expressão do polinucleotídeo-alvo e/ou controlar uma praga de interesse. Os métodos para identificação desses fragmentos candidatos com base na rota desejada para supressão são conhecidos. Por exemplo, vários programas de bioinformática podem ser empregados para identificar a região dos polinucleotídeos-alvo que poderia ser explorada para gerar um elemento silenciador. Consulte, por exemplo, Elbahir et al. (2001) Genes and Development 15:188-200, Schwartz et al. (2003) Cell 115:199-208, Khvorova et al. (2003) Cell 115:209-216. Consulte também, siRNA at Whitehead (jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/) que calculata as energias de ligação para siRNAs senso e antissenso. Consulte também genscript.com/ssl-bin/app/rnai?op=known; o utilitário Block-iT™ RNAi da Invitrogen bem como o GenScript siRNA Construct Builder. V. Construtos de DNA

[0063] O uso do termo “polinucleotídeo” não se destina a limitar a presente invenção a polinucleotídeos compreendendo DNA. Os versados na técnica compreenderão que os polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem moléculas de ocorrência natural e análogos sintéticos. Os polinucleotídeos da invenção também abrangem todas as formas de sequências incluindo, mas não se limitando, a formas em fita simples, formas em fita dupla, grampos, estruturas do tipo haste-alça e similares.

[0064] O polinucleotídeo que codifica o elemento silenciador ou, em modalidades específicas, é empregado nos métodos e composições da invenção, pode ser obtido em cassetes de expressão para expressão em uma planta ou organismo de interesse. É fato reconhecido que podem ser usados múltiplos elementos silenciadores, inclusive múltiplos elementos silenciadores idênticos, múltiplos elementos silenciadores que têm como alvo regiões diferentes da sequência-alvo, ou múltiplos elementos silenciadores oriundos de diferentes sequências-alvo. Nessa modalidade, é reconhecido que cada elemento silenciador pode estar contido em um cassete único ou separado, um construto de DNA ou um vetor. Conforme discutido, qualquer meio para obtenção do elemento silenciador está contemplado. Uma planta ou célula vegetal pode ser transformada com um único cassete que compreende DNA codificando um ou mais elementos silenciadores, ou cassetes separados compreendendo cada elemento silenciador podem ser usados para transformar uma planta, célula vegetal ou célula hospedeira. De modo semelhante, uma planta transformada com um componente pode ser subsequentemente transformada com o segundo componente. Um ou mais elementos silenciadores podem também ser reunidos por meio de cruzamento sexual. Ou seja, uma primeira planta que compreende um componente é cruzada com uma segunda planta que compreende o segundo componente. As plantas da progênie desse cruzamento compreenderão ambos os componentes.

[0065] O cassete de expressão pode incluir sequências reguladoras 5' e 3' funcionalmente ligadas ao polinucleotídeo antipatogênico da presente invenção. “Ligado operacionalmente” se destina a significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação funcional entre um polinucleotídeo da invenção e uma sequência reguladora (isto é, um promotor) é uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídeo da invenção. Os elementos ligados operacionalmente podem ser contíguos ou não contíguos. Quando usado com relação à junção de duas regiões codificantes de proteína, o termo ligado operacionalmente significa que as regiões codificantes estão no mesmo quadro de leitura. O cassete pode, adicionalmente, conter pelo menos um polinucleotídeo adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, os polipeptídeos adicionais podem ser obtidos em múltiplos cassetes de expressão. Os cassetes de expressão podem ser dotados de uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para inserção do polinucleotídeo destinado a ficar sob a regulação transcricional das regiões regulatórias. O cassete de expressão pode conter ainda genes marcadores selecionáveis.

[0066] O cassete de expressão pode incluir, na direção 5' a 3' da transcrição, uma região de iniciação transcricional e traducional (isto é, um promotor), um polinucleotídeo compreendendo o elemento silenciador empregado nos métodos e composições da invenção, e uma região de terminação transcricional e traducional (isto é, região de terminação) funcional em plantas. Em outra modalidade, o RNA de fita dupla é expresso a partir de um cassete de supressão. Esse tipo de cassete pode compreender dois promotores convergentes que conduzem a transcrição de um elemento silenciador ligado de maneira funcional. “Promotores convergentes” refere-se a promotores que estão orientados em cada terminação do elemento silenciador ligado de maneira funcional, de modo que cada promotor conduza a transcrição do elemento silenciador em direções opostas, resultando em duas transcrições. Nessas modalidades, os promotores convergentes permitem a transcrição das fitas senso e antissenso e, desse modo, permitem a formação de um dsRNA. Esse tipo de cassete pode também compreender dois promotores divergentes que conduzem a transcrição de um ou mais elementos silenciadores funcionalmente ligados. “Promotores divergentes” refere-se a promotores que estão orientados em direções opostas um do outro, guiando a transcrição do um ou mais elementos silenciadores em direções opostas. Nessas modalidades, os promotores divergentes permitem a transcrição das fitas senso e antissenso e, desse modo, permitem a formação de um dsRNA. Nessas modalidades, os promotores divergentes também permitem a transcrição de ao menos dois hairpin RNAs separados. Em uma outra modalidade, um cassete que compreende dois ou mais elementos silenciadores sob o controle de dois promotores separados na mesma orientação está presente em um construto. Em uma outra modalidade, dois ou mais cassetes individuais, cada um compreendendo ao menos um elemento silenciador sob o controle de um promotor, estão presentes em um construto na mesma orientação.

[0067] As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras transcricionais, e regiões de terminação traducional) e/ou os polinucleotídeos empregados na invenção podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou um ao outro. Alternativamente, as regiões regulatórias e/ou o polinucleotídeo empregado na invenção podem ser heterólogos à célula hospedeira ou um ao outro. Para uso na presente invenção, “heterólogo”, com relação a uma sequência, é uma sequência que se origina de uma espécie estranha, ou, caso seja da mesma espécie, é substancialmente modificada com relação a sua forma nativa em composição e/ou locus genômico por intervenção humana intencional. Por exemplo, um promotor ligado de maneira funcional a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie a partir da qual o polinucleotídeo se originou, ou, caso seja de espécie igual/análoga, um ou ambos são substancialmente modificados com relação a sua forma original e/ou locus genômico, ou o promotor não é o promotor nativo do polinucleotídeo ligado de maneira funcional. Para uso na presente invenção, um gene quimérico compreende uma sequência codificadora ligada de maneira funcional a uma região de início de transcrição que é heteróloga à sequência codificadora.

[0068] A região de terminação pode ser nativa à região de iniciação transcricional, pode ser nativa ao polinucleotídeo funcionalmente ligado que codifica o elemento silenciador, pode ser nativa à planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga) ao promotor, ao polinucleotídeo compreendendo o elemento silenciador, à planta hospedeira, ou qualquer combinação dos mesmos. Regiões de terminação adequadas estão disponíveis a partir do plasmídeo-Ti de A. tumefaciens, tal como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Consulte também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al . (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 7903; e Joshi et al . (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

[0069] Modificações de sequência adicionais para melhorar a expressão genética em um hospedeiro celular são conhecidas. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais espúrios de poliadenilação, sinais de sítio de splice éxon- íntron, repetições similares a transpóson e outras sequências bem caracterizadas como essas, que podem ser prejudiciais à expressão gênica. O conteúdo de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, conforme calculado por referência a genes conhecidos expressados na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas secundárias de hairpin mRNA previstas.

[0070] No preparo do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a fornecer as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme for adequado, o quadro de leitura adequado. Para isso, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Para este propósito, podem estar envolvidos mutagênese in vitro, reparo de primers, restrição, anelamento, ressubstituições, por exemplo, transições e transversões.

[0071] Inúmeros promotores podem ser usados na prática da invenção. O polinucleotídeo que codifica o elemento silenciador pode ser combinado com promotores constitutivos, preferenciais para tecido ou outros, para expressão em plantas.

[0072] Esses promotores constitutivos fracos incluem, por exemplo, o promotor núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados em WO 99/43838 e na patente US n° 6.072.050), o promotor mínimo CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor da ALS (patente US n° 5.659.026), e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, os das patentes US n° 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611.

[0073] Um promotor induzível, por exemplo um promotor induzível por patógeno, também poderia ser empregado. Esses promotores incluem aqueles provenientes de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidos após a infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Consulte, por exemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Consulte também, WO 99/43819, aqui incorporado por referência.

[0074] Adicionalmente, à medida que os patógenos entram nas plantas através de feridas ou lesões causadas por insetos, um promotor induzível por ferida pode ser usado nas construções da invenção. Esses promotores induzíveis por ferida incluem o gene inibidor da proteinase de batata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 e wun2, U.S. Patent No. 5.428.148; win1 e win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl et al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); gene MPI (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2):141-150); e similares, aqui incorporados por referência.

[0075] Promotores reguláveis quimicamente podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível quimicamente, em que a aplicação da substância química induz uma expressão gênica ou um promotor reprimível quimicamente, em que a aplicação da substância química reprime uma expressão gênica. Promotores induzíveis quimicamente são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, promotor In2-2 no milho, que é ativado por protetores (safeners) de herbicidas compostos por benzenosulfonamida, o promotor GST no milho, que é ativado por compostos hidrofóbicos eletrofílicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores regulados quimicamente de interesse incluem promotores responsivos a esteróides (consulte, por exemplo, o promotor induzido por glicocorticóide em Schena et al . (1991) Proc. Natl . Acad. Sci. USA 88:10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2):247- 257) e os promotores induzidos por tetraciclina e repressores por tetraciclina (consulte, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229 a 237 e as patentes US n° 5.814.618 e 5.789.156), aqui incorporadas por referência.

[0076] Os promotores preferenciais para tecido podem ser usados para se obter uma expressão otimizada em um tecido vegetal específico. Promotores preferenciais de tecido incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255 a 265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129- 1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Esses promotores podem ser modificados, se necessário, para uma expressão fraca.

[0077] Promotores com preferência por folha são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:35767; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.

[0078] Promotores com preferência pela raiz são conhecidos e podem ser selecionados a partir dos muitos exemplos disponíveis na literatura ou isolados “de novo” a partir de várias espécies compatíveis. Consulte, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gene da glutamina sintetase específico para raiz de soja); Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de controle específico para raiz no gene GRP 1.8 da soja francesa); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico para raiz do gene da manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); e Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (clone de DNA de comprimento inteiro que codifica a glutamina sintetase citossólica (GS), que é expressa em raízes e nódulos de raiz de feijão-soja). Consulte também Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7):633-641, em que são descritos dois promotores específicos de raiz isolados a partir do gene de hemoglobina a partir da não leguminosa fixadora de nitrogênio Parasponia andersonii e da não leguminosa não fixadora de nitrogênio Trema tomentosa são descritos. Os promotores desses genes foram ligados a um gene repórter de β- glucuronidase e introduzidos dentro da não leguminosa Nicotiana tabacum e da leguminosa Lotus corniculatus e, em ambos os exemplos, a atividade do promotor específico de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem suas análises dos promotores dos genes indutores de raiz altamente expressos rolC e rolD de Agrobacterium rhizogenes (consulte Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Eles concluíram que o intensificador e os determinantes do DNA com preferência por tecido são dissociados naqueles promotores. Teeri et al. (1989) usaram fusão de genes a lacZ para demonstrar que o gene T-DNA de Agrobacterium que codifica octopina sintase é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz, e que o gene TR2' é específico para raiz na planta intacta e estimulado por ferimentos no tecido foliar, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene de ação inseticida ou larvicida (consulte EMBO J. 8(2):343-350). O gene TR1', fundido a nptII (neomicina fosfotransferase II) apresentou características similares. Promotores adicionais preferenciais de raiz incluem o promotor do gene VfENOD-GRP3 (Kuster, et al. (1995) Plant Mol. Biol . 29(4):759-772); e promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Consulte também patentes U.S. n°s 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 e 5.023.179.

[0079] Em uma modalidade da presente invenção, o promotor expresso por planta é um promotor vascular-específico, como um promotor específico para floema. Um promotor “vascular- específico”, para uso na presente invenção, é um promotor que é pelo menos expresso em células vasculares, ou um promotor que é preferencialmente expresso em células vasculares. A expressão de um promotor vascular-específico não precisa ocorrer exclusivamente em células vasculares, sendo possível a expressão em outros tipos de células ou tecidos. Um “promotor específico para floema” é, para uso na presente invenção, um promotor que pode ser expresso em plantas e que é pelo menos expresso em células de floema, ou um promotor que é preferencialmente expresso em células de floema.

[0080] A expressão de um promotor específico para floema não precisa ocorrer exclusivamente em células de floema, sendo possível a expressão em outros tipos de células ou tecidos, por exemplo o tecido de xilema. Em uma modalidade da presente invenção, um promotor específico para floema é um promotor que pode ser expresso em plantas, sendo pelo menos expresso em células de floema, e sendo que a expressão em células não- pertencentes ao floema é mais limitada (ou ausente) em comparação à expressão em células de floema. Exemplos de promotores específicos vasculares ou específicos para floema de acordo com essa invenção incluem, mas não se limitam a, promotores selecionado do grupo que consiste nos promotores SCSV3, SCSV4, SCSV5 e SCSV7 (Schunmann et al. (2003) Plant Functional Biology 30:453-60; o promotor do gene rolC de Agrobacterium rhizogenes(Kiyokawa et al. (1994) Plant Physiology 104:801-02; Pandolfini et al. (2003) BioMedCentral (BMC) Biotechnology 3:7, (www.biomedcentral.com/1472-6750/3/7); Graham et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:729-35; Guivarc'h et al. (1996); Almon et al . (1997) Plant Physiol. 115:1599-607; o promotor de gene rolA de Agrobacterium rhizogenes (Dehio et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23:1199-210); o promotor do gene 5 do T- DNA de Agrobacterium tumefaciens (Korber et al. (1991) EMBO J. 10:3983-91); o promotor do gene RSs1 da sacarose sintase do arroz (Shi et al. (1994) J. Exp. Bot. 45:623-31); o promotor do CoYMV ou do badnavirus do mosqueado amarelo de Commelina (Medberry et al. (1992) Plant Cell 4:185-92; Zhou et al. (1998) Chin. J. Biotechnol. 14:9-16); o promotor do vírus CFDV da podridão foliar do coco (Rohde et al. (1994) Plant Mol. Biol. 27:623-28; Hehn and Rhode (1998) J. Gen. Virol . 79:1495-99); o promotor RTBV ou vírus baciliforme do arroz tungro (Yin and Beachy (1995) Plant J. 7:969-80; Yin et al. (1997) Plant J. 12:1179-80); o gene GS3A da glutamina sintase da ervilha (Edwards et al. (1990) Proc. Natl . Acad. Sci. USA 87:3459-63; Brears et al. (1991) Plant J. 1:235-44); os promotores inv CD111 e inv CD141 dos genes da intervase da batata (Hedley et al. (2000) J. Exp. Botany 51:817-21); o promotor isolado da Arabidopsis com expressão específica para o floema em tabaco comprovada por Kertbundit et al. (1991) Proc. Natl . Acad. Sci. USA 88:5212-16); a região do promotor VAHOX1 (Tornero et al. (1996) Plant J. 9:639-48); o promotor do gene da invertase da parede celular da ervilha (Zhang et al . (1996) Plant Physiol. 112:1111-17); o promotor da proteína endógena do algodão relacionada à quitinase do pedido de patente publicado US 20030106097, um promotor do gene da invertase ácida da cenour (Ramloch-Lorenz et al. (1993) The Plant J. 4:545-54); o promotor do gene do transportador de sulfato Sultr1; 3 (Yoshimoto et al. (2003) Plant Physiol. 131:1511-17); um promotor de um gene da sintase de sacarose (Nolte and Koch (1993) Plant Physiol. 101:899-905); e o promotor de um gene transportador da sacarose do tabaco (Kuhn et al. (1997) Science 275-1298-1300).

