DE69636637T2

DE69636637T2 - Auf basis ihrer struktur entworfene herbizid-resistente produkte

Info

Publication number: DE69636637T2
Application number: DE69636637T
Authority: DE
Inventors: Genichi Yardley KAKEFUDA; Karl-Heinz Lawrenceville OTT; Jae-Gyu Fairless Hills KWAGH; W. Gerald Yardley STOCKTON
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2016-04-20
Also published as: CA2218526C; EP0821729B1; US20060156427A1; BR9604993A; AU5575896A; JPH11504213A; PL322899A1; DE69636637D1; PL186091B1; HUP9900852A2; US6855533B2; HUP9900852A3; DK0821729T3; NO326115B1; JP4469833B2; WO1996033270A1; HU226259B1; JP4469422B2; ATE342968T1; US6576455B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft das auf Struktur basierende Modellieren und Entwerfen von Varianten von Acetohydroxysäuresynthase (AHAS), die resistent sind gegen Imidazolinone und andere Herbizide, AHAS-inhibierende Herbizide, AHAS-Varianten selbst, DNA, die diese Varianten kodiert, Pflanzen, die diese Varianten exprimieren, und Verfahren von Unkrautmanagement.
Hintergrund der Erfindung
Acetohydroxysäuresynthase (AHAS) ist ein Enzym, das den ersten Schritt bei der Biosynthese von Isoleucin, Leucin und Valin in Bakterien, Hefe und Pflanzen katalysiert. Zum Beispiel ist die reife AHAS von Zea Mays annähernd ein 500-Aminosäure-Protein, das im Chloroplasten lokalisiert ist (siehe 1). Das Enzym nutzt Thiaminpyrophosphat (TPP) und Flavinadenindinukleotid (FAD) als Kofaktoren und Pyruvat als ein Substrat, um Acetolactat zu bilden. Das Enzym katalysiert ebenfalls die Kondensation von Pyruvat und 2-Ketobutyrat um Acetohydroxybutyrat zu bilden. AHAS ist auch bekannt als Acetolactatsynthase oder Acetolactatpyruvatlyase (carboxylierend), und wird als EC 4.1.3.18 bezeichnet. Das aktive Enzym ist wahrscheinlich mindestens ein Homodimer. Ibdah et al. (Protein Science, 3: 479-5, 1994) offenbart in einer Zusammenfassung ein Modell für das aktive Zentrum von AHAS.
Eine Vielfalt von Herbiziden einschließlich Imidazolinonverbindungen wie Imazethapyr (PURSUIT^® – American Cyanamid Company-Wayne, NJ), auf Sulfonylharnstoff basierende Verbindungen wie Sulfometuron-Methyl (OUST^® – E.I. du Pont de Nemours and Company-Wilmington, DE), Triazolpyrimidinsulfonamide (Broadstrike^TM – Dow Elanco; siehe Gerwick et al., Pestic. Sci. 29: 357-364, 1990), Sulfamoylharnstoffe (Rodaway et al., Mechanisms of Selectively of Ac 322,140 in Paddy Rice, Wheat and Barley, Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference-Weeds, 1993), Pyrimidyl-oxy-benzoesäuren (STABLE^® – Kumiai Chemical Industry Company, E.I. du Pont de Nemours and Company; siehe The Pesticide Manual, 10. Ausg. S. 888-889, Clive Tomlin, Hrsg., British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Farmham, Surrey G49 7PH, UNITED KINGDOM), und Sulfonylcarboxamide (Alvarado et al., US-Patent Nr. 4,883,914) wirken durch Inhibieren der enzymatischen Aktivität von AHAS. (Siehe Chaleff et al., Science 224: 1443, 1984, LaRossa et al., J. Biol. Chem. 259: 8753, 1984; Ray, Plant Physiol. 75: 827, 11984; Shaner et al., Plant Physiol. 76: 545, 1984). Diese Herbizide sind hocheffizient und umweltverträglich. Dennoch ist ihre Verwendung in der Landwirtschaft limitiert durch ihre fehlende Selektivität, da sowohl Nutzpflanzen als auch unerwünschtes Unkraut sensitiv gegenüber den phytotoxischen Effekten dieser Herbizide sind.
Bedbrook et al., US-Patente Nr. 5,013,659, 5,141,870 und 5,378,824 offenbaren mehrere Sulfonylharnstoff-resistente AHAS-Varianten. Dennoch wurden diese Varianten entweder über mutagenisierende Pflanzen, Samen, oder Zellen erhalten und bezüglich Herbizidresistenter Mutanten selektiert, oder wurden von solchen Mutanten bezogen. Dieser Ansatz ist dadurch unvorhersehbar, dass er (zumindest am Anfang) eher auf der Einführung einer relevanten Mutation durch gelegentliche Wahrscheinlichkeit beruht, als auf einem rationalen Designansatz, der auf einem Strukturmodell des Zielproteins basiert.
Folglich besteht immer noch ein Bedarf in dem Fachgebiet für Verfahren und Zusammensetzungen, die ein selektives breites Spektrum und/oder spezifische Herbizidresistenz in kultivierten Nutzpflanzen bereitstellen. Die betreffenden Erfinder haben entdeckt, dass selektive Herbizid-resistente variante Formen von AHAS und Pflanzen, die diese enthalten, hergestellt werden können durch auf Struktur basierendes Modellieren von AHAS gegen Pyruvatoxidase (POX), identifizierend eine Bindungstasche oder -taschen für ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid in dem AHAS-Modell, und spezifische Mutationen entwerfend, die die Affinität des auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids für die Bindungstasche verändern. Diese Varianten und Pflanzen werden nicht durch auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizide inhibiert oder getötet, und behalten ausreichend AHAS-Enzymaktivität, um Nutzpflanzenwachstum zu fördern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Abbildung einer 600-Aminosäuresequenz, die der ungefähr 599-Aminosäuresequenz von Acetohydroxysäuresynthase (AHAS) von Zea Mays entspricht, die als ein Beispiel eines Pflanzen-AHAS-Enzyms angegeben ist. Die Sequenz enthält keine Transitsequenz, und das Extraglycin stammt rudimentär von einer Thrombinspaltstelle. Die Reste Met53, Arg128 und Phe135 sind fett dargestellt.
2 ist eine Abbildung des Alignments der Sequenz von Mais-AHAS und Pyruvatoxidase (POX) von Lactobacillus planarum.
3 ist eine schematische Darstellung der Sekundärstruktur einer AHAS-Untereinheit. Regelmäßige Sekundärstrukturelemente, α-Helices und β-Sheets, sind als Kreise bzw. Ellipsen dargestellt, und sind getrennt für jede der drei Domänen innerhalb einer Untereinheit nummeriert. Schleifen und gewendelte Bereiche werden durch schwarze Linien dargestellt mit Zahlen, die die ungefähren Anfänge und Enden der Elemente repräsentieren. Die Lagen von Kofaktor-Bindungsstellen und bekannten Mutationsstellen sind durch Oktaeder bzw. Sterne angezeigt.
4 ist eine Abbildung eines Computer-generierten Modells des aktiven Zentrums von Mais-AHAS, mit Imazethapyr (PURSUIT^®-Herbizid) einmodelliert in die Bindungstasche.
5 ist eine Abbildung der Homologie zwischen AHAS-Aminosäuresequenzen, die von verschiedenen Pflanzenspezies stammen. pAC 751 ist Mais-als 2 AHAS-Isozym, wie es von dem pAC 751 E. Coli-Expressionsvektor exprimiert wird wie in 1; Mais-als 2 ist das Mais-als 2 AHAS-Isozym; Mais-als 1 ist das Mais-als 1 AHAS-Isozym; Tobac 1 ist das tobacco AHAS SuRA-Isozym; Tobac 2 ist das tobacco AHAS SuRB-Isozym; Athcsr 12 ist das Arabidopsis thaliana Csr 1.2 AHAS-Gen; Bnaal 3 ist das Brassica napus AHAS III-Isozym; und Bnaal 2 ist das Brassica napus AHAS II-Isozym.
pAC 751 und Mais-als 2 sind identische Gene, mit Ausnahme, dass Mais-als 2 am Anfang der Transitsequenz beginnt, und pAC 751 an der mutmaßlichen reifen N-terminalen Stelle mit einem zusätzlichen Glycin am N-Terminus aufgrund der Thrombinerkennungssequenz in dem pGEX-2T-Expressionsvektor beginnt. Das N-terminale Glycin ist keine natürliche Aminosäure an dieser Position.
Aminosäuresequenz-Alignments der AHAS-Proteine wurden generiert durch PILEUP (GCG-Paket – Genetics Computer Group, Inc., – University Research Park – Madison-WI). Die Konsensussequenz wurde über PRETTY GCG-Paket generiert.
6 ist eine photographische Abbildung eines SDS-Polyacrylamidgels, gefärbt im Hinblick auf Proteine, das die Reinigung von Mais-AHAS zeigt. Die Spuren enthalten (von links nach rechts): A, Molekulargewichtsmarker; B, Rohen E. Coli-Zellextrakt; C, Glutathion-Agaroseaffinitätsgereinigte Präparation; D, Thrombinverdau der affinitätsgereinigten Präparation; E, Zweiten Durchlauf Glutathionagarosesäule und Sephacryl S-100 Gelfiltration.
7 ist eine graphische Abbildung der Ergebnisse von in vitro-Assays der Enzymaktivität von Wildtyp- und mutanten AHAS-Proteinen in Abwesenheit und Anwesenheit von zunehmenden Konzentrationen an Imazethapyr (PURSUIT^® Herbizid). Die Y-Achse stellt die an Aktivität des mutanten Enzyms dar, wobei der 100%-Wert in Abwesenheit vom Inhibitor gemessen wird.
8 ist eine graphische Abbildung der Ergebnisse von in vitro-Assays der Enzymaktivität von Wildtyp- und mutanten AHAS-Proteinen in Abwesenheit und Anwesenheit von zunehmenden Konzentrationen an Sulfometuron-Methyl (OUST^® Herbizid). Die Y-Achse stellt die % an Aktivität des mutanten Enzyms dar, wobei der 100%-Wert in Abwesenheit vom Inhibitor gemessen wird.
9 ist eine graphische Abbildung von in vitro-Assays der Enzymaktivität des Wildtyp-Arabidopsis-AHAS-Proteins und des mutanten Arabidopsis-AHAS-Proteins, Met124Ile, in Abwesenheit und Anwesenheit von zunehmenden Konzentrationen an Imazethapyr (PURSUIT^® Herbizid) und Sulfometuron-Methyl (OUST^® Herbizid). Die Y-Achse stellt die % an Aktivität des mutanten Enzyms dar, wobei der 100%-Wert in Abwesenheit vom Inhibitor gemessen wird.
10 stellt eine graphische Abbildung von in vitro-Assays der Enzymaktivität des Wildtyp-Arabidopsis-AHAS-Proteins und des mutanten Arabidopsis-AHAS-Proteins, Met124His, in Abwesenheit und Anwesenheit von zunehmenden Konzentrationen an Imazethapyr (PURSUIT^® Herbizid) und Sulfometuron-Methyl (OUST^® Herbizid). Die Y-Achse stellt die % an Aktivität des mutanten Enzyms dar, wobei der 100%-Wert in Abwesenheit vom Inhibitor gemessen wird.
11 ist eine graphische Abbildung von in vitro-Assays der Enzymaktivität des Wildtyp-Arabidopsis-AHAS-Proteins und des mutanten Arabidopsis-AHAS-Proteins, Arg199Glu, in Abwesenheit und Anwesenheit von zunehmenden Konzentrationen an Imazethapyr (PURSUIT^® Herbizid) und Sulfometuron-Methyl (OUST^® Herbizid). Die Y-Achse stellt die % der Aktivität des mutanten Enzyms dar, wobei der 100%-Wert in Abwesenheit vom Inhibitor gemessen wird.
12 ist eine schematische Abbildung eines zur Pflanzentransformation verwendeten DNA-Vektors, der das nptII-Gen (welches Kanamycinresistenz kodiert) enthält unter der Kontrolle des 35S-Promotors, und ein AHAS-Gen (Wildtyp oder Variante) unter der Kontrolle des Arabidopsis-AHAS-Promotors.
13 ist eine Photographie, die die Wurzelentwicklung von Tabakpflanzen zeigt, die transformiert sind mit dem Arabidopsis-AHAS-Gen, das entweder die Mutation Met124Ile- oder Arg199Glu enthält, sowie eine nicht-transformierte Kontrolle. Die Pflanzen wurden für 18 Tage nach dem Transfer in Medium, das 0.25 μM Imazethapyr enthielt, gezüchtet.
14 ist eine Photographie, die Tabakpflanzen zeigt, die transformiert sind mit dem Arabidopsis-AHAS-Gen, das entweder die Mutation Met124Ile, Met124His, oder Arg199Glu enthält, sowie eine nicht-transformierte Kontrolle, die mit dem Doppelten der Feldrate (100 g/ha) an Imazethapyr besprüht worden waren.
15 ist eine Photographie, die die Ergebnisse von Keimungstests zeigt, durchgeführt in Anwesenheit des Herbizids CL 299,263 (Imazamox), die durchgeführt wurden mit Samen, die geerntet wurden von primären Tabakpflanzentransformanten, die mit dem Arabidopsis-AHAS-Gen transformiert waren, das entweder die Mutation Met124Ile, Met124His, oder Arg 199Glu enthielt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein auf Struktur basierendes Modellierungsverfahren bereit zur Herstellung eines varianten AHAS-Proteins, das gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid resistent ist. Das Verfahren enthält:

(a) Alignen eines Ziel-AHAS-Proteins mit Pyruvatoxidase-Template, um die dreidimensionale Struktur des Ziel-AHAS-Proteins herzuleiten;
(b) Modellieren eines oder mehrerer auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden/r Herbizids/e in die dreidimensionale Struktur, um eine Bindungstasche für auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizide in dem Ziel-AHAS-Protein zu lokalisieren;
(c) Auswählen mindestens einer Aminosäureposition in dem Ziel-AHAS-Protein als ein Zielort für eine Mutation, wobei die Mutation die Affinität von mindestens einem auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid für die Bindungstasche verändert;
(d) Mutieren von DNA, die das Ziel-AHAS-Protein kodiert, um eine mutierte DNA herzustellen, die ein variantes AHAS kodiert, welches die Mutation an der Position enthält; und
(e) Exprimieren der mutierten DNA in einer ersten Zelle unter Bedingungen, in denen das variante AHAS, das die Mutation an der Position enthält, hergestellt wird.

