CN103484531A

CN103484531A - 抗除草剂的向日葵植物、编码抗除草剂的乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的多核苷酸和使用方法

Info

Publication number: CN103484531A
Application number: CN201310053159.5A
Authority: CN
Inventors: C·A·萨拉; A·M·艾查特; M·布罗斯; S·R·维特; R·阿森兹
Original assignee: Nidera Semillas SA; BASF SE
Current assignee: Nidera Semillas SA; BASF SE
Priority date: 2005-07-01
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2026-06-29
Also published as: AU2006265984B2; HUE035307T2; CA3006126A1; CN103484531B; EP2532750B1; ATE541939T1; HRP20120294T1; US20160230184A1; PL1902136T3; SI1902136T1; ZA200800947B; EP2532750A1; EP1902136B1; WO2007005581A3; EP2400022A1; EP2400022B1; US20110209232A1; JP5265356B2; EA020462B1; BRPI0612384B1

Abstract

本发明描述了抗除草剂的向日葵植物、编码抗除草剂的和野生型的乙酰羟酸合酶大亚基（AHASL）多肽的分离的多核苷酸和这些多肽的氨基酸序列。描述了包含本发明的多核苷酸的表达盒和转化载体，以及用所述多核苷酸转化的植物和宿主细胞。还描述了使用所述多核苷酸来增强植物对除草剂的抗性的方法，和用于控制在抗除草剂的植物附近的杂草的方法。

Description

抗除草剂的向日葵植物、编码抗除草剂的乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的多核苷酸和使用方法

本申请是申请号为200680032210.2、申请日为2006年6月29日、发明名称为“抗除草剂的向日葵植物、编码抗除草剂的乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的多核苷酸和使用方法”的中国发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及农业生物技术学领域，特别地涉及抗除草剂的向日葵植物以及编码野生型的和抗除草剂的向日葵乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的新型多核苷酸序列。

发明背景

乙酰羟酸合酶(AHAS;EC 4.1.3.18，也称作乙酰乳酸合酶或ALS)是催化缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸这些支链氨基酸的生物化学合成的第一个酶(Singh(1999)"Biosynthesis of valine,leucine and isoleucine",Plant Amino Acid，Singh,B.K.,ed.,Marcel Dekker Inc.New York,New York,pp.227-247)。AHAS是5个结构上不同的除草剂家族的作用位点，所述5个除草剂家族包括磺酰脲类（Tan等人,(2005)PestManag.Sci.61:246-57;Mallory-Smith和Retzinger,(2003)WeedTechnology 17:620-626;LaRossa和Falco,(1984)Trends Biotechnol.2:158-161）、咪唑啉酮类（Shaner等人,(1984)Plant Physiol.76:545-546）、三唑并嘧啶类（Subramanian和Gerwick,(1989)"Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines",Biocatalysis in Agricultural Biotechnology,Whitaker,J.R和Sonnet,P.E.eds.,ACS Symposium Series,American Chemical Society,Washington,D.C.,pp.277-288);嘧啶基氧基苯甲酸酯类(Subramanian等人(1990)Plant Physiol.94:239-244)和磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类（Tan等人,(2005)Pest Manag.Sci.61:246-57;Mallory-Smith和Retzinger,(2003)Weed Technology 17:620-626）。由于它们在非常低的施用率时的有效性和在动物中的相对无毒性，咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂被广泛地用于现代农业。通过抑制AHAS活性，这些除草剂家族阻止易感植物（包括许多杂草物种）的进一步生长和发育。商购可获得的咪唑啉酮类除草剂的几个实例是（咪草烟）、

（灭草喹）和

（灭草烟）。磺酰脲类除草剂的实例是绿磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、砜嘧磺隆、氟胺磺隆、醚苯磺隆、氟嘧磺隆、醚磺隆、酰嘧磺隆、啶嘧黄隆、唑吡嘧磺隆、吡嘧磺隆和吡氯磺隆。

由于它们的高效性和低毒性，喜欢将咪唑啉酮类除草剂通过在大范围植被的顶部的上方喷洒来施用。在大范围植被的顶部的上方喷施除草剂的能力减少了与种植场的建立和维护有关的费用，且减少了在使用这样的化学药品之前对场所准备的需要。在想要的耐受物种的顶部的上方进行喷施也因为不存在竞争物种而导致获得想要的物种的最大生产潜力。然而，使用这样的上方喷施（spray-over）技术依赖于在上方喷施区域中存在想要的植被的抗咪唑啉酮的物种。