[0081] Possíveis promotores também incluem o promotor da prunasina hidrolase da cereja preta (PH DL1.4 PRO) (US Patent No. 6.797, 859), promotor da tiorredoxina H do pepino e do arroz (Fukuda A et al. (2005). Plant Cell Physiol. 46(11):1779-86), Rice (RSs1) (Shi, T. Wang et al. (1994). J. Exp. Bot. 45(274): 623-631) e promotores da sacarose sintase 1 do milho (Yang., N-S. et al. (1990) PNAS 87:4144-4148), promotor PP2 da abórbora, Guo, H. et al. (2004) Transgenic Research 13:559-566), promotor SUC2 (Truernit, E. et al. (1995) Planta 196(3):564-70., SAM-1 (S-adenosil metionina sintetase) (Mijnsbrugge KV. et al. (1996) Planr. Cell. Physiol. 37(8): 1108-1115), e o promotor do vírus baciliforme do arroz tungro (RTBV) (Bhattacharyya-Pakrasi et al. (1993) Plant J. 4(1):71-79).

[0082] O cassete de expressão também pode compreender um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem genes que codificam para resistência a antibióticos, como aqueles que codificam para a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, como o glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4- diclorofenaxiacetato (2,4-D). Marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos como β-galactosidase e proteínas fluorescentes como proteína verde fluorescente (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 e Fetter et al. (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína ciano fluorescente (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiol 129:913-42), e proteína amarela fluorescente (PhiYFP™ da Evrogen, consulte, Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54). Para marcadores selecionáveis adicionais, vide, em geral, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech., 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) em The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl . Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl . Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tese de Doutorado, Universidade de Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res . 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Tese de Doutorado, Universidade de Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al . (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Estas revelações estão aqui incorporadas a título de referência. A lista de genes marcadores selecionáveis acima não se destina a ser limitadora. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado na presente invenção.

VI. Composições compreendendo elementos silenciadores

[0083] Um ou mais dos polinucleotídeos compreendendo o elemento silenciador podem ser obtidos como uma composição externa, como uma aspersão ou pó aplicado à planta, à parte de planta, à semente, a uma praga, ou a um área de cultivo. Em outro exemplo, uma planta é transformada com um construto de DNA ou cassete de expressão para expressar pelo menos um elemento silenciador. Em qualquer das composições, o elemento silenciador, quando ingerido por um inseto, pode reduzir o teor de uma sequência da praga-alvo e, assim, controlar a praga (isto é, uma praga de plantas do tipo coleóptero, inclusive uma praga de plantas do tipo Diabrotica, como D. virgifera virgifera, D. barberi, D. virgifera zeae, D. speciosa ou D. undecimpunctata howardi). É fato reconhecido que a composição pode compreender uma célula (como uma célula vegetal ou uma célula bacteriana), em que um polinucleotídeo codificando o elemento silenciador é incorporado de maneira estável ao genoma, e funcionalmente ligado a promotores ativos na dita célula. Também estão abrangidas as composições compreendendo uma mistura de células, sendo que algumas células expressam pelo menos um elemento silenciador. Em outras modalidades, as composições compreendendo os elementos silenciadores não estão contidas em uma célula. Nessas modalidades, a composição pode ser aplicada a uma área habitada por uma praga. Em uma modalidade, a composição é aplicada externamente a uma planta (isto é, mediante aspersão de um campo ou área de cultivo) para proteger a planta contra a praga. Métodos para aplicar os nucleotídeos dessa forma são conhecidos pelos versados na técnica.

[0084] A composição da invenção pode ser adicionalmente formulada sob a forma de isca. Nessa modalidade, as composições compreendem uma substância alimentícia ou um atrativo que acentua a atratividade da composição para a praga.

[0085] A composição compreendendo o elemento silenciador pode ser formulada em um carreador agriculturalmente adequado e/ou ambientalmente aceitável. Esses carreadores podem consistir em qualquer material que o animal, planta ou ambiente a ser tratada possa tolerar. Além disso, o carreador precisa ser tal que a composição permaneça eficaz no controle da praga. Os exemplos desse tipo de carreador incluem água, solução salina, solução de Ringer, dextrose ou outras soluções de açúcar, solução de Hank e outras soluções salinas aquosas fisiologicamente balanceadas, tampão de fosfato, tampão de bicarbonato e tampão Tris. Além disso, a composição pode incluir compostos que aumentam a meia- vida de uma composição. As várias formulações inseticidas podem também se encontradas, por exemplo, nas publicações US 2008/0275115, 2008/0242174, 2008/0027143, 2005/0042245 e 2004/0127520, cada uma das quais está aqui incorporada, a título de referência.

[0086] É fato reconhecido que os polinucleotídeos compreendendo sequências que codificam o elemento silenciador podem ser usados para transformar organismos, de modo a se obter a produção desses componentes pelos organismos hospedeiros, com a subsequente aplicação do organismo hospedeiro ao ambiente das uma ou mais pragas-alvo. Esses organismos hospedeiros incluir baculovírus, bactérias e similares. Desse modo, as combinações de polinucleotídeos que codificam o elemento silenciador podem ser introduzidas, por meio de um vetor adequado, em um hospedeiro microbiano, sendo o dito hospedeiro aplicado ao ambiente, ou às plantas ou animais.

[0087] O termo “introduzido”, no contexto de inserir um ácido nucléico em uma célula, significa “transfecção”, “transformação” ou “transdução”, e inclui referência à incorporação de um ácido nucléico em uma célula eucariótica ou procariótica, sendo que o ácido nucléico pode ser incorporado de maneira estável ao genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo ou DNA mitocondrial), ser convertido em um réplicon autônomo, ou ser expresso de maneira transitória (por exemplo, mRNA transfectado).

[0088] Podem ser selecionados os hospedeiros microbianos que são conhecidos por ocupar a “fitosfera” (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplano) de um ou mais cultivos de interesse. Esses microorganismos são selecionados de modo a serem capazes de, no ambiente específico, competir com sucesso contra os microorganismos de tipo selvagem, proporcionar manutenção e expressão estável das sequências que codificam o elemento silenciador e, desejavelmente, proporcionar proteção otimizada dos componentes contra degradação e inativação ambiental.

[0089] Esses micro-organismos incluem bactérias, algas e fungos. São de particular interesse os microrganismos como bactérias, por exemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, e Alcaligenes, fungos, particularmente levedura, por exemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasidium. São de particular interesse as espécies bacterianas da fitosfera, como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli e Azotobacter vinlandir, e espéices de levedura da fitosfera, como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae e Aureobasidium pollulans . De interesse particular são os micro-organismos pigmentados.

[0090] Inúmeras formas estão disponíveis para introdução do polinucleotídeo compreendendo o elemento silenciador no hospedeiro microbiano sob condições que permitam a manutenção e a expressão estáveis dessas sequências codificadoras de nucleotídeo. Por exemplo, podem ser construídos cassetes de expressão que incluem os construtos de nucleotídeo de interesse, funcionalmente ligados aos sinais regulatórios transcricional e traducional para expressão dos construtos de nucleotídeo, e uma sequência de nucleotídeo homóloga a uma sequência no organismo hospedeiro, de modo que ocorra integração, e/ou um sistema de replicação que é funcional no hospedeiro, de modo que ocorra integração ou manutenção estável.

[0091] Os sinais regulatórios transcricionais e traducionais incluem, mas não se limitam a, promotores, sítios de iniciação da transcrição, operadores, ativadores, intensificadores, outros elementos reguladores, sítios de ligação ribossômica, um códon de iniciação, sinais de terminação e similares. Consulte, por exemplo, as patentes US n°s 5.039.523 e 4.853.331; EPO 0480762A2; Sambrook et al. (2000); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY); Davis et al. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY); e as referências citadas no mesmo.

[0092] As células hospedeiras adequadas incluem os procariotos e os eucariotos inferiores, como os fungos. Os procariotos ilustrativos, tanto gram-negativos como gram-positivos, incluem Enterobacteriaceae, como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, como Rhizobium; Spirillaceae, como fotobactéria, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraceae e Nitrobacteraceae. Entre os eucariotos estão os fungos, como Phycomycetes e Ascomycetes, que inclui leveduras, como leveduras Saccharomyces e Schizosaccharomyces; e Basidiomycetes, como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces e similares.

[0093] As características de interesse específico na seleção de uma célula hospedeira para os propósitos da invenção incluem facilidade de introdução da sequência de codificação no hospedeiro, disponibilidade dos sistemas de expressão, eficiência da expressão, estabilidade no hospedeiro e a presença de capacidades genéticas auxiliares. As características de interesse para uso como microcápsula de pesticida incluem qualidades protetoras, como paredes celulares espessas, pigmentação e empacotamento intracelular ou formação de corpos de inclusão; afinidade com folhas; ausência de toxicidade a mamíferos; atratividade a pragas para ingestão e similares. Outras considerações incluem facilidade de formulação e manuseio, economia, estabilidade em armazenagem e similares.

[0094] Organismos hospedeiros de particular interesse incluem levedura, como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. e Sporobolomyces spp., organismos filoplanos, como Pseudomonas spp., Erwinia spp., e Flavobacterium spp., e outros organismos similares, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli , Bacillus subtilis, e similares.

[0095] As sequências que codificam os elementos silenciadores abrangidos pela invenção podem ser introduzidos nos microorganismos que se multiplicam em plantas (epífitas) para liberar esses componentes a possíveis pragas-alvo. As epífitas, por exemplo, podem ser bactérias gram-positivas ou gram-negativas.

[0096] O elemento silenciador pode ser fermentado em um hospedeiro bacteriano, e as bactérias resultantes são processadas e usadas como uma aspersão microbiana da mesma maneira que cepas de Bacillus thuringiensis foram usadas como aspersões inseticidas. Qualquer micro-organismo adequado pode ser usado para esse propósito. A título de exemplo, Pseudomonas tem sido usada para expressar endotoxinas de Bacillus thuringiensis como proteínas encapsuladas e as células resultantes processadas e pulverizadas como um inseticida, Gaertner et al. (1993), em Advanced Engineered Pesticides, ed. L. Kim (Marcel Decker, Inc.).

[0097] Alternativamente, os componentes da invenção são produzidos mediante a introdução de genes heterólogos em um hospedeiro celular. A expressão das sequências heterólogas resulta, direta ou indiretamente, na produção intracelular do elemento silenciador. Essas composições podem, então, ser formuladas de acordo com as técnicas convencionais para aplicação aos ambientes que abrigam uma praga-alvo, por exemplo o solo, a água e a folhagem de plantas. Consulte, por exemplo, EPA 0192319, e as referências ali citadas.

[0098] Na presente invenção, um microorganismo transformado pode ser formulado com um carreador aceitável em composições separadas ou combinadas que consistem, por exemplo, em uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um pó para polvilhamento, um grânulo dispersível, um pó molhável e um concentrado emulsificável, um aerossol, um grânulo impregnado, um adjuvante, uma pasta aplicável como revestimento, e também encapsulações em, por exemplo, substâncias poliméricas.

[0099] Essas composições apresentadas acima podem ser obtidas mediante a adição de um agente ativo de superfície, um veículo inerte, um conservante, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente de encapsulação, um aglutinante, um emulsificante, um corante, um protetor contra UV, um tampão, um agente de fluxo ou fertilizantes, doadores de micronutrientes, ou outras preparações que influenciem o crescimento vegetal. Um ou mais produtos agroquímicos incluindo, mas não se limitando a, herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, acaricidas, reguladores do crescimento vegetal, auxiliares de colheita e fertilizantes, podem ser combinados com veículos, tensoativos ou adjuvantes costumeiramente empregados na técnica de formulação, ou outros componentes para facilitar o manuseio e a aplicação do produto para pragas-alvo específicas. Os veículos e os adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos, e correspondem às substâncias ordinariamente empregadas na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, acentuadores de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. Os ingredientes ativos da presente invenção (isto é, pelo menos um elemento silenciador) são normalmente aplicados sob a forma de composições e podem ser aplicados à área de plantio, à planta ou a semente a ser tratada. Por exemplo, as composições podem ser aplicadas ao grão em preparação para o armazenamento, ou durante o mesmo, em um recipiente ou silo para grãos, etc. As composições podem ser aplicadas simultaneamente ou em sucessão com outros compostos. Os métodos para aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição que contém pelo menos um elemento silenciador incluem, mas não se limitam a, aplicação foliar, revestimento de semente e aplicação ao solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[0100] Os agentes ativos de superfície adequados incluem, mas não se limitam a, compostos aniônicos como um carboxilato de, por exemplo, um metal; carboxilato de um ácido graxo de cadeia longa; um sarcosinato de N-acila; mono ou diésteres de ácido fosfórico com etoxilatos de álcool graxo ou sais desses ésteres; sulfatos de álcool graxo como dodecil sulfato de sódio, octadecil sulfato de sódio, ou cetil sulfato de sódio; sulfatos de álcool graxo etoxilado; sulfatos de alquil fenol etoxilado; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de alquil arila como alquil-benzeno sulfonatos ou alquil naftaleno sulfonatos inferiores, por exemplo butil- naftaleno sulfonato; sais de condensados de naftaleno- formaldeído sulfonatado; sais de condensados de fenol- formaldeído sulfonatado; sulfonatos mais complexos como os sulfonatos de amida, por exemplo o produto da condensação sulfonatada de ácido oléico e N-metil taurina; ou os sulfosuccinatos de dialquila, por exemplo sulfonato de sódio ou succinato de dioctila. Os agentes não-iônicos incluem produtos de condensação de ésteres de ácido graxo, alcoóis graxos, amidas de ácido graxo, ou fenóis substituídos com alquila ou alquenila graxa com óxido de etileno, ésteres graxos de éteres de álcool poliídrico, por exemplo ésteres de ácido graxo de sorbitano, produtos de condensação de ésteres com óxido de etileno, por exemplo, ésteres de ácido graxo de polióxi etileno sorbitano, copolímeros de bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilênicos como 2,4,7,9-tetraetil-5-decin- 4,7-diol, ou glicóis acetilênicos etoxilados. Exemplos de um agente ativo de superfície catiônico incluem, por exemplo, um alifático mono-, di- ou poliamina como um acetato, naftenato ou oleato; ou amina contendo oxigênio como um óxido de amina de alquilamina de polióxi etileno; uma amina ligada a amido preparada pela condensação de um ácido carboxílico com uma diou poliamina; ou um sal de amônio quaternário.