Das Verfahren kann weiter enthalten:

(f) paralleles Exprimieren von DNA, die ein Wildtyp-AHAS-Protein kodiert, in einer zweiten Zelle;
(g) Reinigen der Wildtyp- und der varianten AHAS-Proteine von den Zellen;
(h) Untersuchen der Wildtyp- und der varianten AHAS-Proteine auf katalytische Aktivität bei der Konvertierung von Pyruvat zu Acetolactat oder bei der Kondensation von Pyruvat und 2-Ketobutyrat, um Acetohydroxybutyrat zu bilden, in Abwesenheit und Anwesenheit des auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids; und
(i) Wiederholen der Schritte (c) – (h), wobei die DNA, die die AHAS-Variante von Schritt (e) kodiert, verwendet wird als die AHAS-kodierende DNA in Schritt (c), bis ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid-resistentes variantes AHAS Protein identifiziert wird, welches aufweist:
(i) in Abwesenheit des auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids,
(a) katalytische Aktivität, die allein ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in welcher es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; oder
(b) katalytische Aktivität in Kombination mit einem varianten AHAS Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, welches ebenfalls in der Zelle exprimiert wird, das dasselbe wie oder verschieden von dem ersten varianten AHAS Protein sein kann, ausreichend, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in welcher es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; wobei die Zelle AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt; und
(ii) katalytische Aktivität, die resistenter als Wildtyp-AHAS gegen das auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizid ist.

Ebenfalls bereitgestellt wird ein alternierend auf Struktur basierendes Modellierungsverfahren für die Herstellung von einem varianten AHAS-Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstof basierendes Herbizid. Das Verfahren enthält:

(a) Alignen eines Ziel-AHAS-Proteins mit einem ersten AHAS-Template, das von einem Polypeptid stammt, das die Sequenz aus 1 oder ein funktionelles Äquivalent davon aufweist, um die dreidimensionale Struktur des Ziel-AHAS-Proteins herzuleiten;
(b) Modellieren eines oder mehrerer auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden/r Herbizide/s in die dreidimensionale Struktur, um eine Bindungstasche für ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid in dem Ziel-AHAS-Protein zu lokalisieren;
(c) Auswählen mindestens einer Aminosäureposition in dem Ziel-AHAS-Protein als einen Zielort für eine Mutation, wobei die Mutation die Affinität von mindestens einem auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids für die Bindungstasche verändert;
(d) Mutieren von DNA, die das Ziel-AHAS-Protein kodiert, um eine mutierte DNA herzustellen, die ein variantes AHAS kodiert, das die Mutation an der Position enthält; und
(e) Exprimieren der mutierten DNA in einer ersten Zelle unter Bedingungen, in denen das variante AHAS, das die Mutation an der Position enthält, hergestellt wird.

Das Verfahren kann weiter enthalten:

(f) paralleles Exprimieren von DNA, die Wildtyp-AHAS-Protein kodiert, in einer zweiten Zelle;
(g) Reinigen des Wildtyp- und des varianten AHAS-Proteins aus den Zellen;
(h) Untersuchen des Wildtyp- und des varianten AHAS-Proteins auf katalytische Aktivität bei der Umwandlung von Pyruvat in Acetolactat oder bei der Kondensation von Pyruvat und 2-Ketobutyrat, um Acetohydroxybutyrat zu bilden, in Abwesenheit und Anwesenheit des auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids; und
(i) Wiederholen der Schritte (c) – (h), wobei die DNA, die die AHAS-Variante von Schritt (e) kodiert, verwendet wird als die AHAS-kodierende DNA in Schritt (c), bis ein erstes variantes AHAS Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid identifiziert wird, welches aufweist:
(i) in Abwesenheit von dem mindstens einen auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid,
(a) katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; oder
(b) katalytische Aktivität in Kombination mit irgendeinem varianten AHAS-Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, das ebenfalls in der Zelle exprimiert wird, welches dasselbe wie oder verschieden von dem ersten varianten AHAS Protein sein kann, ausreichend, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; wobei die Zelle AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt; und
(ii) katalytische Aktivität, die resistenter als Wildtyp-AHAS gegen das mindestens eine auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizid ist.

In einer anderen alternativen Ausführungsform beinhaltet das Verfahren:

(a) Alignen eines Ziel-AHAS-Proteins mit einem ersten AHAS-Template, das eine identifizierte Bindungstasche für ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid aufweist, und die Sequenz von 1 oder ein funktionelles Äquivalent davon aufweist, um die dreidimensionale Struktur des Ziel-AHAS-Proteins herzuleiten;
(b) Auswählen mindestens einer Aminosäureposition in dem Ziel-AHAS-Protein als einen Zielort für eine Mutation, wobei die Mutation die Affinität von mindestens einem auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid für die Bindungstasche verändert;
(c) Mutieren von DNA, die das Ziel-AHAS-Protein kodiert, um eine mutierte DNA herzustellen, die ein variantes AHAS kodiert, das die Mutation an der Position enthält; und
(d) Exprimieren der mutierten DNA in einer ersten Zelle, unter Bedingungen, in denen das variante AHAS, das die Mutation an der Position enthält, hergestellt wird.

Das Verfahren kann weiter enthalten:

(e) paralleles Exprimieren von DNA, die das Wildtyp-Ziel-AHAS-Protein kodiert, in einer zweiten Zelle;
(f) Reinigen des Wildtyp- und des varianten AHAS-Proteins aus den Zellen;
(g) Untersuchen des Wildtyp- und des varianten AHAS-Proteins auf katalytische Aktivität bei der Umwandlung von Pyruvat zu Acetolactat oder bei der Kondensation von Pyruvat und 2-Ketobutyrat, um Acetohydroxybutyrat zu bilden, in Abwesenheit und Anwesenheit des auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids; und
(h) Wiederholen der Schritte (b) – (g), wobei die DNA, die die AHAS-Variante von Schritt (d) kodiert, verwendet wird als die AHAS-kodierende DNA in Schritt (b), bis ein erstes variantes AHAS-Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid identifiziert wird, welches aufweist:
(i) in Abwesenheit des mindestens einen auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids,
(a) katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in welcher es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; oder
(b) katalytische Akitivität in Kombination mit irgendeinem varianten AHAS-Protein, das resistent ist gegen auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, das ebenfalls in der Zelle exprimiert wird, welches das gleiche wie oder verschieden von dem ersten varianten AHAS-Protein sein kann, ausreichend, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in welcher es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; wobei die Zelle AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt; und
(ii) katalytische Aktivität, die resistenter als Wildtyp-AHAS gegen das mindestens eine auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizid ist.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorstehenden Verfahren beträgt die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Herbizids mindestens ungefähr 5% und am meisten bevorzugt mehr als ungefähr 20% der katalytischen Aktivität des Wildtyp-AHAS. Wo das Herbizid ein Imidazolinon-Herbizid ist, weist das Herbizid-resistente variante AHAS-Protein vorzugsweise auf:

(i) katalytische Aktivität in Abwesenheit des Herbizids von mehr als ungefähr 20% der katalytischen Aktivität des Wildtyp-AHAS;
(ii) katalytische Aktivität, die vergleichsweise resistenter gegenüber der Anwesenheit von Imidazolinon-Herbiziden ist, verglichen mit Wildtyp-AHAS; und
(iii) katalytische Aktivität, die vergleichsweise sensitiver gegenüber der Anwesenheit von Sulfonylharnstoff-Herbiziden ist, verglichen mit Imidazolinon-Herbiziden.

Die vorliegende Erfindung stellt weiter bereit isolierte DNA, die variante Acetohydroxysäuresynthase (AHAS)-Proteine kodiert, wobei die varianten Proteine ein AHAS-Protein umfassen, modifiziert durch:

(i) Substitution von mindestens einem verschiedenen Aminosäurerest an einem Aminosäurerest der Sequenz aus 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus M53, R128, F135 und irgendeiner Kombination von irgendeiner der Vorausgegangenen;

