BRPI0608264B1

BRPI0608264B1 - Método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta de arroz, molécula de polinucleotídeo mutagenizada isolada, cassete de expressão, vetor de transformação, métodos para aumentar atividade de ahas resistente a herbicida em arroz, para produzir arroz resistente a herbicida, para aumentar tolerância a herbicida em arroz, e para selecionar para uma célula de arroz transformada, e, polipeptídeo isolado

Info

Publication number: BRPI0608264B1
Application number: BRPI0608264-5A
Authority: BR
Inventors: Alberto Blas Livore; Alberto Raul Prina; Bijay K. Sigh; Sherry R. Whitt; Robert Ascenzi
Original assignee: Instituto Nacional De Tecnologia Agropecuaria
Priority date: 2005-03-02
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2021-11-30
Also published as: BRPI0608264A2

Abstract

planta, semente da planta, metodo para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta, molécula de polinucleotídeo isolada, cassete de expressão, célula hospedeira não humana, vetor de transformação, semente transformada, célula vegetal transformada, metodos para aumentar atividade de afias resistente a hierbicida em uma planta, para produzir uma planta resistente a herbicida, para aumentar tolerancia a herbicida em uma planta, e para selecionar para uma celula vegetal transformada, polipeptídeo isolado, e, metodos para aumentar a resistência a herbicida de uma planta, e para combater vegetação indesejada. plantas de arroz resistentes a herbicida, polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos de subunidade grande 1 de acetohidroxiácido sintase (ahasl1), e as seqúêneias de aminoácidos destes polipeptídeos, são descritos. cassetes de expressão e vetores de transformação compreendendo os polinucleotídeos da invenção, assim como plantas e células hospedeiras transformadas com os polinucleotídeos, são descritas. métodos de usar os polinucleotídeo para aumentar a resistência de plantas a herbicidas de imidazolinona, e métodos para controlar ervas daninhas na vizinhança de plantas resistentes a herbicida também são descritos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Esta invenção se refere ao campo de biotecnologia agrícola, particularmente a plantas de arroz resistentes a herbicida e a novas seqüências de polinucleotídeos que codificam proteínas de subunidade grande de acetohidroxiácido sintase resistentes a herbicida.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Ervas daninhas são umas das principais limitações para produção de arroz. Semeadura direta reduziu os problemas laborais de transplantação; entretanto, esta tecnologia ajudou a aumentar o problema de ervas daninhas. Uso de herbicida em arroz é uma prática comum na maioria das regiões de arroz sob cultivo de semeadura direta e/ou países desenvolvidos que crescem arroz sob sistemas ou de transplantação ou semeadura direta. Normalmente um herbicida de gramínea e um de dicotiledônea são aplicados uma ou mais vezes a fim de controlar ervas daninhas em cultivos de arroz.

[003] Gramíneas, ciperáceas e arroz daninho (arroz vermelho) foram os principais grupos de espécies que possuem alta aptidão para os mesmos ambientes onde arroz é crescido. Elas se tornaram globalmente distribuídas e são difíceis para controlar ervas daninhas em cultivos de arroz. Embora existam diversas práticas culturais que auxiliam em controle de sementes e são convenientes para melhor cuidado ambiental, estas práticas impõem restrições e aumentam custos de produção. Preparação de terra, nivelamento de terra, barragens e profundidade de água, rotação de terra, semente certificada, sistemas vegetais apropriados e datas de plantio podem ser algumas das práticas culturais que podem ajudar a reduzir o banco de sementes de ervas daninhas e o desenvolvimento de ervas daninhas tolerantes a herbicida.

[004] Apesar das muitas recomendações para melhores práticas culturais os fazendeiros ainda recorrem ao uso de herbicidas como a principal ferramenta para controlar ervas daninhas. O uso e abuso de alguns destes químicos resultou no desenvolvimento de ervas daninhas tolerantes tipo capim-arroz (Eclzinochloa crus galli) resistente a propanil e resistente a butaclor. Nestes casos, seria conveniente ter outros herbicidas com diferentes modos de ação com a capacidade de controlar a maioria destas espécies de ervas daninhas. A disponibilidade de tais herbicidas permitiria uma rotação de herbicidas com um modo de ação diferente do que aqueles herbicidas que são comumente usados em produção de arroz.

[005] Imidazolinonas são um grupo de herbicidas com um modo de ação diferente do que os herbicidas de arroz usados comumente. Estes herbicidas são conhecidos por inibirem acetohidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecida como acetolactato sintase ou ALS), uma enzima chave para a biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada. Em particular, acetohidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecida como acetolactato sintase ou ALS), é a primeira enzima que catalisa a síntese bioquímica dos aminoácidos de cadeia ramificada valina, leucina e isoleucina (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine," in Plant Amino Acid, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. Nova Iorque, Nova Iorque, pp. 227-247). AHAS é o sítio de ação de quatro famílias estruturalmente diversas de herbicidas incluindo as sulfoniluréias (LaRossa and Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161), as imidazolinonas (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546), as triazolopirimidinas (Subramanian and Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines," in Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. and Sonnet, P.E.. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288), e os pirimidiloxibenzoatos (Subramanian et al. (1990) Plant Physiol. 94: 239-244.). Herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia são amplamente usados em agricultura moderna devido a sua efetividade em taxas de aplicação muito baixas e não toxicidade relativa em animais. Inibindo atividade de AHAS, estas famílias de herbicidas previnem crescimento adicional e desenvolvimento de plantas susceptíveis incluindo muitas espécies de ervas daninhas. Diversos exemplos de herbicidas de imidazolinona disponíveis comercialmente são PURSUIT® (imazetapir), SCEPTERS (imazaquin) e ARSENAL® (imazapir). Exemplos de herbicidas de sulfoniluréia são clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil e halosulfuron.

[006] Devido a sua alta efetividade e baixa toxicidade, herbicidas de imidazolinona são favorecidos para aplicação pulverizando sobre o topo de uma ampla área de vegetação. A capacidade de pulverizar um herbicida sobre o topo de uma ampla extensão de vegetação diminui os custos associados com estabelecimento e manutenção de plantação, e diminui a necessidade de preparação de sítio antes de uso de tais químicos. Pulverizar sobre o topo de uma espécie tolerante desejada também resulta na capacidade de atingir potencial de rendimento máximo da espécie desejada devido à ausência de espécies competitivas. Entretanto, a capacidade de usar tais técnicas de pulverização é dependente da presença de espécies resistentes a imidazolinona da vegetação desejada na área de pulverização.

[007] Dentre os principais cultivos agrícolas, algumas espécies de leguminosas tal como soja são naturalmente resistentes a herbicidas de imidazolinona devido a sua capacidade de metabolizar rapidamente os compostos de herbicida (Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471). Outros cultivos tal como milho (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886) e arroz (Barrett et al. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, Nova Iorque, pp. 195-220) são de alguma maneira susceptíveis a herbicidas de imidazolinona. A sensibilidade diferencial para os herbicidas de imidazolinona é dependente da natureza química do herbicida particular e metabolismo diferencial do composto de uma forma tóxica para uma não tóxica em cada planta (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545546; Brown et al., (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Outras diferenças fisiológicas de planta tal como absorção e translocação também desempenham um papel importante em sensibilidade (Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471).

[008] Plantas resistentes a imidazolinonas, sulfoniluréias e triazolopirimidinas foram produzidas com sucesso usando mutagênese de semente, micrósporo, pólen, e calo em Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (i.e., canola) Glicina max, Nicotiana tabacum, e Oryza sativa (Sebastian et al. (1989) Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 83:6570; Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand et al. (1993)1 Heredity 84:91-96; Patente Norte-Americana No. 5.545.822). Em todos os casos, um único, gene nuclear parcialmente dominante conferiu resistência. Quatro plantas de trigo resistentes a imidazolinona também foram previamente isoladas seguindo mutagênese de semente de Triticum aestivunz L. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992) Plant Plzysiol. 100:882-886). Estudos de herança confirmaram que um único, gene parcialmente dominante conferiu resistência. Baseado em estudos alélicos, os autores concluíram que as mutações nas quatro linhagens identificadas foram localizadas no mesmo locus. Um dos genes de resistência de cultivar Fidel foi designado FS-4 (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886).

[009] Modelagem baseada em computador da conformação tridimensional do complexo AHAS-inibidor prediz diversos aminoácidos na área de ligação de inibidor proposta como sítios onde mutações induzidas iriam provavelmente conferir resistência seletiva para imidazolinonas (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368). Plantas de trigo produzidas com algumas destas mutações projetadas racionalmente nos sítios de ligação propostos da enzima AHAS exibiram de fato resistência específica para uma única classe de herbicidas (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368).

[0010] Resistência vegetal a herbicidas de imidazolinona também foi relatada em diversas patentes. Patente Norte-Americana Nos. 4.761.373, 5.331.107, 5.304.732, 6.211.438, 6.211.439 e 6.222.100 geralmente descrevem o uso de um gene de AHAS alterado para obter resistência a herbicida em plantas, e especificamente descrevem certas linhagens de milho resistentes a imidazolinona. Patente Norte-Americana No. 5.013.659 descreve plantas exibindo resistência a herbicida devido a mutações em pelo menos um aminoácido em uma ou mais regiões conservadas. As mutações descritas nessa codificam ou resistência cruzada para imidazolinonas e sulfoniluréias ou resistência específica para sulfoniluréia, mas resistência específica para imidazolinona não é descrita. Patente Norte-Americana No. 5.731.180 e Patente Norte-Americana No. 5.767.361 discutem um gene isolado tendo uma única substituição de aminoácido em uma seqüência de aminoácidos de AHAS de monocotiledônea tipo selvagem que resulta em resistência específica para imidazolinona. Em adição, plantas de arroz que são resistentes a herbicidas que interferem com AHAS foram desenvolvidas por criação de mutação e também pela seleção de plantas resistentes a herbicida a partir de um conjunto de plantas de arroz produzidas por outra cultura. Veja, Patente Norte-Americana Nos. 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796.

[0011] Em plantas, como em todos os outros organismos examinados, a enzima AHAS é compreendida de duas subunidades: uma subunidade grande (papel catalítico) e uma subunidade pequena (papel regulador) (Duggleby and Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36). A subunidade grande de AHAS (também referida neste lugar como AHASL) pode ser codificada por um único gene como no caso de Arabidopsis e arroz ou por múltiplos membros de família de gene como em milho, canola, e algodão. Substituições específicas de único nucleotídeo na subunidade grande conferem na enzima um grau de insensibilidade para uma ou mais classes de herbicidas (Chang and Duggleby (1998) Biochenz J. 333:765-777).

[0012] Por exemplo, trigo, Triticum aestivum L., contém três genes homólogos de subunidade grande de acetohidroxiácido sintase. Cada um dos genes exibe expressão significante baseada em resposta de herbicida e dados bioquímicos de mutantes em cada um dos três genes (Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17). As seqüências de codificação de todos os três genes compartilham extensiva homologia no nível de nucleotídeo (WO 03/014357). Através de seqüenciamento dos genes de AHASL de diversas variedades de Triticum aestivum, a base molecular de tolerância a herbicida nas linhagens mais IMI-tolerantes (imidazolinona-tolerantes) foi encontrada ser a mutação S653(At)N, indicando uma substituição de serina para asparagina em uma posição equivalente a serina em aminoácido 653 em Arabidopsis thaliazza (WO 03/01436; WO 03/014357). Esta mutação é devida a um único polimorfismo de nucleotídeo (SNP) na seqüência de DNA codificando a proteína AHASL.

[0013] Dado sua alta efetividade e baixa toxicidade, herbicidas de imidazolinona são favorecidos para uso agrícola. Entretanto, a capacidade de usar herbicidas de imidazolinona em um sistema de produção de safra particular depende da disponibilidade de variedades resistentes a imidazolinona da planta cultivada de interesse. Para produzir tais variedades resistentes a imidazolinona, melhoristas de plantas necessitam desenvolver linhagens com a característica de resistência a imidazolinona. Assim, linhagens resistentes a imidazolinona adicionais e variedades de plantas cultivadas, assim como métodos e composições para a produção e uso de linhagens e variedades resistentes a imidazolinona, são necessários.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] A presente invenção fornece plantas de arroz tendo resistência aumentada para herbicidas quando comparado a uma planta de arroz tipo selvagem. Em particular, as plantas de arroz da invenção têm resistência aumentada para herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia, quando comparado a uma planta de arroz tipo selvagem. As plantas resistentes a herbicida de arroz da invenção compreendem pelo menos uma cópia de um gene ou polinucleotídeo que codificam uma subunidade grande 1 de acetohidroxiácido sintase (AHASL1) resistente a herbicida que compreende uma substituição de aminoácido em relação à seqüência de aminoácidos de uma proteína AHASL1 de arroz tipo selvagem. Em uma forma de realização da invenção, as plantas de arroz resistentes a herbicida compreendem uma proteína AHASL1 resistente a herbicida que compreende uma valina ou aspartato em posição de aminoácido 179 ou posição equivalente. A planta de arroz resistente a herbicida da invenção pode conter uma, duas, três, quatro, ou mais cópias de um gene ou polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL1 resistente a herbicida da invenção. As plantas de arroz da invenção também incluem sementes e plantas de progenia que compreendem pelo menos uma cópia de um gene ou polinucleotídeo codificando uma AHASL1 resistente a herbicida da invenção.

[0015] A presente invenção fornece plantas de arroz resistentes a herbicida que são da linhagem de arroz que foi designada como IMINTA 16. Uma amostra de sementes da linhagem IMINTA 16 foi depositada com o depósito de patente em NCIMB Ltd. e designado Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262. As plantas de arroz IMINTA 16 compreendem em seus genomas um gene de AHASL1 que compreende as seqüências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, ou que codificam a proteína AHASL1 compreendendo, a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2. Quando comparada à seqüência de aminoácidos da proteína AHASL1 que é codificada por um gene de AHASL1 de uma planta de arroz tipo selvagem (No. de Acesso de GenBank AB049822), a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2 possui uma única diferença de aminoácido da seqüência de aminoácidos de tipo selvagem. Na seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, existe uma valina em posição de aminoácido 179. Na seqüência de aminoácidos da proteína AHASL1 de arroz tipo selvagem, esta mesma posição de aminoácido tem uma alanina.

[0016] A presente invenção fornece adicionalmente polinucleotídeos isolados e polipeptídeos isolados para proteínas AHASL1 de arroz (Oryza sativa). Os polinucleotídeos da invenção abrangem seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas AHASL1 resistentes a herbicida. As proteínas AHASL1 resistentes a herbicida da invenção são proteínas AHASL1 resistentes a imidazolinona que compreendem uma substituição de alanina por valina em posição 179 nas suas seqüências de aminoácidos respectivas, quando comparado à seqüência de aminoácidos tipo selvagem correspondente. Os polinucleotídeos da invenção abrangem as seqüências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, seqüências de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, e fragmentos e variantes de ditas seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas compreendendo atividade de AHAS, particularmente atividade de AHAS resistente a herbicida.

[0017] A presente invenção fornece cassetes de expressão para expressar os polinucleotídeos da invenção em plantas, células vegetais, e outras células hospedeiras não humanas. Os cassetes de expressão compreendem um promotor expressável na planta, célula vegetal, ou outras células hospedeiras de interesse operavelmente ligado a um polinucleotídeo da invenção que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida. Se necessário para direcionar expressão para o cloroplasto, o cassete de expressão também pode compreender uma seqüência tendo como alvo cloroplasto operavelmente ligada que codifica de um peptídeo de trânsito de cloroplasto para direcionar uma proteína AHASL1 expressa para o cloroplasto. Os cassetes de expressão da invenção encontram uso em um método para reforçar a tolerância a herbicida de uma planta e uma célula hospedeira. O método envolve transformar a planta ou célula hospedeira com um cassete de expressão da invenção, em que o cassete de expressão compreende um promotor que é expressável na planta ou célula hospedeira de interesse e o promotor é operavelmente ligado a um polinucleotídeo da invenção que codificam uma proteína AHASL1 resistente a herbicida da invenção. O método compreende adicionalmente regenerar uma planta transformada a partir da célula vegetal transformada.

[0018] A presente invenção fornece um método para aumentar atividade de AHAS em uma planta compreendendo transformar uma célula vegetal com um construto de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressão em uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir da célula vegetal transformada. A seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir daquelas seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL1 resistentes a herbicida da invenção, particularmente as seqüências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, seqüências de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, e fragmentos e variantes destas. Uma planta produzida por este método compreende atividade de AHAS aumentada, quando comparada a uma planta não transformada.