[0101] Os exemplos de materiais inertes incluem, mas não se limitam a, minerais inorgânicos como caulim, filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos ou materiais botânicos como cortiça, sabugos de milho pulverizados, cascas de amendoim, cascas de arroz e cascas de noz.

[0102] As composições compreendendo o elemento silenciador podem estar em uma forma adequada para aplicação direta, ou sob a forma de um concentrado de composição primária que exige diluição com uma quantidade adequada de água ou outro diluente antes da aplicação.

[0103] As composições (incluindo os microorganismos transformados) podem ser aplicadas ao ambiente de uma praga de insetos (como uma praga de plantas do tipo coleóptero ou uma praga de plantas do tipo Diabrotica), por exemplo, mediante aspersão, atomização, polvilhamento, espalhamento, revestimento ou derramamento, introdução no solo ou sobre o mesmo, introdução na água de irrigação, mediante tratamento das sementes ou aplicação ou polvilhamento geral no momento em que a praga começar a aparecer, ou antes do aparecimento das pragas, como medida protetora. Por exemplo, as composições e/ou os microorganismos transformados podem ser misturados com os grãos para proteger os mesmos durante o armazenamento. É geralmente importante obter um bom controle de pragas nos estágios iniciais do crescimento vegetal, já que esse é o momento em que uma planta pode ser mais gravemente danificada. As composições podem convenientemente conter um outro inseticida se isso for considerado necessário. Em uma modalidade da invenção, as uma ou mais composições são aplicadas diretamente ao solo, no momento do plantio, sob a forma granular de uma composição com um carreador e células mortas de uma cepa de Bacillus ou o microorganismo transformado da invenção. Uma outra modalidade consiste em uma forma granular de uma composição compreendendo um produto agroquímico, como um herbicida, um inseticida ou um fertilizante, em um veículo inerte com células mortas de uma cepa de Bacillus, ou o microorganismo transformado da invenção.

VII. Plantas, partes de plantas e métodos para introdução de sequências em plantas

[0104] Em uma modalidade, os métodos da invenção envolvem introduzir um polinucleotídeo em uma planta. Para uso na presente invenção, “introduzir” destina-se a significar apresentar um polinucleotídeo à planta de modo que o polinucleotídeo obtenha acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introduzir uma sequência em uma planta, apenas precisam que o polinucleotídeo ou polipeptídeos obtenham acesso ao interior de pelo menos uma célula vegetal. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas são conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformação estável, métodos de transformação temporária e métodos mediados por vírus.

[0105] “Transformação estável” se destina a significar que o construto de nucleotídeo introduzido em uma planta se integra ao genoma da planta e é capaz de ser herdado pela sua progênie. “Transformação transitória” pretende significar que o polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra ao genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta.

[0106] Os protocolos de transformação e os protocolos para introduzir sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionada para a transformação. Métodos adequados de introduzir polipeptídeos e polinucleotídeos em células vegetais incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium- (patente US n° 5.563.055 e patente US n° 5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração balística de partículas (consulte, por exemplo, patentes US n°s 4.945.050; patente US n° 5.879.918; patente US n° 5.886.244 e 5.932.782; Tomes et al. (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação de Lec1 (WO 00/28058). Consulte também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); patentes US n°s 5.240.855; 5.322.783; e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maize); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; patente US n° 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), páginas 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por whisker); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho através de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência.

[0107] Em modalidades específicas, as sequências do elemento silenciador da invenção podem ser fornecidas a uma planta com o uso de uma variedade de métodos para transformação transitória. Tais métodos de transformação transitória incluem, mas não se limitam à introdução da proteína ou variantes e fragmentos da mesma diretamente na planta ou a introdução do transcrito na planta. Esses métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeio de partículas. Consulte, por exemplo, Crossway et al. (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura et al. (1986) Plant Sci. 44:53-58; Hepler et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 2176-2180 e Hush et al. (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784, todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência. Alternativamente, os polinucleotídeos podem ser transitoriamente transformados na planta com o uso de técnicas conhecidas na arte. Estas técnicas incluem um sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de forma a impossibilitar a liberação subsequente do DNA. Desta forma, a transcrição a partir do DNA ligado à partícula pode ocorrer, mas a frequência com a qual ele é liberado para se tornar integrado ao genoma é muito reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma n° P3143).

[0108] Em outras modalidades, o polinucleotídeo da invenção pode ser introduzido em plantas por colocar as plantas em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Em geral, estes métodos envolvem a incorporação de um construto de nucleotídeo da invenção em uma molécula de DNA ou RNA viral. Adicionalmente, é reconhecido que os promotores da invenção também incluem promotores utilizados para transcrição por RNA polimerases virais. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada por eles envolvendo moléculas de DNA ou RNA virais são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, as patentes US n°s 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 e Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; aqui incorporados por referência.

[0109] Métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em um local específico no genoma da planta são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é obtida usando um sistema de recombinação sítio específica. Consulte, por exemplo, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência. Resumidamente, o polinucleotídeo da invenção pode estar contido em um cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não recombinogênicos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que tem um sítio alvo incorporado de maneira estável no seu genoma que é flanqueado por dois sítios de recombinação não recombinogênicos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase adequada é fornecida e o cassete de transferência é integrado ao sítio- alvo. O polinucleotídeo de interesse é, portanto, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta.

[0110] As células que foram transformadas podem ser cultivadas para se tornarem plantas de acordo com maneiras convencionais. Consulte, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem, então, ser cultivadas, sejam polinizadas com a mesma linhagem transformada ou com linhagens diferentes, e a progênie resultante que tem expressão constitutiva da característica fenotípica pode ser identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de maneira estável e herdada e, então, as sementes são coletadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja alcançada. Dessa forma, a presente invenção fornece sementes transformadas (também chamadas de “sementes transgênicas”) que têm um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado de maneira estável no seu genoma.

[0111] Para uso na presente invenção, o termo planta inclui células vegetais, protoplastos de planta, culturas de tecido de célula vegetal a partir das quais plantas podem ser regeneradas, calos de planta, nódulos de plantas e células vegetais que são intactas em plantas ou partes de plantas, como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramificações, frutos, grãos, espigas, cascas, caules, raízes, pontas das raízes, anteras e similares. Grão se destina a significar a semente madura produzida por produtores comerciais para outros propósitos além do cultivo ou reprodução da espécie. A progênie, variantes, e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídos dentro do escopo da invenção, desde que essas partes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.

[0112] A presente invenção pode ser usada para a transformação de qualquer espécie vegetal, incluindo, mas não se limitando a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de espécies vegetais de interesse incluem, mas não se limitam a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), em particular as espécies de Brassica úteis como fontes de óleo, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), painço (por exemplo, mexoeira (Pennisetum glaucum), painço (Panicum miliaceum), painço-da-Itália (Setaria italica), Eleusine coracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, legumes, ornamentais e coníferas.

[0113] Os legumes comestíveis incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), vagem ( Phaseolus vulgaris), feijão-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), melão cantaloupe (C. cantalupensis) e melão almiscarado (C. melo). As plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortênsia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosa (Rosa spp.), tulipa (Tulipa spp.), narciso (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo.

[0114] As coníferas que podem ser empregadas na prática da presente revelação incluem, por exemplo, pinheiros como pinheiros loblolly (Pinus taeda), pinheiro americano (Pinus elliotii ), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro lodgepole (Pinus contorta) e pinheiro Monterey (Pinus radiata); abeto de Douglas- (Pseudotsuga menziesii); cicuta oriental (Tsuga canadensis); pinheiro-do-canadá (Picea glauca); sequoia ( Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como o abeto prata (Abies amabilis) e abeto de bálsamo (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca-( Chamaecyparis nootkatensis). Em modalidades específicas, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo (por exemplo, milho, alfalfa, girassol, Brassica, feijão-soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc.). Em outras modalidades, as plantas de milho, feijão-soja e cana-de-açúcar são ótimas e ainda em outras modalidades, as plantas de milho são ótimas.

[0115] Outras plantas de interesse incluem plantas de cereais que fornecem sementes de interesse, plantas de sementes oleaginosas e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de grãos como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. As plantas de sementes oleaginosas incluem algodão, feijão-soja, cártamo, girassol, Brassica, milho, alfalfa, palma, coco, etc. As plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, alfarrobeira, feno-grego, feijão-soja, feijões de jardim, feijão-caupi, feijão mungo, feijão-de-lima, feijão fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.

VIII. Empilhamento de traços na planta transgênica

[0116] As plantas transgênicas podem compreender uma pilha de um ou mais polinucleotídeos-alvo, conforme apresentado nas SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60 61, 64, 65, 68, 69, 72, 73, 76, 77, 80, 81, 84, 85, 88, 89, 92 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108 , 109, 112, 113 , 116, 117 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726 727, 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas, ou complementos das mesmas, conforme aqui revelado, com um ou mais polinucleotídeos adicionais resultando na produção ou supressão de múltiplas sequências de polinucleotídeos. As plantas transgênicas compreendendo pilhas de sequências de polinucleotídeos podem ser obtidas por métodos de reprodução tradicionais e/ou através de métodos de engenharia genética. Esses métodos incluem, mas não se limitam a, desenvolvimento de linhagens individuais, cada uma compreendendo um polinucleotídeo de interesse, transformar uma planta transgênica que compreende um construto de expressão compreendendo vários polinucleotídeos- alvo conforme apresentado na SEQ ID NOs : 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21 , 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 68, 69, 72, 73, 76, 77, 80, 81 , 84, 85, 88, 89, 92, 93 , 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 140, 141, 144, 145, 148, 149, 152, 153, 156, 157, 160, 161, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 176, 177, 180, 181, 184, 185, 188, 189, 192, 193, 196, 197, 200, 201, 204, 205, 208, 209, 212, 213, 216, 217, 220, 221, 224, 225, 228, 229, 232, 233, 236, 237, 240, 241, 244, 245, 248, 249, 252, 253, 256, 257, 260, 261, 264, 265, 268, 269, 272, 273, 276, 277, 280, 281, 284, 285, 288, 289, 292, 293, 296, 297, 300, 301, 304, 305, 308, 309, 312, 313, 316, 317, 320, 321, 324, 325, 328, 329, 332, 333, 336, 337, 340, 341, 344, 345, 348, 349, 352, 353, 356, 357, 360, 361, 364, 365, 368, 369, 372, 373, 376, 377, 380, 381, 384, 385, 388, 389, 392, 393, 396, 397, 400, 401, 404, 405, 408, 409, 412, 413, 416, 417, 420, 421, 424, 425, 428, 429, 432, 433, 436, 437, 440, 441, 444, 445, 448, 449, 452, 453, 456, 457, 460, 461, 464, 465, 468, 469, 472, 473, 476, 477, 480, 481, 484, 485, 488, 489, 492, 493, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 509, 512, 513, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 532, 533, 536, 537, 540, 541, 544, 545, 548, 549, 552, 553, 556, 557, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas, ou complementos das mesmas, conforme aqui revelado, com um gene subsequente e cotransformação de genes em uma única célula vegetal. Como usado aqui, o termo “empilhado” inclui ter as múltiplas características presentes na mesma planta (isto é, ambas as características são incorporadas no genoma nuclear, uma característica é incorporada no genoma nuclear e uma característica é incorporada no genoma de um plastídio ou ambas as características são incorporadas no genoma de um plastídio). Em um exemplo não-limitador, os “características empilhadas” compreendem uma pilha molecular onde as sequências estão fisicamente adjacentes umas as outras. Uma característica, como usado aqui, refere-se ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. A co-transformação de genes pode ser executada usando vetores únicos de transformação compreendendo múltiplos polinucleotídeos ou polinucleotídeos carregados separadamente em múltiplos vetores. Caso as sequências sejam empilhadas por transformação genética das plantas, as sequências de polinucleotídeos de interesse podem ser combinadas a qualquer momento e em qualquer ordem. As características podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação ou cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidos no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. É reconhecido ainda que as sequências de polinucleotídeos podem ser empilhadas em um local desejado no genoma com o uso de um sistema de recombinação sítio-específica. Consulte, por exemplo, WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 e WO 1999/25853, todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência.

[0117] Em algumas modalidades, os vários polinucleotídeos-alvo conforme apresentados nas SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 68, 69, 72, 73, 76, 77, 80, 81, 84, 85, 88, 89, 92, 93, 96, 97, 100, 101, 104, 125, 128, 149, 152, 173, 176, 197, 200, 221, 224, 245, 248, 269, 272, 293, 296, 317, 320, 341, 344, 365, 368, 389, 392, 413, 416, 437, 440, 461, 464, 485, 488, 509, 512, 533, 536, 557, 560, 571, 572, 583, 584, 595, 596, 607, 608, 619, 620, 631, 632, 643, 644, 655, 656, 667, 668, 105, 108, 129, 132, 153, 156, 177, 180, 201, 204, 225, 228, 249, 252, 273, 276, 297, 300, 321, 324, 345, 348, 369, 372, 393, 396, 417, 420, 441, 444, 465, 468, 489, 492, 513, 516, 537, 540, 561, 562, 573, 574, 585, 586, 597, 598, 609, 610, 621, 622, 633, 634, 645, 646, 657, 658, 669, 670, 109, 112, 133, 136, 157, 160, 181, 184, 205, 208, 229, 232, 253, 256, 277, 280, 301, 304, 325, 328, 349, 352, 373, 376, 397, 400, 421, 424, 445, 448, 469, 472, 493, 496, 517, 520, 541, 544, 563, 564, 575, 576, 587, 588, 599, 600, 611, 612, 623, 624, 635, 636, 647, 648, 659, 660, 671, 672, 113, 116, 137, 140, 161, 164, 185, 188, 209, 212, 233, 236, 257, 260, 281, 284, 305, 308, 329, 332, 353, 356, 377, 380, 401, 404, 425, 428, 449, 452, 473, 476, 497, 500, 521, 524, 545, 548, 565, 566, 577, 578, 589, 590, 601, 602, 613, 614, 625, 626, 637, 638, 649, 650, 661, 662, 673, 674, 117, 120, 141, 144, 165, 168, 189, 192, 213, 216, 237, 240, 261, 264, 285, 288, 309, 312, 333, 336, 357, 360, 381, 384, 405, 408, 429, 432, 453, 456, 477, 480, 501, 504, 525, 528, 549, 552, 567, 568, 579, 580, 591, 592, 603, 604, 615, 616, 627, 628, 639, 640, 651, 652, 663, 664, 675, 676, 121, 124, 145, 148, 169, 172, 193, 196, 217, 220, 241, 244, 265, 268, 289, 292, 313, 316, 337, 340, 361, 364, 385, 388, 409, 412, 433, 436, 457, 460, 481, 484, 505, 508, 529, 532, 553, 556, 569, 570, 581, 582, 593, 594, 605, 606, 617, 618, 629, 630, 641, 642, 653, 654, 665, 666, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724 725, 726, 727, 728 ou variantes ativas ou fragmentos das mesmas ou complementos das mesmas, conforme aqui revelado, sozinhos ou empilhados com uma ou mais característica adicional de resistência a insetos, podem ser empilhados com uma ou mais características de entrada adicionais (por exemplo, resistência a herbicida, resistência a fungo, resistência a vírus, tolerância a estresse, resistência a doença, esterilidade do macho, força do caule e similares) ou características de saída (por exemplo, produtividade, amidos modificados, perfil aumentado de óleo, aminoácidos balanceados, alta lisina ou metionina, digestibilidade aumentada, maior qualidade de fibras, resistência à seca, e similares). Desta forma, as modalidades de polinucleotídeos podem ser usadas para fornecer um pacote agronômico completo de qualidade aprimorada da cultura com a capacidade de controlar de forma flexível e econômica qualquer quantidade de pragas agrícolas.

