ES2581478T3 - Plantas de girasol resistentes a herbicidas, polinucleótidos que codifican para proteínas de la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa resistentes a herbicidas y procedimientos de uso - Google Patents

Plantas de girasol resistentes a herbicidas, polinucleótidos que codifican para proteínas de la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa resistentes a herbicidas y procedimientos de uso Download PDF

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Abstract

Polinucleótido de subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa de girasol (AHASL), en el que dicho polinucleótido AHASL codifica para una proteína AHASL1 tolerante a herbicidas de imidazolinona que comprende una sustitución de alanina a treonina en la posición de aminoácido 7 de SEQ ID NO:2 o, de manera equivalente, en la posición 107 de SEQ ID NO:12; en el que dicha proteína AHASL1 comprende un polipéptido que es idéntico en al menos el 95% a SEQ ID NO:12; y en el que dicha proteína AHASL1 confiere a una planta un aumento de la tolerancia a un herbicida de imidazolinona en comparación con una variedad de tipo natural de dicha planta.

Description

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SEQ ID NO: 1 expone la secuencia de nucleótidos de longitud parcial que codifica para una proteína AHASL1 resistente a herbicidas de la línea de girasol S4897.
SEQ ID NO: 2 expone la secuencia de aminoácidos de longitud parcial de la proteína AHASL1 resistente a herbicidas codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3 expone la secuencia de nucleótidos de longitud parcial que codifica para la proteína AHASL1 de tipo natural de la línea de girasol BTK47.
SEQ ID NO: 4 expone la secuencia de aminoácidos de longitud parcial de la proteína AHASL1 de tipo natural codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos de número de registro de GenBank U16280.
SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos del número de registro de GenBank U16280.
SEQ ID NO: 7 expone la secuencia de nucleótidos del cebador HA1U409 descrito en el ejemplo 2.
SEQ ID NO: 8 expone la secuencia de nucleótidos del cebador HA1L1379 descrito en el ejemplo 2.
SEQ ID NO: 9 expone la secuencia de nucleótidos del cebador HA1U1313 descrito en el ejemplo 2.
SEQ ID NO: 10 expone la secuencia de nucleótidos del cebador HA1L2131 descrito en el ejemplo 2.
SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótidos del número de registro de GenBank AY541451.
SEQ ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos del número de registro de GenBank AY541451.
SEQ ID NO: 13 es la secuencia de nucleótidos del número de registro de GenBank AY124092.
SEQ ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos del número de registro de GenBank AY124092.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se refiere a plantas de girasol que presentan un aumento de la resistencia a herbicidas en comparación con una planta de girasol de tipo natural. Las plantas de girasol resistentes a herbicidas se produjeron según se describe más adelante en el presente documento exponiendo las plantas de girasol de tipo natural (con respecto a la resistencia a herbicidas) a un mutágeno, dejando madurar y reproducirse las plantas y seleccionando las plantas de la progenie que mostraban un aumento de la resistencia a un herbicida de imidazolinona, en relación con la resistencia de una planta de girasol de tipo natural. La divulgación describe las líneas de girasol resistentes a herbicidas que en el presente documento se denominan S4897, GM40 y GM1606.
A partir de las plantas de girasol resistentes a herbicidas S4897 y de las plantas de girasol de tipo natural BTK47 se aisló la región codificante de un gen de la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa (denominado AHASL1) mediante amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante la comparación de las secuencias de polinucleótido de las plantas de girasol resistentes a herbicidas y de tipo natural se descubrió que la región codificante de la secuencia de polinucleótido de AHASL1 de la planta de girasol resistente a herbicidas difería de la secuencia de polinucleótido de AHASL1 de la planta de tipo natural en un solo nucleótido, una transición de G a A en el nucleótido 21 (SEQ ID NO: 1). Esta transición de G a A en la secuencia de polinucleótido de AHASL1 da como resultado una sustitución de alanina por treonina en el aminoácido 7 (SEQ ID NO: 2) en una región conservada de la secuencia de aminoácidos predicha para la proteína AHASL1 de girasol resistente a herbicidas (SEQ ID NO: 2), en relación con la posición de aminoácido equivalente de la proteína AHASL1 de tipo natural de la línea de girasol BTK47 (es decir, el aminoácido 7 de SEQ ID NO: 4).
Dado que la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 no corresponde a la región codificante de longitud completa de una proteína AHASL, la secuencia de aminoácidos codificada por esta que se expone en SEQ ID NO: 2 tampoco es de longitud completa. Para facilitar la comparación con otras secuencias de aminoácidos de AHASL de girasol, las posiciones de aminoácido de las proteínas AHASL de girasol a las que se hace referencia en el presente documento corresponden a las posiciones de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína AHASL1 de girasol codificada por la secuencia con el número de registro de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 12), a menos que se indique lo contrario o resulte evidente del contexto en que aparecen dichas posiciones. Por consiguiente, la sustitución de alanina por treonina en la posición de aminoácido 7 de SEQ ID NO: 2 corresponde a la posición de aminoácido 107 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
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(preferiblemente secuencias codificantes de proteínas) que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias situadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, la molécula de polinucleótido aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente a la molécula de polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico. Una proteína que no contiene sustancialmente material celular incluye preparaciones de proteína con menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10%, el 5% o el 1% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la divulgación o una porción biológicamente activa de la misma se produce de manera recombinante, preferiblemente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10%, el 5% o el 1% (en peso seco) de precursores químicos o de compuestos químicos distintos de la proteína de interés.
La presente divulgación describe polipéptidos aislados que comprenden proteínas AHASL. Los polipéptidos aislados comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 2 y 4, las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 1 y 3 y fragmentos y variantes funcionales de dichas secuencias de aminoácidos que codifican para un polipéptido AHASL que comprende actividad AHAS. Con “fragmentos y variantes funcionales” se pretende indicar fragmentos y variantes de los polipéptidos de ejemplo que comprenden actividad AHAS.
Los procedimientos divulgados en el presente documento pueden implicar el uso de plantas tolerantes a herbicidas o resistentes a herbicidas. Con una planta “tolerante a herbicidas” o “resistente a herbicidas” se pretende indicar una planta que es tolerante o resistente a al menos un herbicida a una concentración que normalmente destruiría o inhibiría el crecimiento de una planta normal o de tipo natural.