In diesem Aufzählungssystem entspricht Rest #2 dem vermeintlichen Amino-Terminus des reifen Proteins, d.h. nach Entfernen eines Chloroplasten-Targeting-Peptids.
Die vorstehenden Modifikationen sind darauf gerichtet, die Fähigkeit eines auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids derart zu verändern, um die enzymatische Aktivität des Proteins zu inhibieren. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die isolierte DNA eine Variante von AHAS, die resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid. Ebenfalls bereitgestellt werden DNA-Vektoren, die DNA umfassen, die diese AHAS-Varianten kodieren, variante AHAS-Proteine selbst, und Zellen, die entweder in vivo oder in Zellkultur gewachsen sind, welche die AHAS-Varianten exprimieren oder diese Vektoren umfassen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung bereit ein Verfahren zum Verleihen von Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid an eine Zelle oder Zellen und besonders eine Pflanzenzelle oder -zellen wie zum Beispiel einem Samen. Ein AHAS-Gen, vorzugsweise das Arabidopsis thaliana AHAS-Gen, wird mutiert, um die Fähigkeit eines auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids derart zu verändern, um die Enzymaktivität von AHAS zu inhibieren. Das mutante Gen wird in einen kompatiblen Expressionsvektor kloniert, und das Gen wird in eine Zelle, die sensitiv gegenüber einem auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid ist, transformiert, unter Bedingungen, in denen es in ausreichender Menge exprimiert wird, um Herbizidresistenz an die Zelle zu vermitteln.
Ebenfalls betrachtet werden Verfahren zur Unkrautkontrolle, wobei eine Nutzpflanze, welche ein erfindungsgemäßes AHAS-Gen, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, mit einer Unkraut-kontrollierenden effektiven Menge des Herbizids kultiviert und behandelt wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst das rationale Design oder auf Struktur basierendes molekulares Modellieren von modifizierten Versionen des Enzyms AHAS und AHAS-inhibierenden auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden. Diese modifizierten Enzyme (variante AHAS-Proteine) sind resistent gegen die Wirkung von auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls DNAs, die diese Varianten kodieren, Vektoren, die diese DNAs enthalten, die varianten AHAS-Proteine, und Zellen, die diese Varianten exprimieren. Zusätzlich bereitgestellt werden Verfahren zum Erzeugen von Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid in Pflanzen durch Exprimieren dieser Varianten, sowie Verfahren zur Unkrautkontrolle. Die DNA und die AHAS-Varianten der vorliegenden Erfindung wurden in Studien entdeckt, die auf molekularem Modellieren der Struktur von AHAS basierten.
Rationales auf Struktur basierendes Design von AHAS-Varianten und AHAS-inhibierende auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizide
Erfindungsgemäße auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizidresistente Varianten von AHAS sind nützlich im Verleihen von Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid in Pflanzen und können mit dem POX-Modell designed werden.
1. Molekulares Modellieren
Techniken molekularen Modellierens (und speziell Proteinhomologie-Modellierens) können zum Verständnis der Struktur und Aktivität eines gegebenen Proteins beitragen. Das Strukturmodell eines Proteins kann bestimmt werden, direkt aus experimentellen Daten, beispielsweise Röntgenkristallographie, indirekt durch Homologiemodellieren oder Ähnliches, oder Kombinationen davon (siehe White et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23: 349, 1994). Die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von AHAS stellt eine Basis bereit für die Entwicklung eines rationalen Schemas für die Mutation von speziellen Aminosäureresten innerhalb des AHAS, die Herbizidresistenz an das Polypeptid vermitteln.
Molekulares Modellieren der Struktur von Zea mays-AHAS, unter Verwendung der bekannten Röntgen-Kristallstruktur der verwandten Pyruvatoxidase (POX) von Lactobacillus plantarum als Template stellt ein dreidimensionales Modell der AHAS-Struktur bereit, die nützlich ist zum Designen von Herbizid-resistenten AHAS-Varianten oder AHAS-inhibierenden Herbiziden. Diese Modellierungsprozedur nutzt vorteilhaft die Tatsache, dass AHAS und POX eine Anzahl von biochemischen Eigenschaften teilen und möglicherweise von einem gemeinsamen Ur-Gen stammen (Chang et al., J. Bacteriol. 170: 3937, 1988).
Die Ableitung eines Modells unter Verwendung interaktiver molekularer Graphiken und Alignments wird im Detail im Folgenden beschrieben. Die dreidimensionale AHAS-Struktur, die aus dieser Prozedur resultiert, sagt die wahrscheinliche räumliche Organisation des aktiven Zentrums des Enzyms und der Bindungsstelle oder -tasche von Inhibitoren, wie Herbizide einschließlich, aber nicht beschränkt auf Imidazolinon-Herbizide voraus. Das Modell wird dann verfeinert und neu interpretiert, basierend auf biochemischen Studien, die ebenfalls im Folgenden beschrieben werden.
Proteinhomologie-Modellieren erfordert das Alignment der Primärsequenz des zu untersuchenden Proteins mit einem zweiten Protein, dessen Kristallstruktur bekannt ist. Pyruvatoxidase (POX) wurde für das AHAS-Homologie-Modellieren ausgewählt, weil POX und AHAS eine Anzahl von biochemischen Eigenschaften teilen. Zum Beispiel teilen sowohl AHAS als auch POX Aspekte enzymatischer Reaktionsmechanismen sowie Kofaktor- und Metallanforderungen. In beiden Enzymen werden Thiaminpyrophosphat (TPP), Flavinadenindinukleotid (FAD) und ein bivalentes Kation für die enzymatische Aktivität benötigt. FAD vermittelt eine Redoxreaktion während der Katalyse in POX, hat jedoch vermutlich nur eine strukturelle Funktion in AHAS, die möglicherweise ein rudimentärer Rest der Evolution von AHAS aus POX ist. Beide Enzyme verwenden Pyruvat als ein Substrat und bilden Hydroxyethylthiaminpyrophosphat als ein stabiles Reaktionsintermediat (Schloss, J.V. et al. In Biosynthesis of branched chain amino acids, Barak, Z.J.M., Chipman, D.M., Schloss, J.V. (Hrsg.), VCH-Verlag, Weinheim, Deutschland, 1990).
Zusätzlich vorhanden ist AHAS-Aktivität in chimären POX-AHAS-Proteinen, die aus der N-terminalen Hälfte von POX und der C-terminalen Hälfte von AHAS bestehen, und es gibt einen kleinen Grad von AHAS-Aktivität, die POX selbst aufweist. AHAS und POX weisen ebenfalls ähnliche Eigenschaften in Lösung auf (Risse, B. et al., Protein Sci 1: 1699 und 1710, 1992; Singh, B. K., & Schmitt, G.K. (1989), FEBS Letters, 258: 113; Singh B. K. et al. (1989) In: Prospects for Amino Acid Biosynthesis Inhibitors in Crop Protection and Pharmaceutical Chemistry, (Lopping, L.G., et al., Hrsg., BCPC Monograph 5.87). Mit zunehmender Proteinkonzentration durchlaufen sowohl POX als auch AHAS schrittweise Übergänge von Monomeren zu Dimeren und Tetrameren. Erhöhungen der FAD-Konzentration induziert ebenfalls höhere Ordnungen an Untereinheit-Assemblierung. Die tetramere Form beider Proteine ist am stabilsten gegenüber Hitze und chemischer Denaturierung.
Darüber hinaus wurde die Kristallstruktur von POX aus Lactobacillus planarum gelöst durch Muller et al., Science 259: 965, 1993. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben herausgefunden, dass, teilweise basierend auf dem Grad von physikalischer, biochemischer und genetischer Homologie zwischen AHAS und POX, die Röntgenkristallstruktur von POX als ein struktureller Ausgangspunkt für Homologie-Modellierung der AHAS-Struktur verwendet werden kann.
Dennoch waren AHAS und L. plantarum POX-Sequenzen nicht ähnlich genug für ein vollständiges computerisiertes Alignment. Insgesamt sind nur ungefähr 20% der Aminosäuren identisch, während ungefähr 50% der Reste einer ähnlichen Klasse angehören (d.h., sauer, basisch, aromatisch und Ähnliches). Dennoch stimmen, wenn die Sequenzen mit Blick auf Klassifizierungen in hydrophile und hydrophobe Reste verglichen werden, stimmen über 500 von den 600 Aminosäuren überein. Sekundärstruktur-Vorhersagen für AHAS (Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 152, 1989) zeigten eine starke Ähnlichkeit zu der aktuellen Sekundärstruktur von POX. Für annähernd 70% der Reste stimmt die vorhergesagte AHAS-Sekundärstruktur mit der von POX überein.
POX-Monomere bestehen aus drei Domänen, die alle ein zentrales paralleles β-Sheet mit Crossovers aufweisen, bestehend aus α-Helices und langen Schleifen. (Muller et al., Science 259: 965, 1993). Die Topologie der Sheets unterscheidet sich zwischen den Domänen, d.h., in den ersten und dritten Domänen sind die Stränge in der Abfolge 2-1-3-4-6-5 zu dem β-Sheet assembliert, wohingegen im β-Sheet der zweiten Domäne die Abfolge 3-2-1-4-5-6 lautet.
Computer-generierte Alignments waren basiert auf Sekundärstruktur-Vorhersage und Sequzenzhomologie. Es wurde das übliche von Needleman und Wunch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970 beschriebene paarweise Sequenzalignment-Verfahren verwendet. Zwei Sequenzen wurden aligned, um die Alignmenttrefferzahl zu maximieren. Die Alignmenttrefferzahl (Homologietrefferzahl) entspricht der Summe der Treffer für alle Paare der alignten Reste, plus eine optionale Strafe für die Einführung von Lücken in das Alignment. Die Trefferzahl für das Alignment eines Paares von Resten ist ein tabellarischer ganzzahliger Wert. Das Homologiescoring-System basiert auf dem Beobachten der Frequenz der Divergenz zwischen einem gegebenen Paar von Resten. (MO Dayhoff, RM Schwartz & BC Orcutt "Atlas of Protein Sequence and Structure" Bd. 5, Erg. 3, S. 345-362, 1978).
Die Alignments wurden weiter verfeinert durch Repositionieren der Lücken, um die kontinuierliche regelmäßige Sekundärstruktur zu konservieren. Aminosäuresubstitutionen, die durch Evaluierung von wahrscheinlichen Alignmentschemata generiert wurden, wurden anhand von interaktiven molekularen Graphiken verglichen. Alignments mit den meisten konservativen Substitutionen im Hinblick auf die besondere Funktionalität der Aminosäuren innerhalb einer gegebenen Stelle wurden ausgewählt. Das endgültige Alignment sowohl von POX als auch AHAS ist in 2 dargestellt. Es wurden konservierte Cluster von Resten identifiziert, besonders für die TPP-Bindungsstelle und für Teile der FAD-Bindungsstelle. Das Alignment zeigte eine hohe Ähnlichkeit zwischen AHAS und POX für die erste Domäne, für die meisten Teile der zweiten Domäne, und für ungefähr die Hälfte der dritten Domäne. Von den meisten Regionen, die kaum alignten und unterschiedlich in POX und AHAS falten können, wurde erwartet, dass sie an der Oberfläche des Proteins liegen und nicht beteiligt sind bei Kofaktor- oder Inhibitorbindung. Die Vorhersage von Mutationsstellen ist im Wesentlichen nicht durch kleine Shifts im Alignment beeinflusst.
Die meisten TPP-bindenden Reste sind hochkonserviert zwischen POX und AHAS (z. B. P48-G49-G50). In manchen Fällen unterscheiden sich Reste, die nahe an TPP waren, zwischen POX und AHAS, blieben allerdings innerhalb eines Bereichs, der hochkonserviert ist (zum Beispiel Reste 90-110). Auf der anderen Seite schien die FAD-Bindungsstelle weniger konserviert zu sein. Obwohl manche FAD-bindende Reste stark konserviert waren (zum Beispiel D325-I326-D327-P328), unterschieden sich andere deutlich zwischen AHAS und POX (zum Beispiel sind Reste in der Schleife von Positionen 278 bis 285 nicht homolog). Eine detaillierte Analyse zeigte, dass zumindest für einige der weniger konservierten Kontaktstellen die Wechselwirkungen eher durch das Polypeptid-Rückgrat als durch die Seitenketten vermittelt wurden. Demzufolge wurde die Konservierung lediglich für die Polypeptidfaltung benötigt, und wurde nicht benötigt für die Aminosäuresequenz (zum Beispiel bindet das Rückgrat der Reste 258-263 die Ribitolkette von FAD). Eine Hälfte der Adenin- und der Isoalloxazin-Bindungsstellen unterscheiden sich deutlich.
Nach Alignen der Primärstruktur wurde ein Homologiemodell erstellt durch Transposition von AHAS-Aminosäuresequenzen mit der POX-Templatestruktur. Fehlende Koordinaten wurden schrittweise erstellt unter Verwendung von Templates von Aminosäureresten, um unbestimmte Seitenketten zu vervollständigen. Datenbankrecherchen und Energieminimierung von kleinen Teilen des Moleküls wurden verwendet, um die Konformationen von undefinierten Schleifenregionen zu vervollständigen. Die Kofaktoren TPP und FAD wurden in ihre Bindungstaschen modelliert. Dieses Modell wurde dann einer vollständigen 5000-Zyklen-Energieminimierung zugeführt. Die ganze Computermodellierung wurde in einer IRIS Indigo Elan R4000-Workstation von Silicon Graphics Co durchgeführt. Interaktives molekulares Modellieren und Energieminimierung wurden durchgeführt unter Verwendung von Quanta/CHARMm 4.0 von Molecular Simulations Inc. Während dieses Schritts war die Konformation stabil, was anzeigt, dass keine starken ungewollten Wechselwirkungen wie zum Beispiel enge Van der Waals-Kontakte stattgefunden haben. Die Ergebnisse sind schematisch in 3 dargestellt.
Eigenschaften der vorhergesagten AHAS-Struktur
Untersuchung der modellierten AHAS-Struktur wie oben beschrieben zeigte, dass das meiste des Proteins mit einem Rückgrat, das energetisch sinnvoll ist, mit den meisten hydrophilen Seitenketten zugänglich zum Lösungsmittel faltet. Die Oberflächen der β-Sheets sind flach und passen sich den Crossover-Bereichen an, die ihnen angefügt sind.
Ein Modell für dimeres AHAS wurde generiert durch Duplizieren der Koordinaten des Energie-minimierten monomeren AHAS und Überlagern der beiden Kopien mit zwei POX-Untereinheiten unter Verwendung von Paaren von Ca-Koordinaten, wie in dem Alignment-Schema definiert. Die Polypeptidkette von AHAS faltet in drei ähnlich gefaltete Domänen, bestehend aus einem sechssträngigen parallelen β-Sheet-Kern, umgeben von langen "Schleifen" und α-Helices. Zwei Untereinheiten sind derart zusammengesetzt, dass die erste Domäne der einen Untereinheit in enger Nähe zu den Kofaktor-Bindungsdomänen 2 und 3 der anderen Untereinheit ist. Es verbleibt ein Lösungsmittel-gefüllter Raum zwischen den Untereinheiten an dieser Stelle. Diese Tasche, die durch den Zusammenfluss der drei Domänen definiert wird, ist die vorgeschlagene Eintrittsstelle für das Substrat. Sie wird ebenfalls angenommen, als die Bindungsstelle für auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizide.
Die innere Oberfläche der Bindungstasche wird skizziert durch die Kofaktoren. Das Thiazol von TPP ist am Grund der Tasche positioniert. Domäne 3 trägt zur inneren Oberfläche der Tasche mit einer kurzen α-Helix bei, die ihre Achse auf das Pyrophosphat von TPP richtet, wobei die Phosphatladungen mit ihrem dipolarem Moment kompensiert wird. Diese entscheidende Helix, die mit G498 beginnt, ein "Turn"-Rest in engem Kontakt mit TPP, und die bei F507 endet, enthält drei Mutationsstellen, die bekannt sind für Sulfonylharnstoffresistenz: V500, W503 und F507 (siehe US-Patente Nr. 5,013,659; 5,141,870 und 5,378,824). In Domäne 1 steht die Schleife, die definiert ist als P48-S52 (zwischen β-Strang 2 und α-Helix 2), W503 gegenüber, eine Mutation, die Resistenz gegen Imidazolinonen vermittelt. Reste Y47 bis G50 sind ebenfalls in Kontakt mit TPP. Diese Schleife grenzt an P184-Q189, einen weiteren Turn, der den letzten Strang des β-Sheets von Domäne 1 mit einem β-Strang, der mit Domäne 2 verbindet, verknüpft. Innerhalb der Tasche, nahe ihrem Eingang, befindet sich ein langer Bereich von Domäne 1, der wechselwirkt mit einer komplementären Strecke von Domäne 2. Reste 125-129 und 133-137 von Domäne 1 und Reste 304-313 von Domäne 2 befinden sich an der Oberfläche der Tasche. Ein Turn, bestehend aus T96-G100, befindet sich zwischen Schleife 125-129 und TPP. Eine weitere Strecke von Domäne 3 und zwei Bereiche von Domäne 2, welche die Bindungstasche bekleiden, befinden sich an der gegenüberliegenden Ecke der Tasche. Reste 572, 575, 582 und 583 von Domäne 3 definieren die Taschenoberfläche an einer Seite. Der verbleibende Teil des Inneren der Taschenoberfläche wird definiert durch FAD und durch eine Schleife, L278-G282, welche den Isoalloxazinring von FAD kontaktiert.
2. Modellieren von Herbiziden in Bindungsst
Imazethapyr, das aktive Imidazolinon in PURSUIT^®, wurde in seine vorgeschlagene Bindungsstelle positioniert unter Verwendung interaktiver Molekulargraphiken (4) und der oben beschriebenen Software (4). K185 wurde gewählt als ein "Anker", um mit der Ladung der Carboxylgruppe zu wechselwirken. Die NH-CO-Einheit von Imidazolinon wurde angeordnet, um Wasserstoffbrückenbindungen zu G50 und A51 zu bilden. Dieses positionierte den Methylersatz von Imazethapyr nahe zu V500 auf dem Rückgrat der kleinen α-Helix. Möglicherweise ist die Isopropylgruppe über hydrophobe Reste der Aminosäuren in dem Bereich der Reste 125-135 gebunden, die beitragen zu der inneren Oberfläche der Tasche. Der Pyridinring wird aller Wahrscheinlichkeit nach zwischen A134 oder F135, F507 und W503 ge"sandwiched". W503 wechselwirkt ebenfalls mit dem Imidazolinonringsystem.
In gleicher Weise wurden die Sulfonylharnstoff-Herbizide in eine Stelle modelliert, die teilweise die beschriebene Imidazolinon-Bindungsstelle überlappte. Überlappung von Sulfonylharnstoff- und Imidazolinon-Bindungsstellen war übereinstimmend mit Konkurrenz-Bindungsexperimenten und etablierten Mutanten-Daten, die zeigen, dass dieselbe Mutation in Mais, W503L, Resistenz gegen beide Herbizide vermitteln kann. In diesen Modellen sind die meisten der bekannten Mutationsstellen, die Sulfonylharnstoff-Herbizidresistenz vermitteln, d.h., G50, A51, K185, V500, W503, F507 in engem Kontakt mit den gebundenen Herbiziden. P126 und A51 sind nötig, um die K185-Seitenkette durch Generieren einer hydrophoben Pore an Ort und Stelle zu halten. S582, eine Stelle für spezifische Imidazolinon-Resistenz, befindet sich entfernt von dem Bindungsbereich und ist lokalisiert in dem Bereich, wo die Homologie so gering ist, dass eine Veränderung in der Faltung erwartet wird. Die FAD-Bindungsstelle weist in diesem Bereich offensichtlich wenig Homologie auf zwischen AHAS und POX; 5582 ist ein Rest, der Resistenz in Mais vermittelt, und dass S582 und seine angrenzenden Reste sich in engem Kontakt mit der Tasche des aktiven Zentrums befinden. Es wird vorgeschlagen, dass FAD und der Schleifenbereich, der die Reste 278 bis 285 umfasst, sich leicht wegbewegen von der dritten Domäne (nach unten in 4), und dass eine Schleife, die S582 enthält, in den Raum zwischen der Helix an den Positionen 499 bis 507 und die Schleife an die Positionen 278 bis 285 faltet. D305, eine weitere bekannte Resistenzstelle, befindet sich nahe bei FAD und moduliert die Wechselwirkung zwischen Domänen 1 und 2. M280 kann entweder involviert sein im Positionieren der Helix an den Positionen 498 bis 507 oder direkt bei der Inhibitorbindung. M280 und D305 können ebenfalls direkt involviert sein bei Inhibitorbindung, wenn Domänen 1 und 2 sich leicht aufeinander zu bewegen.
3. Auswahl von Mutationen
Spezifische Aminosäurereste sind genau festgelegt als Stellen für die Einführung von Mutationen in die Primärsequenz von AHAS. Diese Aminosäuren werden basierend auf ihrer Position derart ausgewählt, dass, wenn diese Aminosäurerestposition modifiziert wird, es zu einer resultierenden Veränderung (d.h. Abnahme) in der Affinität eines Herbizids für die Bindungstasche kommt. Es ist nicht notwendig, dass die Mutationsposition in der Bindungstasche verbleibt, da Aminosäurereste außerhalb der Tasche selbst die Taschenladung oder -konfiguration verändern können. Die Auswahl von Targetstellen für Mutation wird erreicht unter Verwendung oben beschriebener molekularer Modelle. Zum Beispiel ist gemäß dem obigen Modell Arginin an Position 128 (bezeichnet R128 in 1 unter Verwendung des Einzelbuchstaben-Codes für Aminosäuren) nahe dem Eintritt zu der Bindungstasche für Substrat und auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizide lokalisiert und hat einen hohen Grad an konformationeller Freiheit, der ihm ermöglichen kann, am Transport geladener Herbizide in die Bindungstasche teilzunehmen. Daher wird dieser Rest durch Alanin substituiert, um sowohl seine Ladung als auch seine lange hydrophobe Seitenkette zu entfernen. Die resultierende Mutation wird als R128A bezeichnet.
Die Mutationen können einfache Substitutionen umfassen, die die Wildtyp-Sequenz mit irgendeiner anderen Aminosäure ersetzt. Alternativ können die Mutationen Deletionen oder Additionen von einer oder mehrerer Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 5, an einer bestimmten Stelle umfassen. Die zugegebene Sequenz kann eine Aminosäuresequenz umfassen, die bekannt dafür ist, in einem anderen Protein zu existieren, oder kann eine komplett synthetische Sequenz umfassen. Außerdem können mehr als eine Mutation und/oder mehr als ein Typ von Mutation in ein einziges Polypeptid eingeführt werden.
4. Ortsgerichtete Mutagenese
Die DNA, die AHAS kodiert, kann manipuliert werden, um die gewünschten Mutationen einzuführen. Die Mutagenese wird durchgeführt unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet üblich sind, wie beispielsweise beschrieben in Higuchi, R., Recombinant PCR, In M.A. Innis, et al., Hrsg., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, S. 177-183, 1990.
5. Expression und Reinigung von Varianten
Die mutierte oder variante AHAS-Sequenz wird in einen DNA-Expressionsvektor kloniert (siehe z.B. Beispiel 3) und in einer geeigneten Zelle wie zum Beispiel E. Coli exprimiert. Vorzugsweise ist die DNA, die AHAS kodiert, an ein Transkriptions-regulatorisches Element gebunden, und das variante AHAS wird als Teil eines Fusionsproteins exprimiert, zum Beispiel Glutathion-S-Transferase, um die Reinigung zu erleichtern (siehe Beispiel 3 unten). Das variante AHAS wird dann gereinigt unter Verwendung von Affinitätschromatographie oder eines beliebigen anderen geeigneten, im Fachbereich bekannten Verfahren. "Reinigung" eines AHAS-Polypeptids betrifft die Isolation des AHAS-Polypeptids in einer Art, die erlaubt, seine enzymatische Aktivität zu bestimmen, ohne Störung durch andere Komponenten der Zelle, in welcher das Polypeptid exprimiert wird.
6. Untersuchen enzymatischer Eigenschaften
Das gereinigte variante AHAS kann untersucht werden auf eine oder mehrere der folgenden drei Eigenschaften:

(a) spezifische oder katalytische Aktivität bei der Konvertierung von Pyruvat zu Acetolactat (ausgedrückt als Einheiten/mg reines AHAS, wobei eine Einheit an Aktivität definiert wird als 1 μmol produziertes Acetolactat/Stunde), oder bei der Kondensation von Pyruvat und 2-Ketobutyrat, um Acetohydroxybutyrat zu bilden (ausgedrückt als Einheiten/mg reines AHAS, wobei eine Einheit an Aktivität definiert wird als 1 μmol produziertes Acetohydroxybutyrat/Stunde;
(b) Level der Inhibierung durch ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, wie zum Beispiel Imidazolinon (ausgedrückt als IC₅₀, die Konzentration, bei der 50% der Aktivität des Enzyms inhibiert sind); und
(c) Selektivität der Resistenz gegen das ausgewählte auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizid vs. andere Herbizide. Der Selektivitätsindex wird definiert als die Faltungsresistenz der Mutante gegenüber Imidazolinonen im Vergleich zu dem Wildtyp-Enzym, geteilt durch die Faltungsresistenz derselben Mutante gegenüber anderen Herbiziden ebenfalls im Vergleich zu dem Wildtyp). Faltungsresistenz gegenüber einem Herbizid im Vergleich zu dem Wildtyp-Enzym wird ausgedrückt als der IC₅₀ der Variante, geteilt durch den IC₅₀ des Wildtyps. Der Selektivitätsindext (S.I) wird daher durch die folgende Gleichung dargestellt:

Geeignete Assaysysteme, um diese Bestimmungen vorzunehmen, enthalten, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen, die detailliert in Beispiel 4 unten beschrieben sind.
7.a. Evaluierung geeigneter Varianten
Die enzymatischen Eigenschaften von varianten AHAS-Polypeptiden werden mit dem Wildtyp-AHAS verglichen. Vorzugsweise resultiert eine bestimmte Mutation in einem AHAS-varianten Polypeptid, das in vitro enzymatische Aktivität gegenüber Pyruvat oder Pyruvat und 2-Ketobutyrat beibehält, d.h., die Konversion von Pyruvat zu Acetolactat oder bei der Kondensation von Pyruvat und 2-Ketobutyrat, um Acetohydroxybutyrat zu bilden (und von dem daher erwartet wird, in vivo biologisch aktiv zu sein), während es katalytische Aktivität aufzeigt, die vergleichsweise resistenter gegenüber dem/den ausgewählten Herbizid(en) ist als Wildtyp-AHAS. Vorzugsweise weist das variante AHAS auf:

(i) in Abwesenheit von dem mindestens einen auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid;
(a) katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; oder
(b) katalytische Aktivität in Kombination mit irgendeinem Herbizid-resistenten varianten AHAS-Protein, das ebenfalls in der Zelle exprimiert wird, welches dasselbe wie oder verschieden von dem ersten varianten AHAS-Protein sein kann, ausreichend, um die Lebensfähigkeit einer Zelle in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; wobei die Zelle AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt; und
(ii) katalytische Aktivität, die resistenter gegenüber dem mindestens einen auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid ist als Wildtyp-AHAS; und das vergleichsweise resistenter gegenüber dem/den auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendem/n Herbizid(en) ist als Wildtyp-AHAS.

Daher muss jede spezifische variante AHAS-Protein nicht die volle katalytische Aktivität haben, die notwendig ist, um die Lebensfähigkeit der Zelle aufrecht zu erhalten, muss aber einige katalytische Aktivität aufweisen in einer Menge, alleine oder in Kombination mit der katalytischen Aktivität von zusätzlichen Kopien derselben AHAS-Variante, und/oder der katalytischen Aktivität anderer varianter AHAS-Protein(e), die ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, die AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt, aufrecht zu erhalten. Zum Beispiel kann die katalytische Aktivität auf ein minimal-akzeptables Level erhöht werden durch Einführen multipler Kopien eines eine Variante kodierenden Gens in die Zelle, oder durch Einführen des Gens, welches ferner einen relativ starken Promotor enthält, um die Herstellung der Variante zu verstärken.
Mehr Resistenz bedeutet, dass die katalytische Aktivität der Variante, wenn überhaupt, durch das/die auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizid(e), in einem geringeren Ausmaß verringert wird, als die katalytische Aktivität von Wildtyp-AHAS durch das/die auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende/n Herbizid(e) vermindert wird. Bevorzugtes resistenteres variantes AHAS behält ausreichend katalytische Aktivität bei, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, Pflanze oder eines Organismus aufrecht zu erhalten, wobei bei derselben Konzentration des/derselben auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids/e Wildtyp-AHAS keine ausreichende katalytische Aktivität beibehalten würde, um die Lebensfähigkeit der Zelle, Pflanze oder des Organismus aufrecht zu erhalten.
Vorzugsweise beträgt die katalytische Aktivität in Abwesenheit von auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendem/n Herbizid(en) mindestens ungefähr 5%, und beträgt am meisten bevorzugt mehr als 20% der katalytischen Aktivität des Wildtyp-AHAS in Abwesenheit von auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendem/n Herbizid(en). Am meisten bevorzugte AHAS-Varianten sind resistenter gegenüber Imidazolinon-Herbiziden als gegenüber anderen Herbiziden wie auf Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden, obwohl in manchen Anwendungen Selektivität weder notwendig noch bevorzugt ist.
Im Falle von Imidazolinon-resistentem variantem AHAS ist es bevorzugt, dass das variante AHAS- Protein aufweist

(i) katalytische Aktivität in Abwesenheit dieses Herbizids von mehr als ungefähr 20% der katalytischen Aktivität des Wildtyp-AHAS;
(ii) katalytische Aktivität, die vergleichsweise resistenter gegenüber der Anwesenheit von Imidazolinon-Herbiziden ist, verglichen mit Wildtyp-AHAS; und
(iii) katalytische Aktivität, die vergleichsweise sensitiver gegenüber der Anwesenheit von Sulfonylharnstoff-Herbiziden ist, verglichen mit Imidazolinon-Herbiziden. Am meisten bevorzugt weisen die Herbizid-resistenten AHAS-Varianten eine minimale spezifische Aktivität von ungefähr 20 Einheiten/mg, minimale oder keine Inhibierung durch Imidazolinon, und einen Selektivitätsindex im Bereich von ungefähr 1.3 bis ungefähr 3000 im Vergleich zu anderen Herbiziden auf.