[0118] Os transgenes úteis para empilhamento incluem, mas não se limitam àqueles, conforme descrito aqui abaixo. i. Transgenes que conferem resistência a insetos ou doenças:

[0119] (A) Genes de resistência a doenças da planta. As defesas da planta são frequentemente ativadas pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para elaboração de plantas que são resistentes a cepas específicas de patógeno. Consulte, por exemplo, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (clonagem do gene Cf-9 do tomate para resistência a Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (gene Pto do tomate para resistência a Pseudomonas syringae pv. ao tomate codifica uma proteína quinase); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089 (gene RSP2 da Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae), McDowell and Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178-83 and Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11(6):567-82. Uma planta resistente a uma doença é aquela que é mais resistente a um patógeno, em comparação à planta de tipo selvagem.

[0120] (B) Genes que codificam uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado sobre ela. Consulte, por exemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que revela a clonagem e a sequência de nucleotídeos do gene da delta-endotoxina de Bt. Além disso, moléculas de DNA que codificam genes da delta- endotoxina podem ser compradas junto à American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA), por exemplo, com os números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998. Outros exemplos não limitadores de transgenes de Bacillus thuringiensis sendo geneticamente manipulados são dados nas seguintes patentes e pedidos de patente e estão por meio desta incorporados a título de referência para este propósito: Patente US n°s 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; 5.986.177; 6.023.013. 6.060.594. 6.063.597. 6.077.824. 6.620.988. 6.642.030. 6.713.259. 6.893.826. 7.105.332; 7.179.965. 7.208.474; 7.227.056. 7.288.643. 7.323.556. 7.329.736. 7.449.552. 7.468.278. 7.510.878. 7.521.235. 7.544.862. 7.605.304. 7.696.412. 7.629.504. 7.705.216. 7.772.465. 7.790.846. 7.858.849 e WO 1991/14778; WO 1999/31248; WO 2001/12731; WO 1999/24581 e WO 1997/40162.

[0121] Genes codificano proteínas inseticidas também podem ser empilhados, incluindo, mas não se limitam a, proteínas inseticidas de Pseudomonas sp., como PSEEN3174 (Monalisina, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), da cepa CHA0 e Pf-5 (anteriormente fluorescens) de Pseudomonas protegens (Pechy- Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386: n° de acesso do Gen Bank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem. 58:12343-12349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101-118 and Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069), patente US n° 6.048.838 e patente US n° 6.379.946; e delta-endotoxinas inclindo, mas não se limitando a classes Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry 51 e Cry55 dos genes de delta-endotoxina e os genes Cyt1 e Cyt2 de B. thuringiensis cytolytic. Membros dessas classes de proteínas inseticidas de B. thuringiensis incluem, mas não se limitam a Cry1Aa1 (Accession #Accession #M11250), Cry1Aa2 (Accession #M10917), Cry1Aa3 (Accession #D00348), Cry1Aa4 (Accession #X13535), Cry1Aa5 (Accession #D17518), Cry1Aa6 (Accession #U43605), Cry1Aa7 (Accession #AF081790), Cry1Aa8 (Accession #I26149), Cry1Aa9 (Accession #AB026261), Cry1Aa10 (Accession #AF154676) , Cry1Aa11 (Accession #Y09663), Cry1Aa12 (Accession #AF384211) , Cry1Aa13 (Accession #AF510713), Cry1Aa14 (Accession #AY197341) , Cry1Aa15 (Accession #DQ062690), Cry1Ab1 (Accession #M13898), Cry1Ab2 (Accession #M12661), Cry1Ab3 (Accession #M15271), Cry1Ab4 (Accession #D00117), Cry1Ab5 (Accession #X04698), Cry1Ab6 (Accession #M37263), Cry1Ab7 (Accession #X13233), Cry1Ab8 (Accession #M16463), Cry1Ab9 (Accession #X54939), Cry1Ab10 (Accession #A29125), Cry1Ab11 (Accession #I12419), Cry1Ab12 (Accession #AF059670), Cry1Ab13 (Accession #AF254640) , Cry1Ab14 (Accession #U94191), Cry1Ab15 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[0122] Exemplos de delta-endotoxinas incluem, também, mas não se limitam a, proteínas Cry1A das patentes US n°s 5.880.275 e 7.858.849; uma toxina DIG-3 ou DIG-11 (deleção N-terminal das variantes alfa hélice 1 e/ou alfa hélice 2 das proteínas Cry, como Cry1A) da patente US n°s 8.304.604 e 8.304.605, Cry1B do pedido de patente US Ser. n° 10/525.318; Cry1C da patente US n° 6.033.874; Cry1F da patente US n° 5.188.960, 6.218.188; quimeras Cry1A/F da patente US n°s 7.070.982; 6.962.705 e 6.713.063); uma proteína Cry2, como a proteína Cry2Ab da patente US n° 7.064.249); uma proteína Cry3A que inclui, mas não se limita a uma proteína híbrida inseticida manipulada (eHIP) criada pela fusão de combinações únicas de regiões variáveis e blocos conservados de pelo menos duas proteínas Cry diferentes (publicação de pedido de patente US número 2010/0017914); uma proteína Cry4; uma proteína Cry5; uma proteína Cry6; proteínas Cry8 da patente US n°s 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 e 7.462.760; uma proteína Cry9, como membros das famílias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E e Cry9F; uma proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology 74:7145-7151; uma Cry22, uma proteína Cry34Ab1 da patente US n°s 6.127.180; 6.624.145 e 6.340.593; uma proteína CryET33 e CryET34 da patente US n°s 6.248.535, 6.326.351, 6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 e 7.504.229; um CryET33 e CryET34 homólogos da publicação de patente n° 2006/0191034, 2012/0278954, e publicação n° PCT WO 2012/139004; uma proteína Cry35Ab1 da patente US n°s 6.083.499, 6.548.291 e 6.340.593; uma proteína Cry46, uma proteína Cry 51, uma toxina binária Cry; uma TIC901 ou toxina relacionada; TIC807 da US 2008/0295207; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 de PCT US 2006/033867; AXMI-027, AXMI-036 e AXMI-038 da patente US n° 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI- 049 da patente US n° 7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 e AXMI-021 da WO 2006/083891; AXMI-010 da WO 2005/038032; AXMI-003 da WO 2005/021585; AXMI-008 da US 2004/0250311; AXMI-006 da US 2004/0216186; AXMI-007 da US 2004/0210965; AXMI-009 da US 2004/0210964; AXMI-014 da US 2004/0197917; AXMI-004 da US 2004/0197916; AXMI-028 e AXMI-029 da WO 2006/119457; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080rf2, AXMI-009, AXMI-014 e AXMI-004 da WO 2004/074462; AXMI-150 da patente US n° 8.084.416; AXMI-205 da US20110023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI- 019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI- 022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 e AXMI-064 da US 2011/0263488; AXMI-R1 e proteínas relacionadas da US 2010/0197592; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z e AXMI225z da WO 2011/103248; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 e AXMI231 da WO11/103.247; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 e AXMI- 184 da patente US n° 8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 e AXMI-045 da US 2010/0298211; AXMI-066 e AXMI-076 da US20090144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 da patente US n° 8.318.900; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 da US 2010/0005543; proteínas Cry, como Cry1A e Cry3A tendo sítios proteolíticos modificados da patente US n° 8.319.019; e uma proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa e Cry1Ca de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 da publicação de pedido de patente US n° 2011/0064710. Outras proteínas Cry são bem conhecidas de um versado na técnica (consulte, Crickmore, et al., “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser acessado na internet usando o prefixo “www”). A atividade inseticida das proteínas Cry é bem conhecida de um versado na técnica (para uma revisão, consulte, van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1-16). O uso de proteínas Cry como características de planta transgênica é bem conhecido de um versado na técnica e plantas transgênicas para Cry incluindo, mas não se limitando a Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam aprovação regulamentar (consulte, Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 e o banco de dados CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C., EUA em cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database que pode ser acessada na internet usando o prefixo “www”). As proteínas pesticidas também incluem lipases inseticidas incluindo lipídio acil hidrolases da patente US n° 7.491.869, e colesterol oxidases, como as de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). As proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas) da patente US n°s. 5.877.012, 6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 e 8.237.020 e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas do versado na técnica (consulte, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, que pode ser acessado na internet usando o prefixo “www”). As proteínas pesticidas incluem, também proteínas do complexo de toxina (TC), que podem ser obtidas a partir de organismos como Xenorhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consulte, patentes US n°s 7.491.698 e 8.084.418). Algumas proteínas TC têm atividade inseticida “independente” e outras proteínas TC acentuam a atividade das toxinas independentes produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC “independente” (de Photorhabdus, Xenorhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser intensificada por um ou mais “potenciadores” da proteína TC derivados de um organismo-fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme mencionado na presente invenção, proteínas da classe A (“proteína A”) são toxinas independentes. As proteínas da classe B (“proteína B”) e as proteínas da classe C (“proteína C”) acentuam a toxicidade das proteínas de classe A. Exemplos de proteínas de classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Exemplos de proteínas de classe B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Exemplos de proteínas de classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. As proteínas pesticidas incluem, também, proteínas do veneno de aranha, cobra e escorpião. Exemplos de peptídeos do veneno de aranha incluem, mas não se limitam a peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente US número 8.334.366).

[0123] (C) Um polinucleotídeo que codifica um hormônio ou feromônio específico de inseto como, por exemplo, um hormônio ecdisteroide e juvenil, uma variante do mesmo, um mimético com base no mesmo ou um antagonista ou agonista do mesmo. Consulte, por exemplo, a revelação de Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, de expressão em baculovírus da esterase do hormônio juvenil clonado, um inativador do hormônio juvenil.

[0124] (D) Um polinucleotídeo que codifica um peptídeo específico de insetos que, mediante expressão, atrapalha a fisiologia da praga afetada. Por exemplo, consulte as revelações de Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (clonagem de expressão fornece DNA que codifica o receptor do hormônio diurético de insetos); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (uma alostatina é identificada em Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33-54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300-310; Carlini and Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1515-1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847- 853 e Vasconcelos and Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385-403. Consulte também, patente US n° 5.266.317 concedida a Tomalski, et al., que revela genes que codificam toxinas específicas de inseto.

[0125] (E) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima responsável por um excesso de acúmulo de um monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, um ácido hidroxâmico, um derivado fenilpropanoide ou outra molécula não-proteica com atividade inseticida.

[0126] (F) Um polinucleotídeo que codifica uma enzima envolvida na modificação, inclusive na modificação pós- traducional, de uma molécula biologicamente ativa, por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, sejam estas naturais ou sintéticas. Consulte, o pedido PCT WO 1993/02197 em nome de Scott, et al., que revela a sequência de nucleotídeos de um gene da calase. As moléculas de DNA contendo sequências codificadoras da quitinase podem ser obtidas, por exemplo, junto à ATCC sob os números de acesso 39637 e 67152. Consulte, também, Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que mostra a sequência de nucleotídeos de um cDNA que codifica quitinase do ancilóstomo do tabaco e Kawalleck, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:673, que fornece a sequência de nucleotídeos do gene ubi4-2 da poliubiquitina de salsa e as patentes US n°s 6.563.020; 7.145.060 e 7.087.810.

[0127] (G) Um polinucleotídeo que codifica uma molécula que estimula a transdução de sinal. Por exemplo, vide a descrição de Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757, de sequências de nucleotídeos para os clones de cDNA da calmodulina de feijão mungo, e Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, que fornece a sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA da calmodulina de milho.

[0128] (H) Um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de momento hidrofóbico. Consulte, o pedido PCT WO 1995/16776 e a patente US n° 5.580.852 que revela os derivados do peptídeo da taquiplesina que inibe os patógenos fúngicos de plantas) e o pedido de PCT WO 1995/18855 e a patente US n° 5.607.914 (que mostra os peptídeos sintéticos antimicrobianos que conferem resistência à doença).

[0129] (I) Um polinucleotídeo que codifica uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal. Por exemplo, consulte a revelação de Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, da expressão heteróloga de um análogo do peptídeo lítico de cecropina-beta para tornar plantas de tabaco transgênicas resistentes à Pseudomonas solanacearum.

[0130] (J) Um gene que codifica uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada dela. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento viral nas células vegetais transformadas confere resistência à infecção viral e/ou ao desenvolvimento da doença causada pelo vírus do qual é derivado o gene para proteína de revestimento, bem como por vírus relacionados. Consulte Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:451. A resistência mediada por proteína de revestimento foi conferida a plantas transformadas contra o vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da estria do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus de “etch” do tabaco, vírus de “rattle” do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Id.

[0131] (K) Um gene que codifica um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo que tem como alvo uma função metabólica de importância crítica nos intestinos do inseto desativaria uma enzima afetada, exterminando o inseto. Cf. Taylor, et al., resumo n° 497, SEVENTH INT’L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escócia, 1994) (inativação enzimática em tabaco transgênico através da produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única).

[0132] (L) Um gene que codifica um anticorpo vírus-específico. Consulte, por exemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que mostra que plantas transgênicas que expressam genes de anticorpo recombinante são protegidas do ataque do vírus.

[0133] (M) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína que bloqueia o desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Assim, as endo alfa-1,4-D- poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização por fungos e a liberação de nutrientes pela planta mediante a solubilização da parede celular vegetal por homo-alfa-1,4-D- galacturonase. Consulte, Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína inibidora da endopoligalacturonase de feijão são descritas por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367.

[0134] (N) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína que bloqueia o desenvolvimento produzida na natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305, mostrou que plantas transgênicas que expressam o gene inativador de ribossoma de cevada possuem uma resistência aumentada à doença fúngica.

[0135] (O) Os genes envolvidos na resposta a resistência sistêmica adquirida (SAR, ou “Systemic Acquired Resistance”) e/ou os genes relacionados à patogênese. Briggs, (1995) Current Biology 5(2), Pieterse e Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456-64 and Somssich, (2003) Cell 113(7):815-6.

[0136] (P) Genes antifúngicos (Cornelissen and Melchers, (1993) Pl. Physiol. 101:709-712 e Parijs, et al., (1991) Planta 183:258-264 and Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137-149. Consulte também pedido de patente US Ser. n°s 09/950.933; 11/619.645; 11/657.710; 11/748.994; 11/774.121 e patente US n°s 6.891.085 e 7.306.946. Quinases semelhantes ao receptor LysM da percepção de fragmentos de quitina como uma primeira etapa na resposta de defesa da planta contra patógenos fúngicos (US 2012/0110696).

[0137] (Q) Genes de desintoxicação, como aqueles da fumonisina, bovericina, moniliformina e zearalenona, bem como seus derivados estruturalmente relacionados. Por exemplo, consulte a patente US n°s 5.716.820, 5.792.931, 5.798.255, 5.846.812, 6.083.736, 6.538.177, 6.388.171 e 6.812.380.