Las plantas tolerantes a herbicidas de la divulgación pueden comprender una proteína AHASL tolerante a herbicidas
o resistente a herbicidas. Con “proteína AHASL tolerante a herbicidas” o “proteína AHASL resistente a herbicidas” se pretende indicar que una proteína AHASL de este tipo muestra mayor actividad AHAS respecto a la actividad AHAS de una proteína AHASL de tipo natural, en presencia de al menos un herbicida del que se sabe que interfiere con la actividad AHAS a una concentración o nivel del herbicida que se sabe que inhibe la actividad AHAS de la proteína AHASL de tipo natural. Además, la actividad AHAS de una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas de este tipo puede denominarse en el presente documento como actividad AHAS “tolerante a herbicidas”
o “resistente a herbicidas”.
En el presente documento, los términos “tolerante a herbicidas” y “resistente a herbicidas” se usan de manera intercambiable y se pretende que tengan un significado equivalente y un alcance equivalente. De manera similar, los términos “tolerancia a herbicidas” y “resistencia a herbicidas” se usan de manera intercambiable y se pretende que tengan un significado equivalente y un alcance equivalente. Igualmente, los términos “resistente a imidazolinonas” y “resistencia a imidazolinonas” se usan de manera intercambiable y se pretende que tengan un significado equivalente y un alcance equivalente a los términos “tolerante a imidazolinonas” y “tolerancia a imidazolinonas”, respectivamente.
La divulgación abarca polinucleótidos AHASL resistentes a herbicidas y proteínas AHASL resistentes a herbicidas. Con “polinucleótido AHASL resistente a herbicidas” se pretende indicar un polinucleótido que codifica para una proteína que comprende actividad AHAS resistente a herbicidas. Con “proteína AHASL resistente a herbicidas” se pretende indicar una proteína o polipéptido que comprende actividad AHAS resistente a herbicidas.
Además, se reconoce que una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas puede introducirse en una planta mediante la transformación de una planta o de un antecesor de la misma con una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas. Tales proteínas AHASL tolerantes a herbicidas o resistentes a herbicidas están codificadas por los polinucleótidos AHASL tolerantes a herbicidas o resistentes a herbicidas. Alternativamente, una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas puede producirse en una planta como resultado de una mutación que se produce de manera natural o inducida en un gen AHASL endógeno en el genoma de una planta o de un progenitor de la misma.
La presente divulgación describe plantas, tejidos vegetales, células vegetales y células huésped que presentan un aumento de la resistencia o la tolerancia a al menos un herbicida, en particular a un herbicida de imidazolinona o de sulfonilurea. La cantidad o concentración del herbicida puede ser una “cantidad eficaz” o una “concentración eficaz”. Con “cantidad eficaz” y “concentración eficaz” se pretende indicar una cantidad y concentración, respectivamente, que es suficiente para destruir o inhibir el crecimiento de una planta, tejido vegetal, célula vegetal o célula huésped de tipo natural similar, pero esta cantidad no destruye o inhibe tan intensamente el crecimiento de las plantas, tejidos vegetales, células vegetales y células huésped resistentes a herbicidas de la presente divulgación. Normalmente, la cantidad eficaz de un herbicida es una cantidad que se usa rutinariamente en los sistemas de producción agrícola para destruir las malas hierbas de interés. Una cantidad de este tipo la conocen los expertos en la técnica.
Con “planta, tejido vegetal, célula vegetal o célula huésped de tipo natural similar” se pretende indicar una planta, tejido vegetal, célula vegetal o célula huésped, respectivamente, que carece de las características de resistencia a herbicidas y/o de un polinucleótido particular de la divulgación divulgado en el presente documento. Por lo tanto, el
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uso del término “de tipo natural” no pretende implicar que una planta, tejido vegetal, célula vegetal u otra célula huésped carece de ADN recombinante en su genoma y/o no tiene características de resistencia a herbicidas diferentes de las divulgadas en el presente documento.
Según se usa en el presente documento, a menos que claramente se indique lo contrario, el término “planta” pretende indicar una planta en cualquiera en cualquier estado de desarrollo, así como cualquier parte o partes de una planta que pueden estar unidas a la planta entera intacta o separadas de la misma. Tales partes de una planta incluyen, pero no se limitan a los órganos, tejidos y células de una planta. Algunos ejemplos de partes particulares de una planta incluyen un tallo, una hoja, una raíz, una inflorescencia, una flor, un flósculo, un fruto, un pedículo, un pedúnculo, un estambre, una antera, un estigma, un estilo, un ovario, un pétalo, un sépalo, un carpelo, un extremo de raíz, una cofia de raíz, un pelo radical, un pelo foliar, un pelo seminal, un grano de polen, una microspora, un cotiledón, un hipocótilo, un epicótilo, xilema, floema, parénquima, endospermo, una célula acompañante, una célula oclusiva y cualquier otro órgano, tejido y célula conocidos de una planta. Además se reconoce que una semilla es una planta.
Las plantas de la presente divulgación incluyen tanto plantas no transgénicas como transgénicas. Con “plantas no transgénicas” se pretende indicar una planta que carece de ADN recombinante en su genoma. Con “planta transgénica” se pretende indicar una planta que comprende ADN recombinante en su genoma. Una planta transgénica de este tipo puede producirse mediante la introducción de ADN recombinante en el genoma de la planta. Cuando dicho ADN recombinante se incorpora en el genoma de la planta transgénica, la progenie de la planta puede comprender también el ADN recombinante. Una planta de la progenie que comprende al menos una porción del ADN recombinante de al menos una planta transgénica progenitora también es una planta transgénica.
La presente divulgación describe la línea de girasol resistente a herbicidas que en el presente documento se denomina S4897 y la progenie y derivados de la misma que comprenden las características de resistencia a herbicidas de S4897. El 17 de mayo de 2005 se hizo un depósito de semillas de la línea de girasol GM40, que deriva de la línea S4897 de girasol y comprende las características de resistencia de S4897, en el Depósito de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Mansassas, VA 20110, EE.UU., al que le asignó el número de depósito de patente ATCC PTA-6716. El depósito de la línea GM40 de girasol se hizo por un plazo de al menos 30 años y de al menos cinco años tras la petición más reciente recibida por el ATCC para el suministro de una muestra del depósito. Adicionalmente, los solicitantes han cumplido con todos los requerimientos del Título 37 del C.F.R., 1.801-1.809, incluida la provisión de una indicación de la viabilidad de la muestra.