[0019] A presente invenção fornece um método para produzir uma planta resistente a herbicida compreendendo transformar uma célula vegetal com um construto de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressão em uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir de dita célula vegetal transformada. A seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir daquelas seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL1 resistentes a herbicida da invenção, particularmente as seqüências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, seqüências de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ 11D NO:2, e fragmentos e variantes destas, incluindo, mas não limitadas a, as formas maduras das proteínas AHASL1 resistentes a herbicida da invenção. Uma planta resistente a herbicida produzida por este método compreende resistência aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia, quando comparado a uma planta não transformada.

[0020] A presente invenção fornece um método para reforçar tolerância a herbicida em uma planta resistente a herbicida. O método encontra uso em aumentar a resistência de uma planta que já é resistente para um nível de um herbicida que iria matar ou prejudicar significantemente uma planta tipo selvagem. Uma tal planta tolerante a herbicida pode ser uma planta tolerante a herbicida que foi modificada geneticamente para tolerância a herbicida ou uma planta tolerante a herbicida que foi desenvolvida por meios que não envolvem DNA recombinante tal como, por exemplo, as plantas de arroz IMINTA 16 da presente invenção. O método compreende transformar uma planta tolerante a herbicida com um construto de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressão em uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir da célula vegetal transformada. A seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir daquelas seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL1 resistentes a herbicida da invenção, particularmente as seqüências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NO: 1 e 3, seqüências de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, e fragmentos e variantes destas.

[0021] A presente invenção fornece vetores de transformação compreendendo um gene marcador selecionável da invenção. O gene marcador selecionável compreende um promotor que aciona expressão em uma célula hospedeira operavelmente ligada a um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida da invenção. O vetor de transformação pode adicionalmente compreender um gene de interesse para ser expresso na célula hospedeira e também pode, se desejado, incluir uma seqüência tendo como alvo cloroplasto que é operavelmente ligada ao polinucleotídeo da invenção.

[0022] A presente invenção fornece adicionalmente métodos para usar os vetores de transformação da invenção para selecionar por células transformadas com o gene de interesse. Tais métodos envolvem a transformação de uma célula hospedeira com o vetor de transformação, expondo a célula a um nível de um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia que iria matar ou inibir o crescimento de uma célula hospedeira não transformada, e identificar a célula hospedeira transformada por sua capacidade de crescer na presença do herbicida. Em uma forma de realização da invenção, a célula hospedeira é uma célula vegetal e o gene marcador selecionável compreende um promotor que aciona expressão em uma célula vegetal.

[0023] A presente invenção fornece um método para controlar ervas daninhas na vizinhança das plantas resistentes a herbicida da invenção, incluindo as plantas de arroz resistentes a herbicida descritas acima e plantas transformadas com os polinucleotídeos AHASL1 resistentes a herbicida da invenção. Tais plantas transformadas compreendem em seus genomas pelo menos um cassete de expressão compreendendo um promotor que aciona expressão de gene em uma célula vegetal, em que o promotor é operavelmente ligado a um polinucleotídeo AHASL1 da invenção. O método compreende aplicar uma quantidade efetiva de um herbicida para as ervas daninhas e para a planta resistente a herbicida, em que a planta resistente a herbicida, planta tem resistência aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia, quando comparada a uma planta tipo selvagem ou não transformada.

[0024] As plantas da presente invenção podem ser transgênicas ou não transgênicas. Um exemplo de uma planta de arroz não transgênica tendo resistência aumentada para imidazolinona e/ou herbicidas de sulfoniluréia inclui uma planta de arroz tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262, ou mutante, recombinante, ou um derivado geneticamente modificado da planta tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; ou de qualquer progenia da planta tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; ou uma planta que é uma progenia de qualquer destas plantas; ou uma planta que compreende as características de resistência a herbicida da planta tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262.

[0025] A presente invenção também fornece plantas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas que são transformadas com o pelo menos um polinucleotídeo, cassete de expressão, ou vetor de transformação da invenção. Tais plantas transformadas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas têm tolerância ou resistência aumentada para pelo menos um herbicida, em níveis do herbicida que matam ou inibem o crescimento de uma planta não transformada, tecido vegetal, célula vegetal, ou célula hospedeira não humana, respectivamente. Preferivelmente, as plantas transformadas, tecidos vegetais, células vegetais, e sementes da invenção são Arabidopsis thaliana e plantas cultivadas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

[0026] Figura 1 é um alinhamento de seqüência de nucleotídeos do gene de AHASL1 de arroz resistente a herbicida da presente invenção (SEQ ID NO: 1) com algumas seqüências de nucleotídeos de AHASL de plantas conhecidas. A transição de C para T (em relação a tipo selvagem) em nucleotídeo 542 na SEQ ID NO: 1 é indicada por fonte branca dentro de uma caixa preta. Os códons de início e término são representados em fonte em negrito. Os nomes das outras seqüências de AHASL na figura são definidos como segue: "OsAHASL1.1" é uma seqüência de nucleotídeos AHASL1 tipo selvagem de constituição de arroz El Paso; "OsAHASL1.2" é uma seqüência de nucleotídeos AHASL1 tipo selvagem de constituição de arroz IRGA; "OsAHASL1.4" é uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 de arroz (No. de Acesso AB049822); "OsAHASL1.6" é uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 de arroz (No. de Acesso AB049823); "ZmAHASL1" é uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 de milho (No. de Acesso X63554); "ZmAHASL2" é uma seqüência de nucleotídeos de AHASL2 de milho (No. de Acesso X63553); "OsAHASL2" é uma seqüência de nucleotídeos de AHASL2 de arroz (No. de Acesso AL731599); "AtAHASL" é uma seqüência de nucleotídeos de AHASL de Arabidopsis thaliana (No. de Acesso AY124092).

[0027] Figura 2 é um alinhamento de seqüência de aminoácidos da proteína AHASL1 de arroz resistente a herbicida da presente invenção (SEQ ID NO:2) com algumas seqüências de nucleotídeos de AHASL de plantas conhecidas. A substituição de Ala por Val (em relação a tipo selvagem) em posição 179 na SEQ ID NO:2 é indicada por fonte branca dentro de uma caixa preta. A metionina inicial (M) é representada em fonte em negrito. Os outros nomes usados na figura se referem às seqüências de aminoácidos codificadas pelas seqüências de nucleotídeos indicadas na descrição de Figura 1 acima. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0028] As seqüências de nucleotídeo e de aminoácidos listadas na listagem de seqüências acompanhante são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeos, e código de três letras para aminoácidos. As seqüências de nucleotídeos seguem a convenção padrão de começar na extremidade 5' da seqüência e prosseguir adiante (i.e., de esquerda para direita em cada linha) para a extremidade 3'. Apenas uma fita de cada seqüência de ácidos nucleicos é mostrada, mas a fita complementar é entendida ser inclusa por qualquer referência à fita apresentada. As seqüências de aminoácidos seguem a convenção padrão de começar no término amino da seqüência e prosseguir adiante (i.e., de esquerda para direita em cada linha) para o término carboxil.

[0029] SEQ ID NO:1 expõe a seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL1 resistente a imidazolinona de arroz com a substituição de Ala179 por Val. A região de codificação de SEQ ID NO: 1 corresponde a nucleotídeos 7 a 1938.

[0030] SEQ ID NO:2 expõe a seqüência de aminoácidos de uma proteína AHASL1 resistente a imidazolinona de arroz com a substituição de Ala179 por Val que é codificada pela seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1.

[0031] SEQ ID NO: 3 expõe a seqüência de nucleotídeos da região de codificação de SEQ ID NO: 1.

[0032] SEQ ID NOS: 4-18 expõe as seqüências de nucleotídeos de iniciadores usados para a amplificação por PCR e seqüenciamento de DNA do gene de AHASL1 da invenção como descrito em Exemplo 2 abaixo (veja, Tabela 1).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0033] A presente invenção se refere a plantas de arroz tendo resistência aumentada para herbicidas quando comparado a uma planta de arroz tipo selvagem. As plantas resistentes a herbicida de arroz da invenção foram produzidas como descrito a seguir expondo sementes de arroz tipo selvagem (com respeito à resistência a herbicida) a um mutagênico, semeando as sementes, permitindo que as plantas amadureçam e reproduzam, e selecionando plantas de progenia que apresentaram resistência aumentada para herbicidas de imidazolinona, em relação à resistência de uma planta de arroz tipo selvagem. A invenção fornece a linhagem de arroz resistente a herbicida e plantas destas que são referidas neste lugar como IMINTA 16. Tais plantas resistentes a herbicida de arroz encontram uso em métodos para controlar ervas daninhas, particularmente arroz vermelho e outras ervas daninhas que são sensíveis a herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia.

[0034] A partir das plantas de arroz resistentes a herbicida IMINTA 16, a região de codificação de um gene de subunidade grande 1 de acetohidroxiácido sintase (AHASL1) foi isolado por amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciado. Comparando as seqüências de polinucleotídeos das plantas resistentes a herbicida de arroz da invenção com um cDNA de AHASL1 de arroz de uma planta de arroz tipo selvagem (No. de Acesso de GenBank AB049822), foi descoberto que a região de codificação da seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 de IMINTA 16 diferiu da seqüência de cDNA de AHASL1 de arroz tipo selvagem por um único nucleotídeo. Para a seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 de IMINTA 16, houve uma transição de C para T em nucleotídeo 542 (SEQ ID NO: 1, Figura 1). Esta transição de C para T na seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 resulta em uma substituição de Ala por Val em aminoácido 179 em uma região conservada da seqüência de aminoácidos da proteína AHASL1 prevista, em relação à seqüência de aminoácidos da proteína AHASL1 tipo selvagem (Figura 2).

[0035] A invenção se refere adicionalmente a moléculas isoladas de polinucleotídeo compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL1 resistentes a herbicida de plantas de arroz IMINTA 16 e a tais proteínas AHASL1. A invenção descreve o isolamento e seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL1 de arroz resistente a herbicida de planta de arroz resistente a herbicida que foi produzido por mutagênese química de plantas de arroz tipo selvagem. As proteínas AHASL1 resistentes a herbicida da invenção compreendem uma substituição de alanina por valina em posição 179 em suas respectivas seqüências de aminoácidos, quando comparado à seqüência de aminoácidos de AHASL1 de tipo selvagem correspondente.

[0036] A presente invenção fornece moléculas isoladas de polinucleotídeo que codificam proteínas AHASL1 resistentes a herbicida de arroz (Oryza sativa L.). Especificamente, a invenção fornece moléculas isoladas de polinucleotídeo compreendendo: as seqüências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, seqüências de nucleotídeos codificando proteínas AHASL1 compreendendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, e fragmentos e variantes de tais seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas AHASL1 funcionais que compreendem atividade de AHAS resistente a herbicida.

[0037] As moléculas isoladas de polinucleotídeo de AHASL1 polinucleotídeo resistentes a herbicida da invenção compreendem seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas AHASL1 resistentes a herbicida. Tais moléculas de polinucleotídeo podem ser usadas em construtos de polinucleotídeo para a transformação de plantas, particularmente plantas cultivadas, para estimular a resistência das plantas para herbicidas, particularmente herbicidas que são conhecidos por inibirem atividade de AHAS, mais particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia. Tais construtos de polinucleotídeo podem ser usados cassetes de expressão, vetores de expressão, vetores de transformação, plasmídeos e os semelhantes. As plantas transgênicas obtidas seguindo transformação com tais construtos de polinucleotídeo mostram resistência aumentada para herbicidas inibindo AHAS tal como, por exemplo, herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia.

[0038] Composições da invenção incluem moléculas de polinucleotídeo compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam proteínas AHASL1. Em particular, a presente invenção sustenta moléculas isoladas de polinucleotídeo compreendendo seqüências de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2, e fragmentos e variantes destas que codificam polipeptídeos compreendendo atividade de AHAS. Adicionalmente são fornecidos polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos codificada por uma molécula de polinucleotídeo descrita neste lugar, por exemplo aquelas estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, e fragmentos e variantes destas que codificam polipeptídeos compreendendo atividade de AHAS, particularmente atividade de AHASL resistente a herbicida. As moléculas de polinucleotídeos da invenção abrangem adicionalmente seqüências de nucleotídeos que codificam formas maduras das proteínas AHASL1 descritas acima. Tais formas maduras de proteínas AHASL1 compreendem atividade de AHAS, particularmente atividade de AHAS resistente a herbicida, mas carecem do peptídeo de trânsito de cloroplasto que é parte de proteínas AHASL1 de comprimento completo.

[0039] A invenção abrange composições de ácidos nucleicos ou proteínas isoladas ou substancialmente purificadas. Uma molécula de polinucleotídeo ou proteína "isolada" ou "purificada", ou porção biologicamente ativa desta, é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a molécula de polinucleotídeo ou proteína como encontrado em seu ambiente naturalmente ocorrente. Assim, uma molécula de polinucleotídeo ou proteína isolada ou purificada é substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos quando sintetizada quimicamente. Preferivelmente, um ácido nucleico "isolado" é livre de seqüências (preferivelmente seqüências codificando proteína) que naturalmente flanqueiam o ácido nucleico (i.e., seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado. Por exemplo, em várias formas de realização, a molécula isolada de polinucleotídeo pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeos que naturalmente flanqueiam a molécula de polinucleotídeo em DNA genômico da célula da qual o ácido nucleico é derivado. Uma proteína que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante. Quando a proteína da invenção ou porção biologicamente ativa desta é produzida recombinantemente, preferivelmente meio de cultura representa menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou químicos de não proteína de interesse.

[0040] A presente invenção fornece polipeptídeos isolados compreendendo proteínas AHASL1. Os polipeptídeos isolados compreendem uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo da seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, as seqüências de aminoácidos codificadas por seqüências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, e fragmentos funcionais e variantes de ditas seqüências de aminoácidos que codificam um polipeptídeo AHASL1 compreendendo atividade de AHAS. Por "fragmentos e variantes funcionais" é pretendido fragmentos e variantes dos polipeptídeos exemplificados que compreendem atividade de AHAS.

[0041] Adicionalmente são fornecidos polipeptídeos isolados compreendendo as formas maduras das proteínas AHASL1 da invenção. Tais formas maduras de proteínas AHASL1 compreendem atividade de AHAS, particularmente atividade de AHAS resistente a herbicida, mas carecem do peptídeo de trânsito de cloroplasto que é parte de proteínas AHASL1 de comprimento completo.

[0042] Em certas formas de realização da invenção, os métodos envolvem o uso de plantas tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida. Por uma planta "tolerante a herbicida" ou "resistente a herbicida", é pretendido que uma planta seja tolerante ou resistente à pelo menos um herbicida em um nível que iria normalmente matar, ou inibir o crescimento de, uma planta normal ou tipo selvagem. Em uma forma de realização da invenção, as plantas tolerantes a herbicida da invenção compreendem uma proteína AHASL1 tolerante a herbicida ou resistente a herbicida. Por "proteína AHASL1 tolerante a herbicida" ou "proteína AHASL1 resistente a herbicida", é pretendido que uma tal proteína AHASL1 apresente maior atividade de AHAS, em relação à atividade de AHAS de uma proteína AHASL1 tipo selvagem, quando na presença de pelo menos um herbicida que é conhecido por interferir na atividade de AHAS e em uma concentração ou nível do herbicida que é conhecido por inibir a atividade de AHAS da proteína AHASL1 tipo selvagem. Além disso, a atividade de AHAS de uma tal proteína AHASL1 tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ser referida neste lugar como atividade de AHAS "tolerante a herbicida" ou "resistente a herbicida".

[0043] Para a presente invenção, os termos "tolerante a herbicida" e "resistente a herbicida" são usados permutavelmente e são pretendidos para terem um significado equivalente e um escopo equivalente. Similarmente, os termos "tolerância a herbicida" e "resistência a herbicida" são usados permutavelmente e são pretendidos para terem um significado equivalente e um escopo equivalente. Da mesma maneira, os termos "resistente a imidazolinona" e "resistência a imidazolinona" são usados permutavelmente e são pretendidos serem de um significado equivalente e um escopo equivalente que os termos "tolerante a imidazolinona" e "tolerância a imidazolinona", respectivamente.

[0044] A invenção abrange polinucleotídeos AHASL1 resistentes a herbicida e proteínas AHASL1 resistentes a herbicida. Por "polinucleotídeo AHASL1 resistentes a herbicida" é pretendido um polinucleotídeo que codifica uma proteína compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida. Por "proteína AHASL1 resistente a herbicida" é pretendido uma proteína ou polipeptídeo que compreende atividade de AHAS resistente a herbicida.

[0045] Ademais, é reconhecido que uma proteína AHASL1 tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ser introduzida em uma planta transformando uma planta ou ancestral desta com uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL1 tolerante a herbicida ou resistente a herbicida. Tais proteínas AHASL1 tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida são codificadas pelos polinucleotídeos AHASL1 tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida. Alternativamente, uma proteína AHASL1 tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ocorrer em uma planta como um resultado de uma mutação naturalmente ocorrente ou induzida em um gene de AHASL1 endógeno no genoma de uma planta ou progenitor desta.