Ohne zu beabsichtigten, an die Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass systematische und iterative Anwendung dieses Verfahrens auf Wildtyp- oder ein anderes Ziel-AHAS-Protein, zur Herstellung von AHAS-Varianten führt, die die gewünschten Eigenschaften von hoher enzymatischer Aktivität, wie oben beschrieben, und Resistenz gegenüber einem oder mehreren Klassen von auf Imidazolinon- und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden aufweisen. Zum Beispiel kann die Mutation einer Wildtyp-AHAS-Sequenz an einer bestimmten Position in einer bestimmten Aminosäure in einer Mutante resultieren, die einen hohen Grad an Resistenz gegenüber einem auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid aufweist, aber einen signifikanten Verlust von enzymatischer Aktivität bezüglich Pyruvat oder Pyruvat und 2-Ketobutyrat. In einer zweiten Anwendung des obigen Verfahrens würde das Ausgangs- oder Ziel-AHAS-Polypeptid dann diese Variante sein (anstelle des Wildtyp-AHAS). Rationales Design involviert dann Substituieren anderer Aminosäuren an der ursprünglich mutierten Position und/oder Zufügen oder Entfernen von Aminosäuren an ausgewählten Punkten oder Bereichen in der Erwartung, Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonlyharnstoff basierendes Herbizid beizubehalten, aber ebenso einen höheren Level enzymatischer Aktivität aufrecht zu erhalten.
Das strukturbasierte rationale Design von AHAS-Proteinen, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, bietet viele Vorteile gegenüber konventionellen Ansätzen, die auf zufälliger Mutagenese und Selektion basieren. Zum Beispiel, wenn die Substitution einer bestimmten Aminosäure mit einer anderen die Substitution von mehr als einem Nukleotid innerhalb des Kodons erfordert, ist die Wahrscheinlichkeit, dass dieses zufällig geschieht, derart gering, dass es unmöglich ist. Im Gegensatz dazu können sogar Doppel- oder Tripel-Auswechslungen in der Nukleotidsequenz innerhalb eines Kodons leicht implementiert werden, wenn sie über einen rationalen Design-Approach vorgeschlagen werden. Zum Beispiel erfordert eine rational designte Mutation, um selektiv Imidazolinonresistenz zu vermitteln, einen Austausch von Arginin nach Glutamat. Arginin wird kodiert durch CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG, wohingegen Glutamat kodiert wird durch GAA und GAG. Da keines der Arginin-Kodons mit GA beginnt, würde diese Mutation eine Doppelsubstitution von benachbarten Nukleotiden erfordern, die so selten unter Verwendung von zufälliger Mutagenese vorkommen würde, dass sie mit keinerlei Aussicht auf einen sicheren Erfolg, unvorhersehbar und nicht wiederholbar wäre. Obwohl die Mutationsfrequenz während zufälliger Mutagenese erhöht werden kann, würden in Abwesenheit vorhergehender Ortsgerichtetheit der Mutationen Veränderungen in der Nukleotidsequenz überall in dem AHAS-Gen mit gleicher Wahrscheinlichkeit vorkommen. Das erhöht die Möglichkeit, eine irrelevante Mutation zu erhalten, die die enzymatische Aktivität stört. Gleichermaßen wäre es selten, unter Verwendung von zufälliger Mutagenese, eine multiple Aminosäuresubstitution, -deletion oder Substitutions/Deletions-Mutation zu finden, die Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid vermittelt bei gleichzeitigem Aufrechterhalten der katalytischen Aktivität. Deletionsmutationen, die Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid vermitteln, wären ebenfalls unter Verwendung eines zufälligen Mutageneseansatzes unwahrscheinlich. Deletionen müssten auf kleine Bereiche beschränkt werden und würden in Triplets vorkommen müssen, um den AHAS-Leserahmen beizubehalten, um die Enzymaktivität beizubehalten.
Hingegen werden mit einem rationalen auf Struktur basierenden Ansatz Doppelaminosäuresubstitutions- und/oder -deletionsmutationen relativ schnell erreicht und präzise zielgerichtet. Darüber hinaus erschaffen verschiedene Mutagene, die bei zufälliger Mutagenese verwendet werden, spezifische Typen von Mutationen. Zum Beispiel erschafft Natriumazid Punktsubstitutionsmutationen in Pflanzen, wohingegen Strahlung dahin tendiert, Deletionen zu erschaffen. Dementsprechend müssten zwei Mutageneseprotokolle verwendet werden, um eine multiple Kombination von Substitution/Deletion zu erhalten.
Schließlich erlaubt das vorliegende auf Struktur basierende Verfahren zum rationalen Design von Herbizid-resistenten AHAS-Varianten die iterative Verbesserung von Mutationen, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon- und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, ein Schritt, der durch zufällige Mutagenese nicht ermöglicht wird. Die Identifizierung einer Mutationsstelle für Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid durch zufällige Mutagenese mag einen geringen, wenn überhaupt, einen vorhersagenden Wert bieten, bezüglich Hinführen zu weiteren Verbesserungen bei den Eigenschaften der Mutante. Der vorliegende auf Struktur basierende Ansatz erlaubt auf der anderen Seite, Verbesserungen zu implementieren, basierend auf der Position, Umgebung und Funktion der Aminosäureposition in dem Strukturmodell.
Das iterative Verbesserungsverfahren erlaubt ebenfalls die unabhängige Manipulation dreier wichtiger Eigenschaften von AHAS: Level der Resistenz, Selektivität der Resistenz und katalytische Effektivität. Zum Beispiel können kompensatorische Mutationen in voraussagender Art und Weise designt werden. Wenn eine bestimmte Mutation einen schädlichen Effekt auf die Aktivität eines Enzyms hat, kann eine zweite kompensatorische Mutation verwendet werden, um Aktivität wiederherzustellen. Zum Beispiel kann eine Veränderung in der Nettoladung innerhalb einer Domäne, wenn ein geladener Rest aufgrund einer Mutation eingeführt oder verloren wird, kompensiert werden durch Einführen einer zweiten Mutation. Die Vorhersage der Position und des Typs von dem/den an der zweiten Stelle einzuführenden, zu detektieren oder zu substituierenden Rest(en), um enzymatische Aktivität wiederherzustellen, erfordert ein Wissen von Struktur-Funktionsverhältnissen, abgeleitet von einem Modell wie dem hierin beschriebenen.
Herbizid-resistente AHAS-Varianten: DNA Vektoren und Polypeptide
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls isolierte DNA-Moleküle, die variante AHAS-Polypeptide kodieren, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid. Gene, die erfindungsgemäße AHAS-Polypeptide kodieren, können von jeder Spezies und vorzugsweise einer Pflanzenspezies erhalten werden, und Mutationen, welche Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid vermitteln, können an äquivalenten Positionen innerhalb jeder dieser AHAS-Gene eingeführt werden. Die Äquivalenz einer gegebenen Kodonposition in verschiedenen AHAS-Genen ist eine Funktion sowohl der Konservierung der primären Aminosäuresequenz und ihres Proteins als auch der Beibehaltung ähnlicher dreidimensionaler Struktur. Zum Beispiel illustriert 5 den hohen Grad an Sequenzhomologie zwischen AHAS-Polypeptiden, die von verschiedenen Pflanzenspezies erhalten wurden. Diese AHAS-Polypeptide weisen mindestens ungefähr 60 bis ungefähr 70% Gesamthomologie auf. Ohne zu beabsichtigen, an die Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass in Bereichen, wo die Polypeptide eine hochkonservierte Sequenz haben, die Polypeptidkettenkonformation ebenfalls konserviert sein wird. Daher ist es möglich, für anfängliches Testen und iterative Verbesserung, eine AHAS-kodierende Sequenz von einer Spezies für molekulares Modellieren zu verwenden, um Mutationen voraussagend in ein AHAS-Gen einer zweiten Spezies einzuführen und schließlich die optimierten Mutationen in AHAS einzuführen, das von einer weiteren dritten Pflanzenspezies stammt, zur Expression in einer transgenen Pflanze.
In einer Ausführungsreihe kodieren diese AHAS-DNAs Varianten eines AHAS-Polypeptids und vorzugsweise des Mais-AHAS-Polypeptids aus 1, in welchem das Polypeptid modifiziert ist durch Substitution an oder Deletion von Aminosäureresten M53, R128, F135.
Die vorliegende Erfindung umfasst DNA- und entsprechende RNA-Sequenzen sowie Sense- und Antisense-Sequenzen. Nukleinsäuresequenzen, die AHAS-Polypeptide kodieren, können durch natürliche AHAS-regulatorische Sequenzen flankiert werden, oder können assoziiert sein mit heterologen Sequenzen einschließlich Promotoren, Enhancern, Response Elements, Signalsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Introns, 5'- und 3'-nicht-kodierenden Bereichen und Ähnlichem. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren modifiziert werden, um Stabilität, Löslichkeit, Bindungsaffinität und Spezifität zu verändern. Zum Beispiel können die varianten AHAS-kodierenden Sequenzen selektiv methyliert sein. Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls modifiziert werden mit einer Markierung, in der Lage, ein entweder direkt oder indirekt detektierbares Signal bereitzustellen. Beispielhafte Markierungen beinhalten Radioisotope, fluoreszierende Moleküle, Biotin und Ähnliches.
Die Erfindung stellt ebenfalls Vektoren bereit, die Nukleinsäuren umfassen, die AHAS-Varianten kodieren. Eine große Anzahl von Vektoren, einschließlich Plasmid- und Pilzvektoren, sind für Expression in einer Vielzahl von eukaryotischen und prokaryotischen Wirten beschrieben. Vorteilhafterweise können die Vektoren ebenfalls einen Promotor enthalten, der operativ mit dem AHAS-kodierenden Teil verbunden ist. Das kodierte AHAS kann exprimiert werden unter Verwendung beliebiger geeigneter Vektoren und Wirtszellen, unter Verwendung von hierin offenbarten oder zitierten oder anderweitig dem Fachmann im relevanten Fachbereich bekannten Verfahren. Beispiele von geeigneten Vektoren schließen ohne Limitierung pBIN-basierte Vektoren, pBluescript-Vektoren und pGEM-Vektoren ein.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls sowohl variante AHAS-Polypeptide, die resistent gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid oder Peptidfragmente davon sind. Wie oben erklärt, können die varianten AHAS-Polypeptide vom Mais-Polypeptid, dargestellt in 1, oder von irgendeinem Pflanzen- oder mikrobiellem AHAS-Polypeptid, vorzugsweise Pflanzen-AHAS-Polypeptid stammen. Die Polypeptide können weiter modifiziert sein, durch zum Beispiel Phosphorylierung, Sulfatierung, Acylierung, Glykosilierung oder andere Proteinmodifikationen. Die Polypeptide können aus Pflanzen isoliert werden oder von heterologen Organismen oder Zellen (einschließend, aber nicht beschränkt auf Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Pflanzen- und Säugetierzellen), in welche das Gen, das ein variantes AHAS-Polypeptid kodiert, eingeführt und exprimiert wurde. Darüber hinaus können die AHAS-Polypeptide modifiziert werden mit einer Markierung, in der Lage, ein entweder direkt oder indirekt detektierbares Signal bereitzustellen, einschließlich Radioisotope, Fluoreszenzverbindungen und Ähnliches.
Pflanzen, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, und Pflanzen die variante AHAS-Gene enthalten
Die vorliegende Erfindung umfasst transgene Zellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Samen, Organismen und Pflanzen, in welche Gene, die AHAS-Varianten, welche resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, eingeführt worden sind. Nicht-beschränkende Beispiele von geeigneten Empfängerpflanzen sind in Tabelle 1 unten aufgeführt:
TABELLE 1 EMPFÄNGERPFLANZEN
Expression der varianten AHAS-Polypeptide in transgenen Pflanzen verleiht ein hohes Level an Resistenz gegenüber auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden einschließlich Imazethapyr (PURSUIT^®), das die Verwendung von diesen auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden während der Kultivierung der transgenen Pflanzen erlaubt.
Verfahren zum Einführen fremder Gene in Pflanzen sind im Fachbereich bekannt. Nichtbeschränkende Beispiele solcher Verfahren schließen ein Agrobacterium-Infektion, Partikelbeschuss, Polyethylenglycol (PEG)-Behandlung von Protoplasten, Elektroporation von Protoplasten, Mikroinjektion, Makroinjektion, Sprossinjektion, Pollenschlauchpfad, Trockensamenimbibition, Laserperforation und Elektrophorese. Diese Verfahren sind beschrieben in beispielsweise B. Jenes et al., und S.W. Ritchie et al. In Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S.-D. Kung, R. Wu, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich 1993; und L. Mannonen et al., Critical Reviews in Biotechnology, 14: 287-310, 1994.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA, die ein variantes AHAS kodiert, in einen DNA-Vektor kloniert, der ein antibiotisches Resistenzmarkergen enthält, und das rekombinante AHAS-DNA-enthaltende Plasmid wird in Agrobacterium tumefaciens eingeführt, das ein Ti-Plasmid enthält. Dieses "binäre Vektorsystem" ist beschrieben beispielsweise in US-Patent Nr. 4,490,838 und in An et al., Plant Mol. Biol. Manual A3: 1-19 (1988). Das transformierte Agrobacterium wird dann kokultiviert mit Blattscheiben der Empfängerpflanze, um Infektion und Transformation der Pflanzenzellen zu ermöglichen. Die transformierten Pflanzenzellen werden dann in Regenerationsmedium kultiviert, welches die Bildung von Trieben fördert, zunächst in Anwesenheit des geeigneten Antibiotikums, um auf transformierte Zellen zu selektieren, dann in Anwesenheit des Herbizids. In Pflanzenzellen, die erfolgreich transformiert waren mit der DNA, die AHAS kodiert, welches resistent gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid ist, findet die Triebbildung selbst in Anwesenheit von Levels von einem auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid statt, welches Triebbildung in nicht-transformierten Zellen verhindert. Nach Bestätigen der Anwesenheit varianter AHAS-DNA unter Verwendung von zum Beispiel Polymerasekettenreaktion (PCR)-Analyse, werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, dem Besprühen mit einem auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid standzuhalten und bezüglich ihrer Fähigkeit zur Samenkeimung und Wurzelbildung und Proliferation in der Anwesenheit des Herbizids.
Andere Anwendungen
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden in auf Struktur basierendem rationalem Design von AHAS-Varianten, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, die in Pflanzen inkorporiert werden können, um den Pflanzen selektive Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid zu verleihen.
AHAS-Gene, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, können in Nutzpflanzenspezies in Einzel- oder multiplen Kopien transformiert werden, um Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid zu verleihen. Die Genmanipulation von Nutzpflanzenspezies mit eduzierter Sensitivität gegenüber auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden kann:

(1) das Spektrum und die Flexibilität der Anwendung spezifisch effektiver und gut umweltverträglicher auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierender Herbizide erhöhen;
(2) den kommerziellen Wert dieser auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizide verstärken;
(3) Unkrautbelastung in Nutzpflanzenfeldern durch effektive Verwendung von auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden für Nutzpflanzenspezies, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, reduzieren und eine entsprechende Erhöhung der Ernteerträge;
(4) Absatz von Samen für Pflanzen, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, erhöhen;
(5) Resistenz gegen Nutzpflanzenschäden durch Übertragung von auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden, die in einer vorherigen Bepflanzung angewendet wurden, erhöhen;
(6) Empfindlichkeit gegenüber Änderungen in den Eigenschaften von einem auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid aufgrund von ungünstigen Klimabedingungen verringern; und
(7) Toleranz gegenüber ungleichmäßig oder falsch angewendeten auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden erhöhen.

Zum Beispiel können transgene Pflanzen, die das variante AHAS-Protein enthalten, kultiviert werden. Die Nutzpflanze kann behandelt werden mit einer Unkraut-kontrollierenden effektiven Menge des auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids, gegenüber welchem die transgene Pflanze mit dem varianten AHAS resistent ist, was zu Unkrautkontrolle in der Nutzpflanze führt, ohne in schädlicher Weise die kultivierte Nutzpflanze zu beeinflussen.
Die oben beschriebenen DNA-Vektoren, die AHAS-Varianten kodieren, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, können weiter verwendet werden, so dass die Expression der AHAS-Variante einen selektierbaren Marker bereitstellt zur Transformation von Zellen durch den Vektor. Die beabsichtigten Empfängerzellen können in Kultur oder in situ vorliegen, und die varianten AHAS-Gene können alleine oder in Kombination mit anderen selektierbaren Markern verwendet werden. Die einzige Bedingung ist, dass die Empfängerzelle sensitiv gegenüber den zytotoxischen Effekten des verwandten Herbizids ist. Diese Ausführungsform nutzt vorteilhaft die relativ geringen Kosten und fehlende Toxizität von auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden, und kann in jedem System verwendet werden, welches DNA-vermittelte Tranformation benötigt.
Erläuterung bezüglich der bevorzugten Ausführungsformen
Beispiel 1: Design von AHAS-Varianten, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid
Reste, die nahe der Bindungsstelle für das vorgeschlagene auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizid, des oben detailliert beschriebenen Modells lokalisiert sind, wurden für die Mutagenese ausgewählt, um ein aktives AHAS-Polypeptid zu entwerfen mit erniedrigter Bindungskapazität für ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid. Jede Stelle auf der Oberfläche der Tasche wurde berücksichtigt bezüglich potenzieller Wechselwirkungen mit anderen Resten in der Tasche, sowie mit Kofaktoren und auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden. Zum Beispiel wird von der Addition von positiv geladenem/n Rest(en) erwartet, dass sie die Ladungsverteilung innerhalb der Bindungsstelle stören, was zu einem Verlust der Bindungsaffinität eines auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids führt.
Drei Reste wurden als die nützlichsten Zielorte für die Mutagenese identifiziert:

(1) von F135 wurde angenommen, dass es sowohl mit dem Isoalloxazinring von FAD, als auch mit der aromatischen Gruppe der Herbizide wechselwirkt. In Übereinstimmung mit der Strategie, mehr geladene Reste in die Bindungstasche einzuführen, wurde dieser Rest nach Arginin geändert.
(2) M53 kontaktiert Helix 498-507. Diese Helix enthält bekannte Herbizidresistenz-Mutationsstellen und ist ebenfalls einbezogen in TPP-Bindung. Darüber hinaus wurde von der Substitution von Glutaminsäure an Position 53 angenommen, eine Wechselwirkung mit K185 zu favorisieren, was die Affinität von K185 für die Carboxylatgruppe von Imazethapyr reduziert.
(3) R128 befindet sich nahe dem Eintritt zu der Tasche, von wo man angenommen hatte, dass es involviert ist in den anfänglichen Transport von geladenen auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbiziden in die Bindungstasche. Dieser Rest wurde nach Alanin geändert, um sowohl seine Ladung als auch seine lange hydrophobe Seitenkette zu entfernen.