La presente divulgación proporciona además la línea de girasol resistente a herbicidas que en el presente documento se denomina GM1606. El 19 de mayo de 2006 se hizo un depósito de semillas de la línea de girasol GM1606 en el Depósito de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Mansassas, VA 20110, EE.UU., al que le asignó el número de depósito de patente ATCC PTA-7606. El depósito de la línea GM1606 de girasol se hizo por un plazo de al menos 30 años y de al menos cinco años tras la petición más reciente recibida por el ATCC para el suministro de una muestra del depósito. Adicionalmente, los solicitantes han cumplido con todos los requerimientos del Título 37 del C.F.R., 1.801-1.809, incluida la provisión de una indicación de la viabilidad de la muestra.
La presente divulgación describe plantas de girasol resistentes a herbicidas producidas mediante mejora por mutación. Las plantas de girasol de tipo natural se mutagenizaron mediante la exposición de las plantas a un mutágeno, en particular un mutágeno químico, más en particular metanosulfonato de etilo (EMS). Sin embargo, la presente divulgación no se limita a las plantas de girasol resistentes a herbicidas producidas mediante un procedimiento de mutagénesis que implica el mutágeno químico EMS. Cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica puede usarse para producir las plantas de girasol resistentes a herbicidas divulgadas en el presente documento. Tales procedimientos de mutagénesis pueden implicar, por ejemplo, el uso de uno o más de los mutágenos siguientes: radiación, tal como rayos X, rayos gamma (por ejemplo, cobalto 60 o cesio 137), neutrones (por ejemplo, producto de la fisión nuclear de uranio 235 en un reactor atómico), radiación beta (por ejemplo, emitida por radioisótopos tales como fósforo 32 o carbono 14) y radiación ultravioleta (preferiblemente de
2.500 a 2.900 nm) y mutágenos químicos tales como análogos de bases (por ejemplo, 5-bromouracilo), compuestos relacionados (por ejemplo, 8-etoxicafeína), antibióticos (por ejemplo, estreptonigrina), agentes alquilantes (por ejemplo, mostazas de azufre, mostazas de nitrógeno, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso o acridinas. Las plantas resistentes a herbicidas también pueden producirse mediante procedimientos de cultivo tisular para seleccionar células vegetales que comprenden mutaciones de resistencia a herbicidas y después regenerar plantas resistentes a herbicidas a partir de las mismas. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.773.702 y 5.859.348.
Pueden encontrarse detalles adicionales sobre la mejora por mutación en “Principles of Cultivar Development” Fehr, 1993, Macmillan Publishing Company.
El análisis del gen AHASL1 de las plantas de girasol de las líneas S4897 y GM1606 reveló la mutación que da como resultado la sustitución por una treonina de la alanina que se encuentra en la posición de aminoácido 7 en la secuencia de aminoácidos de AHASL1 de tipo natural de SEQ ID NO: 4. La posición de aminoácido 7 en SEQ ID
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secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado según Karlin y Altschul (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden llevarse a cabo con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de polinucleótido de la divulgación. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden llevarse a cabo con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de la divulgación. Para obtener alineamientos con huecos con fines de comparación puede utilizarse el programa Gapped BLAST según se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterativa que detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul et al. (1997) citado anteriormente. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Un algoritmo de este tipo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de programas de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos puede usarse una tabla de peso de residuos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. El alineamiento también puede hacerse manualmente mediante inspección.
A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en el presente documento se refieren al valor obtenido con el uso de las secuencias de longitud completa de la divulgación y el uso de un alineamiento múltiple por medio del algoritmo Clustal W (Nucleic Acids Research, 22(22):4673-4680, 1994) usando el programa AlignX incluido en el paquete de software Vector NTI Suite, versión 7 (InforMax, Inc., Bethesda, MD, EE. UU.) con los parámetros por defecto o cualquier programa equivalente de este. Con “programa equivalente” se pretende indicar cualquier programa de comparación de secuencias que genere, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, un alineamiento con idénticas coincidencias de nucleótidos o residuos de aminoácido y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia en comparación con el alineamiento correspondiente generado por AlignX en el paquete de software Vector NTI Suite, versión 7.
Las secuencias de nucleótidos de AHASL de la divulgación incluyen tanto las secuencias que se producen de manera natural como las formas mutantes, en particular formas mutantes que codifican para proteínas AHASL que comprenden actividad AHAS resistente a herbicidas. De manera similar, las proteínas de la divulgación abarcan tanto proteínas que se producen de manera natural como variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes seguirán teniendo la actividad AHAS deseada. Obviamente, las mutaciones que se hagan en el ADN que codifica para la variante no deben poner a la secuencia fuera del marco de lectura y preferiblemente no crearán regiones complementarias que podrían producir estructuras secundarias de ARNm. Por ejemplo, véase la publicación de solicitud de patente EP n.o 75.444.
No se espera que las deleciones, inserciones y sustituciones de las secuencias de proteína abarcadas por esta divulgación produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando sea difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción antes de llevarla a cabo, el experto en la técnica apreciará que el efecto se evaluará mediante ensayos rutinarios. Es decir, la actividad puede evaluarse mediante ensayos de la actividad AHAS. Por ejemplo, véase Singh et al (1988) Anal. Biochem. 171:173-179.
Las secuencias de nucleótidos y proteínas variantes también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y de recombinación como el intercambio de ADN. Con un procedimiento de este tipo es posible manipular una o más secuencias codificantes de AHASL diferentes para crear una nueva proteína AHASL con las propiedades deseadas. De esta manera se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones en la secuencia con una sustancial identidad de secuencia y que pueden experimentar una recombinación homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, mediante el uso de este enfoque pueden intercambiarse motivos de secuencia que codifican para un dominio de interés entre el gen AHASL de la divulgación y otros genes AHASL conocidos para obtener un nuevo gen que codifica para una proteína con una propiedad de interés mejorada, como un aumento de Km, en el caso de una enzima. Las estrategias para tal intercambio de ADN se conocen en la técnica. Por ejemplo, véanse Stemmer (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4505-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291, y las patentes estadounidenses n.os 5.605.793 y 5.837.458.