[0046] A presente invenção fornece plantas, tecidos vegetais, células vegetais, e células hospedeiras com resistência ou tolerância aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia. A quantidade ou concentração preferida do herbicida é uma "quantidade efetiva" ou "concentração efetiva”. Por "quantidade efetiva" e "concentração efetiva" é pretendido uma quantidade e concentração, respectivamente, que é suficiente para matar ou inibir o crescimento de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou célula hospedeira tipo selvagem similar, mas esta dita quantidade não mata ou inibe tão severamente o crescimento das plantas, tecidos vegetais, células vegetais, e células hospedeiras resistentes a herbicida da presente invenção. Tipicamente, a quantidade efetiva de um herbicida é uma quantidade que é rotineiramente usada em sistemas de produção agrícola para matar ervas daninhas de interesse. Uma tal quantidade é conhecido por aqueles de habitual verso na arte.

[0047] Por "planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira tipo selvagem similar" é pretendido uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou célula hospedeira, respectivamente, que carece das características de resistência a herbicida e/ou polinucleotídeo particular da invenção que são descritos neste lugar. O uso do termo "tipo selvagem" não é, portanto, pretendido para implicar que uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou outra célula hospedeira careça de DNA recombinante em seu genoma, e/ou não possua características de resistência a herbicida que são diferentes daquelas descritas neste lugar.

[0048] Como usado neste lugar a menos que claramente indicado de outra maneira, o termo "planta" pretendeu significar uma planta em qualquer estágio de desenvolvimento, assim como qualquer parte ou partes de uma planta que pode ser acoplada a ou separada de uma planta intacta inteira. Tais partes de uma planta incluem, mas não são limitadas a, órgãos, tecidos, e células de uma planta. Exemplos de partes vegetais particulares incluem um caule, uma folha, uma raiz, uma inflorescência, uma flor, uma flor pequena, uma fruta, um pedículo, a pedúnculo, um estame, uma antera, um estigma, um estilo, um ovário, uma pétala, uma sépala, um carpelo, uma ponta de raiz, uma coifa, um pêlo radicular, um pêlo foliar, um pêlo de semente, um grão de pólen, a micrósporo, um cotilédone, um hipocótilo, um epicótilo, xilema, floema, parênquima, endosperma, uma célula companheira, uma célula guarda, e quaisquer outros órgãos, tecidos, e células conhecidos de uma planta. Além disso, é reconhecido que uma semente é uma planta.

[0049] As plantas da presente invenção incluem tanto plantas não transgênicas e plantas transgênicas. Por "planta não transgênica" é pretendido significar uma planta carecendo de DNA recombinante em seu genoma. Por "planta transgênica" é pretendido significar uma planta compreendendo DNA recombinante em seu genoma. Uma tal planta transgênica pode ser produzida introduzindo DNA recombinante no genoma da planta. Quando tal DNA recombinante é incorporado no genoma da planta transgênica, progenia da planta também pode compreender o DNA recombinante. Uma planta de progenia que compreende pelo menos uma porção do DNA recombinante de pelo menos uma planta transgênica progenitora também é uma planta transgênica.

[0050] A presente invenção fornece a linhagem de arroz resistente a herbicida e plantas desta conhecidas como IMINTA 16. Um depósito de pelo menos 250 sementes de IMINTA 16 foi feito para o depósito de patente de NCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland, UK em 5 de Janeiro de 2005 e concedido Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262. Devido a uma escassez de sementes da linhagem IMINTA 16 no momento de depósito, menos do que 2500 sementes da linhagem IMINTA 16 foram submetidas a NCIMB Ltd. antes de depósito. Requerentes irão fornecer sementes adicionais da linhagem IMINTA 16 para atingir um total de pelo menos 2500 sementes à medida que as sementes se tornem disponíveis. Estes depósitos serão mantidos sob os termos do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para os Propósitos de Procedimento de Patente. O depósito das sementes de IMINTA 16 foi feito por um termo de pelo menos 30 anos e pelo menos 5 anos depois do requerimento mais recente para o fornecimento de uma amostra daquele depósito ser recebido por NCIMB Ltd. Adicionalmente, Requerentes satisfizeram todos os requerimentos de 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809, incluindo fornecer uma indicação da viabilidade da amostra.

[0051] A presente invenção fornece plantas de arroz resistentes a herbicida da linhagem IMINTA 16 que foram produzidas por uma indução de mutação. Plantas de arroz tipo selvagem foram mutagenizadas expondo as plantas a um mutagênico, particularmente um mutagênico químico, mais particularmente azida de sódio. Entretanto, a presente invenção não é limitada a plantas de arroz resistentes a herbicida que são produzidas por um método de mutagênese envolvendo o mutagênico químico azida de sódio. Qualquer método de mutagênese conhecido na arte pode ser usado para produzir as plantas de arroz resistentes a herbicida da presente invenção.

[0052] Tais métodos de mutagênese podem envolver, por exemplo, o uso de qualquer um ou mais dos seguintes mutagênicos: radiação, tal como raios-X, raios Gamma (e.g., cobalto 60 ou césio 137), nêutrons, (e.g., produto de fissão nuclear por urânio 235 em um reator atômico), radiação Beta (e.g., emitida de radioisótopos tal como fósforo 32 ou carbono 14), e radiação ultravioleta (preferivelmente de 2500 a 2900 nm), e mutagênicos químicos tal como análogos de base (e.g., 5-bromo-uracil), compostos relacionados (e.g., 8-etoxi cafeína), antibióticos (e.g., estreptonigrina), agentes alquilantes (e.g., mostardas de enxofre, mostardas de nitrogênio, epóxidos, etilenoaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso, etil metanosulfonato (EMS), ou acridinas. Plantas resistentes a herbicida também podem ser produzidas usando métodos de cultura de tecido para selecionar células vegetais compreendendo mutações de resistência a herbicida e então regenerando plantas resistentes a herbicida a partir destas. Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 5.773.702 e 5.859.348, ambas as quais são neste lugar incorporadas em sua totalidade por referência. Detalhes adicionais de indução de mutação podem ser encontrados em "Principals of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company a descrição da qual é incorporada neste lugar por referência.

[0053] Análise do gene AHASL1 das plantas de arroz de linhagem IMINTA 16 revelou uma mutação pontual. No gene AHASL1 de IMINTA 16, a mutação pontual resulta na substituição de uma valina pela alanina que é encontrada em posição de aminoácido 179 na seqüência de aminoácidos de AHASL1 tipo selvagem No. de Acesso de GenBank AB049822. Assim, a presente invenção descreve que substituir outro aminoácido pela alanina em posição de aminoácido 179 da proteína AHASL1 de arroz pode causar uma planta de arroz ter resistência aumentada a um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona e/ou sulfoniluréia. Como descrito em Exemplo 3 abaixo, alanina 179 é encontrada em uma região conservada de proteínas AHASL e foram descritas outras substituições de aminoácidos pela alanina em 179 que são conhecidas por conferirem resistência a herbicida em uma planta que compreende uma tal proteína AHASL. Por conseguinte, as plantas de arroz resistentes a herbicida da invenção incluem, mas não são limitadas àquelas plantas de arroz que compreendem em seus genomas pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo AHASL1 que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida que compreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ou posição equivalente.

[0054] As plantas de arroz da invenção adicionalmente incluem plantas que compreendem, em relação à proteína AHASL1 tipo selvagem, um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ou posição equivalente e uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais na proteína AHASL1 em relação à proteína AHASL1 tipo selvagem, em que uma tal planta de arroz tem resistência aumentada para pelo menos um herbicida quando comparado a uma planta de arroz tipo selvagem. Tais substituições de aminoácidos adicionais incluem, mas não são limitadas a: uma treonina em posição de aminoácido 96 ou posição equivalente; uma alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ou serina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente; uma leucina em posição de aminoácido 548 ou posição equivalente; e uma asparagina, treonina, ou fenilalanina em posição de aminoácido 627 ou posição equivalente.

[0055] A presente invenção fornece proteínas AHASL1 com substituições de aminoácidos em particular posições de aminoácidos dentro de regiões conservadas das proteínas AHASL1 de arroz descritas neste lugar. A menos que de outra maneira indicado neste lugar, posições de aminoácidos particulares se referem à posição daquele aminoácido nas seqüências de aminoácidos de AHASL1 de arroz de comprimento completo estabelecidas na SEQ ID NO:2. Além disso, aqueles de habitual verso na arte irão reconhecer que tais posições de aminoácidos podem variar dependendo se os aminoácidos são adicionados ou removidos de, por exemplo, a extremidade N-terminal de uma seqüência de aminoácidos. Assim, a invenção abrange as substituições amino na posição referida ou posição equivalente (e.g., "posição de aminoácido 179 ou posição equivalente"). Por "posição equivalente" é pretendido significar uma posição que está dentro da mesma região conservada que a posição de aminoácido exemplificada. Exemplos de tais regiões conservadas são fornecidos em Tabela 2 abaixo.

[0056] Em adição, a presente invenção fornece polipeptídeos AHASL1 de arroz compreendendo um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ou posição equivalente e uma ou mais substituições de aminoácidos adicionais na proteína AHASL1, em relação à proteína AHASL1 tipo selvagem, em que polipeptídeo AHASL1 compreende atividade de AHAS tolerante a herbicida, quando comparado à atividade de AHAS de um AHASL1 tipo selvagem. Estas substituições de aminoácidos incluem, mas não são limitadas, àquelas que são conhecidas por conferir resistência em uma planta para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona e/ou um herbicida de sulfoniluréia. Tais substituições de aminoácidos adicionais incluem, mas não são limitadas a: uma treonina em posição de aminoácido 96 ou posição equivalente; uma alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ou serina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente; uma leucina em posição de aminoácido 548 ou posição equivalente; e uma asparagina, treonina, ou fenilalanina em posição de aminoácido 627 ou posição equivalente. A invenção fornece adicionalmente polinucleotídeos isolados codificando tais polipeptídeos AHASL1, assim como cassetes de expressão, vetores de transformação, células hospedeiras transformadas, plantas transformadas, e métodos compreendendo tais polinucleotídeos.

[0057] A presente invenção fornece métodos para estimular a tolerância ou resistência de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou outra célula hospedeira para pelo menos um herbicida que interfere na atividade da enzima AHAS. Preferivelmente, um tal herbicida inibindo AHAS é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, um herbicida de sulfonilaminocarboniltriazolino, ou mistura destes. Mais preferivelmente, um tal herbicida é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, ou mistura destes. Para a presente invenção, os herbicidas de imidazolinona incluem, mas não são limitados a, PURSUIT® (imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquin), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), um derivado de qualquer dos herbicidas acima mencionados, e uma mistura de dois ou mais dos herbicidas acima mencionados, por exemplo, imazapir/imazamox (ODYSSEYS).

[0058] Mais especificamente, o herbicida de imidazolinona pode ser selecionado a partir de, mas não é limitado a, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5- oxo-2-imidiazolin-2-i1)-nicotínico, ácido [2-(4-isopropil)-4-[metil-5-oxo-2- imidazolin-2-i1)-3-quinolinacarboxílico], ácido [5etil-2-(4-isopropil-] 4-metil- 5-oxo-2-imidazolin-2-i1)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)- nicotínico, ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5- oxo-2-] imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de metil [6-(4- isopropil-4]-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato e metil [2-(4-isopropil- 4-metil-5-] oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato. O uso de ácido 5-etil-2-(4- isopropil-4-metil-5-oxo- 2-imidazolin-2-il)-nicotínico e ácido [2-(4-isopropil- 4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-] il)-5-(metoximetil)- nicotínico é preferido. O uso de ácido [2-(4-isopropil-4]-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5- (metoximetil)-nicotínico é particularmente preferido.

[0059] Para a presente invenção, os herbicidas de sulfoniluréia incluem, mas não são limitados a, clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, azimsulfuron, ciclosulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron metil, foramsulfuron, iodosulfuron, oxasulfuron, mesosulfuron, prosulfuron, sulfosulfuron, trifloxisulfuron, tritosulfuron, um derivado de qualquer dos herbicidas acima mencionados, e uma mistura dois ou mais dos herbicidas acima mencionados. Os herbicidas de triazolopirimidina da invenção incluem, mas não são limitados a, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, e penoxsulam. Os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato da invenção incluem, mas não são limitados a, bispiribac, piritiobac, piriminobac, piribenzoxim e piriftalid. Os herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona incluem, mas não são limitados a, flucarbazona e propoxicarbazona.

[0060] É reconhecido que herbicidas de pirimidiniloxibenzoato são intimamente relacionados aos herbicidas de pirimidiniltiobenzoato e são generalizados sob o título do último nome pela Weed Science Society of America. Por conseguinte, os herbicidas da presente invenção incluem adicionalmente herbicidas de pirimidiniltiobenzoato, incluindo, mas não limitados a, os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato descritos acima.

[0061] A presente invenção fornece métodos para estimular atividade de AHAS em uma planta compreendendo transformar uma planta com um construto de polinucleotídeo compreendendo um promotor operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 da invenção. Os métodos envolvem introduzir um construto de polinucleotídeo da invenção em pelo menos uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir desta. Os métodos envolvem o uso de um promotor que é capaz de acionar expressão de gene em uma célula vegetal. Preferivelmente, um tal promotor é um promotor constitutivo ou um promotor tecido-específico. Os métodos encontram uso em estimular ou aumentar a resistência de uma planta para pelo menos um herbicida que interfere na atividade catalítica da enzima AHAS, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia.

[0062] A presente invenção fornece cassetes de expressão para expressar os polinucleotídeos da invenção em plantas, tecidos vegetais, células vegetais, e outras células hospedeiras. Os cassetes de expressão compreendem um promotor expressável na planta, tecido vegetal, célula vegetal, ou outras células hospedeiras de interesse operavelmente ligado a um polinucleotídeo da invenção que compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando ou uma proteína AHASL1 de comprimento completo (i.e. incluindo o peptídeo de trânsito de cloroplasto) ou madura (i.e. sem o peptídeo de trânsito de cloroplasto). Se expressão é desejada nos plastídeos ou cloroplastos de plantas ou células vegetais, o cassete de expressão também pode compreender uma seqüência tendo como alvo cloroplasto operavelmente ligada que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto.

[0063] Os cassetes de expressão da invenção encontram uso em um método para reforçara tolerância a herbicida de uma planta ou uma célula hospedeira. O método envolve transformar a planta ou célula hospedeira com um cassete de expressão da invenção, em que o cassete de expressão compreende um promotor que é expressável na planta ou célula hospedeira de interesse e o promotor é operavelmente ligado a um polinucleotídeo da invenção que compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL1 resistente a imidazolinona da invenção.

[0064] O uso do termo "construtos de polinucleotídeos" neste lugar não é pretendido para limitar a presente invenção a construtos de polinucleotídeos compreendendo DNA. Aqueles de habitual verso na arte irão reconhecer que construtos de polinucleotídeos, particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeos, compreendidos de ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxiribonucleotídeos também podem ser empregadas nos métodos descritos neste lugar. Assim, os construtos de polinucleotídeos da presente invenção abrangem todos os construtos de polinucleotídeos que podem ser empregados nos métodos da presente invenção para transformar plantas incluindo, mas não limitados a, aqueles compreendidos de desoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e combinações destes. Tais desoxiribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto moléculas naturalmente ocorrentes como análogos sintéticos. Os construtos de polinucleotídeos da invenção também abrangem todas as formas de construtos de polinucleotídeos incluindo, mas não limitadas a, formas de fita simples, formas de dupla fita, formas de grampo de cabelo, estruturas de hastes e alças, e os semelhantes. Além disso, é entendido por aqueles de habitual verso na arte que cada seqüência de nucleotídeos descrita neste lugar também abrange o complemento daquela seqüência de nucleotídeos exemplificada.

[0065] Além disso, é reconhecido que os métodos da invenção podem empregar um construto de polinucleotídeo que é capaz de direcionar, em uma planta transformada, a expressão de pelo menos uma proteína, ou pelo menos um RNA, tal como, por exemplo, um RNA antisentido que é complementar a pelo menos uma porção de um mRNA. Tipicamente um tal construto de polinucleotídeo é compreendido de uma seqüência de codificação para uma proteína ou RNA operavelmente ligado a regiões reguladoras transcricionais 5' e 3'. Alternativamente, também é reconhecido que os métodos da invenção podem empregar um construto de polinucleotídeo que não é capaz de direcionar, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou RNA.

[0066] Ademais, é reconhecido que, para expressão de um polinucleotídeo da invenção em uma célula hospedeira de interesse, o polinucleotídeo é tipicamente operavelmente ligado a um promotor que é capaz de acionar expressão de gene na célula hospedeira de interesse. Os métodos da invenção para expressar os polinucleotídeos em células hospedeiras não dependem de promotor particular. Os métodos abrangem o uso de qualquer promotor que é conhecido na arte e que é capaz de acionar expressão de gene na célula hospedeira de interesse.