[0138] (R) Um polinucleotídeo que codifica inibidores da cistatina e cisteína proteinase. Consulte a patente US n° 7.205.453.

[0139] (S) Genes da defensina. Consulte WO 2003/000863 e as patentes US n°s 6.911.577, 6.855.865; 6.777.592 e 7.238.781.

[0140] (T) Genes que conferem resistência a nematódeos. Consulte o pedido PCT WO 1996/30517, o pedido PCT WO 1993/19181, WO 2003/033651 e Urwin, et al., (1998) Planta 204:472-479, Williamson, (1999) Curr Opin Plant Bio. 2(4):327- 31; patente US n°s 6.284.948 e 7.301.069 e os genes miR164 (WO 2012/058266).

[0141] (U) Genes que conferem resistência à podridão da raiz de Phytophthora, como os genes Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2, Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 e outros genes Rps. Consulte, por exemplo, Shoemaker, et al., Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean, Plant Genome IV Conference, San Diego, Califórnia, EUA. (1995).

[0142] (V) Genes que conferem resistência à podridão parda da haste, conforme descrito na patente US n° 5.689.035 e incorporada por referência para esse propósito.

[0143] (W) Genes que conferem resistência ao Colletotrichum, tal como descrito na publicação de pedido de patente US 2009/0035765 e incorporada a título de referência para este propósito. Isto inclui o locus Rcg que pode ser usado como uma conversão de locus único.

ii. Transgenes que conferem resistência a um herbicida.

[0144] (A) Um polinucleotídeo que codifica resistência a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, como uma imidazolinona ou uma sulfonilureia. Genes exemplificadores nesta categoria codificam as enzimas ALS e AHAS mutantes, conforme descrito, por exemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241 e Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Consulte também, as patentes US n°s 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 e 5.378.824; pedido de patente US Ser. n° 11/683.737 e publicação internacional WO 1996/33270.

[0145] (B) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína para resistência ao glifosato (resistência conferida pelos genes da 5-enolpiruvil-3-fosfochiquimato sintase (EPSP) e aroA mutantes, respectivamente) e outros compostos fosfono como, por exemplo, glufosinato (genes de fosfinotricina acetil transferase (PAT) e fosfinotricina acetil transferase de Streptomyces hygroscopicus (bar)) e ácidos piridinoxi ou fenóxi propiônicos e ciclo- hexonas (genes que codificam o inibidor de ACCase). Consulte, por exemplo, a patente US n° 4.940.835 concedida a Shah et al., que apresenta a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSPS que pode conferir resistência ao glifosato. A patente US n° 5.627.061 concedida a Barry et al. também descreve genes que codificam enzimas EPSPS. Consulte também, as patentes US n°s 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 5.094.945. 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E e 5.491.288 e publicações internacionais EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 e EP 1173582, as quais estão aqui incorporadas a título de referência.

[0146] A resistência ao glifosato é também conferida a plantas que expressam um gene codificando uma enzima glifosato óxido- redutase, conforme descrito em mais detalhes nas patentes US n°s 5.776.760 e 5.463.175, as quais estão aqui incorporadas a título de referência para este propósito. Além disso, a resistência ao glifosato pode ser conferida a plantas mediante a superexpressão de genes que codificam a glifosato N- acetiltransferase. Consulte, por exemplo, as patentes US n°s 7.462.481; 7.405.074 e a publicação de pedido de patente US n° US 2008/0234130. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob o número de acesso ATCC 39256, e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é apresentada na patente US n° 4.769.061 concedida a Comai. Pedido EP n° 0 333 033 concedido a Kumada, et al., e patente US n° 4.975.374 concedida a Goodman, et al., apresentam sequências de nucleotídeos de genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene da fosfinotricina-acetil-transferase é fornecida nos pedidos EP n°s 0.242.246 e 0.242.236 de Leemans, et al. De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61, que descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos codificando a atividade de fosfofinotricina acetil transferase. Consulte também, as patentes US n°s 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 e 5.879.903, as quais estão aqui incorporadas a título de referência para esse propósito. Exemplos de genes que conferem resistência a ácidos fenóxi propiônicos e ciclo-hexonas, como, por exemplo, setoxidima e haloxifope são os genes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.

[0147] (C) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína para resistência a um herbicida que inibe a fotossíntese, como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169, descrevem a transformação de Chlamydomonas com plasmídios que codificam genes psbA mutantes. As sequências de nucleotídeos dos genes da nitralase são reveladas na patente US n° 4.810.648 concedida a Stalker e moléculas de DNA contendo estes genes estão disponíveis com os números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão de DNA que codifica uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.

[0148] (D) Um polinucleotídeo que codifica uma proteína para resistência à aceto-hidróxi ácido sintase que, conforme observado, torna as plantas que expressam esta enzima resistentes a múltiplos tipos de herbicidas, foi introduzido em uma variedade de plantas (consulte, por exemplo, Hattori, et al., (1995) Mol Gen Genet. 246:419). Outros genes que conferem resistência a herbicidas incluem: um gene codificando uma proteína quimérica de citocromo de rato P4507A1 e óxido redutase de citocromo NADPH de levedura P450 (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol. 106:17), genes para glutationa redutase e superóxido dismutase (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1687, e genes para várias fosfotransferases (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619).

[0149] (E) Um polinucleotídeo que codifica resistência a um herbicida que direciona a protoporfirinogênio oxidase (Protox) que é necessária para a produção de clorofila. A enzima Protox serve como alvo para uma variedade de compostos herbicidas. Esses herbicidas também inibem o crescimento de todas as diferentes espécies de plantas presentes, causando sua total destruição. O desenvolvimento de plantas contendo atividade alterada de Protox que são resistentes a estes herbicidas é descrito nas patentes US n°s 6.288.306 B1; 6.282.837 B1 e 5.767.373 e na publicação internacional WO 2001/12825.

[0150] (F) O gene aad-1 (originalmente de Sphingobium herbicidovorans) codifica a proteína ariloxialcanoato desoxigenase (AAD-1). A característica confere tolerância aos herbicidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ariloxifenoxipropionato (comumente denominados herbicidas “fop”, tal como quizalofope). O gene aad-1 em si, para tolerância a herbicida em plantas, foi primeiramente apresentado no documento WO 2005/107437 (consulte também, US 2009/0093366). O gene aad-12, derivado de Delftia acidovorans, que codifica a proteína arilóxi alcanoato desoxigenase (AAD- 12) que confere tolerância aos herbicidas ácido 2,4- diclorofenoxiacético e piridiloxi acetato pela desativação de vários herbicidas com uma porção ariloxi alcanoato, inclusive fenóxi auxina (por exemplo, 2,4-D, MCPA), assim como piridiloxi auxinas (por exemplo, fluroxipir, triclopir).

[0151] (G) Um polinucleotídeo que codifica uma dicamba mono oxigenase resistente a herbicida apresentado na publicação de pedido de patente US 2003/0135879 para conferir tolerância à dicamba.

[0152] (H) Uma molécula de polinucleotídeo que codifica bromoxinil nitrilase (Bxn) revelada na patente US n° 4.810.648 para conferir tolerância a bromoxinil.

[0153] (I) Uma molécula de polinucleotídeo em fitoeno (crtl) descrita em Misawa, et al., (1993) Plant J. 4:833 a 840 e em Misawa, et al., (1994) Plant J. 6:481 a 489 para tolerância a norflurazon.

iii. Transgenes que conferem ou contribuem para uma característica alterada para os grãos

[0154] (A) Ácidos graxos alterados, por exemplo, pela (1) regulação negativa da estearoil-ACP para aumentar o teor de ácido esteárico da planta. Consulte, Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 e WO 1999/64579 (Genes to Alter Lipid Profiles in Corn); (2) aumento do ácido oleico através da modificação do gene FAD-2 e/ou redução no ácido linolênico através da modificação do gene FAD-3 (consulte a patente US n°s 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 e WO 1993/11245); (3) alteração do teor do conjugado linolênico ou ácido linoléico, como em WO 2001/12800; (4) alteração de LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mil ps, vários genes Ipa, como Ipa1, Ipa3, hpt ou hggt. Por exemplo, consulte WO 2002/42424, WO 1998/22604, WO 2003/011015, WO 2002/057439, WO 2003/011015, patente US n°s 6.423.886, 6.197.561, 6.825.397 e publicação de pedido de patente US n°s 2003/0079247, 2003/0204870 e Rivera- Madrid, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5620-5624; (5) Genes codificando a delta-8 desaturase para produzir cadeias longas de ácidos graxos poliinsaturados (patente US n°s 8.058.571 e 8.338.152), delta-9 desaturase para reduzir as gorduras saturadas (patente US n° 8.063.269), Primula. DELTA 6-desaturase para otimizar os perfis de ácidos graxos ômega-3; (6) Ácidos nucleicos isolados e proteínas associadas com a regulação do metabolismo de lipídios e açúcares, em particular, a proteína do metabolismo de lipídio (LMP) usada em métodos para produzir plantas transgênicas e modular os níveis de compostos de armazenamento na semente inclusive lipídios, ácidos graxos, amidos ou proteínas de armazenamento da semente e uso em métodos para modulação do tamanho da semente, número de sementes, pesos da semente, comprimento da raiz e tamanho da folha das plantas (EP 2404499); (7) Alterar a expressão de uma expressão de alto nível da proteína induzível por açúcar 2 (HSI2) na planta para aumentar ou reduzir a expressão de HSI2 na planta. Aumentar a expressão de HSI2 aumenta o conteúdo de óleo, enquanto reduzir a expressão de HSI2 reduz a sensibilidade ao ácido abscísico e/ou reduz a resistência à seca (publicação de pedido de patente US n° 2012/0066794); (8) Expressão do citocromo b5 (Cb5) sozinho ou com FAD2 para modular o conteúdo de óleo na semente da planta, em particular, para aumentar os níveis de ácidos graxos ômega 3 e otimizar a razão de ácidos graxos ômega 6 para ômega 3 (publicação de pedido de aplicação US n° 2011/0191904); e (9) Moléculas de ácido nucleico codificando polipeptídeos do tipo wrinkled1 para modular o metabolismo do açúcar (patente US n° 8.217.223).

[0155] (B) O conteúdo de fósforo alterado, por exemplo, pela (1) introdução de um gene codificando fitase acentuaria a decomposição de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. Consulte, por exemplo, Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para uma descrição da sequência de nucleotídeos de um gene de fitase de Aspergillus niger, e (2) a modulação de um gene que reduz o conteúdo de fitato. No milho isto poderia ser obtido, por exemplo, mediante a clonagem seguida de reintrodução do DNA associado a um ou mais dos alelos, como os alelos LPA, identificados em mutantes de milho caracterizados por baixos teores de ácido fítico, como no WO 2005/113778 e/ou mediante a alteração da atividade de inositol quinase como no WO 2002/059324, publicação de pedido de patente US n° 2003/0009011, WO 2003/027243, publicação de pedido de patente US n° 2003/0079247, WO 1999/05298, patente US n° 6.197.561, patente US n° 6.291.224, patente US n° 6.391.348, WO 2002/059324, publicação de pedido de patente US n° 2003/0079247, WO 1998/45448, WO 1999/55882, WO 2001/04147.

[0156] (C) Alteração nos carboidratos afetados, por exemplo, pela alteração de um gene por uma enzima que afeta o padrão de ramificação do amido ou um gene que altera a tiorredoxina, como NTR e/ou TRX (consulte, a patente US n° 6.531.648 que está incorporada a título de referência para esse propósito) e/ou uma inativação da gama zeína ou mutante como cs27 ou TUSC27 ou en27 (consulte, a patente US n° 6.858.778 e a publicação de pedido de patente US n° 2005/0160488, publicação de pedido de patente US n° 2005/0204418, que estão aqui incorporadas a título de referência para esse propósito). Consulte, Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (sequência de nucleotídeos do gene mutante da fructosiltransferase de Streptococcus), Steinmetz, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (sequência de nucleotídeos do gene levansucrase de Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (produção de plantas transgênicas que expressam alfa-amilase de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. Biol. 21:515 (sequências de nucleotídeos dos genes da tomate invertase), S0gaard, et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (mutagênese sítio-dirigida do gene da alfa-amilase da cevada) e Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima II da ramificação do amido do endosperma de milho), WO 1999/10498 (digestibilidade melhorada e/ou extração através da modificação da UDP-D-xilose 4- epimerase, Fragil 1 e 2, Ref1, HCHL, C4H), patente US n° 6.232.529 (método de produção da semente de óleo alto pela modificação dos níveis de amido (AGP)). Os genes da modificação de ácidos graxos mencionados na presente invenção podem, também, ser usados para afetar o teor e/ou a composição de amido através da interrelação das rotas de amido e óleo.

[0157] (D) Alteração no teor ou na composição de antioxidantes, como alteração do tocoferol ou dos tocotrienóis. Por exemplo, consulte a patente US n° 6.787.683, publicação de pedido de patente US n° 2004/0034886 e WO 2000/68393 envolvendo a manipulação dos níveis de antioxidantes e WO 2003/082899 através da alteração de uma homogentisato geranil geranil transferase (hggt).

[0158] (E) Aminoácidos essenciais da semente alterados. Por exemplo, consulte a patente US n° 6.127.600 (método para aumentar o acúmulo dos aminoácidos essenciais em sementes), patente US n° 6.080.913 (métodos binários para aumentar o acúmulo dos aminoácidos essenciais em sementes), patente US n° 5.990.389 (alto teor de lisina), WO 1999/40209 (alteração das composições de aminoácido nas sementes), WO 1999/29882 (métodos para alterar o teor de aminoácidos alterados de proteínas), patente US n° 5.850.016 (alteração das composições de aminoácidos nas sementes), WO 1998/20133 (proteínas com níveis aumentados de aminoácidos essenciais), patente US n° 5.885.802 (alto teor de metionina), patente US n° 5.885.801 (alto teor de treonina), patente US n° 6.664.445 (enzimas biossintéticas de aminoácidos de plantas), patente US n° 6.459.019 (lisina e treonina aumentadas), patente US n° 6.441.274 (subunidade beta da triptofano sintase de plantas), patente US n° 6.346.403 (enzimas metabólicas da metionina), patente US n° 5.939.599 (alto teor de enxofre), patente US n° 5.912.414 (metionina aumentada), WO 1998/56935 (enzimas biossintéticas do aminoácido de plantas), WO 1998/45458 (proteína de semente manipulada tendo porcentagem mais alta de aminoácidos essenciais), WO 1998/42831 (lisina aumentada), patente US n° 5.633.436 (teor de aminoácido de enxofre aumentado), patente US n° 5.559.223 (proteínas de armazenamento sintético com teores programáveis contendo estrutura definida de aminoácidos essenciais para o aprimoramento do valor nutricional das plantas), WO 1996/01905 (treonina aumentada), WO 1995/15392 (lisina aumentada), publicação de pedido de patente US n° 2003/0163838, publicação de pedido de patente US n° 2003/0150014, publicação de pedido de patente US n° 2004/0068767, patente US n° 6.803.498, WO 2001/79516. iv. Genes que controlam a esterilidade masculina

[0159] Há vários métodos que conferem esterilidade masculina genética disponíveis, como múltiplo genes mutantes em locais separados dentro do genoma que conferem esterilidade masculina, conforme revelado na patente US n°s 4.654.465 e 4.727.219 conferidas a Brar, et al., e translocações cromossômicas, conforme descrito por Patterson na patente US n°s 3.861.709 e 3.710.511. Além desses métodos, Albertsen, et al., patente US n° 5.432.068, descrevem um sistema de esterilidade masculina nuclear que inclui: identificar um gene que é crítico para a fertilidade masculina; silenciar esse gene nativo que é crítico para a fertilidade masculina; remover o promotor ativo do gene essencial da fertilidade masculina e substituir por um promotor induzível; inserir esse gene geneticamente manipulado de volta na planta e criar, desse modo, uma planta com esterilidade masculina porque o promotor induzível não está “ligado”, fazendo com que o gene da esterilidade masculina não seja transcrito. A fertilidade é restaurada induzindo ou “ligando” o promotor, o que, por sua vez, permite que o gene que confere fertilidade masculina seja transcrito. Exemplos não limitadores incluem: (A) Introdução de um gene da desacetilase sob o controle de um promotor específico do tapetum e com a aplicação da substância química N-Ac-PPT (WO 2001/29237); (B) Introdução de vários promotores específicos para o estame (WO 1992/13956, WO 1992/13957); e (C) Introdução da barnase e do gene barstar (Paul, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 19:611-622). Para exemplos adicionais de sistemas de esterilidade nuclear masculinos e femininos, consulte também as patentes US n°s 5.859.341; 6.297.426; 5.478.369; 5.824.524; 5.850.014 e 6.265.640, todas as quais estão aqui incorporadas, a título de referência.

v. Genes que criam um sítio para uma integração de DNA sítio- específica .