Las secuencias de nucleótidos de la divulgación pueden usarse para aislar secuencias correspondientes en otros organismos, en particular en otras plantas, más en particular en otras dicotiledóneas. De esta manera, es posible usar procedimientos tales como PCR, hibridación y similares para identificar tales secuencias sobre la base de su homología de secuencia con las secuencias expuestas en el presente documento. La presente divulgación abarca las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con las secuencias de polinucleótido AHASL expuestas en el presente documento en su totalidad o con fragmentos de las mismas. Por lo tanto, la presente divulgación abarca las secuencias de polinucleótido aisladas que codifican para una proteína AHASL y que hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia divulgada en el presente documento o con fragmentos de la misma.
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una secuencia de direccionamiento al cloroplasto que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido de tránsito al cloroplasto para dirigir el producto génico de interés a los cloroplastos. Tales péptidos de tránsito se conocen en la técnica. Con respecto a las secuencias de direccionamiento al cloroplasto, “operativamente unida” significa que la secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido de tránsito (es decir, la secuencia de direccionamiento al cloroplasto) está unida al polinucleótido AHASL de la divulgación de tal manera que las dos secuencias son contiguas y están en el mismo marco de lectura. Véanse, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Plysiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Aunque las proteínas AHASL de la divulgación incluyen un péptido nativo de tránsito al cloroplasto, puede fusionarse cualquier péptido de tránsito al cloroplasto conocido en la técnica con la secuencia de aminoácidos de una proteína AHASL madura de la divulgación uniendo operativamente una secuencia de direccionamiento al cloroplasto en el extremo 5’ de una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína AHASL madura de la divulgación.
Se conocen en la técnica secuencias de direccionamiento al cloroplasto e incluyen la subunidad pequeña de cloroplasto de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5-(enolpiruvil)shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); triptófano sintasa (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); corismato sintasa (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); y proteína de unión a clorofila a/b captadora de luz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Véanse también Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
Se conocen en la técnica procedimientos para la transformación de cloroplastos. Véanse, por ejemplo, Svab et. al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El procedimiento se basa en el suministro con pistola génica de ADN que contiene un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN al genoma plastídico a través de recombinación homóloga. Adicionalmente, puede lograrse la transformación plastídica mediante transactivación de un transgén portado por plastidios silencioso mediante expresión preferida de tejido de una ARN polimerasa codificada de manera nuclear y dirigida a plastidios. Se ha notificado un sistema de este tipo en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.
Los ácidos nucleicos de interés que van a dirigirse al cloroplasto pueden optimizarse para la expresión en el cloroplasto para tener en cuenta diferencia en el uso de codones entre el núcleo vegetal y este orgánulo. De este modo, los ácidos nucleicos de interés pueden sinterizarse usando codones preferidos de cloroplasto. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.380.831.
Según se divulga en el presente documento, las secuencias de nucleótidos de AHASL de la divulgación encuentran uso para mejorar la tolerancia a herbicidas de plantas que comprenden en sus genomas un gen que codifica para una proteína AHASL tolerante a herbicidas. Un gen de este tipo puede ser un gen endógeno. Adicionalmente, las secuencias de nucleótidos de la presente divulgación pueden mezclarse con cualquier combinación de secuencias de polinucleótido de interés con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente divulgación pueden mezclarse con otros polinucleótidos cualesquiera que codifican para polipéptidos con actividad pesticida y/o insecticida tales como, por ejemplo, las proteínas de la toxina de Bacillus thuringiensis (descrita en las patentes estadounidenses n.os 5.366.892, 5.747.450, 5.737.514, 5.723.756, 5.593.881 y en Geiser et al. (1986) Gene 48:109). Las combinaciones generadas pueden incluir también múltiples copias de uno cualquiera de los polinucleótidos de interés.
Se reconoce que con estas secuencias de nucleótidos, pueden construirse construcciones antisentido, complementarias a al menos una porción del ARN mensajero (ARNm) para las secuencias de polinucleótido AHASL. Se construyen nucleótidos antisentido para hibridar con el ARNm correspondiente. Pueden realizarse modificaciones de las secuencias antisentido siempre que las secuencias hibriden con e interfieran con la expresión del ARNm correspondiente. De este modo, pueden usarse construcciones antisentido con una identidad de secuencia del 70%, preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 85% con las secuencias antisentido correspondientes. Además, pueden usarse porciones de los nucleótidos antisentido para perturbar la expresión del gen diana. Generalmente, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, o más.
Las secuencias de nucleótidos de la presente divulgación también pueden usarse en la orientación sentido para suprimir la expresión de genes endógenos en plantas. Se conocen en la técnica procedimientos para suprimir la expresión génica en plantas usando secuencias de nucleótidos en la orientación sentido. Los procedimientos implican generalmente transformar plantas con un constructo de ADN que comprende un promotor que dirige la expresión en una planta operativamente unido a al menos una porción de una secuencia de nucleótidos que corresponde al transcrito del gen endógeno. Normalmente, una secuencia de nucleótidos de este tipo tiene una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcrito del gen endógeno, por ejemplo una identidad de
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secuencia mayor de aproximadamente el 65%, una identidad de secuencia mayor de aproximadamente el 85%, o una identidad de secuencia mayor de aproximadamente el 95%. Véanse, las patentes estadounidenses n.os
5.283.184 y 5.034.323.
Aunque los polinucleótidos AHASL1 resistentes a herbicidas de la divulgación encuentran uso como genes marcadores seleccionables para la transformación de plantas, los casetes de expresión de la divulgación pueden incluir otro gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Se utilizan genes marcadores seleccionables, incluyendo los de la presente divulgación, para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican para resistencia a antibióticos, tales como aquellos que codifican para neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinil, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Véanse generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:6372;Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) en The Operon, págs. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschla et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) tesis doctoral, Universidad de Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) tesis doctoral, Universidad de Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al (1988) Nature 334:721-724.
La lista anterior de genes marcadores seleccionables no pretende ser limitativa. Puede usarse cualquier gen marcador seleccionable.