[0067] A presente invenção abrange moléculas de polinucleotídeo AHASL1 e fragmentos e variantes destas. Moléculas de polinucleotídeo que são fragmentos destas seqüências de nucleotídeos também são abrangidas pela presente invenção. Por "fragmento" é pretendido uma porção da seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL1 da invenção. Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 da invenção pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL1, ou ele pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR usando métodos descritos abaixo. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL1 pode ser preparada isolando uma porção de uma das seqüências de nucleotídeos de AHASL1 da invenção, expressando a porção codificada da proteína AHASL1 (e.g., por expressão recombinante in vitro), e verificando a atividade da porção codificada da proteína AHASL1. Moléculas de polinucleotídeo que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ou 1950 nucleotídeos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma seqüência de nucleotídeos de comprimento completo descrita neste lugar (por exemplo, 1961 e 1932 nucleotídeos para SEQ ID NOS: 1 e 3, respectivamente) dependendo do uso pretendido.

[0068] Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL1 da invenção irá codificar pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, ou 625 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína AHASL1 de comprimento completo da invenção (por exemplo, 644 aminoácidos para SEQ ID NO:2). Fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 que são úteis como sondas de hibridização para iniciadores de PCR geralmente não necessitam codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL1.

[0069] Moléculas de polinucleotídeo que são variantes das seqüências de nucleotídeos descritas neste lugar também são abrangidas pela presente invenção. "Variantes" das seqüências de nucleotídeos de AHASL1 da invenção incluem aquelas seqüências que codificam as proteínas AHASL1 descritas neste lugar mas que diferem conservativamente por causa da degenerescência do código genético. Estas variantes alélicas naturalmente ocorrentes podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tal como reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização como esboçado abaixo. Seqüências de nucleotídeos variantes também incluem seqüências de nucleotídeos derivadas sinteticamente que foram geradas, por exemplo, usando mutagênese sítio acionada mas que ainda codificam a proteína AHASL1 descrita na presente invenção como discutido abaixo. Geralmente, variantes de seqüência de nucleotídeos da invenção terão pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma seqüência de nucleotídeos particular descrita neste lugar. Uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 variante irá codificar uma proteína AHASL1, respectivamente, que tem uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a seqüência de aminoácidos de uma proteína AHASL1 descrita neste lugar.

[0070] Em adição, o artesão versado irá adicionalmente perceber que mudanças podem ser introduzidas por mutação nas seqüências de nucleotídeos da invenção levando com isso a mudanças na seqüência de aminoácidos das proteínas AHASL1 codificadas sem alterar a atividade biológica da proteína AHASL1s. Assim, uma molécula isolada de polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL1 tendo uma seqüência que difere daquela de SEQ ID NOS: 1 ou 3, respectivamente, pode ser criada introduzindo uma ou mais substituições, adições, ou deleções de nucleotídeo na seqüência de nucleotídeos correspondente descrita neste lugar, de forma que uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos são introduzidas na proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tal como mutagênese sítio acionada e mutagênese mediada por PCR. Tais seqüências de nucleotídeos variantes também são abrangidas pela presente invenção.

[0071] Por exemplo, preferivelmente, substituições de aminoácidos conservativas podem ser feitas em um ou mais previstos, preferivelmente resíduos de aminoácidos não essenciais. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da seqüência tipo selvagem de uma proteína AHASL1 (e.g., a seqüência de SEQ ID NO:2) sem alterar a atividade biológica, ao passo que um resíduo de aminoácido "essencial" é requerido para atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (e.g., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (e.g., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (e.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (e.g., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos residindo dentro de um motivo conservado.

[0072] As proteínas da invenção podem ser alteradas de várias maneiras incluindo substituições, deleções, truncamentos, e inserções de aminoácidos. Métodos para tais manipulações geralmente são conhecidos na arte. Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácidos das proteínas AHASL1 podem ser preparadas por mutações no DNA. Métodos para mutagênese e alterações de seqüência de nucleotídeos são bem conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Patente Norte- Americana No. 4.873.192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova Iorque) e as referências citadas nestes. Orientação como para substituições de aminoácidos apropriadas que não afetam atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), neste lugar incorporado por referência. Substituições conservativas, tal como trocar um aminoácido por outro tendo propriedades similares, pode ser preferível.

[0073] Alternativamente, seqüências de nucleotídeos de AHASL1 variantes podem ser feitas introduzindo mutações aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüência de codificação de AHASL1, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser monitorados para atividade de AHAS para identificar mutantes que retêm atividade de AHAS, incluindo atividade de AHAS resistente a herbicida. Seguindo mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa recombinantemente, e a atividade da proteína pode ser determinada usando técnicas de ensaio padrão.

[0074] Assim, as seqüências de nucleotídeos da invenção incluem as seqüências descritas neste lugar assim como fragmentos e variantes destas. As seqüências de nucleotídeos de AHASL1 da invenção, e fragmentos e variantes destas, podem ser usadas como sondas e/ou iniciadores para identificar e/ou clonar homólogos de AHASL em outras plantas. Tais sondas podem ser usadas para detectar transcritos ou seqüências genômicas codificando as mesmas proteínas ou idênticas.

[0075] Desta maneira, métodos tal como PCR, hibridização, e os semelhantes podem ser usados para identificar tais seqüências tendo identidade substancial com as seqüências da invenção. Veja, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Seqüências de nucleotídeos de AHASL isoladas baseado na sua identidade de seqüência com as seqüências de nucleotídeos de AHASL1 estabelecidas neste lugar ou com fragmentos e variantes destas são abrangidas pela presente invenção.

[0076] Em um método de hibridização, toda ou parte de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 conhecida pode ser usada para monitorar cDNA ou bibliotecas genômicas. Métodos para construção de tal cDNA e bibliotecas genômicas são geralmente conhecido na arte e são descritos em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). As assim chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadas com um grupo detectável tal como 32P, ou qualquer outro marcador detectável, tal como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator de enzima. Sondas para hibridização podem ser feitas marcando oligonucleotídeos sintéticos baseado na seqüência de nucleotídeos de AHASL1 conhecida descrita neste lugar. Iniciadores degenerados projetados com base em nucleotídeos conservados ou resíduos de aminoácidos em uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 conhecida ou seqüência de aminoácidos codificada podem adicionalmente ser usadas. A sonda tipicamente compreende uma região de seqüência de nucleotídeos que hibridiza em condições estringentes com pelo menos cerca de 12, preferivelmente cerca de 25, mais preferivelmente cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, ou 1800 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 da invenção ou um fragmento ou variante desta. Preparação de sondas para hibridização é geralmente conhecida na arte e é descrita em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), neste lugar incorporado por referência.

[0077] Por exemplo, a seqüência inteira de AHASL1 descrita neste lugar, ou uma ou mais porções desta, pode ser usada como uma sonda capaz de especificamente hibridizar com seqüências de AHASL1 correspondentes e RNAs mensageiros. Técnicas de hibridização incluem triagem por hibridização de bibliotecas de DNA emplacadas (ou placas ou colônias; veja, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque)).

[0078] Hibridização de tais seqüências pode ser realizada em condições estringentes. Por "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" é pretendido condições nas quais uma sonda irá hibridizar com sua seqüência alvo para um grau detectavelmente maior do que para outras seqüências (e.g., pelo menos 2-vezes sobre base). Condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes.

[0079] Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal émenos do que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (e.g., 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (e.g., maior do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser atingidas com a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida. Condições de baixa estringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaC1, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M de NaC1/0,3 M de citrato trissódico) a 50 a 55°C. Condições de moderada estringência exemplares incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaC1, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC a 55 a 60°C. Condições de alta estringência exemplares incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M de NaC1, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,1X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração de hibridização é geralmente menos do que cerca de 24 horas, normalmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[0080] Especificidade é tipicamente a função de lavagens pós- hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA-DNA, a T., pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) -0,61 (% de forma)-500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de forma é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A T., é a temperatura (em força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente compatível. T., é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de desigualdade; assim, Tm, condições de hibridização, e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com seqüências da identidade desejada. Por exemplo, se seqüências com >90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída 10°C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para ser cerca de 5°C menor do que o ponto térmico de fusão (Tm) para a seqüência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C menor do que o ponto de fusão térmica (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10°C menor do que o ponto de fusão térmica (T.); condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20°C menor do que o ponto de fusão térmica (T.). Usando a equação, composições de hibridização e lavagem, e Tm desejada, aqueles de habitual verso irão entender que variações na estringência de soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de desigualdade resulta em uma T. de menos do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferido aumentar a concentração de SSC para que uma temperatura maior possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nova Iorque). Veja Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque).

[0081] É reconhecido que as moléculas de polinucleotídeo e proteínas da invenção abrangem moléculas de polinucleotídeo e proteínas compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ou de aminoácidos que é suficientemente idêntica à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 1, 3, 4, e/ou 6, ou à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 e/ou 5. O termo "suficientemente idêntica" é usado neste lugar para se referir a uma primeira seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (e.g., com uma cadeia lateral similar) a uma segunda seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos de forma que a primeira e segunda seqüências de aminoácidos ou de nucleotídeos têm um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum. Por exemplo, seqüências de aminoácidos ou de nucleotídeos que contêm um domínio estrutural comum tendo pelo menos cerca de 45%, 55%, ou 65% de identidade, preferivelmente 75% de identidade, mais preferivelmente 85%, 95%, ou 98% de identidade são definidas neste lugar como suficientemente idênticas.

[0082] Para determinar a identidade percentual de duas seqüências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as seqüências são alinhadas para propósitos de comparação ótima. A identidade percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhado pelas seqüências (i.e., identidade percentual = número de posições idênticas/número total de posições (e.g., posições sobrepostas) x 100). Em uma forma de realização, as duas seqüências são do mesmo comprimento. A identidade percentual entre duas seqüências pode ser determinada usando técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem permitir lacunas. Ao calcular identidade percentual, compatibilidade tipicamente exatas são contadas.

[0083] A determinação de identidade percentual entre duas seqüências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como em Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Um tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, escore = 100, extensão de palavra = 12, para obter seqüências de nucleotídeos homólogas às moléculas de polinucleotídeo da invenção. Buscas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, extensão de palavra = 3, para obter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteínas da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma busca repetida que detecta relações distantes entre moléculas. Veja Altschul et al. (1997) supra. Quando utilizando programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI- Blast, os parâmetros padrão dos programas respectivos (e.g., XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Veja http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de seqüências é o algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17. m tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que é parte do pacote de aplicativo computacional de alinhamento de seqüência GCG. Quando utilizando o programa ALIGN para comparar seqüências de aminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12, e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usadas. Alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

[0084] A menos que de outra forma determinado, valores de identidade/similaridade de seqüência fornecidos neste lugar se referem ao valor obtido usando as seqüências de comprimento completo da invenção e usando alinhamento múltiplo por meio do algoritmo Clustal W (Nucleic Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994) usando o programa AlignX incluído no pacote de aplicativo computacional Vector NTI Suite Versão 7 (InforMax, Inc., Bethesda, MD, USA) usando os parâmetros padrão; ou qualquer programa equivalente deste. Por "programa equivalente" é pretendido qualquer programa de comparação de seqüências que, para quaisquer duas seqüências em questão, fornece um alinhamento tendo compatibilidades idênticas de nucleotídeo ou resíduo de aminoácido e uma identidade de seqüência percentual idêntica quando comparado ao alinhamento correspondente gerado por AlignX no pacote de aplicativo computacional Vector NTI Suite Versão 7.

[0085] As seqüências de nucleotídeos de AHASL1 da invenção incluem tanto as seqüências naturalmente ocorrentes assim como formas mutantes, particularmente formas mutantes que codificam proteínas AHASL1 compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida. Da mesma maneira, as proteínas da invenção abrangem tanto proteínas naturalmente ocorrentes assim como variações e formas modificadas destas. Tais variantes continuarão a possuir a atividade de AHAS desejada. Obviamente, as mutações que serão feitas no DNA codificando a variante não devem colocar a seqüência fora de quadro de leitura e preferivelmente não criarão regiões complementares que poderiam produzir estrutura secundária de mRNA. Veja, Publicação de Pedido de Patente Européia No. 75.444.

[0086] As deleções, inserções, e substituições das seqüências de proteínas abrangidas neste lugar não são esperadas produzirem mudanças radicais nas características da proteína. Entretanto, quando é difícil prever o efeito exato da substituição, deleção, ou inserção antecipadamente a fazê-lo, alguém versado na arte irá perceber que o efeito será avaliado por ensaios de triagem de rotina. Isto é, a atividade pode ser avaliada por ensaios de atividade de AHAS. Veja, por exemplo, Singh et al. (1988) Anal. Biocheni. 171:173-179, neste lugar incorporado por referência.

[0087] Seqüências de nucleotídeos e proteínas variantes também abrangem seqüências e proteínas derivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênico tal como embaralhamento de DNA. Com um tal procedimento, uma ou mais diferentes seqüências de codificação de AHASL podem ser manipuladas para criar uma nova proteína AHASL possuindo as propriedades desejadas.

[0088] Desta maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de seqüência relacionada compreendendo regiões de seqüência que têm identidade de seqüência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando esta abordagem, motivos de seqüências codificando um domínio de interesse podem ser recombinados entre o gene AHASL1 da invenção e outros genes AHASL conhecidos para obter um novo gene codificando para uma proteína com uma propriedade melhorada de interesse, tal como um Km aumentado no caso de uma enzima. Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na arte. Veja, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288291; e Patente Norte-Americana Nos. 5.605.793 e 5.837.458.

[0089] As seqüências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas para isolar seqüências correspondentes de outros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente outras dicotiledôneas. Desta maneira, métodos tal como PCR, hibridização, e os semelhantes podem ser usados para identificar tais seqüências com base na sua homologia de seqüência com as seqüências expostas neste lugar. Seqüências isoladas baseado na sua identidade de seqüência com as seqüências inteiras de AHASL1 expostas neste lugar ou com fragmentos destas são abrangidas pela presente invenção. Assim, seqüências isoladas que codificam para uma proteína AHASL e que hibridizam em condições estringentes com a seqüência descrita neste lugar, ou com fragmentos desta, são abrangidas pela presente invenção.

[0090] Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeos podem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar seqüências de DNA correspondentes de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem por PCR são geralmente conhecidos na arte e são descritos em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque). Veja também Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Iorque). Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não são limitados a, métodos usando iniciadores pareados, pares de iniciadores, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados, iniciadores gene-específicos, iniciadores vetor-específicos, iniciadores parcialmente incompatíveis, e os semelhantes.

[0091] As seqüências de polinucleotídeos de AHASL1 da invenção são fornecidos em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. O cassete irá incluir seqüências reguladoras 5' e 3' operavelmente ligadas a uma seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 da invenção. Por "operavelmente ligada" é pretendida uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda seqüência, em que a seqüência de promotor inicia e media transcrição da seqüência de DNA correspondente à segunda seqüência. Geralmente, operavelmente ligadas significa que as seqüências de ácidos nucleicos sendo ligadas são contíguas e, onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e no mesmo quadro de leitura. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional para ser co-transformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode ser fornecido em múltiplos cassetes de expressão.

[0092] Um tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis.

[0093] O cassete de expressão irá incluir na direção 5'-3' de transcrição, uma região de iniciação transcricional e traducional (i.e., um promotor), uma seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 da invenção, e uma região de terminação transcricional e traducional (i.e., região de terminação) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou exógeno ou heterólogo, para o hospedeiro vegetal e/ou para a seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a seqüência natural ou alternativamente uma seqüência sintética. Onde o promotor é "exógeno" ou "heterólogo" para o hospedeiro vegetal, é pretendido que o promotor não seja encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Onde o promotor é "exógeno" ou "heterólogo" para a seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 da invenção, é pretendido que o promotor não seja o promotor nativo ou naturalmente ocorrente para a seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 operavelmente ligada da invenção. Como usado neste lugar, um gene quimérico compreende uma seqüência de codificação operavelmente ligada a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga para a seqüência de codificação.

[0094] Embora possa ser preferível expressar os polinucleotídeos AHASL1 da invenção usando promotores heterólogos, as seqüências de promotor nativo podem ser usadas. Tais construtos mudariam níveis de expressão da proteína AHASL1 na planta ou célula vegetal. Assim, o fenótipo da planta ou célula vegetal é alterado.