[0160] Isso inclui a introdução de sítios FRT que podem ser usados no sistema FLP/FRT, e/ou sítios Lox que podem ser usados no sistema Cre/Loxp. Por exemplo, consulte, Lyznik, et al., (2003) Plant Cell Rep 21:925-932 e WO 1999/25821, que estão aqui incorporados, por referência. Outros sistemas que podem ser usados incluem a Gln recombinase de bacteriófago Mu (Maeser, et al., (1991) Vicki Chandler, The Maize Handbook capítulo 118 (Springer-Verlag 1994), a Pin recombinase de E. coli (Enomoto, et al., 1983) e o sistema R/RS do plasmídeo pSRi (Araki, et al., 1992).

vi. Genes que afetam a resistência ao estresse abiótico

[0161] Incluindo, mas não se limitando a floração, panícula/glume e desenvolvimento de semente, intensificação da eficiência de utilização de nitrogênio, capacidade de resposta alterada do nitrogênio, resistência ou tolerância à seca, resistência ou tolerância ao frio, e resistência ou tolerância ao sal e produtividade aumentada sob condições de estresse. Exemplos não limitadores incluem: (A) Por exemplo, consulte: WO 2000/73475 em que a eficiência do uso de água é alterada através da alteração de malato; patente US n°s 5.892.009, 5.965.705, 5.929.305, 5.891.859, 6.417.428, 6.664.446, 6.706.866, 6.717.034, 6.801.104, WO 2000/060089, WO 2001/026459, WO 2001/035725, WO 2001/034726, WO 2001/035727, WO 2001/036444, WO 2001/036597, WO 2001/036598, WO 2002/015675, WO 2002/017430, WO 2002/077185, WO 2002/079403, WO 2003/013227, WO 2003/013228, WO 2003/014327, WO 2004/031349, WO 2004/076638, WO 199809521; (B) WO 199938977 que descrevem genes, inclusive genes CBF e fatores de transcrição eficazes para mitigar os efeitos negativos de congelamento, alta salinidade e seca sobre as plantas, bem como para conferir outros efeitos positivos sobre o fenótipo da planta; (C) publicação de pedido de patente US n° 2004/0148654 e WO 2001/36596, onde o ácido abscísico é alterado nas plantas, resultando em fenótipo aprimorado das plantas, como rendimento aumentado e/ou tolerância aumentada ao estresse abiótico; (D) WO 2000/006341, WO 2004/090143, patente US n°s 7.531.723 e 6.992.237, nos quais a expressão da citocinina é modificada, resultando em plantas com tolerância ao estresse aumentada, como tolerância à seca, e/ou produtividade aumentada. Consulte, também, WO 2002/02776, WO 2003/052063, JP 2002/281975, patente US n° 6.084.153, WO 2001/64898, patente US n° 6.177.275 e patente US n° 6.107.547 (melhoramento da utilização do nitrogênio e capacidade de resposta ao nitrogênio alterada); (E) Para a alteração no etileno, consulte a publicação de pedido de patente US n° 2004/0128719, a publicação de pedido de patente US n° 2003/0166197 e WO 2000/32761; (F) Para fatores de transcrição vegetal ou reguladores da transcrição do estresse abiótico, consulte, por exemplo, a publicação de pedido de patente US n° 2004/0098764 ou a publicação de pedido de patente US n° 2004/0078852; (G) Genes que aumentam a expressão da pirofosfatase vacuolar como AVP1 (patente US n° 8.058.515) para produtividade aumentada; ácido nucleico codificando um polipeptídeo HSFA4 ou HSFA5 (fator de choque térmico da classe A4 ou A5), um polipeptídeo da proteína transportadora de oligopeptídeo (do tipo OPT4), um polipeptídeo do tipo plastocrono 2 (do tipo PLA2) ou polipeptídeo do tipo homeobox 1 relacionado a Wuschel (tipo WOX1) (publicação de pedido de patente US n° 2011/0283420); (H) Regulação negativa de polinucleotídeos codificando a proteína poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) para modular a morte celular programada (patente US n° 8.058.510) para vigor aumentado; (I) Polinucleotídeo codificando polipeptídeos DTP21 para conferir resistência à seca (publicação de pedido de patente n° US 2011/0277181); (J) Sequências de nucleotídeo codificando as proteínas ACC sintase 3 (ACS3) para modular o desenvolvimento, modular a resposta ao estresse e modular a tolerância ao estresse (publicação de pedido de patente n° US 2010/0287669); (K) Polinucleotídeos que codificam proteínas que conferem um fenótipo de tolerância à seca (DTP) para conferir resistência à seca (WO 2012/058528); (L) genes da Tocoferol ciclase (TC) para conferir tolerância à seca e ao sal (publicação de pedido de patente n° 2012/0272352); (M) CAAX proteínas da família amino terminal para tolerância ao estresse (patente US n° 8.338.661); (N) Mutações no gene codificando SAL1 têm tolerância aumentada ao estresse, incluindo resistência aumentada à seca (publicação de pedido de patente US 2010/0257633); (O) Expressão de um sequência de ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo selecionado de um grupo que consiste em: polipeptídeo GRF, polipeptídeo do tipo RAA1, polipeptídeo SYR, polipeptídeo ARKL e polipeptídeo YTP aumentando as características relacionadas à produtividade (publicação de pedido de patente n° 2011/0061133); e (P) Modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo Trealose Fosfato Fosfatase (TPP) de classe III para acentuar as características relacionadas à produtividade em plantas, aumentando particularmente a produtividade de sementes (publicação de pedido de patente n° 2010/0024067).

[0162] Outros genes e fatores de transcrição que afetam o crescimento vegetal e características agronômicas, como produtividade, florescência, crescimento da planta e/ou estrutura da planta, podem ser introduzidos ou introgredidos nas plantas, consulte, por exemplo, WO 1997/49811 (LHY), WO 1998/56918 (ESD4), WO 1997/10339 e patente US n° 6.573.430 (TFL), patente US n° 6.713.663 (FT), WO 1996/14414 (CON), WO 1996/38560, WO 2001/21822 (VRN1), WO 2000/44918 (VRN2), WO 1999/49064 (GI), WO 2000/46358 (FR1), WO 1997/29123, patente US n° 6.794.560, patente US n° 6.307.126 (GAI), WO 1999/09174 (D8 e Rht) e WO 2004/076638 e WO 2004/031349 (fatores de transcrição).

vii. Genes que conferem aumento da produtividade

[0163] Exemplos não limitadores de genes que conferem aumento da produtividade são: (A) Uma planta de cultivo transgênica transformada por um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo semelhante à 1-AminoCiclopropano-1-Carboxilato Desaminase (ACCDP), sendo que a expressão da sequência de ácidos nucleicos na planta de cultivo resulta em um aumento do crescimento da raiz na planta e/ou aumento da produtividade e/ou tolerância aumentada ao estresse ambiental em comparação a uma variedade selvagem da planta (patente US n° 8.097.769); (B) A superexpressão do gene da proteína dedo de zinco do milho (Zm-ZFP1) usando um promotor preferencial de semente mostrou que acentua o crescimento vegetal, aumenta o número de grãos e o peso total de grãos por planta (publicação de pedido de patente US n° 2012/0079623); (C) A superexpressão constitutiva da proteína do domínio dos contornos dos órgãos lateral (LOB) do milho (Zm-LOBDP1) mostrou que aumenta o número de grãos e o peso total de grãos por planta (publicação de pedido de patente US n° 2012/0079622); (D) Acentuação das características relacionadas à produtividade nas plantas através da modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo do tipo VIM1 (variante na metilação 1) ou um polipeptídeo do tipo VTC2 (GDP-L-galactose fosforilase) ou um polipeptídeo DUF1685 ou um polipeptídeo do tipo ARF6 (fator responsivo à auxina) (WO 2012/038893); (E) Modulação da expressão em uma planta de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo do tipo Ste20 ou um homólogo do mesmo confere às plantas que têm produtividade aumentada relativa para controlar as plantas (EP 2431472); e (F) Genes codificando a nucleosídeo difosfatase quinase (NDK), polipeptídeos e homólogos dos mesmos para modificar a arquitetura da raiz da planta (publicação de pedido de patente US n° 2009/0064373).

IX. Métodos de Uso

[0164] Os métodos da invenção compreendem métodos para controlar uma praga (isto é, uma praga de plantas do tipo coleóptero, inclusive uma praga de plantas do tipo Diabrotica, como D. virgifera virgifera, D. barberi, D. virgifera zeae, D. speciosa ou D. undecimpunctata howardi). O método compreende alimentar ou aplicar em uma praga uma composição que compreende um elemento silenciador da invenção, sendo que o dito elemento silenciador, quando ingerido ou em contato com uma praga (isto é, uma praga de plantas do tipo coleóptero, inclusive uma praga de plantas do tipo Diabrotica, como D. virgifera virgifera, D. barberi, D. virgifera zeae, D. speciosa ou D. undecimpunctata howardi) reduz o teor de um polinucleotídeo-alvo da praga e, assim, controla a mesma. A praga pode ser alimentada com o elemento silenciador de diversas maneiras. Em uma modalidade, por exemplo, o polinucleotídeo compreendendo o elemento silenciador é introduzido em uma planta. Conforme a praga de plantas do tipo coleóptero ou a praga de plantas do tipo Diabrotica se alimenta da planta ou de parte da mesma que expressa essas sequências, o elemento silenciador é fornecido à praga. Quando o elemento silenciador é aplicado à planta dessa maneira, é fato reconhecido que o elemento silenciador pode ser expresso constitutiva ou alternativamente, podendo ser produzido de maneira específica quanto a estágio, mediante o uso de vários promotores induzíveis ou preferenciais para tecido, ou regulados por desenvolvimento, os quais são discutidos em outra parte do presente documento. Em modalidades específicas, o elemento silenciador é expresso nas raízes, no caule ou na haste, nas folhas inclusive nos pecíolos, xilema e floema, frutas ou tecido reprodutivo, estigma, flores e todas as partes da mesma, ou qualquer combinação das mesmas.

[0165] Em outro método, uma composição compreendendo pelo menos um elemento silenciador da invenção é aplicado à planta. Nessas modalidades, o elemento silenciador pode ser formulado em um carreador agronomicamente adequado e/ou ambientalmente aceitável que é, de preferência, adequado para dispersão em campo. Além disso, o carreador pode também incluir compostos que aumentam a meia-vida da composição. Em modalidades específicas, a composição compreendendo o elemento silenciador é formulada de tal modo que persiste no ambiente por um período de tempo suficiente para permitir que seja aplicada a uma praga. Nessas modalidades, a composição pode ser aplicada a uma área habitada por uma praga. Em uma modalidade, a composição é aplicada externamente a uma planta (isto é, mediante aspersão de um campo) para proteger a planta contra pragas.

[0166] Em certas modalidades, os construtos da presente invenção podem ser empilhados com qualquer combinação de sequências de polinucleotídeo de interesse, de modo a criar plantas com uma característica desejada. Uma característica, como usado aqui, refere-se ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhados com quaisquer outros polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que têm atividade pesticida e/ou inseticida, como outras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas nas patentes US n°s 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descrito na patente US n° 5.981.722), e similares. As combinações geradas também podem incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser empilhados com qualquer outro gene ou combinação de genes para produzir plantas com uma variedade de combinações de características desejadas incluindo, mas não se limitando a, características desejadas para alimentação animal como genes de óleo alto (por exemplo, patente US n° 6.232.529); aminoácidos balanceados (por exemplo, hordotioninas (patentes US n°s 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; e 5.703.409); cevada com alto teor de lisina (Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122) e proteínas com alto teor de metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; e Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada (por exemplo, proteínas de armazenamento modificadas (pedido de patente US n° de série 10/053.410, depositado em 7 de novembro, 2001) e tiorredoxinas (pedido de patente US n° de série 10/005.429, depositado em 3 de dezembro, 2001)), cujas descrições estão aqui incorporadas, a título de referência.

[0167] Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ser empilhados com características desejáveis para doença ou resistência a herbicida (por exemplo, genes de detoxificação da fumonisina (patente US n° 5.792.931); genes de avirulência e resistência à doença (Jones et al . (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes da acetolactato sintase (ALS) que levam à resistência a herbicidas, como as mutações S4 e/ou Hra; inhibidores da glutamina sintase como fosfinotricina ou basta (por exemplo, gene bar); e resistência à glifosato (gene EPSPS) e características desejáveis para o processamento ou processo de produtos com alto teor de óleo (por exemplo, patente US n° 6.232.529); óleos modificados (por exemplo, genes da enzima desnaturase de ácido graxo (patente US n° 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (por exemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase), sintases de amidos (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE) e enzimas de desramificação de amido (SDBE)) e polímeros ou bioplásticos (por exemplo, patente US n° 5.602.321; beta-cetotiolase, polihidróxibutirato sintase e acetoacetil-CoA redutase (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão de poliidroxialcanoatos (PHAs)); suas descrições estando aqui incorporadas, a título de referência. Pode-se, também, combinar os polinucleotídeos da presente invenção com polinucleotídeos que oferecem características agronômicas, como esterilidade masculina (por exemplo, consulte a patente US n° 5.583.210), características de resistência do caule, resistência à seca (por exemplo, patente US n° 7.786.353), tempo de floração ou tecnologia de transformação, como regulação do ciclo celular ou gene “targeting” (por exemplo, WO 99/61619; WO 00/17364 e WO 99/25821), estando as descrições desses documentos aqui incorporadas a título de referência.