Las moléculas de polinucleótidos aisladas que comprenden secuencia de nucleótidos que codifican para las proteínas AHASL de la divulgación pueden usarse en vectores para transformar plantas de modo que las plantas creadas presenten un aumento de la resistencia a herbicidas, particularmente herbicidas de imidazolinona. Las moléculas de polinucleótido AHASL aisladas de la divulgación pueden usarse en vectores solas o en combinación con una secuencia de nucleótidos que codifica para la subunidad pequeña de la enzima AHAS (AHASS) confiriendo resistencia a herbicidas en plantas. Véase, la patente estadounidense n.º 6.348.643.
La divulgación también se refiere a un vector de expresión de plantas que comprende un promotor que dirige la expresión en una planta operativamente unido a una molécula de polinucleótido aislada de la divulgación. La molécula de polinucleótido aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína AHASL, particularmente una proteína AHASL que comprende una secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 2 ó 4, o un fragmento funcional y variante de la misma. El vector de expresión de plantas de la divulgación no depende de un promotor particular, sólo de que tal promotor pueda dirigir la expresión génica en una célula vegetal. Los promotores preferidos incluyen promotores constitutivos y promotores preferidos de tejido.
Los vectores de transformación de la divulgación pueden usarse para producir plantas transformadas con un gen de interés. El vector de transformación comprenderá un gen marcador seleccionable de la divulgación y un gen de interés que va a introducirse y expresarse normalmente en la planta transformada. Un gen marcador seleccionable de este tipo comprende un polinucleótido AHASL resistente a herbicidas de la divulgación operativamente unido a un promotor que dirige la expresión en una célula huésped. Para su uso en plantas y células vegetales, el vector de transformación comprende un gen marcador seleccionable que comprende un polinucleótido AHASL resistente a herbicidas de la divulgación operativamente unido a un promotor que dirige la expresión en una célula vegetal.
Los genes de interés de la divulgación varían dependiendo del resultado deseado. Por ejemplo, diversos cambios en el fenotipo pueden ser de interés incluyendo la modificación de la composición de ácidos grasos en una planta, la alteración del contenido de aminoácidos de una planta, la alteración de los mecanismos de defensa frente a insectos y/o patógenos de una planta, y similares. Pueden lograrse estos resultados proporcionando la expresión de productos heterólogos o el aumento de la expresión de productos heterólogos en planta. Alternativamente, pueden lograrse los resultados proporcionando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios dan como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada.
Los genes de interés pueden incluir genes de resistencia a insectos tales como, por ejemplo, genes de proteínas de toxina de Bacillus thuringiensis (patentes estadounidenses n.os 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109).
Las proteínas o polipéptidos AHASL de la divulgación pueden purificarse a partir de, por ejemplo, plantas de girasol y pueden usarse en composiciones. Además, puede usarse una molécula de polinucleótido aislada que codifica para
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una proteína AHAS de la divulgación para expresar una proteína AHASL de la divulgación en un microbio tal como
E. coli o una levadura. La proteína AHASL expresada puede purificarse a partir de extractos de E. coli o levadura mediante cualquier procedimiento conocido por los expertos habituales en la técnica.
La divulgación también se refiere a un procedimiento para crear una planta transgénica que es resistente a herbicidas, que comprende transformar una planta con un vector de expresión de plantas que comprende un promotor que dirige la expresión en una planta operativamente unido a una molécula de polinucleótido aislada de la divulgación. La molécula de polinucleótido aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína AHASL de la divulgación, particularmente una proteína AHASL que comprende: una secuencia de aminoácidos que se expone en SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1, o un fragmento funcional y variante de dichas secuencias de aminoácidos.
La divulgación se refiere a las plantas no transgénicas de girasol, a plantas transgénicas producidas mediante los métodos de la divulgación y a la progenie y otros descendientes de tales plantas no transgénicas y plantas transgénicas que muestran una mejora o un aumento de la resistencia a herbicidas que interfieren con la enzima AHAS, en particular herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea.
Los polinucleótidos AHASL de la divulgación, en particular aquellos que codifican para proteínas AHASL resistentes a herbicidas, encuentran uso en procedimientos para mejorar la resistencia de plantas tolerantes a herbicidas. Las plantas tolerantes a herbicidas comprenden una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas. Las plantas tolerantes a herbicidas incluyen tanto plantas transformadas con secuencias de nucleótidos AHASL tolerantes a herbicidas como plantas que comprenden un gen endógeno en su genoma que codifica para una proteína AHASL tolerante a herbicidas. Las secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas AHASL tolerantes a herbicidas y las plantas tolerantes a herbicidas que comprenden un gen endógeno que codifica para una proteína AHASL tolerante a herbicidas incluyen los polinucleótidos y las plantas de la presente divulgación y aquellos que se conocen en la técnica. Por ejemplo, véanse las patentes estadounidenses n.os 5.013.659, 5.731.180, 5.767.361, 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 y 6.274.796.
Tales procedimientos para mejorar la resistencia de plantas tolerantes a herbicidas comprenden transformar una planta tolerante a herbicidas con al menos una construcción de polinucleótido que comprende un promotor que dirige la expresión en una célula vegetal que está operativamente unido a un polinucleótido AHASL resistente a herbicidas de la divulgación, particularmente el polinucleótido que codifica para una proteína AHASL resistente a herbicidas expuesta en SEQ ID NO: 1, polinucleótidos que codifican para la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, y fragmentos y variantes de dichos polinucleótidos que codifican para polipéptidos que comprenden actividad AHAS resistente a herbicidas.
Se dispone de numerosos vectores de transformación de plantas y procedimientos para la transformación de plantas. Por ejemplo, véanse An, G. et al. (1986) Plant Pysiol. 81:301-305; Fry, J. et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321325; Block, M. (1988) Theor. Appl. Genet. 76:767-774; Hinchee et al. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212:203-212; Cousins et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P. P. y Slightom, J. L. (1992) Gene 118:255-260; Christou et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir et al. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 29P:119-124; Davies et al. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. y Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148; Franklin, C. I. y Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167; Golovkin et al. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asano et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. y Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker et al. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5:17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman et al. (1994) Bio-Technology 12:919923; Ritala et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325, y Wan, Y. C. y Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748.