[0095] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com a seqüência AHASL1 operavelmente ligada de interesse, pode ser nativa com o hospedeiro vegetal, ou pode ser derivada de outra fonte (i.e., exógena ou heteróloga para o promotor, a seqüência de polinucleotídeos de AHASL1 de interesse, o hospedeiro vegetal, ou qualquer combinação destes). Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo-Ti de A. tuinefaciens, tal como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[0096] Onde apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para expressão aumentada na planta transformada. Isto é, os genes podem ser sintetizados usando códons preferidos de plantas para expressão melhorada. Veja, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão de uso de códon preferido de hospedeiro. Métodos estão disponíveis na arte para sintetizar genes preferidos de plantas. Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 5.380.831, e 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, neste lugar incorporados por referência.

[0097] Modificações adicionais de seqüência são conhecidas por estimular expressão de gene em um hospedeiro celular. Estas incluem eliminação de seqüências codificando sinais de poliadenilação artificiais, sinais de sítio de corte de éxon-íntron, repetições tipo transposon, e outras tais seqüências bem caracterizadas que podem ser deletérias para expressão de gene. O teor de G-C da seqüência pode ser ajustado para média de para um dado hospedeiro celular, quando calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a seqüência é modificada para evitar estruturas secundárias de mRNA de grampo de cabelo previstas.

[0098] Seqüências de nucleotídeos para estimular expressão de gene também podem ser usadas nos vetores de expressão de plantas. Estas incluem os íntrons do Adhl de milho, gene intronl (Callis et al. Genes and Development 1:1183-1200, 1987), e seqüências líder, (seqüência W) do Vírus do Mosaico de Tabaco (TMV), Vírus da Mancha Clorótica de Milho e Vírus do Mosaico de Alfafa (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 e Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). O primeiro íntron do locus shrunken-1 de milho, foi mostrado aumentar expressão de genes em construtos de gene quimérico. Patente Norte-Americana Nos. 5.424.412 e 5.593.874 descreve o uso de íntrons específicos em construtos de expressão de gene, e Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) também mostrou que íntrons são úteis para regular expressão de gene em uma base específica para tecido. Para estimular adicionalmente ou para otimizar expressão de gene de subunidade pequena de AHAS, os vetores de expressão de plantas da invenção também podem conter seqüências de DNA contendo regiões de interação com a matriz (MARs). Células vegetais transformadas com tais sistemas de expressão modificados, então, podem exibir superexpressão ou expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos da invenção.

[0099] Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter seqüências líder 5' no construto de cassete de expressão. Tais seqüências líder podem atuar para estimular tradução. Líderes de tradução são conhecidos na arte e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região não codificante 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus Etch do Tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), líder de MDMV (Vírus do Mosaico do Nanismo de Milho) (Virology 154:920), e proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido do mRNA de proteína de revestimento de vírus do mosaico de alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder de vírus do mosaico de tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nova Iorque), pp. 237-256); e líder de vírus da mancha clorótica de milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Veja também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Outros métodos conhecidos por estimularem tradução também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons, e os semelhantes.

[00100] Ao preparar o cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de forma a sustentar as seqüências de DNA na orientação apropriada e, se apropriado, no quadro de leitura apropriado. Para este fim, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para sustentar sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição, ou os semelhantes. Para este propósito, mutagênese in vitro, reparo de iniciador, restrição, anelamento, re- substituições, e.g., transições e transversões, podem estar envolvidos.

[00101] Diversos promotores podem ser usados na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados baseado no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, tecido-preferidos, ou outros para expressão em plantas.

[00102] Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor do core do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos descritos em WO 99/43838 e Patente Norte-Americana No. 6.072.050; o promotor do core CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. AppL Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente Norte-Americana No. 5.659.026), e os semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, Patente Norte- Americana Nos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611.

[00103] Promotores tecido-específicos podem ser utilizados para direcionar expressão de AHASL1 estimulada dentro de um tecido vegetal particular. Tais promotores tecido-específicos incluem, mas não são limitados a, promotores preferidos por folha, promotores preferidos por raiz, promotores preferidos por semente, e promotores preferidos por caule. Promotores tecido-específicos incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results ProbL Cell Differ. 20:181196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca.

[00104] Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos de interesse são direcionados para o cloroplasto para expressão. Desta maneira, onde o ácido nucleico de interesse não é diretamente inserido no cloroplasto, o cassete de expressão irá adicionalmente conter uma seqüência tendo como alvo cloroplasto compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto para direcionar o produto de gene de interesse para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na arte. Com respeito a seqüências tendo como alvo cloroplastos, "operavelmente ligadas" significa que a seqüência de ácidos nucleicos codificando um peptídeo de trânsito (i.e., a seqüência tendo como alvo cloroplasto) é ligada ao polinucleotídeo AHASL1 da invenção de forma que as duas seqüências são contíguas e no mesmo quadro de leitura. Veja, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Comnzun. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Embora as proteínas AHASL1 da invenção incluam um peptídeo de trânsito de cloroplasto nativo, qualquer peptídeo de trânsito de cloroplasto conhecido na arte pode ser fusionado à seqüência de aminoácidos de uma proteína AHASL1 madura da invenção operavelmente ligando uma seqüência tendo como alvo cloroplasto à extremidade 5' de uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL1 madura da invenção.

[00105] Seqüências tendo como alvo cloroplasto são conhecidas na arte e incluem a subunidade pequena de cloroplasto de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant MoL Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991)1 Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5- (enolpiruvil)shikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); triptofano sintase (Zhao et al. (1995)1 Biol. Chem. 270(11):6081-6087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) Biol. Chem. 272(33):20357-20363); corismato sintase (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); e a proteína de ligação de clorofila coletora de luz a/b (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:1499614999). Veja também Von Heijne et al. (1991) Plant MoL Biol. Rep. 9:104126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. COMMUll. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

[00106] Métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método se pauta em liberação por canhão de partículas de DNA contendo um marcador selecionável e direcionando o DNA para o genoma de plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente, transformação de plastídeo pode ser realizada por transativação de um transgene silencioso gerado em plastídeo por expressão tecido-preferida de uma RNA polimerase nuclear- codificada e direcionada por plastídeo. Um tal sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

[00107] Os ácidos nucleicos de interesse a serem direcionados para o cloroplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto para considerar diferenças em uso de códon entre o núcleo vegetal e esta organela. Desta maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferidos de cloroplasto. Veja, por exemplo, Patente Norte- Americana No. 5.380.831, neste lugar incorporada por referência.

[00108] Como descrito neste lugar, as seqüências de nucleotídeos de AHASL1 da invenção encontram uso em estimular a tolerância a herbicida de plantas que compreendem em seus genomas um gene codificando uma proteína AHASL1 tolerante a herbicida. Um tal gene pode ser um gene endógeno ou um transgene. Adicionalmente, em certas formas de realização, as seqüências de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser sobrepostas com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeos de interesse a fim de criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser sobrepostos com quaisquer outros polinucleotídeos codificando polipeptídeos tendo atividade de pesticida e/ou inseticida, tal como, por exemplo, as proteínas de toxina de Bacillus thuringiensis (descritas em Patente Norte-Americana Nos. 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109). As combinações geradas também podem incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse.

[00109] É reconhecido que com estas seqüências de nucleotídeos, construções antisentido, complementares a pelo menos uma porção do RNA mensageiro (mRNA) para as seqüências de polinucleotídeos de AHASL1 podem ser construídas. Nucleotídeos antisentido são construídos para hibridizar com o mRNA correspondente. Modificações das seqüências antisentido podem ser feitas contanto que as seqüências hibridizem com e interfiram em expressão do mRNA correspondente. Desta maneira, construções antisentido tendo 70%, preferivelmente 80%, mais preferivelmente 85% de identidade de seqüência com as seqüências antisentido correspondentes podem ser usadas. Além disso, porções dos nucleotídeos antisentido podem ser usadas para interromper a expressão do gene alvo. Geralmente, seqüências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, ou mais podem ser usadas.

[00110] As seqüências de nucleotídeos da presente invenção também podem ser usadas na orientação sentido para suprimir a expressão de genes endógenos em plantas. Métodos para suprimir expressão de gene em plantas usando seqüências de nucleotídeos na orientação sentido são conhecidos na arte. Os métodos geralmente envolvem transformar plantas com um construto de DNA compreendendo um promotor que aciona expressão em uma planta operavelmente ligada à pelo menos uma porção de uma seqüência de nucleotídeos que corresponde ao transcrito do gene endógeno. Tipicamente, uma tal seqüência de nucleotídeos tem identidade de seqüência substancial com a seqüência do transcrito do gene endógeno, preferivelmente maior do que cerca de 65% de identidade de seqüência, mais preferivelmente maior do que cerca de 85% de identidade de seqüência, o mais preferivelmente maior do que cerca de 95% de identidade de seqüência. Veja, Patente Norte- Americana Nos. 5.283.184 e 5.034.323; neste lugar incorporadas por referência.

[00111] Embora os polinucleotídeos AHASL1 resistentes a herbicida da invenção encontrem uso como genes marcadores selecionáveis para transformação vegetal, os cassetes de expressão da invenção podem incluir outro gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis, incluindo aqueles da presente invenção, são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Genes marcadores incluem, mas não são limitados a, genes codificando resistência a antibiótico, tal como aqueles codificando neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes conferindo resistência a compostos de herbicida, tal como glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Veja geralmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Tais descrições são neste lugar incorporadas por referência.

[00112] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é pretendida para ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser usado na presente invenção.

[00113] As moléculas isoladas de polinucleotídeo compreendendo seqüência de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASL1 da invenção podem ser usadas em vetores para transformar plantas de forma que as plantas criadas têm resistência estimulada para herbicidas, particularmente herbicidas de imidazolinona. As moléculas isoladas de polinucleotídeo AHASL1 da invenção podem ser usadas em vetores apenas ou em combinação com uma seqüência de nucleotídeos codificando a subunidade pequena da enzima AHAS (AHASS) para conferir resistência a herbicida em plantas. Veja, Patente Norte-Americana No. 6.348.643; que é neste lugar incorporada por referência.

[00114] A invenção também se refere a um vetor de expressão de planta compreendendo um promotor que aciona expressão em uma planta operavelmente ligada a uma molécula isolada de polinucleotídeo da invenção. A molécula isolada de polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL1, particularmente uma proteína AHASL1 compreendendo uma seqüência amino que é estabelecida na SEQ ID NO:2, ou um fragmento funcional e variante desta. O vetor de expressão de planta da invenção não depende de um promotor particular, apenas que um tal promotor seja capaz de acionar expressão de gene em uma célula vegetal. Promotores preferidos incluem promotores constitutivos e promotores tecido-específicos.

[00115] Os vetores de transformação da invenção podem ser usados para produzir plantas transformadas com um gene de interesse. O vetor de transformação irá compreender um gene marcador selecionável da invenção e um gene de interesse a ser introduzido e tipicamente expresso na planta transformada. Um tal gene marcador selecionável compreende um polinucleotídeo AHASL1 resistente a herbicida da invenção operavelmente ligado a um promotor que aciona expressão em uma célula hospedeira. Para uso em plantas e células vegetais, o vetor de transformação compreende um gene marcador selecionável compreendendo um polinucleotídeo AHASL1 resistente a herbicida da invenção operavelmente ligado a um promotor que aciona expressão em uma célula vegetal.

[00116] Os genes de interesse da invenção variam dependendo do resultado desejado. Por exemplo, várias mudanças em fenótipo podem ser de interesse incluindo modificar a composição de ácidos graxos em uma planta, alterar o teor de aminoácidos de uma planta, alterar mecanismos de defesa contra inseto e/ou patógeno de uma planta, e os semelhantes. Estes resultados podem ser atingidos fornecendo expressão de produtos heterólogos ou expressão aumentada de produtos endógenos em plantas. Alternativamente, os resultados podem ser atingidos sustentando uma redução de expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou cofatores na planta. Estas mudanças resultam em uma mudança em fenótipo da planta transformada.

[00117] Em uma forma de realização da invenção, os genes de interesse incluem genes de resistência a inseto tal como, por exemplo, genes de proteína de toxina de Bacillus thuringiensis (Patente Norte-Americana Nos. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109).

[00118] As proteínas ou polipeptídeos AHASL1 da invenção podem ser purificadas a partir de, por exemplo, plantas de arroz e podem ser usadas em composições. Também, uma molécula isolada de polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL1 da invenção pode ser usada para expressar uma proteína AHASL1 da invenção em um micróbio tal como E. coli ou uma levedura. A proteína AHASL1 expressa pode ser purificada a partir de extratos de E. coli ou levedura por qualquer método conhecido por aqueles de habitual verso na arte.

[00119] A invenção também se refere a um método para criar uma planta transgênica que é resistente a herbicidas, compreendendo transformar uma planta com um vetor de expressão de planta compreendendo um promotor que aciona expressão em uma planta operavelmente ligada a uma molécula isolada de polinucleotídeo da invenção. A molécula isolada de polinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASL1 da invenção, particularmente uma proteína AHASL1 compreendendo: uma seqüência amino que é estabelecida na SEQ ID NO:2, uma seqüência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1 ou 3, ou um fragmento funcional e variante de ditas seqüências de aminoácidos.

[00120] A invenção também se refere às plantas não transgênicas de arroz, plantas transgênicasproduzidas pelos métodos da invenção, e progenia e outros descendentes de tais plantas não transgênicas e transgênicas, cujas plantas exibem resistência estimulada ou aumentada para herbicidas que interferem na enzima AHAS, particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia.

[00121] Os polinucleotídeos AHASL1 da invenção, particularmente aqueles codificando proteínas AHASL1 resistentes a herbicida, encontram uso em métodos para estimular a resistência de plantas tolerantes a herbicida. Em uma forma de realização da invenção, as plantas tolerantes a herbicida compreendem uma proteína AHASL1 tolerante a herbicida ou resistente a herbicida. As plantas tolerantes a herbicida incluem tanto plantas transformadas com uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 tolerante a herbicida como plantas que compreendem em seus genomas um gene endógeno que codifica uma proteína AHASL1 tolerante a herbicida. Seqüências de nucleotídeos codificando proteínas AHASL1 tolerantes a herbicida e plantas tolerantes a herbicida compreendendo um gene endógeno que codifica uma proteína AHASL1 tolerante a herbicida incluem os polinucleotídeos e plantas da presente invenção e aqueles que são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 5.013.659, 5.731.180, 5.767.361, 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 e 6.274.796; todas as quais são neste lugar incorporadas por referência. Tais métodos para estimular a resistência de plantas tolerantes a herbicida compreendem transformar uma planta tolerante a herbicida com pelo menos uma construção de polinucleotídeo compreendendo um promotor que aciona expressão em uma célula vegetal que é operavelmente ligado a um polinucleotídeo AHASL1 resistente a herbicida da invenção, particularmente o polinucleotídeo codificando uma proteína AHASL1 resistente a herbicida estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3 polinucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, e fragmentos e variantes ditos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida.

[00122] Numerosos vetores de transformação vegetal e métodos para transformar plantas estão disponíveis. Veja, por exemplo, An, G. et al. (1986) Plant Pysiol., 81:301-305; Fry, J., et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl. Genet.76:767-774; Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212.203-212; Cousins, et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P. P. and Slightom, J. L. (1992) Gene.118:255- 260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P:119-124; Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. and Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148; Franklin, C. I. and Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167; Golovkin, et al. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:20722078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. and Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325; e Wan, Y. C. and Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748.

[00123] Os métodos da invenção envolvem introduzir um construto de polinucleotídeo em uma planta. Por "introduzir" é pretendido apresentar à planta o construto de polinucleotídeo de uma maneira tal que o construto ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introduzir um construto de polinucleotídeo para uma planta, apenas que o construto de polinucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos para introduzir construtos de polinucleotídeos em plantas são conhecidos na arte incluindo, mas não limitados a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transitória, e métodos mediados por vírus.

[00124] Por "transformação estável" é pretendido que o construto de polinucleotídeo introduzido em uma planta se integre no genoma da planta e seja capaz de ser herdado por progenia desta. Por "transformação transitória" é pretendido que um construto de polinucleotídeo introduzido em uma planta não se integre no genoma da planta.

[00125] Para a transformação de plantas e células vegetais, as seqüências de nucleotídeos da invenção são inseridas usando técnicas padrão em qualquer vetor conhecido na arte que é adequado para expressão das seqüências de nucleotídeos em uma planta ou célula vegetal. A seleção do vetor depende da técnica de transformação preferida e da espécie de planta alvo a ser transformada. Em uma forma de realização da invenção, uma seqüência de nucleotídeos de AHASL1 é operavelmente ligada a um promotor vegetal que é conhecido por expressão de alto nível em uma célula vegetal, e este construto é então introduzido em uma planta que é susceptível a um herbicida de imidazolinona e uma planta transformada é regenerada. A planta transformada é tolerante a exposição a um nível de um herbicida de imidazolinona que iria matar ou significantemente prejudicar uma planta não transformada. Este método pode ser aplicado a qualquer espécie de planta; entretanto, ele é mais benéfico quando aplicado a plantas cultivadas, particularmente plantas cultivadas que tipicamente são crescidas na presença de pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona.