Beispiel 2: Ortsgerichtete Mutagenese von AHAS, um Varianten herzustellen, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid
Das Arabidopsis-AHAS-Gen wurde "in-frame" in das 3'-Ende des kodierenden Bereichs des Glutathionin-S-Transferase-Gens in den pGEX-2T-Vektor (Pharmacia) eingebaut. Die Konstruktion des Vektors in dieser Art erhielt die Sechs-Aminosäure-Thrombin-Erkennungssequenz an der Ansschlussstelle des exprimierten Glutathionin-S-Transferase (GST)/AHAS-Fusionsproteins aufrecht. Thrombinverdau des exprimierten Fusionsproteins führt zu einem AHAS-Protein mit einer N-terminalen Startposition am Ende des Transitpeptids an einer mutmaßlichen Transitpeptid-Prozessierungsstelle mit einem verbleibenden N-terminalen Glycin, das von der Thrombinerkennungsstelle stammt. Der schließliche Aminoterminus des gespaltenen AHAS-Proteins besteht aus Gly-Ser-Ser-Ile-Ser. Die ortsgerichteten Mutationen wurden in das AHAS-Gen in diesem Vektor eingeführt.
Die ortsgerichteten Mutationen wurden entsprechend dem PCR-Verfahren von Higuchi konstruiert (Recombinant PCR. In MA Innis, et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, S. 177-183, 1990). Zwei PCR-Produkte, von dem jedes die Mutationsstelle überlappt, wurden amplifiziert. Die Primer in den überlappenden Bereichen enthielten die Mutation. Die überlappenden PCR-amplifizierten Fragmente wurden kombiniert, denaturiert, und es wurde ihnen erlaubt, sich wieder aneinander anzulagern, wobei zwei mögliche Heteroduplexprodukte mit zurückhängenden 3'-Enden hergestellt wurden. Die zurückhängenden 3'-Enden wurden von der Taq DNA-Polymerase verlängert, um ein Fragment herzustellen, das der Summe der beiden überlappenden PCR-Produkte entsprach und die gewünschte Mutation enthielt. Eine nachfolgende Reamplifizierung dieses Fragments mit lediglich den beiden "außenseitlichen" Primern führte zur Anreicherung des Volllängen-Produkts. Das Produkt, das die Mutation enthält, wurde dann wieder eingeführt in das Arabidopsis-AHAS-Gen in dem pGEX-2T-Vektor.
Beispiel 3: Expression und Reinigung von AHAS-Varianten
A. Methoden
E. Coli (DH5α)-Zellen, transformiert mit dem pGEX-2T-Vektor, der entweder das Mais-Wildtyp-AHAS-Gen (Vektorbezeichnung pAC751), die Arabidopsis-Mutante Ser653Asn oder die Arabidopsis-Mutante Ile401Phe enthielt, wurden über Nacht in LB-Brühe angezüchtet, die 50 μg/ml Ampicillin enthält. Die Übernacht-Kultur von E. coli wurde 1:10 verdünnt in 1lLB, 50 μg/ml Ampicillin und 0.1% v/v Antifoam A. Die Kultur wurde bei 37°C unter Schütteln inkubiert, bis die OD₆₀₀ ungefähr 0.8 erreichte. Isopropylthiogalactose (IPTG) wurde zugegeben zu einer Endkonzentration von 1 mM, und die Kultur wurde für 3 weitere Stunden inkubiert.
Die Zellen wurden geerntet durch Zentrifugation bei 8,670 xg für 10 Minuten in einem JA-10-Rotor und wieder gelöst in 1/100el des Original-Kulturvolumens in MTPBS (16 mM Na₂HPO₄, 4 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.3). Triton X-100 und Lysozym wurden zu einer Endkonzentration von 1% v/v bzw. 100 μg/m1 zugegeben. Die Zellen wurden bei 30°C für 15 Minuten inkubiert und auf Eis auf 4°C gekühlt und durch Sonifizierung für 10 Sekunden auf Stufe 7 mit einem Branson Sonifier Cell Disrupter, der mit einer Microtip-Sonde ausgestattet ist, lysiert. Der zellfreie Extrakt wurde bei 35000 xg für 10 Min. bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und der Zentrifugationsschritt wurde wiederholt.
Reinigung der exprimierten Fusionsproteine wurde modifiziert wie von Smith und Johnson durchgeführt (Gene 67: 31-40, 1988). Der Überstand wurde auf Raumtemperatur erwärmt und durch eine 2 ml-Säule von Glutathion-Agarosebeads (Sulfur Linkage, Sigma), die in MTPBS äquilibriert war, laufen gelassen. Die Säule wurde anschließend bei Raumtemperatur mit MTPBS gewaschen, bis die A₂₈₀ des Elutionsmittels dem von MTPBS entsprach. Das Fusionsprotein wurde dann eluiert unter Verwendung einer Lösung, die 5 mM reduziertes Glutathion in 50 mM Tris HCl, pH 8.0, enthielt. Das eluierte Fusionsprotein wurde behandelt mit ungefähr 30 NIH-Einheiten von Thrombin und gegen 50 mM Citrat pH 6.5 und 150 mM NaCl dialysiert.
Das Fusionsprotein wurde über Nacht bei Raumtemperatur verdaut. Verdaute Proben wurden gegen MTPBS dialysiert und zweimal durch eine Glutathion-Agarosesäule, äquilibriert in MTPBS, laufen gelassen, um das freigesetzte Glutathion-Transferaseprotein zu entfernen. Die Proteinfraktion, die nicht an die Säure gebunden hatte, wurde gesammelt und über Ultrafiltration auf einem YM10-Filter (Amicon) aufkonzentriert. Die aufkonzentrierte Probe wurde auf eine 1.5 × 95 cm Sephacryl S-100 Gelfiltrationssäule, äquilibriert in Gelfiltrationspuffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0), geladen. Zwei ml-Fraktionen wurden gesammelt bei einer Flussrate von 0.14 ml/min. Enzymstabilität wurde getestet durch Aufbewahrung des Enzyms bei 4°C in Gelfiltrationspuffer mit der Zugabe von 0.02% Natriumazid und in Anwesenheit oder Abwesenheit von 2 mM Thiaminpyrophosphat und 100 μM Flavinadenindinukleotid (FAD).
B. Ergebnisse
E. Coli, das transformiert war mit dem pAC751-Plasmid, das das Wildtyp-AHAS-Gen enthielt, stromabwärts und in-frame fusioniert mit dem GST-Gen, exprimierte ein 91 kD-Protein, wenn mit IPTG induziert wird. Das 91 kD-Protein wies die vorhergesagte molekulare Masse eines GST/AHAS-Fusionsproteins auf (die Summe von 26 kD bzw. 65 kD). Wenn der zellfreie Extrakt von DH5α/pAC751 durch ein Glutathion-Agaroseaffinitätsgel laufen gelassen wurde, gewaschen und mit freiem Glutathion eluiert, erbrachte er eine Präparation, die angereichert an 91 kD-Protein war (6, Spur C). Die in der Anschlussstelle von GST und AHAS konstruierte Sechs-Aminosäure-Thrombin-Erkennungsstelle wurde erfolgreich durch Thrombin gespalten (6, Spur D). Die Präparation des gespaltenen Fusionsproteins bestand aus dem erwarteten 26 kD GST-Protein und 65 kD Mais-AHAS-Protein. Mais-AHAS wurde bis zur Homogenität über einen zweiten Lauf durch die Glutathion-Agarosesäule gereinigt, um GST über Affinität zu entziehen, und einem finalen Sephacryl S-100 Gelfitrationsschritt zugeführt, um Thrombin zu eliminieren (6, Spur E). Das 65 kD-Protein wird auf Western Blots durch einen monoklonalen gegen ein Mais-AHAS-Peptid gerichteten Antikörper erkannt.
Gereinigtes Wildtyp-Mais-AHAS wurde über Elektronenspray-Massenspektroskopie analysiert und es wurde bestimmt, dass es eine molekulare Masse von 64,966 Daltons besitzt (Daten nicht gezeigt). Die vorausgesagte Masse, wie aus der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Gens, eingebaut in den pGEX-2T-Vektor, kalkuliert, beträgt 65,058. Die 0.096% Diskrepanz zwischen der empirisch bestimmten und vorausgesagten Masse lag innerhalb der Tuning-Variabilität des Massenspektrometers. Die enge Nähe der beiden Massenbestimmungen legt nahe, dass weder fehl-eingebaute Nukleotide während der Konstruktion des Expressionsvektors, noch irgendwelche posttranslationalen Modifikationen an dem Protein vorlagen, die große Veränderungen in der molekularen Masse hervorrufen würden. Darüber hinaus zeigte das Fehlen von falschen Peaks in der Präparation des gereinigten Enzyms an, dass die Probe frei von Kontamination war.
Beispiel 4: Enzymatische Eigenschaften der AHAS-Varianten
Die enzymatischen Eigenschaften von Wildtyp- und variantem AHAS, produziert in E. coli, wurden durch eine Modifikation des Verfahrens von Singh et al. (Anal. Biochem. 171: 173-179, 1988) wie folgt gemessen:
Ein Reaktionsgemisch, das 1X AHAS-Probenpuffer (50 mM HEPES pH 7.0, 100 mM Pyruvat, 10 mM MgCl₂, 1 mM Thiaminpyrophosphat (TPP), und 50 μM Flavinadenindinukleotid (FAD)) enthält, wurde erhalten entweder über Verdünnung des Enzyms in 2X Probenpuffer oder durch Zugabe von konzentriertem Enzym zu 1X AHAS-Probenpuffer. Alle Assays, die Imazethapyr und zugehörige Kontrollen enthielten, wiesen eine Endkonzentration auf von 5% DMSO aufgrund der Zugabe von Imazethapyr zu Assaygemischen als eine 50% DMSO-Lösung. Die Assays wurden in einem Endvolumen von 250 μl bei 37°C in Mikrotiterplatten durchgeführt. Nachdem der Reaktion erlaubt wurde, für 60 Minuten fortzuschreiten, wurde Acetolactatakkumulation kolorimetrisch, wie von Singh et al., Anal. Biochem. 171: 173-179, 1988, beschrieben, gemessen.
Mais-AHAS, exprimiert und gereinigt von pAC751, wie in Beispiel 3 oben beschrieben, ist aktiv bei der Konversion von Pyruvat zu Acetolactat. Die vollständige AHAS-Aktivität ist abhängig von der Anwesenheit der Kofaktoren FAD und TPP im Assaymedium. Es wurde keine Aktivität detektiert, wenn nur FAD zu dem Assaymedium zugegeben wurde. Die Aktivität des gereinigten Enzyms mit TPP alleine oder ohne Kofaktoren betrug weniger als 1% der in Anwesenheit sowohl von TPP als auch FAD detektierten Aktivität. Normalerweise ist AHAS, das in rohen Pflanzenextrakten vorhanden ist, sehr labil, speziell in Abwesenheit von Substrat und Kofaktoren. Im Gegensatz dazu zeigte das gereinigte AHAS von dem bakteriellen Expressionssystem keinen Verlust an katalytischer Aktivität, wenn es für einen Monat bei 4°C in 50 mM HEPES, pH 7.0, 150 mM NaCl, 0.02% NaN₃ in Anwesenheit oder Abwesenheit von FAD und TPP aufbewahrt wurde. Darüber hinaus waren, wenn erneut aufgelöst in SDS-PAGE-Gelen, keine Degradationsprodukte von diesen aufbewahrten Präparationen sichtbar.
Die spezifischen Aktivitäten von Wildtyp-AHAS und den Varianten M124E, R199A und F206R sind in Tabelle 2 unten dargestellt. Wie aus dem Alignment in 5 bestimmt, ist die Mutation M124E in Arabidopsis-AHAS das Äquivalent der Mais-Mutation M53E, die Mutation R199A in Arabidopsis ist das Äquivalent der Mais-Mutation R128A, und die Mutation F206R in Arabidopsis ist das Äquivalent der Mais-Mutation F135R. Die in dem Mais-AHAS-Strukturmodell designten Mutationen wurden verwendet, um die äquivalente Aminosäure in dem dicotylen Arabidopsis-AHAS-Gen zu identifizieren und wurden in das Arabidopsis-AHAS-Gen eingebaut und getestet. Diese Translation und der Einbau von rational designten Herbizid-Mutationen in das dicotyle Arabidopsis-AHAS-Gen kann die Evaluierung von Herbizidresistenz in Pflanzen einer dicotylen Spezies erleichtern.
TABELLE 2 SPEZIFISCHE AKTIVITÄT
Die Mutation R199A hält einen hohen Level an katalytischer Aktivität (Tabelle 2) aufrecht, während sie einen signifikanten Level an Resistenz gegenüber Imazethapyr (7) aufweist. Vor allem behält diese Variante vollständige Sensitivität gegenüber Sulfonylharnstoffen (8) bei. Daher erfüllt diese Variante die Kriterien von hoher spezifischer Aktivität und selektiver Herbizidresistenz. Im Gegensatz dazu führte die Substitution M124E zu fast vollständiger Resistenz gegenüber Imazethapyr (7), zeigte aber auch stark reduzierte katalytische Aktivität (Tabelle 2). Im Vergleich zu Imidazolinon-Resistenz, wies dieser Variante eine größere Sensitivität gegenüber Sulfonylharnstoff (8) auf, was nahe legt, dass dieser Rest ein guter Kandidat ist zum Erschaffen einer Mutation, die selektive Resistenz vermittelt. Die Substitution einer anderen Aminosäure als Glutaminsäure kann helfen, die katalytische Aktivität aufrecht zu erhalten. Die Substitution F206R erbrachte ähnliche Ergebnisse wie die für die Variante M124E beobachteten, jedoch fehlte ihr die Selektivität in Resistenz.
Beispiel 5: Iterative Verbesserung einer AHAS-Variante, die resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid unter Verwendung eines rationalen Design-Ansatzes
Das Austauschen des Restes 124 in AHAS von Met zu Glu, wie in Beispiel 4 oben beschrieben, verlieh Imidazolinon-Resistenz, reduzierte jedoch ebenfalls die enzymatische Aktivität bis zu 9.2% des Wildtyp-Wertes. Das Modell der oben beschriebenen Mais-AHAS-Struktur legte nahe, dass Met53 (äquivalent zu dem Arabidopsis-Rest Met124) mit einer Reihe von hydrophoben Resten an der Seite einer α-Helix wechselwirkt, die von einer separaten Untereinheit stammt, sich aber in enger Nachbarschaft zu Met53 befinden. Daher kann die hydrophobe Wechselwirkung zwischen Met53 und den Resten auf der Helix sowohl die Untereinheit/Untereinheitsassoziation als auch die Konformation des aktiven Zentrums stabilisieren. Es wurde angenommen, dass die Substitution des hydrophoben Met-Rests mit einem geladenen Glutamatrest höchstwahrscheinlich die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten destabilisieren und zu einem Verlust der katalytischen Aktivität führen.
Basierend auf dieser Struktur-/Funktionsanalyse wurde die Aktivität des ursprünglichen mutanten Enzyms aus Arabidopsis, Met124Glu (äquivalent zu Mais-Met53Glu), durch Substituieren einer hydrophoberen Aminosäure (Ile) an dieser Position iterativ verbessert. Die hydrophobe Natur der Ile-Seitenkette führte zur Wiederherstellung der Aktivität auf Wildtyp-Levels (spezifische Aktivität von 102, äquivalent zu 102% der Wildtyp-Aktivität), aber der größere Teil der Ile-Seitenkette war immer noch in der Lage, ein signifikantes Level von Imidazolinon-Resistenz aufrecht zu erhalten (9).
Im Vergleich führt die Substitution eines Histidin-Rests an dieser Position zu einer AHAS-Variante, die eine spezifische Aktivität von 42.5, äquivalent zu 42.6% der Wildtyp-Aktivität aufweist. Nichtsdestoweniger wies diese Mutante einen hohen Grad an Resistenz gegenüber PURSUIT^® (10) auf.
Beispiel 6: Iterative Verbesserung einer AHAS-Variante, die resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid unter Verwendung eines rationalen Design-Ansatzes