在主要的农作物中，一些豆科物种例如大豆，由于其快速代谢除草剂化合物的能力而天然地对咪唑啉酮类除草剂具有抗性（Shaner和Robinson,(1985)Weed Sci.33:469-471）。其他作物例如玉米（Newhouse等人,(1992)Plant Physiol.100:882-886）和水稻（Barrett等人,(1989)Crop Safeners for Herbicides,Academic Press,New York,pp.195-220）对咪唑啉酮类除草剂有些易感。对咪唑啉酮类除草剂的不同敏感性依赖于特定除草剂的化学性质和在各植物中所述化合物从毒性至非毒性形式的不同代谢（Shaner等人,(1984)Plant Physiol.76:545-546;Brown等人,(1987)Pestic.Biochem.Physiol.27:24-29）。其他植物生理学差异例如吸收和转运也在敏感性上起着重要作用（Shaner和Robinson,(1985)Weed Sci.33:469-471）。

在玉米（Zea mays）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、欧洲油菜（即，油菜)、大豆（Glycine max）、烟草（Nicotiana tabacum）、甜菜(Beta vulgaris)和水稻（Oryza sativa）中使用种子、小孢子、花粉和愈伤组织诱变已成功地产生了抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和三唑并嘧啶类的植物（Sebastian等人,(1989)Crop Sci.29:1403-1408;Swanson等人,1989 Theor.Appl.Genet.78:525-530;Newhouse等人,(1991)Theor.Appl Genet.83:65-70;Sathasivan等人,(1991)Plant Physiol.97:1044-1050;Mourand等人,(1993)J.Heredity 84:91-96;Wright和Penner(1998)Theor.Appl.Genet.96:612-620;美国专利号5,545,822）。在所有情况下，单一的、部分显性的核基因提供了抗性。之前也在小麦Fidel栽培种（Triticum aestivum L.cv.Fidel）的种子诱变后分离了4种抗咪唑啉酮的小麦植物(Newhouse等人,(1992)Plant Physiol.100:882-886)。遗传研究确认了，单一的、部分显性的基因提供了抗性。基于等位基因的研究，作者推断出4种已鉴定的品系中的突变定位于相同的基因座。Fidel栽培种抗性基因中的一个被命名为FS-4（Newhouse等人,(1992)Plant Physio1.100:882-886）。

被发现具有咪唑啉酮类和/或磺酰脲类除草剂抗性的天然发生的植物群体也已用于开发抗除草剂的向日葵繁殖系（breeding line）。近年来，使用源于普通向日葵（Helianthus annuus）的野生群体的种质作为除草剂抗性性状的来源开发了两种抗磺酰脲类除草剂的向日葵品系(Miller和Al-Khatib,(2004)Crop Sci.44:1037-1038)。以前，White等人（(2002)Weed Sci.50:432-437）已报导，来自South Dakota,U.S.A.的普通向日葵野生群体中的个体对咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂具有交叉抗性。对于该群体中的个体的乙酰羟酸合酶大亚基（AHASL）基因的编码区的部分所进行的分析揭示了点突变，该点突变导致向日葵AHASL蛋白中的Ala至Val的氨基酸置换，这相应于野生型拟南芥AHASL蛋白中的Ala₂₀₅（White等人,(2003)Weed Sci.51:845-853）。更早前，Al-Khatib和Miller((2000)Crop Sci.40:869)报导了4种抗咪唑啉酮的向日葵繁殖系。

AHAS-抑制剂复合物的三维构象的基于计算机的建模预测了所提出的抑制剂结合袋中的几个氨基酸作为位点，在所述位点上诱导的突变可能提供对咪唑啉酮的选择性抗性（Ott等人,(1996)J.Mol.Biol.263:359-368）。用在AHAS酶的所提出的结合位点中的这些合理设计的突变之中的一些突变产生了烟草植物，这些小麦植物事实上已展示出对单一类别的除草剂的特异性抗性（Ott等人,(1996)J.Mol.Bio1.263:359-368）。

在许多专利中也已报道了对咪唑啉酮类除草剂的植物抗性。美国专利号4,761,373、5,331,107、5,304,732、6,211,438、6,211,439和6,222,100概括性地描述了改变的AHAS基因在植物中引发除草剂抗性的用途，并且具体地公开了某些抗咪唑啉酮的玉米品系。美国专利号5,013,659公开了由于一个或多个保守区域中的至少一个氨基酸的突变而展示出的除草剂抗性的植物。此处描述的突变编码对咪唑啉酮类和磺酰脲类的交叉抗性或磺酰脲类特异性抗性，但未描述咪唑啉酮特异性抗性。美国专利号5,731,180和美国专利号5,767,361论述了在野生型单子叶植物AHAS氨基酸序列中具有单个氨基酸置换的分离的基因，所述置换导致咪唑啉酮特异性抗性。此外，已通过突变育种，还通过从由花药培养产生的水稻植物库中选择抗除草剂的植物，开发了对于干扰AHAS的除草剂具有抗性的水稻植物。参见，美国专利号5,545,822、5,736,629、5,773,703、5,773,704、5,952,553和6,274,796。