Los procedimientos de la divulgación implican la introducción de un constructo de polinucleótido en una planta. Con “introducción” se pretende indicar la presentación a la planta del constructo de polinucleótido de tal manera que el constructo adquiere acceso al interior de una célula de la planta. Los procedimientos de la divulgación no dependen de un procedimiento particular para la introducción de un constructo de polinucleótido en una planta, solamente de que el constructo de polinucleótido adquiera acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los procedimientos para la introducción de constructos de polinucleótido en plantas se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a procedimientos de transformación estable, procedimientos de transformación transitoria y procedimientos mediados por virus.
Con “transformación estable” se pretende indicar que el constructo de polinucleótido introducido en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de heredarse por la progenie de la misma. Con “transformación transitoria” se pretende indicar que un constructo de polinucleótido introducido en una planta no se integra en el genoma de la planta.
Para la transformación de plantas y de células vegetales, las secuencias de nucleótidos de la divulgación se insertan mediante técnicas convencionales en cualquier vector conocido en la técnica adecuado para la expresión de las
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secuencias de nucleótidos en una planta o en una célula vegetal. La selección del vector depende de la técnica de transformación preferida y de la especia de planta diana que ha de transformarse. Una secuencia de nucleótidos de AHASL1 puede estar unida operativamente a un promotor de plantas que se conoce por la expresión de alto nivel en una célula vegetal y este constructo se introduce entonces en una planta que es susceptible a un herbicida de imidazolinona y se regenera una planta transformada. La planta transformada es tolerante a la exposición a un nivel de un herbicida de imidazolinona que destruiría o dañaría significativamente a una planta no transformada. Este procedimiento puede aplicarse a cualquier especie de planta; sin embargo, lo más beneficioso es cuando se aplica a plantas de cultivo.
Las metodologías para la construcción de casetes de expresión en plantas y para la introducción de ácidos nucleicos foráneos en plantas se conocen generalmente en la técnica y se han descrito previamente. Por ejemplo, el ADN foráneo puede introducirse en las plantas por medio de vectores del plásmido inductor de tumores (Ti). Otros procedimientos para la introducción de ADN foráneo implican el uso de la transformación de protoplastos mediada por PEG, electroporación, microinyección, fibras cortas y biolística o bombardeo de microproyectiles para la absorción directa de ADN. Estos procedimientos se conocen en la técnica (patente estadounidense n.o 5.405.765 concedida a Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor. Appl Genet. 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) y Methods in Plant Molecular Biology (Schuler y Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989)). El procedimiento de transformación depende de la célula vegetal que ha de transformarse, la estabilidad de los vectores usados, el nivel de expresión de los productos génicos y de otros parámetros.
Otros procedimientos adecuados para la introducción de secuencias de nucleótidos en células vegetales y para la subsiguiente inserción en el genoma de la planta incluyen la microinyección según Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334, la electroporación según se describe en Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, la transformación mediada por Agrobacterium según se describe en Townsend et al., patente estadounidense n.o 5.563.055, Zhao et al., patente estadounidense n.o 5.981.840, la transferencia génica directa según se describe en Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722 y la aceleración balística de partículas según se describe, por ejemplo, en Sanford et al., patente estadounidense n.o 4.945.050; Tomes et al., patente estadounidense n.o 5.879.918; Tomes et al., patente estadounidense n.o 5.886.244; Bidney et al., patente estadounidense n.o 5.932.782; Tomes et al. (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment” en Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín, Alemania); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); y la transformación de Lec1 (documento WO 00/28058). Véanse también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, patente estadounidense n.o 5.240.855; Buising et al., patentes estadounidenses n.os 5.322.783 y 5.324.646; Tomes et al. (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlín, Alemania) (maíz); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al., patente estadounidense n.o
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Los polinucleótidos de la divulgación pueden introducirse en las plantas poniendo estas en contacto con un virus o con ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales procedimientos implican la incorporación de un constructo de polinucleótido de la divulgación dentro de una de una molécula de ADN o ARN viral. Se reconoce que una proteína AHASL de la divulgación puede sintetizarse inicialmente como parte de una poliproteína viral, que después puede procesarse mediante proteólisis in vivo o in vitro para producir la proteína recombinante deseada. Además, se reconoce que los promotores de la divulgación también abarcan promotores utilizados para la transcripción por ARN polimerasas virales. Los procedimientos para la introducción de constructos de polinucleótido en plantas y la expresión de una proteína codificada en los mismos, que implican moléculas de ADN o ARN viral se conocen en la técnica. Por ejemplo, véanse las patentes estadounidenses n.os 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 y
5.316.931.
Las células que han sido transformadas pueden dejarse crecer hasta obtener plantas de acuerdo con procedimientos convencionales. Por ejemplo, véase McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden dejarse crecer entonces y o bien polinizarse con la misma cepa transformada o bien con cepas diferentes, e identificarse el híbrido resultante con expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada.
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Puede ser necesario el crecimiento de dos o más generaciones para garantiza que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene y se hereda de manera estable y después las semillas se recogen para garantizar que se ha conseguido la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente divulgación describe semillas transformadas (también denominadas “semillas transgénicas”) que tienen un constructo de polinucleótido de la divulgación, por ejemplo, un casete de expresión de la divulgación, incorporado de manera estable en su genoma.
La presente divulgación se refiere a la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de especies de planta de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente las especies Brassica útiles como fuente de oleaginosas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo común (Panicum miliaceum), panizo (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum), soja (Glicina max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hipogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), boniato (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffee spp.), coco (Cocos micifera), piña (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té(Camellia sinensis), plátano (Musia spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna (Olea europaea), papaya (Curica papaya), anacardo (Amacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prumus amygdalus), remolachas azucareras (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avenas, cebada, hortalizas, plantas ornamentales y coníferas.
Las plantas de la presente divulgación incluyen plantas de cultivo (por ejemplo, girasol, Brassica sp., algodón, remolacha azucarera, soja, cacahuete, alfalfa, cártamo; tabaco, maíz, arroz, trigo, centeno, cebada, triticale, sorgo, mijo, etc.).