[00126] Metodologias para construir cassetes de expressão de plantas e introduzir ácidos nucleicos exógenos em plantas são geralmente conhecidas na arte e foram previamente descritas. Por exemplo, DNA exógeno pode ser introduzido em plantas, usando plasmídeos vetores indutores de tumor (Ti). Outros métodos utilizados para liberação de DNA exógeno envolvem o uso de transformação de protoplasto mediada por PEG, eletroporação, filmes de microinjeção, e biolísticas ou bombardeamento de microprojétil para absorção direta de DNA. Tais métodos são conhecidos na arte. (Patente Norte- Americana No. 5.405.765 para Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104-112; Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al., (1987) Theor. AppL Genet. 75: 30-36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., (1980) Science 208:1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). O método de transformação depende da célula vegetal a ser transformada, estabilidade de vetores usados, nível de expressão de produtos de gene e outros parâmetros.

[00127] Outros métodos adequados de introduzir seqüências de nucleotídeos em células vegetais e subseqüente inserção no genoma vegetal incluem microinjeção como Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334, eletroporação como descrito por Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium como descrito por Townsend et al., Patente Norte-Americana No. 5.563.055, Zhao et al., Patente Norte-Americana No. 5.981.840, transferência de gene direta como descrito por Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, e aceleração de partícula balística como descrito em, por exemplo, Sanford et al., Patente Norte-Americana No. 4.945.050; Tomes et al., Patente Norte-Americana No. 5,879,918; Tomes et al., Patente Norte-Americana No. 5.886.244; Bidney et al., Patente Norte-Americana No. 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); Mccabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação de Lecl (WO 00/28058). Também veja, Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); Mccabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923926 (soja); Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); Tomes, Patente Norte-Americana No. 5.240.855; Buising et al., Patente Norte-Americana Nos. 5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al. (1995) 'Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (milho); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763764; Bowen et al., Patente Norte-Americana No. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por filme); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407 -413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho através de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais são neste lugar incorporados por referência.

[00128] Os polinucleotídeos da invenção podem ser introduzidos em plantas colocando em contato plantas com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar um construto de polinucleotídeo da invenção dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral. É reconhecido que a proteína AHASL1 da invenção pode ser inicialmente sintetizada como parte de uma poliproteína viral, que pode ser depois processada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Ademais, é reconhecido que promotores da invenção também abrangem promotores utilizados para transcrição por RNA polimerases virais. Métodos para introduzir construtos de polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada nesse, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e 5.316.931; neste lugar incorporadas por referência.

[00129] As células que foram transformadas podem ser crescidas em plantas em conformidade com meios convencionais. Veja, por exemplo, Mccormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser crescidas, e ou polinizadas com a mesma linhagem transformada ou linhagens diferentes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser crescidas para assegurar que expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e então sementes coletadas para assegurar expressão da característica fenotípica desejada tenha sido atingida. Desta maneira, a presente invenção fornece semente transformada (também referida como "semente transgênica") tendo um construto de polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado no seu genoma.

[00130] A presente invenção pode ser usada para transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não limitada a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de espécies de planta de interesse incluem, mas não são limitados a, cereal ou milho (Zea mays), Brassica sp. (e.g., B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorgo bicolor, Sorgo vulgare), milheto (e.g., milheto pérola (Pennisetum glaucum), milheto miúdo (Panicum miliaceum), painço português (Setaria italica), capim pé-de-galinha (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), açafrão (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivuin, T Turgidum ssp. durum), soja (Glicina max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), mamão (Carica papaya), castanha (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterrabas açucareiras (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveias, cevada, hortaliças, ornamentais, e coníferas. Preferivelmente, plantas da presente invenção são plantas cultivadas (por exemplo, girassol, Brassica sp., algodão, açúcar, beterraba, soja, amendoim, alfafa, açafrão, tabaco, milho, arroz, trigo, centeio, cevada triticale, sorgo, milheto, etc.).

[00131] As plantas resistentes a herbicida da invenção encontram uso em métodos para controlar ervas daninhas. Assim, a presente invenção fornece adicionalmente um método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta resistente a herbicida da invenção. O método compreende aplicar uma quantidade efetiva de um herbicida às ervas daninhas e à planta resistente a herbicida, em que a planta tem resistência aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia, quando comparado a uma planta tipo selvagem. Em um tal método para controlar ervas daninhas, as plantas resistentes a herbicida da invenção são preferivelmente plantas cultivadas, incluindo, mas não limitadas a, arroz, girassol, alfafa, Brassica sp., soja, algodão, açafrão, amendoim, tabaco, tomate, batata, trigo, milho, sorgo, cevada, centeio, milheto, e sorgo.

[00132] Fornecendo plantas tendo resistência aumentada para herbicidas, particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia, uma ampla variedade de formulações pode ser empregada para proteger plantas de ervas daninhas, assim como para estimular crescimento vegetal e reduzir competição por nutrientes. Um herbicida pode ser usado por si só para pré- emergência, pós-emergência, controle pré-plantio e em plantio de ervas daninhas em áreas circundando as plantas descritas neste lugar ou pode ser usada uma formulação de herbicida de imidazolinona que contém outros aditivos. O herbicida também pode ser usado como um tratamento de semente. Aditivos encontrados em uma formulação de herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de espalhamento, agentes de adesão, agentes estabilizantes, ou os semelhantes. A formulação de herbicida pode ser uma preparação úmida ou seca e pode incluir, mas não é limitada a, pós dispersáveis, concentrados emulsionáveis e concentrados líquidos. O herbicida e formulações de herbicida podem ser aplicados em conformidade com métodos convencionais, por exemplo, pulverizando, irrigando, polvilhando, ou os semelhantes.

[00133] A presente invenção fornece sementes não transgênicas e transgênicas com tolerância aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida inibindo AHAS, mais particularmente um herbicida de imidazolinona. Tais sementes incluem, por exemplo, sementes de arroz não transgênicas compreendendo as características de tolerância a herbicida da planta com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262, e sementes transgênicas compreendendo uma molécula de ácido nucleico IMI da invenção que codifica uma proteína IMI.

[00134] A presente invenção fornece métodos para produzir uma planta resistente a herbicida, particularmente uma planta de arroz resistente a herbicida, através de melhoramento vegetal convencional envolvendo reprodução sexual. Os métodos compreendem cruzar uma primeira planta que é resistente a um herbicida com uma segunda planta que não é resistente ao herbicida. A primeira planta pode ser qualquer das plantas resistentes a herbicida da presente invenção incluindo, por exemplo, plantas transgênicas compreendendo pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção que codificam uma proteína IMI resistente a herbicida e plantas não transgênicas de arroz que compreendem as características de tolerância a herbicida da planta de arroz com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262. A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzir plantas de progenia viáveis (i.e., sementes) quando cruzada com a primeira planta. Tipicamente, mas não necessariamente, a primeira e segunda planta são da mesma espécie. Os métodos da invenção podem envolver adicionalmente uma ou mais gerações de retrocruzamento das plantas de progenia do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linhagem ou genótipo que ou a primeira ou segunda planta. Alternativamente, a progenia do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subseqüente pode ser cruzada com uma terceira planta que é de uma linhagem ou genótipo diferente do que ou a primeira ou segunda planta. Os métodos da invenção podem adicionalmente envolver selecionar plantas que compreendem as características de tolerância a herbicida da primeira planta.

[00135] A presente invenção fornece adicionalmente métodos para aumentar a resistência a herbicida de uma planta, particularmente uma planta de arroz resistente a herbicida, através de melhoramento vegetal convencional envolvendo reprodução sexual. Os métodos compreendem cruzar uma primeira planta que é resistente a um herbicida com uma segunda planta que pode ou não ser resistente ao herbicida ou pode ser resistente a herbicida ou herbicidas diferentes do que a primeira planta. A primeira planta pode ser qualquer das plantas resistentes a herbicida da presente invenção incluindo, por exemplo, plantas transgênicas compreendendo pelo menos um dos ácidos nucleicos IMI da presente invenção que codificam proteína IMI e plantas não transgênicas de arroz que compreendem as características de tolerância a herbicida da planta de arroz com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262. A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzir plantas de progenia viáveis (i.e., sementes) quando cruzada com a primeira planta. Tipicamente, mas não necessariamente, a primeira e segunda planta são da mesma espécie. As plantas de progenia produzidas por este método da presente invenção têm resistência aumentada para um herbicida quando comparado a ou a primeira ou segunda planta ou ambas. Quando a primeira e segunda planta são resistentes a herbicidas diferentes, as plantas de progenia terão as características de tolerância a herbicidas da primeira e segunda planta combinadas. Os métodos da invenção podem envolver adicionalmente uma ou mais gerações de retrocruzamento das plantas de progenia do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linhagem ou genótipo que ou a primeira ou segunda planta. Alternativamente, a progenia do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subseqüente pode ser cruzada com uma terceira planta que é de uma linhagem ou genótipo diferente do que ou a primeira ou segunda planta. Os métodos da invenção podem adicionalmente envolver selecionar plantas que compreendem as características de tolerância a herbicida da primeira planta, da segunda planta, ou ambas a primeira e a segunda planta.

[00136] As plantas da presente invenção podem ser transgênicas ou não transgênicas. Um exemplo de uma planta de arroz não transgênica tendo resistência aumentada para imidazolinona é a planta de arroz (IMINTA 16) tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; ou mutante, recombinante, ou um derivado geneticamente modificado da planta tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; ou de qualquer progenia da planta tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; ou uma planta que é uma progenia de qualquer destas plantas; ou uma planta que compreende as características de tolerância a herbicida da planta tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262.

[00137] A presente invenção também fornece plantas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas que são transformadas com a pelo menos uma molécula de polinucleotídeo, cassete de expressão, ou vetor de transformação da invenção. Tais plantas transformadas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras não humanas têm tolerância ou resistência estimulada para pelo menos um herbicida, em níveis do herbicida que matam ou inibem o crescimento de uma planta não transformada, tecido vegetal, célula vegetal, ou célula hospedeira não humana, respectivamente. Preferivelmente, as plantas transformadas, tecidos vegetais, células vegetais, e sementes da invenção são Arabidopsis thaliana e plantas cultivadas.

[00138] A presente invenção fornece métodos que envolvem o uso de pelo menos um herbicida inibindo AHAS selecionado a partir do grupo consistindo de herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfoniluréia, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato, herbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona, e misturas dos mesmos. Nestes métodos, o herbicida inibindo AHAS pode ser aplicado por qualquer método conhecido na arte incluindo, mas não limitado a, tratamento de semente, tratamento de solo, e tratamento foliar.

[00139] Antes de aplicação, o herbicida inibindo AHAS -pode ser convertido nas formulações habituais, por exemplo soluções, emulsões, suspensões, polvilhos, pós, pastas e grânulos. A forma de uso depende do propósito pretendido particular; em cada caso, ela deve assegurar uma fina e igual distribuição do composto de acordo com a invenção.

[00140] As formulações são preparadas de uma maneira conhecida (veja e.g. para revisão Patente Norte-Americana 3.060.084, Patente Européia- A 707 445 (para concentrados líquidos), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, Nova Iorque, 1963, pages 8-57 e et seq. WO 91/13546, Patente Norte-Americana 4.172.714, Patente Norte-Americana 4.144.050, Patente Norte-Americana 3.920.442, Patente Norte-Americana 5.180.587, Patente Norte-Americana 5.232.701, Patente Norte-Americana 5.208.030, Patente Britânica 2.095.558, Patente Norte-Americana 3.299.566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 e Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-75140443-8), por exemplo estendendo o composto ativo com auxiliares adequados para a formulação de agroquímicos, tal como solventes e/ou carreadores, se desejado emulsificantes, tensoativos e dispersantes, conservantes, agentes antiespumantes, agentes anticongelantes, para formulação de tratamento de semente também opcionalmente corantes e/ou ligantes e/ou agentes geleificantes.

[00141] Exemplos de solventes adequados são água, solventes aromáticos (por exemplo produtos de Solvesso, xileno), parafinas (por exemplo frações de óleo mineral), álcoois (por exemplo metanol, butanol, pentanol, benzil álcool), cetonas (por exemplo ciclohexanona, gama- butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP), acetatos (glicol diacetato), glicóis, dimetilamidas de ácido graxo, ácidos graxos e ésteres de ácido graxo. Em princípio, misturas de solventes também podem ser usadas.

[00142] Exemplos de carreadores adequados são minerais naturais do solo (por exemplo caolims, argilas, talco, giz) e minerais sintéticos do solo (por exemplo sílica altamente dispersa, silicatos).

[00143] Emulsificantes adequados são emulsificantes não iônicos e aniônicos (por exemplo éteres de álcool graxo de polioxietileno, alquilsulfonatos e arilsulfonatos).

[00144] Exemplos de dispersantes são licores residuais de lignina- sulfito e metilcelulose.

[00145] Tensoativos adequados são metal alcalino, metal alcalino terroso e sais de amônio de ácido lignosulfônico, ácido naftalenosulfônico, ácido fenolsulfônico, ácido dibutilnaftalenosulfônico, alquilarilsulfonatos, alquil sulfatos, alquilsulfonatos, sulfatos de álcool graxo, ácidos graxos e glicol éteres de álcool graxo sulfatado, além disso condensados de naftaleno sulfonado e derivados de naftaleno com formaldeído, condensados de naftaleno ou de ácido naftalenosulfônico com fenol e formaldeído, polioxietileno octilfenol éter, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol, alquilfenol poliglicol éteres, tributilfenil poliglicol éter, tristearilfenil poliglicol éter, alquilaril poliéter álcoois, condensados de óxido de etileno de álcool e álcool graxo, óleo de ricínio etoxilado, polioxietileno alquil éteres, polioxipropileno etoxilado, lauril álcool poliglicol éter acetal, sorbitol ésteres, licores residuais de lignosulfito e metilcelulose.

[00146] Substâncias que são adequadas para a preparação de soluções, emulsões, pastas ou dispersões oleosas pulverizáveis diretamente são frações de óleo mineral de ponto de ebulição médio a alto, tal como querosene ou óleo diesel, além disso óleos de piche de carvão e óleos de origem vegetal ou animal, hidrocarbonos alifáticos, cíclicos e aromáticos, por exemplo tolueno, xileno, parafina, tetrahidronaftaleno, naftalenos alquilados ou seus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, ciclohexanol, ciclohexanona, isoforona, solventes altamente polares, por exemplo dimetil sulfóxido, N- metilpirrolidona ou água.

[00147] Também agentes anticongelantes tal como glicerina, etilenoglicol, propilenoglicol e bactericidas tal como podem ser adicionados à formulação.

[00148] Agentes antiespumantes adequados são por exemplo agentes antiespumantes baseados em silicone ou estearato de magnésio.

[00149] Conservantes adequados são por exemplo Diclorofeno e enzilalcoolhemiformal.

[00150] Formulações de tratamento de semente podem adicionalmente compreender ligantes e opcionalmente corantes.

[00151] Ligantes podem ser adicionados para melhorar a adesão dos materiais ativos nas sementes depois de tratamento. Ligantes adequados são copolímeros de bloqueio EO/P0 tensoativos mas também álcoois de polivinil, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno, polietilenoaminas, polietilenoaminas, polietilenoiminas (Lupasol®, Polymin®), poliéteres, poliuretanos, polivinilacetato, tilose e copolímeros derivados destes polímeros.

[00152] Opcionalmente, também corantes podem ser incluídos na formulação. Corantes ou tinturas adequadas para formulações de tratamento de semente são Rodamina B, C.I. Pigmento Vermelho 112, C.I. Solvente Vermelho 1, pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2, pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarelo 1, pigmento amarelo 13, pigmento vermelho 112, pigmento vermelho 48:2, pigmento vermelho 48:1, pigmento vermelho 57:1, pigmento vermelho 53:1, pigmento laranja 43, pigmento laranja 34, pigmento laranja 5, pigmento verde 36, pigmento verde 7, pigmento branco 6, pigmento marrom 25, violeta básico 10, violeta básico 49, vermelho ácido 51, vermelho ácido 52, vermelho ácido 14, azul ácido 9, amarelo ácido 23, vermelho básico 10, vermelho básico 108.

[00153] Um exemplo de um agente geleificante adequado é carragenano (Satiagel).

[00154] Pós, materiais para espalhamento, e produtos polvilháveis podem ser preparados misturando ou concomitantemente moendo as substâncias ativas com um carreador sólido.