在植物中，如在所有经检查的其他生物中一样，AHAS酶由两个亚基组成：大亚基（催化作用）和小亚基（调节作用）（Duggleby和Pang,(2000)J.Biochem.Mol.Biol.33:1-36）。AHAS大亚基（此处也称作AHASL）可由单基因编码，如在拟南芥和水稻的情况下，或由多基因家族成员编码，如在玉米、油菜和棉花的情况下。大亚基中特定的单核苷酸置换为酶提供了一定程度的对一种或更多种类别的除草剂的不敏感性（Chang和Duggleby,(1998)Biochem J.333:765-777）。

例如，小麦（Triticum aestivum L.）包含3个同源的乙酰羟酸合酶大亚基基因。这些基因中的每一个展示出显著的表达，基于来自所述三个基因中的每一个基因的突变体的除草剂应答和生物化学数据(Ascenzi等人,(2003)International Society of Plant MolecularBiologists Congress,Barcelona,Spain,Ref.No.S10-17)。所有三个基因的编码序列在核苷酸水平上共有广泛的同源性(WO 03/014357)。通过对来自小麦的几个变种的AHASL基因进行序列，发现在大多数耐受IMI（耐受咪唑啉酮）的品系中的除草剂耐受性的分子基础是突变S653(At)N，表示在等同于拟南芥中氨基酸653上的丝氨酸的位置处丝氨酸至天冬酰胺的置换（WO 03/01436;WO 03/014357）。该突变是由于在编码AHASL蛋白的DNA序列中的单核苷酸多态性（SNP）造成的。

还已知双子叶植物物种中存在多个AHASL基因。近年来，Recently,Kolkman等人((2004)Theor.Appl.Genet.109:1147-1159)报导来自抗除草剂的和野生型的向日葵(Helianthus annuus L.)的三种AHASL基因(AHASL1、AHASL2和AHASL3)的鉴定、克隆和测序。Kolkman等人报导，除草剂抗性由AHASL1蛋白中的Pro197Leu(使用拟南芥AHASL的氨基酸位置命名法)的置换或Ala205Val置换导致，以及这些置换中的各置换提供了对咪唑啉酮和磺酰脲类除草剂的抗性。

因为其高效性和低毒性，咪唑啉酮类除草剂有利于农业用途。然而，在特定的作物生产系统中使用咪唑啉酮类除草剂的能力依赖于目的作物植物的咪唑啉酮抗性变种的可获得性。为了产生这样的咪唑啉酮抗性变种，植物育种家需要开发出具有咪唑啉酮抗性性状的繁殖系。因此，需要作物植物的另外的咪唑啉酮抗性繁殖系和变种，以及用于产生和使用咪唑啉酮抗性繁殖系和变种的方法和组合物。

发明概述

本发明提供了当与野生型向日葵植物相比较时，具有增加的对除草剂的抗性的向日葵植物。特别地，当与野生型向日葵植物相比较时，本发明的向日葵植物具有增加的对咪唑啉酮除草剂的抗性。本发明的抗除草剂的向日葵植物包含至少一个拷贝的编码抗除草剂的乙酰羟酸合酶大亚基（AHASL）的基因或多核苷酸。这样的抗除草剂的AHASL蛋白在氨基酸位置107或等同位置上包含苏氨酸。本发明的抗除草剂的向日葵植物可包含1、2、3、4、5、6或更多个拷贝的编码本发明的抗除草剂的AHASL蛋白的基因或多核苷酸。本发明的向日葵植物也包括种子和后代植物，其包含至少一个拷贝的编码本发明的抗除草剂的AHASL蛋白的基因或多核苷酸。

在一个实施方案中，本发明提供了被命名为S4897的向日葵品系的抗除草剂的向日葵植物和其包含S4897的抗除草剂的特征的后代和衍生物。此处命名为GM40的遗传系来源于S4897并且具有其的抗除草剂的性质。已将GM40品系的种子的样品以ATCC专利保藏号PTA-6716保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。因此，本发明的包含GM40的抗除草剂的特征的向日葵植物和具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物也包含S4897的抗除草剂的性质。S4897向日葵植物、GM40向日葵植物和具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物以及包含S4897、GM40或具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物的抗除草剂的性质的其后代和衍生物在其基因组中包含AHASL1基因，所述AHASL1基因包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列和编码包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的AHASL1蛋白。当与由来自野生型向日葵植物的AHASL1编码的AHASL1蛋白(SEQID NO:4)的氨基酸（SEQ ID NO:3）序列相比较时，SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列与野生型氨基酸序列具有单个氨基酸的差异。在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中，在氨基酸位置7上是苏氨酸。该位置相应于SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列(注册号AY541451)编码的全长AHASL1蛋白中的位置107。在本发明的野生型AHASL1氨基酸序列（SEQ ID NO:4）中，该等同氨基酸位置具有丙氨酸。除非另外指出，此处提及的向日葵AHASL蛋白的氨基酸位置相应于SEQ IDNO:12所示的全长AHASL1蛋白中的氨基酸位置。