Las plantas resistentes a herbicidas de la divulgación tienen utilidad en procedimientos para el control de malas hierbas. Por lo tanto, la presente divulgación describe además un procedimiento para el control de las malas hierbas en las proximidades de una planta resistente a herbicidas de la divulgación. El procedimiento comprende la aplicación de una cantidad eficaz de un herbicida a las malas hierbas y a la planta resistente a herbicidas, en el que la planta presenta un aumento de la resistencia a al menos un herbicida, en particular un herbicida de imidazolinona
o de sulfonilurea, en comparación con una planta de tipo natural. En un procedimiento de este tipo para el control de las malas hierbas, las plantas resistentes a herbicidas de la divulgación pueden ser plantas de cultivo, incluyendo, pero sin limitarse a, girasol, alfalfa, Brassica sp., soja, algodón, cártamo, cacahuete, tabaco, tomate, patata, trigo, arroz, maíz, sorgo, cebada, centeno, mijo, y sorgo.
Al proporcionar plantas que presentan un aumento de la resistencia a herbicidas, en particular a herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea, es posible emplear una amplia diversidad de formulaciones para proteger las plantas frente a las malas hierbas, con el fin de mejorar el crecimiento de dichas plantas y reducir la competencia por los nutrientes. Un herbicida puede usarse por sí mismo para el control de malas hierbas en preemergencia, postemergencia, antes de plantar o al plantar en áreas que rodean a las plantas descritas en el presente documento o puede usarse una formulación de un herbicida de imidazolinona que contiene otros aditivos. El herbicida puede usarse también como tratamiento de semillas. Los aditivos que se encuentran en una formulación de un herbicida de imidazolinona o sulfonilurea incluyen otros herbicidas, detergentes, adyuvantes, agentes de esparcido, agentes adherentes, agentes estabilizantes o similares. La formulación del herbicida puede ser una preparación húmeda o seca y puede incluir, pero sin limitarse a polvos fluidos, concentrados emulsionables y concentrados líquidos. El herbicida y las formulaciones de herbicidas pueden aplicarse de acuerdo con procedimientos convencionales, por ejemplo, por pulverización, riego, espolvoreo o similares.
La presente divulgación describe semillas transgénicas y no transgénicas que presentan un aumento de la tolerancia a al menos un herbicida, en particular un herbicida inhibidor de AHAS, más en particular, herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea. Tales semillas incluyen, por ejemplo, semillas de girasol no transgénicas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606 y semillas transgénicas que comprenden una molécula de polinucleótido de la divulgación que codifica para una proteína AHASL resistente a herbicidas.
La presente divulgación describe procedimientos para la producción de una planta resistente a herbicidas, particularmente una planta de girasol resistente a herbicidas mediante mejora de plantas convencional que implica la reproducción sexual. Los procedimientos comprenden el cruzamiento de una primera planta que es resistente a un herbicida con una segunda planta que no es resistente al herbicida. La primera planta puede ser cualquiera de las plantas resistentes a herbicidas de la presente divulgación, incluidas por ejemplo, plantas transgénicas que comprenden al menos una de las moléculas de polinucleótido de la presente divulgación que codifican para una proteína AHASL resistente a herbicidas y plantas de girasol no transgénicas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de
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depósito de patente ATCC PTA-7606. La segunda planta puede ser cualquier planta que es capaz de producir plantas de progenie viables (es decir, semillas) al cruzarla con la primera planta. Normalmente, pero no necesariamente, la primera y la segunda plantas son de la misma especie. Los procedimientos de la divulgación pueden implicar además una o más generaciones de retrocruzamiento de las plantas de la progenie del primer cruzamiento con una planta de la misma línea o genotipo que la primera o la segunda plantas. Alternativamente, la progenie del primer cruzamiento o de cualquier cruzamiento subsiguiente puede cruzarse con una tercera planta de una línea o genotipo diferente que o bien la primera o bien la segunda plantas. Los procedimientos de la divulgación pueden implicar adicionalmente la selección de plantas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la primera planta.
La presente divulgación describe además procedimientos para aumentar la resistencia a herbicidas de una planta, en particular una planta de girasol resistente a herbicidas, mediante mejora de plantas convencional que implica la reproducción sexual. Los procedimientos comprenden el cruzamiento de una primera planta que es resistente a un herbicida con una segunda planta que puede ser o no resistente al herbicida o que puede ser resistente a un herbicida o herbicidas diferentes de los de la primera planta. La primera planta puede ser cualquiera de las plantas resistentes a herbicidas de la presente divulgación, incluidas, por ejemplo, plantas de girasol transgénicas que comprenden al menos una de las moléculas de polinucleótido de la presente divulgación que codifican para una proteína AHASL resistente a herbicidas y plantas de girasol no transgénicas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606. La segunda planta puede ser cualquier planta que es capaz de producir plantas de progenie viables (es decir, semillas) al cruzarla con la primera planta. Normalmente, pero no necesariamente, la primera y la segunda plantas son de la misma especie. Las plantas de la progenie producidas mediante este procedimiento de la presente divulgación presentan un aumento de la resistencia a un herbicida en comparación con o bien la primera o bien la segunda plantas o con las dos. Cuando la primera y la segunda plantas son resistentes a diferentes herbicidas las plantas de la progenie tendrán características de tolerancia a herbicidas combinadas de la primera y la segunda plantas. Los procedimientos de la divulgación pueden implicar además una o más generaciones de retrocruzamiento de las plantas de la progenie del primer cruzamiento con una planta de la misma línea o genotipo que o bien la primera o bien la segunda planta. Alternativamente, la progenie del primer cruzamiento o de cualquier cruzamiento subsiguiente puede cruzarse con una tercera planta de una línea o genotipo diferente que o bien la primera o bien la segunda plantas. Los procedimientos de la divulgación pueden implicar adicionalmente la selección de plantas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la primera planta, de la segunda planta o de las dos plantas, primera y segunda.
Las plantas de la presente divulgación pueden ser transgénicas o no transgénicas. Un ejemplo de una planta de girasol no transgénica que presenta un aumento de la resistencia a imidazolinonas es la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606; o un derivado mutante, recombinante o modificado mediante ingeniería genética de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606; o de cualquier progenie de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606;
o una planta que es una progenie de cualquiera de estas plantas; o una planta que comprende las características de tolerancia a herbicidas de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606.