Ein weiteres Beispiel iterativer Verfeinerung unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt die Variante Arg128Ala ein. Das Strukturmodell von Mais- AHAS legte nahe, dass der Arg128-Rest, der sich am Rand der Herbizid-Bindungstasche befindet, dazu beiträgt, geladene Substrate und Herbizide in die Herbizid-Bindungstasche und in das aktive Zentrum zu leiten. Der Arg128-Rest ist weiter entfernt von dem TPP-Rest, der das anfängliche Pyruvat-Molekül in dem Reaktionsmechanismus von AHAS bindet, was erklärt, warum die Substitution von Arabidopsis-AHAS-Arg199 (das Äquivalent zu Mais-Arg128) nach Alanin einen geringen Effekt auf die katalytische Aktivität des Enzyms hat. Das Strukturmodell zeigte weiter an, dass eine radikalere Veränderung an dieser Position gemacht werden kann, um das Level an Resistenz zu erhöhen bei Aufrechterhalten hoher Levels an katalytischer Aktivität. Auf dieser Basis wurde eine iterative Verbesserung der Mutation durchgeführt, um den positiv geladenen Arginin-Rest durch einen negativ geladenen Glutamat-Rest zu ersetzen. Das derart mutierte Enzym verfügte über verbesserte Levels an Resistenz gegenüber PURSUIT^® bei Aufrechterhalten hoher Levels an Aktivität (spezifische Aktivität von 114, äquivalent zu 114% der Wildtyp-Aktivität) (11).
Beispiel 7: Austauschbarkeit von AHAS erhalten von verschiedenen Spezies im auf Struktur basierendem rationalen Design von AHAS-Varianten die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoffs basierendes Herbizid
Ein Strukturmodell der dreidimensionalen Struktur von AHAS wird erstellt mit einer monocotylen AHAS-Sequenz wie die, die wie oben beschrieben, von Mais erhalten wurde. Um Mutationen in AHAS einzuführen, das von einer dicotylen Spezies wie Arabidopsis stammt, werden die Sequenzen von AHAS, die von den monocotylen und dicotylen Spezies stammen, aligned unter Verwendung der GAP- und PILEUP-Programme (Genetics Computer Group, 575 Sequence Drive, Madison, WI 53711). Äquivalente Positionen werden von dem computergenerierten Alignment bestimmt. Die Mutationen werden dann wie oben beschrieben in das dicotyle AHAS-Gen eingeführt. Im Anschluss an die Expression des mutanten AHAS-Proteins in E. coli und Untersuchung seiner biochemischen Eigenschaften (d. h., spezifische Aktivität und Resistenz gegen Herbizide) wird das mutante Gen in eine dicotyle Pflanze durch Pflanzentransformationsverfahren wie oben beschrieben eingeführt.
Beispiel 8: Herstellung von Pflanzen, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid durch Transformation mit rational designten AHAS-Genen
DNA-Konstrukte:
Rational designte variante AHAS-Gene, die in einem E. coli-Expressionsvektor enthalten sind, wurden als Quelle für DNA-Restriktionsfragmente verwendet, um das äquivalente Restriktionsfragment in einem Arabidopsis-AHAS-Gen zu ersetzen. Dieses Gen liegt in einem 5.5 kb genomischen DNA-Fragment vor, das ebenfalls den Arabidopsis-AHAS-Promotor, die Arabidopsis-AHAS-Terminationssequenz und 5'- und 3'-flankierende DNA enthält. Nachdem DNA-Sequenzieren durch die Mutationsstellen durchgeführt wurde, um die Anwesenheit der richtigen Mutation zu bestätigen, wurde das gesamte 5.5 kb-Fragment von jedem Plasmid in einen auf pBIN basierenden Pflanzentransformationsvektor (Mogen, Leiden, Niederlande) eingebaut. Der Pflanzentransformationsvektor enthielt ebenfalls das Neomycin-Phosphotransferase II (nptII)-Kanamycin-Resistenzgen, welches über den 355-cauliflower-Mosaikvirus-Promotor gesteuert wird. Das schließliche Vektorkonstrukt ist in 12 abgebildet. Vektoren, die Arabidopsis-AHAS-Gene mit den Mutationen Met124Ile, Met124His und Arg199Glu (entsprechend den Mutationen Met53Ile, Met53His und Arg128Glu in der Mais-AHAS-Sequenz wie in 1 gezeigt) enthielten, wurden pJK002, pJK003 bzw. pJK004 benannt.
Jeder dieser Vektoren wurde in Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 (R&D Life Technologies, Gaithersburg, MD) transformiert unter Verwendung des Transformationsverfahrens, beschrieben in An et al., Plant Mol. Biol. Manual A3: 1-19 (1988).
Pflanzentransformation:
Pflanzenscheibentransformation von Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38 wurde mit leichten Modifikationen durchgeführt, wie von Horsch et al. (Science, 227: 1229-1231, 1985) beschrieben. Blattscheiben wurden von Pflanzen geschnitten, die unter sterilen Bedingungen gewachsen sind und kopfüber in Murashige-Skoog-Medium (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) für 2-3 Tage bei 25°C in Dunkelheit co-kultiviert zusammen mit Agrobacterium tumefaciens-Stämmen, die die Plasmide pJK002, pJK003 oder pJK004 enthielten. Die Scheiben wurden trocken geblottet und in Regenerations-Murashige-Skoog-Medium mit B5- Vitaminen überführt, enthaltend 1 mg/l Benzyladenin und 0.1 mg/l 1-Naphthylessigsäure, 100 mg/l Kanamycin und 500 mg/l Cefotaxim (alles von Sigma bezogen).
Anfänglich wurden die Transformanten über Kanamycin-Resistenz selektiert, die durch das nptII-Gen verliehen wurde, das in dem Transformationsvektor vorhanden ist. Triebe, die von den Blattscheiben stammten, wurden abgeschnitten und auf frisches hormonfreies Murashige-Skoog-Medium gegeben, das Cefotaxim und Kanamycin enthielt.
In-vivo-Herbizidresistenz
Kanamycin-resistente Tabaktriebe wurden in Medium überführt, das 0.25 μM Imazethapyr enthielt. Bei dieser Konzentration des Imidazolinon-Herbizids waren nicht-transformierte Tabaktriebe (die das endogene Wildtyp-AHAS enthielten) nicht in der Lage, Wurzelbildung zu initiieren. Im Gegensatz dazu wurde Wurzelinitiierung und Wachstum bei denjenigen Tabaksprossen beobachtet, die mit einem der mutanten AHAS-Gene transformiert waren. Wurzeln, die von Trieben entwickelt wurden, die mit den mutanten Genen Met124Ile und Arg199Glu transformiert waren, zusammen mit Wildtyp sind in 1 dargestellt. Darüber hinaus waren Pflanzen, die mit den mutanten Genen Met124Ile oder Arg199Glu transformiert waren, resistent gegenüber Besprühung mit der zweifachen Feldrate (100 g/ha) von Imazethapyr (13). Die Muster von Wurzelwachstum in transformierten vs. nichttransformierten Pflanzen in Anwesenheit des Herbizids wie auch das Verhalten nach Herbizid-Besprühung legt nahe, dass die Expression der rational designten Herbizidresistenzgene Herbizidresistenz in vivo vermittelt.
Nachweis der rational designten Gene in Herbizid-resistentem Tabak
Genomische DNA wurde aus AHAS-transformierten Tabakpflanzen isoliert, und das Vorhandensein der varianten Arabidopsis-AHAS-Gene wurde über PCR-Analyse verifiziert. Unterschiede zwischen den Nukleotidsequenzen des Arabidopsis-AHAS-Gens und den zwei Tabak-AHAS-Genen wurde ausgenutzt, um PCR-Primer zu designen, die lediglich das Arabidopsis-Gen vor einem Hintergrund von genomischer Tabak-DNA amplifizieren. Die rational designten Herbizidresistenzgene wurden, wie durch die Amplifizierung eines DNA-Fragments der richtigen Größe gezeigt, in einer Mehrzahl der Herbizid-resistenten Pflanzen nachgewiesen. Aus nicht-transformierten Tabakpflanzen wurde kein PCR-Signal gesehen.
Segregation von transformierten AHAS-Genen:
Um Segretation von rational designten AHAS-Genen in transformierten Pflanzen zu überwachen, wurden Keimungstests durchgeführt. Samen wurden in hormonfreies Murashige-Skoog-Medium gegeben, das bis zu 2.5 μM PURSUIT^® und 100 μM Kanamycin enthielt. Die Keimlinge, die entstanden, wurden visuell nach Resistenz oder Anfälligkeit gegenüber dem Herbizid eingeteilt.
Da Tabakpflanzen diploid sind, würde erwartet werden, dass die Nachkommenschaft von selbstbefruchteten Pflanzen 3:1 resistent:anfällig aufspalten sollte, was die Existenz von 1 Keimling homozygot für das resistente AHAS-Gen, 2 Keimlingen heterozygot für das resistente AHAS-Gen, und 1 Keimling, dem ein resistentes AHAS-Gen fehlt, widerspiegelt.
Die Ergebnisse zeigen, dass die resistenten AHAS-Gene in dem erwarteten 3:1-Verhältnis aufspalten, was die Schlussfolgerung unterstützt, dass Herbizidresistenz durch eine einzige dominante Kopie eines rational designten AHAS-Gens verliehen wird.
Diese Ergebnisse zeigen, dass rationales Design von Herbizid-resistenten AHAS-Genen verwendet werden kann, um Pflanzen herzustellen, die ein Herbizid-resistentes Wachstum in vivo aufweisen.
Beispiel 9: Herstellung von Pflanzen, die kreuz-resistent sind gegenüber verschiedenen Herbiziden durch Transformation mit rational designten AHAS-Genen
Tabakpflanzen, die wie in Beispiel 8 oben beschrieben mit rational designten AHAS-Genen transformiert sind, wurden ebenfalls auf Kreuzresistenz gegenüber einem anderen Herbizid, CL 299,263 (auch als Imazamox bekannt), getestet. Keimungstests wurden mit aus den primären Tranformanten geernteten Samen durchgeführt, welche die varianten Arabidopsis-AHAS-Gene Met124Ile, Met124His und Arg199Glu enthielten, in Abwesenheit oder Anwesenheit von 2.5 μM CL 299,263 (15). Diese Konzentration des Herbizids verursacht schwere Verkrüppelung und Bleichung von Wildtyp-Tabakpflanzen. Tabakpflanzen, die mit dem AHAS-Gen Met124His transformiert waren, zeigten den höchsten Level an Resistenz (15). Arg199Glu-Transformanten zeigten ein mittelmäßes Level an Resistenz, wogegen Met124Ile schwache Resistenz zeigten (15).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden resistenten varianten AHAS-Proteins unter Verwendung von auf Struktur basierender Information, das Verfahren umfassend: (a) Alignen eines Ziel-AHAS-Proteins mit Pyruvatoxidase-Template, um die dreidimensionale Struktur des Ziel-AHAS-Proteins herzuleiten; (b) Modellieren eines oder mehrerer auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden/r Herbizids/e in die dreidimensionale Struktur, um eine Bindungstasche für auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizide in dem Ziel-AHAS-Protein zu lokalisieren; (c) Auswählen einer Aminosäureposition in dem Ziel-AHAS-Protein als einen Zielort für eine Mutation, wobei die Mutation die Affinität mindestens eines auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids für die Bindungstasche verändert; (d) Mutieren von DNA, die das Ziel-AHAS-Protein kodiert, um eine mutierte DNA herzustellen, die ein variantes AHAS kodiert, welches die Mutation an der Position enthält; und (e) Exprimieren der mutierten DNA in einer ersten Zelle unter Bedingungen, unter denen das variante AHAS hergestellt wird, das die Mutation an der Position enthält.
Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, weiter umfassend: (f) Paralleles Exprimieren von DNA, die Wildtyp-AHAS kodiert, in einer zweiten Zelle; (g) Reinigen der Wildtyp- und der varianten AHAS-Proteine von den Zellen; (h) Untersuchen der Wildtyp- und der varianten AHAS-Proteine auf katalytische Aktivität bei der Konvertierung von Pyruvat zu Acetolactat oder bei der Kondensation von Pyruvat und 2-Ketobutyrat, um Acetohydroxybutyrat zu bilden, in Abwesenheit und in Anwesenheit des auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids; und (i) Wiederholen der Schritte (c) – (h), wobei die DNA, die die Variante von Schritt (e) kodiert, als die AHAS-kodierende DNA in Schritt (c) verwendet wird, bis ein variantes AHAS-Protein, das resistent gegen ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid ist, identifiziert wird, welches aufweist: (i) in Abwesenheit des auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids, (a) eine katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; oder (b) katalytische Aktivität in Kombination mit irgendeinem varianten AHAS-Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, das ebenfalls in der Zelle exprimiert wird, welches das gleiche oder verschieden von dem ersten varianten AHAS-Protein sein kann, ausreichend, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; wobei die Zelle AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt; und (ii) katalytische Aktivität, die resistenter gegen ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid ist, als Wildtyp-AHAS.
Verfahren wie in Anspruch 2 definiert, wobei die katalytische Aktivität in Abwesenheit eines auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids mehr als 20% der katalytischen Aktivität des Wildtyp-AHAS in Abwesenheit eines auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids beträgt.
Verfahren wie in Anspruch 3 definiert, wobei das Herbizid ein Imidazolinon-Herbizid ist und das herbizidresistente variante AHAS-Protein aufweist: (i) katalytische Aktivität in Abwesenheit des Herbizids von mehr als 20% der katalytischen Aktivität des Wildtyp-AHAS; (ii) katalytische Aktivität, die, verglichen mit Wildtyp-AHAS, resistenter gegenüber der Anwesenheit von Imidazolinon-Herbiziden ist; und (iii) katalytische Aktivität, die, verglichen mit Imidazolinon-Herbiziden, sensitiver gegenüber der Anwesenheit von Sulfonylharnstoff-Herbiziden ist.
Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, wobei das Ziel-AHAS-Protein von Arabidopsis thaliana stammt.
Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, wobei die erste Zelle E. coli ist.
Verfahren wie in Anspruch 2 definiert, wobei die ersten und zweiten Zellen E. coli sind.
Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, wobei das Ziel-AHAS-Protein ein Protein umfasst, das die Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder die Aminosäuresequenz eines anderen Pflanzen-AHAS-Proteins aufweist.
Verfahren wie in Anspruch 1 definiert, wobei die Mutation eine Substitution von mindestens einem verschiedenartigen Aminosäurerest an einem Aminosäurerest der Sequenz von SEQ ID NO: 1 ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F135, M53, R128 und einem Aminosäurerest eines anderen Pflanzen-AHAS-Proteins an einer Aminosäure, aligned mit irgendeiner der Vorhergehenden, sowie irgendeine Kombination von irgendeiner der Vorhergehenden.
Verfahren wie in Anspruch 9 definiert, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg oder eine Kombination von irgendeiner der Vorhergehenden.