[0168] Essas combinações piramidizadas pode ser criadas por qualquer método incluindo, mas não se limitando a, plantas com cruzamento de raças por qualquer metodologia convencional ou TopCross, ou transformação genética. Caso as sequências sejam empilhadas por transformação genética das plantas (ou seja, pilhas moleculares), as sequências de polinucleotídeos de interesse podem ser combinadas a qualquer momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica que compreende uma ou mais características desejadas pode ser usada como alvo para introduzir características adicionais por transformação subsequente. As características podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de cotransformação com os polinucleotídeos de interesse fornecidos por qualquer combinação ou cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das sequências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que vai suprimir a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação de características desejadas na planta. É reconhecido ainda que as sequências de polinucleotídeos podem ser empilhadas em um local desejado no genoma com o uso de um sistema de recombinação sítio-específica. Consulte, por exemplo, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, todos os quais estão aqui incorporados, a título de referência.

[0169] Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração mas sem que isto constitua uma limitação.

Experimental Exemplo 1: Método para triagem de transcrição in vitro de dsRNA

[0170] Uma biblioteca de cDNA foi produzida a partir de larvas recém-nascidas do verme da raiz do milho ocidental, por meio de métodos-padrão. Um clone de cDNA selecionado, contendo uma etiqueta de sequência expressa, foi amplificado por PCR com o uso de primers universais para a cadeia principal do plasmídeo e flanqueando o elemento de inserção EST. Os primers universais também continham sítios T7 de RNA polimerase. O produto da reação de PCR foi usado como molde para uma reação de transcrição in vitro (IVT) para produzir RNAs de fita dupla longos. Em seguida à digestão enzimática e remoção do molde de DNA e RNA de fita simples, os produtos de reação IVT foram incorporados à dieta artificial para inseto, conforme descrito abaixo.

[0171] Diferentes estratégias de seleção de alvo foram usadas nesta invenção para identificar alvos ativos de RNAi com atividades inseticidas no ensaio com base na dieta do verme da raiz do milho. As bibliotecas de cDNA foram produzidas a partir do intestino médio de recém-nascido e/ou de larvas de 3° ínstar do verme da raiz do milho ocidental. Clones de cDNA aleatoriamente selecionados contendo uma etiqueta de sequência expressa (EST), foram amplificados por PCR com o uso de primers-alvo (na direção 5'-3' e na direção 3'-5', Tabela 1) e fornecidos na listagem de sequência incluída na presente invenção, para gerar os moldes de DNA. Os primers-alvo específicos também continham sítios para a T7 RNA (sequência T7 na extremidade 5’ de cada primer). O segundo conjunto de clone de cDNA foi selecionado com base na homologia dos genes letais conhecidos de outros insetos, principalmente Drosophila melanogaster. Um terceiro conjunto de genes foi testado com base no envolvimento em funções do proteassoma. A identificação desses genes foi baseada em uma busca de homologia progressiva começando com uma lista de genes de proteassoma identificados em referência remissiva de humanos ao banco de dados de Tribolium. Acertos do Tribolium foram então usados para analisar o banco de dados da sequência do verme da raiz do milho ocidental. Genes de proteassoma foram categorizados como uma subunidade 26S não ATPase, subunidade 26S ATPase, genes tipo alfa e tipo beta.

[0172] As regiões dos genes WCRW foram produzidas por PCR seguidos de transcrição in vitro 5 (IVT) para produzir RNAs de fita dupla longos. Os produtos da reação IVT são quantificados em gel e incorporados na dieta artificial do inseto durante a primeira triagem (FIS) da IVT, conforme descrito a seguir.

Bioensaios com inseto

[0173] dsRNAs foram incorporados em uma dieta artificial padrão do WCRW em uma concentração final de 50 ppm em uma placa de microtitulação de 96 cavidades. Foram adicionados 5 ul da reação IVT (300 ng/ul) a uma determinada cavidade de uma placa de microtitulação de 96 cavidades. 25 μl de dieta lentamente derretida para verme da raiz do milho ocidental foram adicionados à amostra que foi submetida à agitação em um agitador orbital para misturar a amostra e a dieta. Depois que a dieta se solidificou, oito cavidades foram usadas para cada amostra de RNA. 1° ínstar de WCRW precondicionados (insetos recém-nascidos foram colocados em dieta neutra durante 24 horas antes da transferência para material de teste) foram adicionados a placas de microtitulação de 96 cavidades a uma taxa de 3-5 insetos/cavidade. As placas foram vedadas com Mylar que foi, então, perfurado duas vezes sobre cada cavidade da placa de microtitulação usando um alfinete de coleta de inseto superfino. Para evitar o ressecamento da dieta, as placas foram primeiro colocadas dentro de uma bolsa de plástico com um pano ligeiramente úmido e as bolsas foram colocadas dentro de uma incubadora ajustada a 28°C e 70% de umidade relativa. O ensaio foi analisado quanto à mortalidade e retardamento do desenvolvimento após 7 dias e foi obtida uma média com base na designação de valores numéricos para cada categoria de impacto (3=mortalidade, 2=retardamento grave, 1=retardamento, 0= nenhum efeito). O número relatado nessa e outras tabelas de ensaio de dieta refletem a pontuação média de todas as observações. Uma pontuação de 3 representa mortalidade completa em todas as observações. Uma pontuação de 2,5 incida que metade das cavidades apresentou mortalidade e metade apresentou retardamento de desenvolvimento grave. Os resultados do ensaio podem ser encontrados na Tabela 1A.

[0174] As sequências de DNA que codificam RNAs de fita dupla que demonstraram ter atividade inseticida (pontuação média acima de 1,5) contra vermes da raiz do milho com o uso de o teste descrito no Exemplo 1 são apresentados na Tabela 1. Para identificar cDNA de comprimento total ou quadro de leitura aberto do gene-alvo ativo do RNAi, o sequenciamento total do elemento de inserção dos clones EST e as análises do transcriptoma das amostras de RNA do intestino médio foram conduzidos. Sequências de todos os transcritos-alvo contendo cDNA de comprimento total ou transcritos mais longos também são apresentados na Tabela 1. Algumas dessas sequências foram usadas para a busca do fragmento ativo do RNAi.

Exemplo 2. Sequências que têm atividade inseticida

[0175] As sequências de DNA que codificam RNAs de fita dupla que demonstraram ter atividade inseticida contra vermes da raiz do milho com o uso de o teste descrito no Exemplo 1 são apresentados abaixo. Alguns exemplos não-limitadores de polinucleotídeos-alvo são apresentados abaixo, na Tabela 1A e B e SEQ ID NOs: 1, 4, 5, 8, 9, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60, 61, 64, 65, 68, 69, 72, 73, 76, 77, 80, 81, 84, 85, 88, 89, 92, 93, 96, 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 137, 160, 161, 184, 185, 208, 209, 232, 233, 256, 257, 280, 281, 304, 305, 328, 329, 352, 353, 376, 377, 400, 401, 424, 425, 448, 449, 472, 473, 496, 497, 520, 521, 544, 545, 564, 565, 576, 577, 588, 589, 600, 601, 612, 613, 624, 625, 636, 637, 648, 649, 660, 661, 672, 673, 684, 685, 140, 141, 164, 165, 188, 189, 212, 213, 236, 237, 260, 261, 284, 285, 308, 309, 332, 333, 356, 357, 380, 381, 404, 405, 428, 429, 452, 453, 476, 477, 500, 501, 524, 525, 548, 549, 566, 567, 578, 579, 590, 591, 602, 603, 614, 615, 626, 627, 638, 639, 650, 651, 662, 663, 674, 675, 686, 687, 144, 145, 168, 169, 192, 193, 216, 217, 240, 241, 264, 265, 288, 289, 312, 313, 336, 337, 360, 361, 384, 385, 408, 409, 432, 433, 456, 457, 480, 481, 504, 505, 528, 529, 552, 553, 568, 569, 580, 581, 592, 593, 604, 605, 616, 617, 628, 629, 640, 641, 652, 653, 664, 665, 676, 677, 688, 689, 148, 149, 172, 173, 196, 197, 220, 221, 244, 245, 268, 269, 292, 293, 316, 317, 340, 341, 364, 365, 388, 389, 412, 413, 436, 437, 460, 461, 484, 485, 508, 509, 532, 533, 556, 557, 570, 571, 582, 583, 594, 595, 606, 607, 618, 619, 630, 631, 642, 643, 654, 655, 666, 667, 678, 679, 690, 691, 152, 153, 176, 177, 200, 201, 224, 225, 248, 249, 272, 273, 296, 297, 320, 321, 344, 345, 368, 369, 392, 393, 416, 417, 440, 441, 464, 465, 488, 489, 512, 513, 536, 537, 560, 561, 572, 573, 584, 585, 596, 597, 608, 609, 620, 621, 632, 633, 644, 645, 656, 657, 668, 669, 680, 681, 692, 693, 156, 157, 180, 181, 204, 205, 228, 229, 252, 253, 276, 277, 300, 301, 324, 325, 348, 349, 372, 373, 396, 397, 420, 421, 444, 445, 468, 469, 492, 493, 516, 517, 540, 541, 562, 563, 574, 575, 586, 587, 598, 599, 610, 611, 622, 623, 634, 635, 646, 647, 658, 659, 670, 671, 682, 683, 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720 , 721, 724, 725 , 726, 727 , 728 ou variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas, incluindo, por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 9, 37 , 45, 49, 61, 65, 77 , 101 , 113, 137 , 141, 145, 149, 153, 157, 169, 173, 181, 185, 189, 205, 217, 225, 233, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690 , 691 , 692, e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesma s e SEQ ID NOs: 4, 140, 14 4, 14 8, 693 , 694, 695, 696, 697, 700, 701, 702, 703, 706, 707, 708, 709, 712, 713, 714, 715, 718, 719, 720, 721, 724, 725, 726, 727, 728 e variantes ativas e fragmentos das mesmas e complementos das mesmas.

[0176] Subregiões de dsRNAs de eficácia foram projetados para acentuar as atividades inseticidas na dieta e expressão do dsRNA na plant a. Esses fragmentos foram testados da mesma maneira que os ensaio FIS descritos acima. As regiões demonstrando um impacto forte sobre o fenótipo da larva (mortalidade ou retardo do crescimento grave) foram encaminhadas para ensaios de concentração inibitória informal (CI50). Ensaios de CI50 usaram doses a partir de 50 ppm e reduzindo com diluições em ^ etapa para 25; 12,5; 6; 3; 1,5 e 0,75 ppm. 12 observações foram incluídas para cada taxa. Os métodos do ensaio são iguais aos descritos acima para as triagens primárias. Os cálculos de inibição tiveram por base a pontuação de mortalidade e retardo do desenvolvimento grave. Fragmentos selecionados foram encaminhados para ensaios de resposta à dosagem formais, em que os valores CL50 e CI50 foram calculados e descritos na Tabela 2 (Seq n° 561 a 728). Esses ensaios incluíram um ensaio de faixa inicial de descoberta seguidos de ensaios de resposta à dosagem para faixas selecionadas incluindo 3 replicações do experimento. Fragmentos com valores CI50 conformados abaixo de 2 ppm foram encaminhados para a construção de vetor de transformação de plantas.

[0177] O gene-alvo d subunidade alfa tipo 3 do proteassoma (PAT3) foi usado como modelo de otimização de gene e construto. Como uma primeira etapa, o gene foi dividido em fragmentos (f) de tamanho 1/3, 1/6 e 1/12. Além disso, f11-13 representa segmentos que se estendem pelos limites dos primeiros quatro fragmentos 1/6°. A Figura 5 fornece um diagrama dos fragmentos PAT3.

[0178] Os fragmentos preferidos pelas plantas foram identificados a partir dos genes-alvo do RNAi ativo e testados em ensaios de dsRNA de dieta artificial. A seleção dessas regiões preferidas pelas plantas teve por base evitar a desestabilização dos elementos e motivos ou regiões composição de bases inadequadas. As avaliações de homologia também foram usadas para evitar possíveis organismos não-alvo. Finalmente, fragmentos com um faixa de tamanho de 150 a 250 pb foram preferidos. Todas as regras foram consideradas na seleção dos fragmentos, mas os fragmentos não foram excluídos da consideração com base em qualquer uma regra. A Tabela 2 inclui dados de ensaios inseticidas das amostras FIS iniciais e fragmentos subsequentes. Amostras selecionadas foram encaminhadas para determinações de CI50 e CL50.

Exemplo 3. Identificar alvos ativos de RNAi de outros insetos

[0179] Para identificar genes ativos RNAi de outras pragas do milho importantes ou insetos não alvo, experimentos com transcriptoma foram realizados usando larvas do 3° ínstar do verme da raiz do milho setentrional (Diabrotica barberi), verme da raiz do milho meridional (Diabrotica undecimpunctata), besouro do feijão mexicano (Epilachna varivestis), besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata), percevejo predador (Orius insidiosus) e joaninha predadora (Coleomegilla maculata, [CMAC]). Os transcritos homólogos de RNAi ativo são apresentados na Tabela 3 (Seq n° 693 a 723). Os dados dessa sequência são importantes para projetar fragmentos para suprimir genes de praga-alvo e evitar a ruputra do mesmo gene em insetos não alvo.

Exemplo 4. Alvos de RNA inseticida no intestino médio de WCRW

[0180] Dois alvos ativos de RNAi Ryanr e HP2 (Tabela 1 e Tabela 2) foram identificados através da triagem FIS aleatória de cDNA. Ryanr foi identificado em uma triagem FIS anterior (US 2011/0054007A1). Os fragmentos desses alvos mostraram atividades inseticidas muito forte. Buscas de homólogos mostraram que Ryanr e HP2 apresentavam 54% e 49% de identidade com Drosophila Ssk e Mesh, respectivamente. O complexo de proteínas Mesh-Ssk é necessário para septar a formação de junção no intestino médio de Drosophila. Consulte o alinhamento da sequência de aminoácidos de WCRW Ryanr e Drosophila Ssk na Figura 4.

Exemplo 5. Transformação do milho

[0181] Os embriões de milho imaturos de plantas doadoras da estufa são bombardeados com um plasmídeo contendo o elemento silenciador da invenção, funcionalmente ligado a um promotor específico para tecido, seletivo para tecido ou constitutivo, e o gene marcador selecionável PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37), que confere resistência ao herbicida Bialaphos. Em uma modalidade, os construtos expressarão um RNA de fita dupla longa da sequência-alvo apresentada na Tabela 3. Esse construto pode ser ligado a um promotor UBIZM. Alternativamente, o gene marcador selecionável é fornecido em um plasmídio separado. A transformação é feita como descrito um seguir. As fórmulas dos meios são fornecidas abaixo. Preparação de tecido alvo

[0182] As espigas são descascadas e a sua superfície esterilizada em alvejante Clorox a 30% mais 0,5% de detergente Micro durante 20 minutos, sendo então enxaguadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são cortados e colocados com o eixo do embrião para baixo (lado do escutelo para cima), 25 embriões por placa, em meio 560Y durante 4 horas e, então, alinhados dentro da zona alvo de 2,5 cm em preparação para o bombardeio.