La presente divulgación también describe plantas, órganos vegetales, tejidos vegetales, células vegetales, semillas y células huésped no humanas que se transforman con al menos una molécula de polinucleótido, casete de expresión
o vector de transformación de la divulgación. Tales plantas, órganos vegetales, tejidos vegetales, células vegetales, semillas y células huésped no humanas transformados presentan un aumento de la tolerancia o resistencia a al menos un herbicida, a niveles del herbicida que destruyen o inhiben el crecimiento de una planta, tejido vegetal, célula vegetal o célula huésped no humana no transformados, respectivamente. La planta, tejidos vegetales, células vegetales y semillas transformados de la divulgación pueden ser Arabidopsis thaliana y plantas de cultivo.
La presente divulgación describe procedimientos que implican el uso de al menos un herbicida inhibidor de AHAS seleccionado del grupo que consiste en herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de piridimidiniloxibenzoato, herbicidas de sulfonilamino-carboniltrizolinona y mezclas de los mismos. En estos procedimientos, el herbicida inhibidor de AHAS puede aplicarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos, pero sin limitarse al tratamiento de semillas, el tratamiento del suelo y el tratamiento foliar.
Antes de su aplicación, el herbicida inhibidor de AHAS puede transformarse en las formulaciones habituales, por ejemplo, disoluciones, emulsiones, suspensiones, polvos, polvos finos, pastas y gránulos. La forma de uso depende del fin particular pretendido; en cada caso deberá garantizarse una distribución fina y uniforme del compuesto de
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pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2, pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarillo 1, pigmento amarillo 13, pigmento rojo 112, pigmento rojo 48:2, pigmento rojo 48:1, pigmento rojo 57:1, pigmento rojo 53:1, pigmento naranja 43, pigmento naranja 34, pigmento naranja 5, pigmento verde 36, pigmento verde 7, pigmento blanco 6, pigmento marrón 25, violeta básico 10, violeta básico 49, rojo ácido 51, rojo ácido 52, rojo ácido 14, azul ácido 9, amarillo ácido 23, rojo básico 10, rojo básico 108.
Un ejemplo de un agente gelificante adecuado es carragenina (Satiagel®).
Los polvos, los materiales para esparcido y los productos espolvoreables pueden prepararse mediante mezclado o molienda simultánea de los principios activos con un portador sólido.
Pueden prepararse gránulos, por ejemplo, gránulos recubiertos, gránulos impregnados y gránulos homogéneos, mediante la unión de los compuestos activos a portadores sólidos. Algunos ejemplos de portadores sólidos son tierras minerales como geles de sílice, silicatos, talco, caolín, arcilla acicular, piedra caliza, cal, creta, arcilla calcareoferruginosa, loess, arcilla, dolomía, tierra de diatomeas, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, óxido de magnesio, materiales sintéticos molidos, fertilizantes tales como, por ejemplo, sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, ureas y productos de origen vegetal como harina de cereales, harina de corteza de árboles, serrín y harina de cáscaras de nuez, polvos de celulosa y otros sólidos.
En general, las formulaciones comprenden desde el 0,01 hasta el 95% en peso, preferiblemente desde el 0,1 hasta el 90% en peso del herbicida inhibidor de AHAS. En este caso, los herbicidas inhibidores de AHAS se emplean con una pureza de desde el 90% hasta el 100% en peso, preferiblemente, del 95% al 100% en peso (de acuerdo con el espectro de RMN). Para fines de tratamiento de semillas, las formulaciones respectivas pueden diluirse de 2 a 10 veces, lo que conduce a concentraciones en las preparaciones listas para usar del 0,01 al 60% en peso del principio activo, preferiblemente del 0,1 al 40% en peso.
El herbicida inhibidor de AHAS puede usarse tal cual, en forma de sus formulaciones o las formas de uso preparadas a partir de las mismas, por ejemplo, en forma de pulverizables, polvos, suspensiones o dispersiones disoluciones directamente, emulsiones, dispersiones oleosas, pastas, productos espolvoreables, materiales para esparcir o gránulos, por medio de pulverización, atomización, espolvoreo, esparcido o vertido. Las formas de uso dependen totalmente de los fines pretendidos; en cada caso se pretenden garantizar la distribución más fina posible del herbicida inhibidor de AHAS de acuerdo con la divulgación.
Pueden prepararse formas de uso acuosas a partir de concentrados de emulsión, pastas o polvos humectables (polvos pulverizables, dispersiones oleosas) mediante la adición de agua. Para preparar emulsiones, pastas o dispersiones oleosas, las sustancias, tal cuales o disueltas en un aceite o disolvente, pueden homogeneizarse en agua por medio de un agente humectante, de adhesividad, dispersante o emulsionante. Sin embargo, también es posible preparar concentrados compuestos por el principio activo, humectante, agente de adhesividad, dispersante o emulsionante y, en caso apropiado, el disolvente o aceite y tales concentrados son adecuados para su dilución con agua.
Las concentraciones de compuesto activo en las preparaciones listas para usar pueden variar en intervalos relativamente amplios. En general, son desde el 0,0001 hasta el 10%, por ejemplo desde el 0,01 hasta el 1% en peso.
El herbicida inhibidor de AHAS también puede usarse satisfactoriamente en el procedimiento de ultra bajo volumen (ULV), en el que es posible aplicar formulaciones que comprenden más del 95% en peso del compuesto activo o incluso aplicar el compuesto activo sin aditivos.
A continuación se incluyen ejemplos de formulaciones:
1. Productos para dilución con agua para aplicaciones foliares. Para fines de tratamiento de semillas, tales productos pueden aplicarse a la semilla diluidos o sin diluir.
A) Concentrados solubles en agua (SL, LS)
Se disuelven 10 partes en peso del herbicida inhibidor de AHAS en 90 partes en peso de agua o de un disolvente soluble en agua. Como alternativa se añaden humectantes u otros agentes auxiliares. El herbicida inhibidor de AHAS se disuelve al diluirlo con agua, mediante lo cual se obtiene una formulación con el 10% (p/p) del herbicida inhibidor de AHAS.
B) Concentrados dispersables (DC)
Se disuelven 20 partes en peso del herbicida inhibidor de AHAS en 70 partes en peso de ciclohexanona con la adición de 10 partes en peso de un dispersante, por ejemplo, polivinilpirrolidona. La dilución con agua da lugar a una dispersión, mediante lo cual se obtiene una formulación con el 20% (p/p) del herbicida inhibidor de AHAS.
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