Verfahren zur Herstellung eines auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden resistenten varianten AHAS-Proteins unter Verwendung von auf Struktur basierender Information, das Verfahren umfassend: (a) Alignen eines Ziel-AHAS-Proteins mit einem ersten AHAS-Template, abgeleitet von einem Polypeptid, das die Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder die Aminosäuresequenz eines anderen Pflanzen-AHAS-Proteins aufweist, um die dreidimensionale Struktur des Ziel-AHAS-Proteins herzuleiten; (b) Modellieren eines oder mehrerer auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden/r Herbizids/e in die dreidimensionale Struktur, um eine Bindungstasche für auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierende Herbizide in dem Ziel-AHAS-Protein zu lokalisieren; (c) Auswählen mindestens einer Aminosäureposition in dem Ziel-AHAS-Protein als einen Zielort für eine Mutation, wobei die Mutation die Affinität mindestens eines auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids für die Bindungstasche verändert; (d) Mutieren von DNA, die das Ziel-AHAS-Protein kodiert, um eine mutierte DNA herzustellen, die ein variantes AHAS kodiert, das die Mutation an der Position enthält; und (e) Exprimieren der mutierten DNA in einer ersten Zelle unter Bedingungen, unter denen das variante AHAS hergestellt wird, welches die Mutation an der Position enthält.
Verfahren wie in Anspruch 11 definiert, weiter umfassend: (f) Paralleles Exprimieren von DNA, die Wildtyp-AHAS kodiert, in einer zweiten Zelle; (g) Reinigen der Wildtyp- und der varianten AHAS-Proteine von den Zellen; (h) Untersuchen der Wildtyp- und der varianten AHAS-Proteine auf katalytische Aktivität bei der Konvertierung von Pyruvat zu Acetolactat oder bei der Kondensation von Pyruvat und 2-Ketobutyrat, um Acetohydroxybutyrat zu bilden, in Abwesenheit und in Anwesenheit des auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids; und (i) Wiederholen der Schritte (c) – (h), wobei die DNA, die die Variante von Schritt (e) kodiert, als die AHAS-kodierende DNA in Schritt (c) verwendet wird, bis ein erstes herbizidresistentes variantes AHAS-Protein identifiziert wird, welches aufweist: (i) in Abwesenheit des auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids, (a) eine katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; oder (b) katalytische Aktivität in Kombination mit irgendeinem varianten AHAS-Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, das ebenfalls in der Zelle exprimiert wird, welches das gleiche oder verschieden von dem ersten varianten AHAS-Protein sein kann, ausreichend, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; wobei die Zelle AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt; und (ii) katalytische Aktivität, die resistenter gegen mindestens ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenes Herbizid ist, als Wildtyp-AHAS.
Verfahren zur Herstellung von einem varianten AHAS-Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid unter Verwendung von auf Struktur basierender Information, das Verfahren umfassend: (a) Alignen eines Ziel-AHAS-Proteins mit einem ersten AHAS-Template, das eine identifizierte Bindungstasche für ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid sowie die Sequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist, um die dreidimensionale Struktur des Ziel-AHAS-Proteins herzuleiten; (b) Auswählen mindestens einer Aminosäureposition in dem Ziel-AHAS-Protein als einen Zielort für eine Mutation, wobei die Mutation die Affinität eines auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids für die Bindungstasche verändert; (c) Mutieren von DNA, die das Ziel-AHAS-Protein kodiert, um eine mutierte DNA herzustellen, die ein variantes AHAS kodiert, das die Mutation an der Position enthält; und (d) Exprimieren der mutierten DNA in einer ersten Zelle unter Bedingungen, unter denen das variante AHAS hergestellt wird, welches die Mutation an der Position enthält.
Verfahren wie in Anspruch 13 definiert, weiterhin umfassend: (e) Paralleles Exprimieren von DNA, die Wildtyp-AHAS kodiert, in einer zweiten Zelle; (f) Reinigen der Wildtyp- und der varianten AHAS-Proteine von den Zellen; (g) Untersuchen der Wildtyp- und der varianten AHAS-Proteine auf katalytische Aktivität bei der Konvertierung von Pyruvat zu Acetolactat oder bei der Kondensation von Pyruvat und 2-Ketobutyrat, um Acetohydroxybutyrat zu bilden, in Abwesenheit und in Anwesenheit des auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids; und (h) Wiederholen der Schritte (b) – (g), wobei die DNA, die das AHAS von Schritt (d) kodiert, als die AHAS-kodierende DNA in Schritt (b) verwendet wird, bis ein erstes herbizidresistentes variantes AHAS-Protein identifiziert wird, welches aufweist: (i) in Abwesenheit des auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids, (a) eine katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; oder (b) katalytische Aktivität in Kombination mit irgendeinem varianten AHAS-Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, das ebenfalls in der Zelle exprimiert wird, welches das gleiche oder verschieden von dem ersten varianten AHAS-Protein sein kann, ausreichend um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; wobei die Zelle AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt; und (ii) katalytische Aktivität, die resistenter gegen mindestens ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid ist, als Wildtyp-AHAS.
Verfahren wie in Anspruch 12 oder 14 definiert, wobei die katalytische Aktivität in Abwesenheit des mindestens einen auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids mehr als 20% der katalytischen Aktivität des Wildtyp-AHAS beträgt.
Verfahren wie in Anspruch 15 definiert, wobei das Herbizid ein auf Imidazolinon basierendes Herbizid ist und ein erstes herbizidresistentes variantes AHAS-Protein aufweist: (i) katalytische Aktivität in Abwesenheit des Herbizids von mehr als 20% der katalytischen Aktivität des Wildtyp-AHAS; (ii) katalytische Aktivität, die, verglichen mit Wildtyp-AHAS, resistenter gegenüber der Anwesenheit von Imidazolinon-Herbiziden ist; und (iii) katalytische Aktivität, die, verglichen mit Herbiziden, die auf Imidazolinon basieren, sensitiver gegenüber der Anwesenheit von Herbiziden, die auf Sulfonylharnstoff basieren, ist.
Verfahren wie in Anspruch 16 definiert, wobei das Ziel-AHAS-Protein von Arabidopsis thaliana stammt.
Verfahren wie in Anspruch 11 oder 13 definiert, wobei die Zelle E. coli ist.
Verfahren wie in Anspruch 12 oder 14 definiert, wobei die ersten und zweiten Zellen E. coli sind.
Verfahren wie in Anspruch 11 oder 13 definiert, wobei die Mutation eine Substitution von mindestens einem verschiedenartigen Aminosäurerest an einem Aminosäurerest der Sequenz von SEQ ID NO: 1 ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F135, M53, R128 und einem Aminosäurerest eines anderen Pflanzen-AHAS-Proteins an einer Aminosäure, aligned mit irgendeiner der Vorhergehenden, sowie irgendeine Kombination von irgendeiner Vorhergehenden.
Verfahren wie in Anspruch 20 definiert, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg, einem Aminosäurerest eines anderen Pflanzen-AHAS-Proteins an einer Aminosäure, aligned mit irgendeiner der Vorhergehenden, oder einer Kombination von irgendeiner der Vorhergehenden.
Isolierte DNA, die ein variantes Acetohydroxysäuresynthase (AHAS)-Protein kodiert, das variante Protein umfassend ein AHAS-Protein, modifiziert durch Substitution von mindestens einem verschiedenartigen Aminosäurerest an einem Aminosäurerest der Sequenz von SEQ ID NO: 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus M53; R128, F135, und irgendeine Kombination von irgendeiner der Vorhergehenden.
DNA wie in Anspruch 22 definiert, wobei die Modifikation die Fähigkeit eines auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids, die enzymatische Aktivität des Proteins zu inhibieren, verändert.
DNA wie in Anspruch 23 definiert, wobei das AHAS-Protein von Arabidopsis thaliana stammt.
DNA wie in Anspruch 24 definiert, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg oder einer Kombination von irgendeiner der Vorhergehenden.
DNA wie in Anspruch 25 definiert, wobei das variante AHAS-Protein aufweist: (a) in Abwesenheit von mindestens einem auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden AHAS-inhibierenden Herbizid, (i) eine katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; oder (ii) katalytische Aktivität in Kombination mit irgendeinem zweiten varianten AHAS-Protein, das resistent ist gegen ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, das ebenfalls in der Zelle exprimiert wird, welches das gleiche oder verschieden von dem varianten AHAS-Protein sein kann, ausreichend, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; wobei die Zelle AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt; und (b) katalytische Aktivität, die resistenter gegen mindestens ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid ist, als Wildtyp-AHAS.
DNA wie in Anspruch 22 definiert, wobei das variante AHAS mehr als 20% der katalytischen Aktivität von Wildtyp-AHAS aufweist.
DNA wie in Anspruch 27 definiert, wobei das variante AHAS resistenter gegen Herbizide, die auf Imidazolinon basiseren als gegen Herbizide, die auf Sulfonylharnstoff basieren, ist.
DNA-Vektor, umfassend die DNA-Sequenz von Anspruch 22, welche operativ mit einem transkriptionsregulierenden Element verbunden ist.
Zelle, umfassend eine DNA-Sequenz, die AHAS kodiert, die von einem wie in Anspruch 29 definierten DNA-Vektor stammt, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien-, Pilz-, Pflanzen-, Insekten-, und Säugerzellen.
Zelle wie in Anspruch 30 definiert, umfassend eine Pflanzenzelle.
Samen, umfassend eine Zelle wie in Anspruch 31 definiert.
Variantes AHAS-Protein, umfassend ein Protein, das von einer wie in Anspruch 22 definierten DNA kodiert wird.
Variantes AHAS-Protein, umfassend ein AHAS-Protein, modifiziert durch Substitution von mindestens einem verschiedenartigem Aminosäurerest an einem Aminosäurerest der Sequenz von SEQ ID NO: 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus M53; R128, F135, einem Aminosäurerest eines anderen Pflanzen-AHAS-Proteins an einer Aminosäure, aligned mit irgendeiner der Vorhergehenden, sowie irgendeine Kombination von irgendeiner der Vorhergehenden.
Variantes AHAS-Protein wie in Anspruch 34 definiert, wobei die Modifikation die Fähigkeit eines auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids, die enzymatische Aktivität des Proteins zu inhibieren, verändert.
Variantes AHAS-Protein wie in Anspruch 35 definiert, wobei das AHAS-Protein von Arabidopsis thaliana stammt.
Variantes AHAS-Protein wie in Anspruch 33 definiert, wobei die Substitution ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg oder eine Kombination von irgendeiner der Vorhergehenden.
Variantes AHAS-Protein wie in Anspruch 33 definiert, wobei das variante AHAS Protein aufweist: (a) in Abwesenheit des mindestens einen AHAS-inhibierenden auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizids, (i) eine katalytische Aktivität, die alleine ausreicht, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; oder (ii) katalytische Aktivität in Kombination mit irgendeinem zweiten herbizidresistenten varianten AHAS-Protein, das ebenfalls in der Zelle exprimiert wird, welches das gleiche oder verschieden von dem varianten AHAS-Protein sein kann, ausreichend, um die Lebensfähigkeit einer Zelle, in der es exprimiert wird, aufrecht zu erhalten; wobei die Zelle AHAS-Aktivität zur Lebensfähigkeit benötigt; und (b) katalytische Aktivität, die resistenter gegen mindestens ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid ist, als Wildtyp-AHAS.
Variantes AHAS-Protein wie in Anspruch 33 definiert, wobei das variante AHAS mehr als 20% der katalytischen Aktivität des Wildtyp-AHAS aufweist.
Verfahren zum Verleihen von Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid an eine Zelle, das Verfahren umfassend: (a) Klonieren einer DNA wie in Anspruch 22 definiert, in einen kompatiblen Expressionsvektor; und (b) Transformieren der DNA in die Zelle unter Bedingungen, unter denen das Gen in ausreichender Menge exprimiert wird, um der Zelle Resistenz gegen ein auf Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid zu verleihen.
Zelle, präpariert nach dem Verfahren von Anspruch 40.
Pflanze, umfassend eine Zelle wie in Anspruch 41 definiert.
Verfahren wie in Anspruch 40 definiert, wobei das mutierte Gen an mindestens einer der Positionen 53, 128, 135 oder Kombinationen davon eine andere Aminosäure kodiert.
Verfahren wie in Anspruch 43 definiert, wobei das AHAS-Gen das Arabidopsis thaliana AHAS-Gen umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 43 definiert, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren wie in Anspruch 45 definiert, wobei die Zelle in einem Samen ist.
Verfahren zum Kontrollieren von Unkraut in einer Nutzpflanze, das Verfahren umfassend Kultivieren einer Nutzpflanze einschließlich wie in Anspruch 42 definierter Pflanzen, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid, und Behandeln der Nutzpflanze mit dem auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid.
Verfahren zum Kontrollieren von Unkraut in einer Nutzpflanze, das Verfahren umfassend Kultivieren einer Nutzpflanze umfassend wie in Anspruch 42 definierte Pflanzen, die resistent sind gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid und Behandeln der Nutzpflanze mit der auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierenden Herbizid-Zusammensetzung, welche dieses Herbizid enthält.
Zelle, transformiert mit einer DNA wie in Anspruch 22 definiert, wobei die DNA in der Zelle derart exprimiert wird, dass sie der Zelle Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid verleiht.
Pflanze transfomiert mit einer DNA wie in Anspruch 23 definiert, wobei die DNA in der Pflanze derart exprimiert wird, dass sie der Pflanze Resistenz gegen ein auf Imidazolinon und/oder Sulfonylharnstoff basierendes Herbizid verleiht.