[00155] Grânulos, por exemplo grânulos revestidos, grânulos impregnados e grânulos homogêneos, podem ser preparados ligando os compostos ativos a carreadores sólidos. Exemplos de carreadores sólidos são terras minerais mineral tal como géis de sílica, silicatos, talco, caolim, “attaclay”, pedra calcária, cal, giz, fuste, loess, argila, dolomita, terra diatomácea, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio, materiais sintéticos do solo, fertilizantes, tal como, por exemplo, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, uréias, e produtos de origem vegetal, tal como farelo de cereal, farelo de casca de árvore, farelo de madeira e farelo de casca de noz, pós de celulose e outros carreadores sólidos.

[00156] Em geral, as formulações compreendem de 0,01 a 95% em peso, preferivelmente de 0,1 a 90% em peso, do herbicida inibindo AHAS. Neste caso, os herbicidas inibindo AHAS são empregados em uma pureza de a partir de 90% a 100% em peso, preferivelmente 95% a 100% em peso (de acordo com espectro de NMR). Para propósitos de tratamento de semente, respectivas formulações podem ser diluídas 2-10 vezes levando a concentrações nas preparações prontas para uso de 0,01 a 60% em peso de composto ativo em peso, preferivelmente 0,1 a 40% em peso.

[00157] O herbicida inibindo AHAS pode ser usado como tal, na forma de suas formulações ou as formas de uso preparadas a partir destas, por exemplo na forma de soluções, pós, suspensões ou dispersões diretamente pulverizáveis, emulsões, dispersões oleosas, pastas, produtos polvilháveis, materiais para espalhamento, ou grânulos, por meio de pulverização, atomização, polvilhamento, espalhamento ou derramamento. As formas de uso dependem inteiramente dos propósitos pretendidos; elas são pretendidas para assegurar em cada caso a melhor distribuição possível do herbicida inibindo AHAS de acordo com a invenção.

[00158] Formas de uso aquosas podem ser preparadas a partir de concentrados de emulsão, pastas ou pós molháveis (pós pulverizáveis, dispersões oleosas) adicionando água. Para preparar emulsões, pastas ou dispersões oleosas, as substâncias, como tal ou dissolvidas em um óleo ou solvente, podem ser homogeneizadas em água por meio de um umectante, taquificante, dispersante ou emulsificante. Entretanto, também é possível preparar concentrados compostos de substância ativa, umectante, taquificante, dispersante ou emulsificante e, se apropriado, solvente ou óleo, e tais concentrados são adequados para diluição com água.

[00159] As concentrações do composto ativo nas preparações prontas para uso podem ser variadas dentro de extensões relativamente amplas. Em geral, elas são de 0,0001 a 10%, preferivelmente de 0,01 a 1% em peso.

[00160] O herbicida inibindo AHAS também pode ser usado com sucesso no processo de volume ultra baixo (ULV), sendo possível aplicar formulações compreendendo mais de 95% em peso de composto ativo, ou mesmo aplicar o composto ativo sem aditivos.

[00161] Os seguintes são exemplos de formulações: 1. Produtos para diluição com água para aplicações foliares. Para propósitos de tratamento de semente, tais produtos podem ser aplicados à semente diluídos ou não diluídos. Concentrados solúveis em água (SL, LS)

[00162] Dez partes em peso do herbicida inibindo AHAS são dissolvidas em 90 partes em peso de água ou um solvente solúvel em água. Como uma alternativa, umectantes ou outros auxiliares são adicionados. O herbicida inibindo AHAS dissolve com diluição com água, por meio do que uma formulação com 10 % (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. Concentrados dispersáveis (DC)

[00163] Vinte partes em peso do herbicida inibindo AHAS são dissolvidas em 70 partes em peso de ciclohexanona com adição de 10 partes em peso de um dispersante, por exemplo polivinilpirrolidona. Diluição com água fornece uma dispersão, por meio do que uma formulação com 20% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. Concentrados emulsionáveis (EC)

[00164] Quinze partes em peso do herbicida inibindo AHAS são dissolvidas em 7 partes em peso de xileno com adição de dodecilbenzenosulfonato de cálcio e óleo de ricínio etoxilado (em cada caso 5 partes em peso). Diluição com água fornece uma emulsão, por meio do que uma formulação com 15% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. D) Emulsões (EW, BO, ES)

[00165] Vinte e cinco partes em peso do herbicida inibindo AHAS são dissolvidas em 35 partes em peso de xileno com adição de dodecilbenzenosulfonato de cálcio e óleo de ricínio etoxilado (em cada caso 5 partes em peso). Esta mistura é introduzida em 30 partes em peso de água por meio de uma máquina emulsificante (e.g. Ultraturrax) e feita em uma emulsão homogênea. Diluição com água fornece uma emulsão, por meio do que uma formulação com 25% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. E) Suspensões (SC, OD, FS)

[00166] Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida inibindo AHAS são fracionadas com adição de 10 partes em peso de dispersantes, umectantes e 70 partes em peso de água ou de um solvente orgânico para gerar uma suspensão fina do herbicida inibindo AHAS. Diluição com água fornece uma suspensão estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que uma formulação com 20% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. F) Grânulos dispersáveis em água e grânulos solúveis em água (WG, SG)

[00167] Cinqüenta partes em peso do herbicida inibindo AHAS são finamente moídas com adição de 50 partes em peso de dispersantes e umectantes e feitas como grânulos dispersáveis em água ou solúveis em água por meio de ferramentas técnicas (por exemplo extrusão, torre de pulverização, cama fluidizada). Diluição com água fornece uma dispersão ou solução estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que uma formulação com 50% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. G) Pós dispersáveis em água e pós solúveis em água (WP, SP, SS, WS)

[00168] Setenta e cinco partes em peso do herbicida inibindo AHAS são moídas em um moinho de rotor-estator com adição de 25 partes em peso de dispersantes, umectantes e gel de sílica. Diluição com água fornece uma dispersão ou solução estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que uma formulação com 75% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. I) Formulação de Gel (GF)

[00169] Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso do herbicida inibindo AHAS são fracionadas com adição de 10 partes em peso de dispersantes, 1 pare em peso de umectantes de um agente geleificante e 70 partes em peso de água ou de um solvente orgânico para gerar uma suspensão fina do herbicida inibindo AHAS. Diluição com água fornece uma suspensão estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que uma formulação com 20% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. Esta formilação de gel é adequada para uso como um tratamento de semente.

[00170] 2. Produtos para serem aplicados não diluídos para aplicações foliares. Para propósitos de tratamento de semente, tais produtos podem ser aplicados à semente diluídos. Pós polvilháveis (DP, DS)

[00171] Cinco partes em peso do herbicida inibindo AHAS são finamente moídas e misturadas intimamente com 95 partes em peso de caolim finamente dividida. Isto fornece um produto polvilhável tendo 5% (w/w) de herbicida inibindo AHAS. Grânulos (GR, FG, GG, MG)

[00172] Meia parte em peso do herbicida inibindo AHAS é finamente moída e associada com 95,5 partes em peso de carreadores, por meio do que uma formulação com 0,5% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. Métodos atuais são extrusão, secagem por pulverizador ou a cama fluidizada. Isto fornece grânulos para serem aplicados não diluídos para uso foliar.

[00173] Formulações convencionais de tratamento de semente incluem por exemplo concentrados dispersáveis FS, soluções LS, pós para tratamento seco DS, pós dispersáveis em água para tratamento pastoso WS, pós solúveis em água SS e emulsão ES e EC e formulação de gel GF. Estas formulações podem ser aplicadas à semente diluídas ou não diluídas. Aplicação às sementes é realizada antes de semear, ou diretamente nas sementes.

[00174] Em uma forma de realização preferida uma formulação FS é usada para tratamento de semente. Tipicamente, uma formulação FS pode compreender 1-800 g/1 de ingrediente ativo, 1-200 g/1 de Tensoativo, 0 a 200 g/1 de agente anticongelante, 0 a 400 g/1 de ligante, 0 a 200 g/1 de um pigmento e até 1 litro de um solvente, preferivelmente água.

[00175] As sementes não transgênicas e transgênicas da presente invenção das plantas resistentes a herbicida da presente invenção. Tais sementes incluem, por exemplo, sementes de arroz não transgênicas compreendendo as características de tolerância a herbicida da planta com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262, e sementes transgênicas compreendendo uma molécula de polinucleotídeo da invenção que codifica uma proteína IMI.

[00176] Para tratamento de semente, sementes das plantas resistentes a herbicida de acordo com a presente invenção são tratadas com herbicidas, preferivelmente herbicidas selecionados a partir do grupo consistindo de herbicidas inibindo AHAS tal como amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfuron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam,penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid, piritiobac, e misturas dos mesmos, ou com uma formulação compreendendo um herbicida inibindo AHAS.

[00177] O termo tratamento de semente compreende todas as técnicas adequadas de tratamento de semente conhecidas na arte, tal como tratamento de sementes, recobrimento de sementes, polvilhamento de sementes, embebição de sementes, e peletização de sementes.

[00178] Em conformidade com uma variante da presente invenção, um assunto adicional da invenção é um método de tratar solo pela aplicação, em particular na semeadora: ou de uma formulação granular contendo o herbicida inibindo AHAS como uma composição/formulação (e.g.uma formulação granular, com opcionalmente um ou mais carreadores sólidos ou líquidos, agricolamente aceitáveis e/ou opcionalmente com um ou mais tensoativos agricolamente aceitáveis). Este método é vantajosamente empregado, por exemplo, em canteiros de cereais, milho, algodão, e girassol.

[00179] A presente invenção também compreende sementes revestidas com ou contendo com uma formulação de tratamento de semente compreendendo pelo menos um herbicida inibindo AHAS selecionado a partir do grupo consistindo de amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfuron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron, trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid e piritiobac.

[00180] O termo semente inclui sementes e propágulos vegetais de todos os tipos incluindo mas não limitados a sementes verdadeiras, pedaços de semente, brotos secundários, cormos, bulbos, fruto, tubérculos, grãos, estacas, ramos cortados e os semelhantes e significa em uma forma de realização preferida sementes verdadeiras.

[00181] O termo "revestida com e/ou contendo" geralmente significa que o ingrediente ativo está para a maior parte na superfície do produto de propagação no momento de aplicação, embora uma parte maior ou menor do ingrediente possa penetrar no produto de propagação, dependendo do método de aplicação. Quando o dito produto de propagação é (re)plantado, ele pode absorver o ingrediente ativo.

[00182] A aplicação de tratamento de semente com o herbicida inibindo AHAS ou com uma formulação compreendendo o herbicida inibindo AHAS é realizada pulverizando ou polvilhando as sementes antes de semeadura das plantas e depois de emergência das plantas.

[00183] No tratamento de sementes, as formulações correspondentes são aplicadas tratando as sementes com uma quantidade efetiva do herbicida inibindo AHAS ou uma formulação compreendendo o herbicida inibindo AHAS. Neste lugar, as taxas de aplicação são geralmente de 0,1 g a 10 kg do a.i. (ou da mistura de a.i. ou da formulação) por 100 kg de semente, preferivelmente de 1 g a 5 kg por 100 kg de semente, em particular de 1 g a 2,5 kg por 100 kg de semente. Para cultivos específicas tal como alface a taxa pode ser maior.

[00184] A presente invenção fornece um método para combater vegetação indesejada ou controlar ervas daninhas compreendendo colocar em contato as sementes das plantas resistentes de acordo com a presente invenção antes de semeadura e/ou depois de pré-germinação com um herbicida inibindo AHAS. O método pode compreender adicionalmente semear as sementes, por exemplo, em solo em um campo ou em um substrato em casa de vegetação. O método encontra uso particular para combater vegetação indesejada ou controlar ervas daninhas na vizinhança imediata da semente.

[00185] O controle de vegetação indesejada é entendido como significando o assassinato de ervas daninhas e/ou de outra maneira retardando ou inibindo o crescimento normal das ervas daninhas. Ervas daninhas, no sentido mais amplo, são entendidas como significando todas as plantas que crescem em localizações onde elas são indesejadas.

[00186] As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo, ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. Ervas daninhas dicotiledôneas incluem, mas não são limitadas a, ervas daninhas dos gêneros: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, e Taraxacum. Ervas daninhas monocotiledôneas incluem, mas não são limitadas a, ervas daninhas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, e Apera.

[00187] Em adição, as ervas daninhas da presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas cultivadas que estão crescendo na localização indesejada. Por exemplo, uma planta voluntária de milho que está em um campo que compreende predominantemente plantas de soja pode ser considerada uma erva daninha, se a planta de milho é indesejada no campo de plantas de soja.

[00188] Os artigos "um" e "uma" são usados neste lugar para se referir a um ou mais do que um (i.e., a pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. Como forma de exemplo, "um elemento" significa um ou mais elementos.

[00189] Como usado neste lugar, a palavra "compreendendo," ou variações tal como "compreende" ou "compreendendo," serão entendidas para implicar a inclusão de um determinado elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos,, números inteiros ou etapas.

[00190] Os exemplos seguintes são oferecidos como forma de ilustração e não como forma de limitação. EXEMPLO 1: Produção de uma Linhagem de Arroz Resistente a Imidazolinona

[00191] AHASL é uma enzima codificada no núcleo e seu gene, em diferentes espécies, foi seqüenciado em sua forma selvagem e outras formas mostrando sítios de mutação que conferem resistência a herbicidas de sulfoniluréia e de imidazolinona. A fim de produzir plantas de arroz com enzimas AHAS resistentes a herbicida, sementes de arroz foram tratadas com um mutagênico químico em uma tentativa de induzir pequenas mudanças no sítio ativo de interação com o herbicida a fim de prevenir inibição. Variedades dominantes de arroz e linhagens elite de arroz foram selecionadas a fim de gerar uma nova mutação que é resistente as imidazolinonas mais ativas em germoplasma excelente. Pressão de seleção foi baseada em exposição de plantas em estágio de quatro folhas para dois dos mais ativos herbicidas de imidazolinona aplicados em uma aplicação durante diversas gerações até que linhagens homozigotas altamente resistentes fossem obtidas. As linhagens de arroz com resistência a imidazolinona foram produzidas como descrito abaixo.

[00192] Na primavera tardia da estação de crescimento número 1, duas amostras de sementes (600 g cada) da cultivar IRGA 417 de arroz foram tratadas com uma solução aquosa de azida de sódio 0,001 M em pH 3 (tampão fosfato 0,067M). Este tratamento foi aplicado embebendo cada semente-amostra em um Erlenmeyer de dois litros contendo um litro da solução de azida de sódio, em agitação constante, por 18 horas, em temperatura ambiente. Depois de tratamento, as sementes foram enxaguadas em água de torneira e, mais tarde, elas foram parcialmente seco-aerado em folhas de papel mata-borrão a fim de extrair a umidade da superfície de sementes. Depois disso, sementes tratadas foram semeadas diretamente no viveiro em Concepcion del Uruguay, E.R., Argentina.

[00193] Sementes tratadas (Ml) e não tratadas controle da cultivar IRGA 417 de arroz foram plantas no viveiro em uma taxa de 50 plantas por metro quadrado. As plantas foram crescidas em condições inundadas até maturidade (26 % de umidade do grão) e volume coletado. Sementes (M2) das plantas foram coletadas e secas em um secador por convecção por 14 h a 45°C. Elas foram mantidas em armazenamento fechado até próxima estação de crescimento.

[00194] Na primavera tardia da estação de crescimento número 2, sementes M2 foram plantadas com uma semeadeira experimental para grandes áreas em uma taxa de 50 kg/ha no viveiro em Concepcion del Uruguay, E.R., Argentina. Uma área de 3 ha foi estabelecida compreendendo uma população de aproximadamente 6 x 106 plantas M2. IRGA 417 (tipo selvagem) também foi plantado como um controle. A área inteira foi sujeita a uma pressão de seleção com uma mistura de dois herbicidas de imidazolinona. Três aplicações separadas foram feitas com um pulverizador comercial in diferentes direções para prevenir qualquer fuga e resultando em um tratamento de 3X. Um volume total de 222 L/ha foi pulverizado a 50 psi (344,7 kPa), com bocais Teejets 8002, em cada aplicação. A taxa do tratamento de lx foi uma mistura de Arsenal® (Imazapir 75 cm3 a.i/ha) e Cadre® (Imazapic 24,85 cm3 a.i/ha) em uma solução aquosa com um tensoativo não iônico (Citowett) na taxa de 0,25%. As aplicações foram feitas no estágio de quatro folhas das plantas de arroz. Nenhuma chuva foi registrada durante os 7 dias depois de tratamentos.

[00195] Observações em tempos regulares foram feitas para avaliar a área inteira tratada com herbicida. Em 90 dias depois do tratamento com herbicida, os indivíduos sobreviventes foram marcados e transplantados para a casa de vegetação para multiplicação assexual e produção de semente. Um total de 10 plantas individuais foram crescidas, e a semente foi coletada e seca em um incubador de semente por 7 dias a 50 °C. Como esperado, nenhuma das plantas de controle (IRGA 417) sobreviveu ao tratamento com herbicida.