[0183] É produzido um vetor de plasmídeo compreendendo o elemento silenciador de interesse funcionalmente ligado a ao promotor específico para tecido, seletivo para tecido ou constitutivo. Esse DNA do plasmídeo mais o DNA do plasmídeo contendo um marcador selecionável PAT é precipitado sobre péletes de tungsténio de 1,1 μm (diâmetro médio) com o uso de um procedimento de precipitação por CaCl2 da seguinte forma: 100 μl de partículas de tungstênio preparadas em água; 10 μl (1 μg) de DNA em tampão de Tris EDTA (1 μg de DNA total); 100 μl de CaC12 a 2,5 M; e 10 μl de espermidina a 0,1 M.

[0184] Cada reagente é adicionado sequencialmente à suspensão de partículas de tungstênio mantida no vórtex para vários tubos. Uma mistura final é submetida a breve sonicação e deixada em incubação sob agitação constante durante 10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido é removido, lavado com 500 ml de etanol 100%, e centrifugados durante 30 segundos. Novamente o líquido é removido, e 105 μl de etanol 100% é adicionado ao pélete de partícula de tungstênio. Para o bombardeio com pistola de partículas, as partículas de tungstênio/DNA são brevemente sonicadas e 10 μl colocados sobre o centro de cada macrocarreador e deixadas secar por cerca de 2 minutos antes do bombardeio.

[0185] As placas de amostra são bombardeadas em nível n° 4 com uma pistola de partículas. Todas as amostras recebem um único disparo a 4,5 MPa (650 PSI), com um total de dez alíquotas tomadas de cada tubo de partículas/DNA preparado.

[0186] Após o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio 560Y durante 2 dias, então transferidos para um meio de seleção 560R contendo 3 mg/litro de bialafos, e subcultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas de seleção, os clones de calos resistentes por seleção são transferidos para meio 288J para iniciar a regeneração das plantas. Após maturação do embrião somático (2 a 4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para meio para germinação e são transferidos para a sala de cultura iluminada. Aproximadamente 7 a 10 dias mais tarde, as plântulas em desenvolvimento são transferidas para meio 272V sem hormônio em tubos durante 7 a 10 dias até as plântulas estarem bem estabelecidas. As plantas são, então, transferidas para enchimentos em recipientes planos (equivalentes a um vaso de 6,4 cm (2,5")) contendo solo para plantio e são cultivadas durante 1 semana em uma câmara de crescimento, e são subsequentemente cultivadas mais 1 a 2 semanas na estufa e, então, transferidas para vasos clássicos 600 (6 litros (1,6 galão)) e cultivadas até a maturidade.

[0187] As plantas são monitoradas e classificadas quanto ao marcador adequado, como o controle de uma praga de plantas do tipo coleóptero, como uma praga de plantas do tipo Diabrotica e têm atividade inseticida. Por exemplo, as raízes da planta R0 são fornecidas como alimento a larvas de verme da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera). As raízes de milho transgênico são colocadas em placas de Petri com meio MSOD contendo antibióticos e glifosato para seleção in vitro. Cada raiz é infestada com duas larvas de WCR em cada placa, com um pincel de ponta fina. As placas são lacradas com Parafilm para impedir que as larvas escapem. Os testes são colocados a 27°C, 60% de umidade relativa em uma incubadora Percival com escuridão incompleta. A contaminação e a qualidade das larvas são monitoradas. Após seis dias de alimentação com tecidos de raiz, as larvas são transferidas para a dieta de WCR em uma placa de 96 cavidades. As larvas são deixadas alimentar-se com a dieta durante oito dias, o que torna o teste completo em um período de 14 dias. A massa larval e a sobrevivência são registradas para análise. Uma análise ANOVA unidirecional e um teste de Dunnett são realizados com os dados sobre a massa larval, buscando importância estatística em comparação a um controle negativo não-transformado (HC69). A atrofia das larvas WCR é medida após a alimentação em dois eventos, e comparada ao crescimento de larvas alimentadas com plantas de controle negativo.

[0188] Em outros testes, plantas de milho transgênicas (R0) geradas são plantadas em vasos de 25 cm (10 polegadas) contendo solo Metromix, após atingirem um tamanho adequado. Quando as plantas atingem o estágio de crescimento V4, sua zona da raiz é infestada com aproximadamente 400 ovos de verme da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera). Plantas de milho não- transgênico do mesmo genótipo são infestadas em um estágio de crescimento similar para servir como controle negativo. Os ovos são pré-incubados, portanto a eclosão ocorre 24 horas após a infestação. As larvas são deixadas alimentar-se dos sistemas de raiz durante 3 semanas. As plantas são removidas do solo e lavadas, de modo que as raízes possam ser avaliadas quanto à alimentação larval. Os danos às raízes são classificados com o uso de uma Escala de Lesão Nodal (ELN) para classificação do nível de danos, onde 0 indica nenhum dano, 1 indica que um nó das raízes está reduzido a algo em torno de 3,8 cm (1,5 polegadas), 2 indica que 2 nós estão reduzidos, e 3 indica que 3 nós estão reduzidos. Como as plantas sendo usadas para avaliação vieram diretamente de cultura de tecidos após a transformação, e como os eventos de transformação são únicos, somente uma planta é avaliada por evento, nesse momento. As plantas no teste que apresentam sinais ou sintomas de alimentação larval indicam que se obteve uma infestação bem- sucedida. As raízes das plantas do controle negativo estão entre moderada e gravemente danificadas, enquanto as raízes das plantas transgênicas apresentam um controle substancial da alimentação larval, com cerca de 0,2 ou menos na Escala de Lesão Nodal do Verme da Raiz do Milho (“CRWNIS”).

[0189] O meio para bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mistura de vitaminas de Eriksson (1.000X, SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 120,0 g/l de sacarose, 1,0 mg/l de 2,4-D, e 2,88 g/l de L-prolina (levado ao volume desejado com H2O DI seguida do ajuste para pH 5,8 com KOH); 2,0 g/l de Gelrite (adicionado após levar ao volume desejado com H2O DI); e 8,5 mg/l de nitrato de prata (adicionado após esterilização do meio e resfriamento até a temperatura ambiente). O meio de seleção (560R) compreende 4,0 g/l de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de mistura de vitaminas de Eriksson (1.000X, SIGMA-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 30,0 g/l de sacarose e 2,0 mg/l de 2,4-D (levado ao volume desejado com H2O DI em seguida ao ajuste para pH 5,8 com KOH); 3,0 g/l de Gelrite (adicionado após levar ao volume desejado com H2O DI); e 0,85 mg/l de nitrato de prata e 3,0 mg/l de bialafos (ambos adicionados após esterilização do meio e resfriamento até a temperatura ambiente).

[0190] O meio de regeneração vegetal (288J) compreende 4,3 g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solução estoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCL, 0,10 g/l de piridoxina HCL e 0,40 g/l de glicina e volume desejado completado com D-I H2O refinado) (Murashige e Skoog, (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarose, e 1,0 ml/l de 0,1 mM de ácido abscísico (levado ao volume desejado com D-I H2O refinado após o ajuste para o pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrite® (adicionado após levar ao volume desejado com D-I H2O); e 1,0 mg/l de ácido indoleacético e 3,0 mg/l de bialafos (adicionado após a esterilização do meio e resfriamento a 60°C). O meio isento de hormônio (272V) compreende 4,3 g/l de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solução estoque de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de tiamina HCl, 0,10 g/l de piridoxina HCl e 0,40 g/l de glicina (levado ao volume desejado com H2O DI refinada), 0,1 g/l de mio-inositol e 40,0 g/l de sacarose (levado ao volume desejado com H2O DI refinada, após ajustar o pH para 5,6); e 6 g/l de Bacto-ágar (adicionada após levar ao volume desejado com H2O DI refinada), esterilizado e resfriado até 60°C.

Exemplo 6. Transformação do milho mediada por Agrobacterium

[0191] Para transformação do milho mediada por Agrobacteriumcom construtos de polinucleotídeo revelados que compreendem um elemento silenciador, conforme aqui revelado, o método de Zhao foi empregado (patente US n° 5.981.840 e publicação de patente internacional n° WO 1998/32326, cujos conteúdos estão aqui incorporados, por referência). Brevemente, embriões imaturos são isolados de milho e os embriões são colocados em contato com uma suspensão de Agrobacterium, em que as bactérias são capazes de transferir os construtos de polinucleotídeo revelados compreendendo um elemento silenciador, conforme aqui revelado, por exemplo, o construto de polinucleotídeos mostrado na Figura 6 de pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos foram imersos em uma suspensão de Agrobacterium para o início da inoculação. Os embriões foram co-cultivados por um tempo com o Agrobacterium (etapa 2: a etapa de co-cultivo). Os embriões imaturos foram cultivados em meio sólido após a etapa de infecção. Após este período de co-cultivo, uma etapa de repouso opcional foi contemplada. Nesta etapa de repouso, os embriões foram incubados na presença de pelo menos um antibiótico que sabidamente inibe o crescimento de Agrobacterium sem um agente seletivo para os transformantes de planta (etapa 3: etapa de repouso). Os embriões imaturos foram cultivados sobre meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para eliminação de Agrobacterium e para uma fase de repouso para as células infectadas. A seguir, os embriões inoculados foram cultivados em um meio contendo um agente seletivo e o calo transformado em crescimento é recuperado (etapa 4: a etapa de seleção). Os embriões imaturos foram cultivados sobre meio sólido com um agente seletivo, resultando no crescimento seletivo das células transformadas. O calo foi então regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regeneração) e os calos cultivados em meio seletivo foram cultivados em meio sólido para regenerar as plantas.

Exemplo 7 Expressão de elementos silenciadores no milho

[0192] Os elementos silenciadores foram expressos em uma planta de milho, como hairpins, usando as técnicas de transformação anteriormente descritas neste documento no Exemplo 6, e a planta foi testada quanto à atividade inseticida contra os vermes da raiz do milho. Os dados esses estudos são mostrados na Tabela 4 (Figura 7).

[0193] As plantas de milho foram transformadas com os plasmídeos contendo os genes mencionados na Tabela 4 (Figura 7) e as plantas expressando os elementos silenciadores foram transplantadas de placas 272V para vasos planos de estufa contendo mistura de cultivo Fafard Superfine. Aproximadamente 10 a 14 dias após o transplante, as plantas (agora no estágio de crescimento V2-V3) foram transplantadas a vasos para árvore contendo mistura de cultivo Fafard Superfine. Quatorze dias após a data de envio à estufa, as plantas foram infestadas com 200 ovos de vermes da raiz do milho ocidental (VRMO)/planta. Para conjuntos posteriores, uma segunda infestação de 200 ovos de VRMO/planta foi realizada 7 dias após a primeira infestação, e a pontuação ocorreu 14 dias após a segunda infestação. Vinte e um dias após a infestação, as plantas foram pontuadas usando- se a PLNVRM. As plantas com uma pontuação de < 0,5 foram transplantadas para vasos grandes contendo SB300 para sementes T1. Os dados na Tabela 4 e Figura 8 mostraram que PHP58050, PHP61599, PHP68041, PHP68142 e PHP68043 mostraram CRWNIS com redução significativa em comparação com plantas do controle não transgênicas HC6.

[0194] As sequências aqui mencionadas, SEQ. ID NOs: 1 a 731 são depositadas simultaneamente juntamente em um arquivo de texto e são incorporado na presente invenção em sua totalidade.

[0195] Para uso na presente invenção, as formas singulares “um/uma”, “e” e “a/o” incluem referências no plural a menos que o contexto claramente determine de outro modo. Desta forma, por exemplo, referência a “uma célula” inclui uma pluralidade destas células e referência a “a proteína” inclui referência a uma ou mais proteínas e seus equivalentes conhecidos pelos versados na técnica, e assim em diante. Exceto onde evidentemente indicado em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado comumente compreendido pelo versado na técnica à qual pertence esta invenção.

[0196] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível dos versados na técnica à qual pertence a invenção. Todas as publicações e pedidos de patentes estão aqui incorporados a título de referência, na mesma extensão, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

[0197] Embora a invenção anteriormente mencionada tenha sido descrita em detalhes consideráveis por meio de ilustração e exemplos para os propósitos de clareza de entendimento, certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (16)

1. Cassete de expressão CARACTERIZADO por compreender um promotor heterólogo funcionalmente ligado a um polinucleotídeo que codifica um elemento silenciador de RNA de fita dupla, em que a região alvo do elemento silenciador de RNA de fita dupla consiste na sequência senso e antissenso da sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 728, ou o complemento total da mesma na direção 3’-5’, em que o dito elemento silenciador de RNA de fita dupla tem atividade inseticida contra uma praga de plantas do tipo coleóptero.

2. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita praga de plantas do tipo coleóptero é uma praga de plantas do tipo Diabrotica.

3. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito elemento silenciador de RNA de fita dupla compreende um RNA em forma de grampo (hairpin).

4. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo é flanqueado por um primeiro promotor convergente funcionalmente ligado a uma terminação do polinucleotídeo e um segundo promotor convergente funcionalmente ligado à terminação oposta do polinucleotídeo, sendo que o primeiro e o segundo promotores convergentes são capazes de conduzir a expressão do elemento silenciador de RNA de fita dupla.

5. Célula hospedeira bacteriana CARACTERIZADA por compreender um cassete de expressão heterólogo conforme definido na reivindicação 1.

6. Método para controlar uma praga de planta do tipo coleóptero CARACTERIZADO pelo fato de que compreende alimentar uma praga de planta do tipo coleóptero com uma composição que compreende um elemento silenciador de RNA de fita dupla, em que o dito elemento silenciador de RNA de fita dupla, quando ingerido pela dita praga de planta do tipo coleóptero, reduz o nível de expressão de uma sequência-alvo da praga de planta do tipo coleóptero, controlando, assim, a praga de planta do tipo coleóptero, em que a região alvo do dito elemento silenciador de RNA de fita dupla consiste nas sequências senso e antissenso da sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 728, ou o complemento total da mesma na direção 3’-5’, e em que o elemento silenciador de RNA de fita dupla tem atividade inseticida contra uma praga de plantas do tipo coleóptero.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita praga de plantas do tipo coleóptero compreende uma praga de plantas do tipo Diabrotica.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita praga de plantas Diabrotica compreende D. virgifera virgifera, D. virgifera zeae, D. speciosa, D. barberi, D. virgifera zeae, ou D. undecimpunctata howardi.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita composição compreende uma planta ou parte de planta que tem, incorporado de maneira estável em seu genoma, um polinucleotídeo que codifica o dito elemento silenciador de RNA de fita dupla.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito elemento silenciador de RNA de fita dupla compreende um RNA em forma de grampo (hairpin).

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo está funcionalmente ligado a um promotor heterólogo.

12. Método, de acordo com qualquer a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polinucleotídeo está flanqueado por um primeiro promotor convergente funcionalmente ligado a uma terminação do polinucleotídeo e um segundo promotor convergente funcionalmente ligado à terminação oposta do polinucleotídeo, sendo que o primeiro e o segundo promotores convergentes são capazes de conduzir a expressão do elemento silenciador de RNA de fita dupla.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta é uma monocotiledônea.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita monocotiledônea consiste em milho, cevada, milheto, trigo ou arroz.

15. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita planta é uma dicotiledônea.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita dicotiledônea consiste em soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão.

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