[00196] Sementes (M3) de plantas M2 selecionadas foram plantadas em potes individuais em condições de casa de vegetação em Concepcion del Uruguay, E.R., Argentina durante o inverno imediatamente seguindo a segunda estação. Um tratamento de 2X foi aplicado com um pulverizador costal dividido em duas aplicações de uma taxa de 1X de Arsenal® (Imazapir 75 cm3 a.i/ha) e Cadre® (Imazapic 24,85 cm3 a.i/ha) em uma solução aquosa com um tensoativo não iônico (Citowet) na taxa de 0,25%.

[00197] Perfilhos das plantas tolerantes a herbicida (e.g., plantas que sobreviveram a tratamentos com herbicida) foram crescidos até maturidade (26% de umidade de grão) e coletados manualmente. A semente coletada (M4) foi sujeita a um tratamento de quebra de dormência de 7 dias a 50°C e preparada para o plantio de próxima estação de crescimento. Sementes de duas plantas tolerantes a herbicida foram mantidas separadamente. As sementes de foram preparadas para um plantio de estação tardia externo em Concepcion del Uruguay, E.R., Argentina.

[00198] No verão de estação de crescimento número 3, sementes M4 de uma planta M3 tolerante a herbicida que foi designado como IMINTA 16 foram plantadas com a taxa de 50 kg/ha.

[00199] Um tratamento de 2X de herbicidas de imidazolinona foi aplicado no estádio de quatro a cinco folhas das plantas de arroz como duas aplicações de uma taxa de 1X de Arsenal® (Imazapir 75 cm3 a.i/ha) e Cadre® (Imazapic 24,85 cm3 a.i/ha) em uma solução aquosa com um tensoativo não iônico (Citowet) na taxa de 0,25%. Nenhum sintoma fitotóxico foi observado para plantas da linhagem IMINTA 16. Nenhum segregante tipo selvagem (i.e., não tolerante ao tratamento com herbicida) foi observado, e uma população altamente homogênea em características agronômicas e de tolerância foi produzida. Plantas IMINTA 16 individuais foram transplantadas para a casa de vegetação para produção de semente, e sementes (M5) foram coletadas mais tarde naquele ano. EXEMPLO 2: Uma Linhagem de Arroz Resistente a Imidazolina com uma Mutação no Gene AHASL1

[00200] DNA genômico foi separadamente extraído de folhas de plântulas crescidas na casa de vegetação da linhagem IMINTA 16 descrita em Exemplo 1 acima e o gene AHASL1 foi amplificado por um método de reação em cadeia da polimerase (PCR) usando os iniciadores descritos abaixo. Os produtos resultantes das amplificações de PCR individuais foram seqüenciados usando métodos padrão.

[00201] Os iniciadores usados para PCR e seqüenciamento são fornecidos em Tabela 1. Os iniciadores foram selecionados manualmente por inspeção visual das seqüências de arroz conhecidas publicamente para Oryza sativa 'Kinmaze', Oryza sativa japonica e Oryza sativa indica. Os iniciadores foram pareados aproximadamente a cada 400-500 bp ao longo dos aproximadamente 2000 bp do gene AHAS. Diversos iniciadores foram projetados para cada trecho de 500 bp para maximizar a probabilidade de sucesso de amplificação. Nenhum peso foi dado para regiões conservadas quando escolhendo iniciadores. As seqüências de iniciadores foram verificadas para formas de grampo de cabelo e dímeros através do sítio da rede mundial de computadores www.mature.comioligonucleotide.html. Pelo fato de não haver íntrons presentes no gene AHASL1, o gene inteiro representa seqüência de codificação, e é portanto conservado. Iniciadores foram projetados para ter um teor de GC perto de 50% e temperaturas de fusão similares, aproximadamente 54-58°C. Os nomes de iniciadores em Tabela 1 refletem a exata posição de base de começo de acordo com seqüências de nucleotídeos de AHASL1 públicas para arroz (e.g., No. de Acesso de GenBank AB049822). U136851 se refere a uma região antes do códon de início no gene AHAS e foi projetado a partir de um clone BAC (OSJNBa0053B21), No. de Acesso AL731599. Tabela 1 Iniciadores para Amplificação por PCR e Seqüenciamento de DNA do Gene AHASL1 de Arroz em IMINTA 16

*Também usou U642 e L2155 como um par de PCR

[00202] Quando o DNA genômico amplificado por PCR das plântulas IMINTA 16 foi examinado, uma mudança de base única (i.e., transição, C para T) foi identificada na região de codificação do gene que causou uma substituição de aminoácido na proteína AHASL1 em posição de aminoácido 179 de Ala na linhagem tipo selvagem para Val na linhagem IMINTA 16. O sítio desta substituição corresponde à posição 205 na proteína AHASL de Arabidopsis thaliana (veja, Tabela 2 abaixo). A substituição de Ala205 por Val na proteína AHASL de Arabidopsis thaliana é conhecida por conferir em plantas que expressam esta proteína tolerância a herbicidas de imidazolinona. EXEMPLO 3: Proteínas AHASL1 de Arroz Resistentes a Herbicida

[00203] A presente invenção descreve tanto seqüências de nucleotídeos como de aminoácidos para polipeptídeos AHASL1 de arroz resistentes a herbicida. Plantas compreendendo polipeptídeos AHASL1 resistentes a herbicida foram previamente identificadas, e diversas regiões conservadas de polipeptídeos AHASL1 que são os sítios de substituições de aminoácidos que conferem resistência a herbicida foram descritas. Veja, Devine and Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites". In: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al. (eds.), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam; e Devine and Shukla, (2000) Crop Protection 19:881-889.

[00204] Usando as moléculas de polinucleotídeo AHASL1 da invenção e métodos conhecidos por aqueles de habitual verso na arte, alguém pode produzir moléculas de polinucleotídeo adicionais codificando polipeptídeos AHASL1 resistentes a herbicida tendo uma, duas, três, ou mais substituições de aminoácidos nos sítios identificados nestas regiões conservadas. Tabela 2 fornece as regiões conservadas de proteínas AHASL1, as substituições de aminoácidos conhecidas por conferir resistência a herbicida dentro destas regiões conservadas, e os aminoácidos correspondentes na proteína AHASL1 de arroz estabelecida na SEQ ID NO:2. Tabela 2 Substituições de aminoácidos em Regiões conservadas de Polipeptídeos AHASL que são conhecidos por Conferir Resistência a herbicida e sua Posição equivalente em Polipeptídeos AHASL1 de Arroz

[00205] 1Regiões conservadas de Devine and Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites". In: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al. (eds.), pp. 159-185, IOS Press, Amsterdam e Devine and Shukla, (2000) Crop Protection 19:881-889.

[00206] 2Numeração de aminoácido corresponde à seqüência de aminoácidos do polipeptídeo AHASL de Arabidopsis thaliana.

[00207] 3A proteína AHASL de arroz AHASL1 da invenção (SEQ ID NO:2) tem as mesmas regiões conservadas.

[00208] 4Bernasconi et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(29):17381-17385.

[00209] 5Boutsalis et al. (1999) Pestic. Sci. 55:507-516. 6Guttieri et al. (1995) Weed Sci. 43:143-178.

[00210] 7Guttieri et al. (1992) Weed Sci. 40:670-678.

[00211] 8Hartnett et al. (1990) "Herbicide-resistant plants carrying mutated acetolactate synthase genes," In: Managing Resistance to Agrochemicals: Fundamental Research to Practical Strategies, Green et al. (eds.), American Chemical Soc. Symp., Series No. 421, Washington, DC, USA 9Simpson (1998) Down to Earth 53(1):26-35.

[00212] 10Bruniard (2001) Inheritance of imidazolinone resistance, characterization of cross-resistance pattern, and identification of molecular markers in sunflower (Helianthus annuus L.). Ph.D. Thesis, North Dakota State University, Fargo, ND, USA, pp 1-78.

[00213] "A presente invenção descreve a seqüência de aminoácidos de uma proteína AHASL1 de arroz resistente a herbicida com a substituição de Ala179 por Val (SEQ ID NO:2) e a seqüências de polinucleotídeos codificando esta AHASL1 resistente a herbicida (SEQ ID NOS: 1 e 3).

[00214] 12Chang and Duggleby (1998) Biochem.1 333:765-777.

[00215] 13Lee et al. (1999) FEBS Lett. 452:341-345.

[00216] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório são indicativos do nível daqueles versados na arte ao qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são neste lugar incorporadas por referência no mesmo grau que se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[00217] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe como forma de ilustração e exemplo para propósitos de claridade de entendimento, será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexadas.

Claims

1. Método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta de arroz, caracterizado pelo fato de compreender aplicar uma quantidade efetiva de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, e um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona, ou mistura destes às ervas daninhas e à planta de arroz, em que dita planta de arroz é selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) uma planta de arroz compreendendo em seu genoma pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo AHASL1 compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou 3 que codifica uma proteína AHASL1 resistente a herbicida, dita proteína AHASL1 resistente a herbicida compreendendo valina em posição de aminoácido 179 ou posição equivalente como resultado de mutagêse com azida de sódio, em que dita planta tem resistência aumentada para pelo menos um herbicida se comparada a uma planta de arroz tipo selvagem; (b) a planta de arroz com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; e (c) uma planta de arroz que é uma progenia da planta com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262, dita planta de arroz compreendendo as características de resistência a herbicida da planta de arroz com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262.

2. Método de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito herbicida de imidazolinona é selecionado a partir do grupo consistindo de: ácido nicotínico, ácido quinolinacarboxílico, imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-i1)-5-(metoximetil)-nicotínico, imidazolin-2-i1)-5-metilnicotínico, e uma mistura de metil 6-(4-isopropil-4- metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato, metil [2-(4-] isopropil-4-metil-5- oxo-2-imidazolin2-il)-p-toluato e mistura destes.

3. Método de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito herbicida de sulfoniluréia é selecionado a partir do grupo consistindo de: clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron e misturas dos mesmos.

4. Molécula de polinucleotídeo mutagenizada isolada, caracterizada pelo fato de codificar um polipeptídeo tendo uma substituição A179V como resultado da mutagênese com azida de sódio, a dita molécula de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo da sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3.

5. Cassete de expressão, caracterizado por compreender um promotor operavelmente ligado à molécula de polinucleotídeo como definida na reivindicação 4.

6. Cassete de expressão de acordo com reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dito promotor é capaz de acionar expressão de gene em uma bactéria, uma célula fúngica, uma célula animal, ou uma célula vegetal.

7. Vetor de transformação, caracterizado pelo fato de compreender um gene de interesse e um gene marcador selecionável, dito gene marcador selecionável compreendendo um promotor operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeos, em que dito promotor aciona expressão em uma célula hospedeira e dita sequência de nucleotídeos compreende a molécula de polinucleotídeo mutagenizada como definida na reivindicação 4.

8. Vetor de transformação de acordo com reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito promotor é expressável em uma célula vegetal.

9. Vetor de transformação de acordo com reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que dito promotor é um promotor constitutivo.

10. Vetor de transformação de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que dito gene marcador selecionável compreende adicionalmente uma sequência tendo como alvo cloroplasto operavelmente ligada.

11. Vetor de transformação de acordo com reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dito promotor é expressável em uma bactéria ou uma levedura.

12. Método para aumentar atividade de AHAS resistente a herbicida em arroz, caracterizado pelo fato de compreender transformar uma célula vegetal com um construto de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressão em uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir de dita célula vegetal transformada, em que dita sequência de nucleotídeos compreende a molécula de polinucleotídeo mutagenizada como definida na reivindicação 4; e em que a atividade de AHAS resistente a herbicida é aumentada em dita planta ou pelo menos uma parte desta, quando comparada a uma planta não transformada.

13. Método para produzir arroz resistente a herbicida, caracterizado pelo fato de compreender transformar uma célula vegetal com um construto de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressão em uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir de dita célula vegetal transformada, em que dita sequência de nucleotídeos compreende a molécula de polinucleotídeo mutagenizada como definida na reivindicação 4; e em que dita planta transformada tem resistência aumentada para pelo menos um herbicida em relação à resistência de uma planta não transformada para dito herbicida.

14. Método de acordo com reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que dito promotor é selecionado a partir do grupo consistindo de promotores constitutivos e promotores preferidos para tecidos.

15. Método de acordo com reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que dito construto de polinucleotídeo compreende adicionalmente uma sequência tendo como alvo cloroplasto operavelmente ligada.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que a atividade de AHAS de dita planta transformada é aumentada em relação a uma planta não transformada.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que dito herbicida é um herbicida de imidazolinona.

18. Método de acordo com reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que dito herbicida de imidazolinona é selecionado a partir do grupo consistindo de: ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-]imidiazolin-2- il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3- quinolinacarboxílico, ácido [5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-]5-oxo-2- imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin- 2-i1)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolin-2-i1)-5-metilnicotínico, e uma mistura de metil 6-(4-isopropil-4- metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato e metil [2-(4-] isopropil-4-metil-5- oxo-2-imidazolin2-il)-p-toluato.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que dito herbicida é um herbicida de sulfoniluréia.

20. Método de acordo com reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que dito herbicida de sulfoniluréia é selecionado a partir do grupo consistindo de: clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, e misturas dos mesmos.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado pelo fato de que dita célula vegetal compreende resistência para pelo menos um herbicida, antes de dita etapa de transformação.

22. Método para aumentar tolerância a herbicida em arroz tolerante a herbicida, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de transformar uma planta tolerante a herbicida com um construto de polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressão em uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir de dita célula vegetal transformada, em que dita sequência de nucleotídeos compreende a molécula de polinucleotídeo mutagenizada como definida na reivindicação 4; e em que a tolerância a herbicida de dita planta tolerante a herbicida é aumentada em dita planta quando comparada a uma planta tolerante a herbicida não transformada.

23. Método de acordo com reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que dita planta tolerante a herbicida compreende uma proteína AHASL1 tolerante a herbicida, antes de dita etapa de transformação.

24. Método de acordo com reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que dita planta tolerante a herbicida não foi geneticamente modificada para expressar dita proteína AHASL1 tolerante a herbicida.

25. Método de acordo com reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que dita planta tolerante a herbicida foi geneticamente modificada para expressar dita proteína AHASL1 tolerante a herbicida.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizado pelo fato de que dita planta tolerante a herbicida é uma planta tolerante a imidazolinona, antes de dita etapa de transformação.

27. Método para selecionar para uma célula de arroz transformada, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: transformar uma célula vegetal com o vetor de transformação vegetal, expor dita célula vegetal transformada a pelo menos um herbicida em uma concentração que inibe o crescimento de uma célula vegetal não transformada, e identificar dita célula vegetal transformada por sua capacidade de crescer na presença de dito herbicida; em que dito vetor de transformação vegetal compreende um gene marcador selecionável compreendendo um promotor e uma sequência de nucleotídeos operavelmente ligada, dito promotor aciona expressão em uma célula vegetal, e dita sequência de nucleotídeos compreende a molécula de polinucleotídeo mutagenizada como definida na reivindicação 4.

28. Método de acordo com reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que dito herbicida é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, e um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona, ou mistura destes.

29. Método de acordo com reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que dito vetor de transformação vegetal compreende adicionalmente pelo menos um gene de interesse.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de regenerar uma planta transformada a partir de dita célula vegetal transformada.

31. Método para controlar ervas daninhas na vizinhança de um arroz transformado, caracterizado pelo fato de compreender aplicar uma quantidade efetiva de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, e um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona, ou mistura destes às ervas daninhas e à planta transformada, em que dita planta transformada tem resistência aumentada ao herbicida de imidazolinona se comparada a uma planta não transformada, e a planta transformada compreende em seu genoma pelo menos um cassete de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressão de gene em uma célula vegetal, dita sequência de nucleotídeos compreende a molécula de polinucleotídeo mutagenizada como definida na reivindicação 4.

32. Método de acordo com reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dito herbicida de imidazolinona é selecionado a partir do grupo consistindo de: ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-]imidiazolin-2- il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3- quinolinacarboxílico, ácido [5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-]5-oxo-2- imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin- 2-i1)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2- imidazolin-2-i1)-5-metilnicotínico, e uma mistura de metil 6-(4-isopropil-4- metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato e metil [2-(4-] isopropil-4-metil-5- oxo-2-imidazolin2-il)-p-toluato, e mistura destes.

33. Método de acordo com reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que dito herbicida de sulfoniluréia é selecionado a partir do grupo consistindo de: clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, e misturas dos mesmos.

34. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que é codificado por uma molécula de polinucleotídeo mutagenizada compreendendo uma sequência que codifica um polipeptídeo tendo uma substituição A179V como resultado da mutagênese com azida de sódio, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo da sequência estabelecida na SEQ ID NO:2.