在另一个实施方案中，本发明提供了此处被命名为GM1606的向日葵品系的抗除草剂的向日葵植物。已将GM1606的遗传材料的种子的样品ATCC专利保藏号PTA-7606保藏在ATCC。因此，本发明提供了具有ATCC专利保藏号PTA-7606的抗除草剂的向日葵植物和包含具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的抗除草剂的性质的其后代和衍生物。与S4897和GM40向日葵植物一样，GM1606和包含GM1606的抗除草剂的性质的其后代和衍生物在其基因组中包含AHASL1基因，所述AHASL1基因编码在全长向日葵AHASL1蛋白的位置107上包含苏氨酸的AHASL1蛋白。类似地，具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物和包含具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的抗除草剂的性质的其后代和衍生物在其基因组中包含AHASL1基因，所述AHASL1基因编码在全长向日葵AHASL1蛋白的位置107上包含苏氨酸的AHASL1蛋白。

本发明还提供了向日葵（Helianthus annuus）AHASL蛋白的分离的多核苷酸和分离的多肽。本发明的多核苷酸包含编码抗除草剂的和野生型的AHASL蛋白（包括但不限于由AHASL1、AHASL2和AHASL3基因编码的蛋白）的核苷酸序列。本发明的抗除草剂的AHASL蛋白是在全长向日葵AHASL1蛋白的位置107或等同的位置上包含除了丙氨酸外的氨基酸的抗咪唑啉酮的AHASL蛋白。优选地，位置107或等同位置上的氨基酸是苏氨酸。本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO:1和3所示的核苷酸序列、编码SEQ ID NO:2和4所示的氨基酸序列的核苷酸序列以及所述核苷酸序列的编码具有AHAS活性的蛋白质的片段和变体。

本发明提供了用于在植物、植物细胞和其他非人宿主细胞中表达本发明的多核苷酸的表达盒。所述表达盒包含可在植物、植物细胞或其他目的宿主细胞中表达的、有效地连接至本发明多核苷酸的启动子，所述多核苷酸编码野生型的或抗除草剂的AHASL蛋白。如果需要将表达靶向叶绿体，那么表达盒还可包含有效地连接的编码叶绿体转运肽的叶绿体靶向序列以将表达的AHASL蛋白导向叶绿体。本发明的表达盒可在用于增强植物和宿主细胞的除草剂耐受性的方法中使用。该方法涉及用本发明的表达盒转化植物或宿主细胞，其中表达盒包含可在目的植物或宿主细胞中表达的启动子，所述启动子有效地连接至编码本发明的抗除草剂的AHASL蛋白的本发明多核苷酸。该方法还包括从转化的植物细胞再生出转化的植物。

本发明提供了用于增加植物中的AHAS活性的方法，其包括用包含与在植物细胞中驱动表达的启动子有效地连接的核苷酸序列的多核苷酸构建体转化植物细胞，和从转化的植物细胞再生出转化的植物。所述核苷酸序列选自编码本发明的抗除草剂的或野生型的AHASL蛋白的那些核苷酸序列，特别是SEQ ID NO:1和3所示的核苷酸序列、SEQ ID NO:2和4所示的核苷酸序列以及其片段和变体。当与未转化的植物相比较时，由该方法产生的植物具有增加的AHAS活性，或增加的除草剂抗性AHAS活性。

本发明提供了用于产生抗除草剂的植物的方法，其包括用包含与在植物细胞中驱动表达的启动子有效地连接的核苷酸序列的多核苷酸构建体转化植物细胞，和从所述转化的植物细胞再生出转化的植物。所述核苷酸序列选自编码本发明的抗除草剂的AHASL蛋白的那些核苷酸序列，特别是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，编码SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，以及其片段和变体，包括但不限于。当与未转化的植物相比较时，由该方法产生的抗除草剂的植物具有增加的对至少一种除草剂的抗性。

本发明提供了用于增强除草剂耐受性植物中的除草剂耐受性的方法。该方法用于增强植物的抗性，所述植物已对可杀死或严重损伤野生型植物的除草剂水平具有抗性。这样的除草剂耐受性植物可以是就除草剂耐受性已进行基因工程改造的除草剂耐受性植物或通过不涉及重组DNA的手段而形成的除草剂耐受性植物，例如，本发明的S4897、GM40和GM1606向日葵植物。所述方法包括用包含与在植物细胞中驱动表达的启动子有效地连接的核苷酸序列的多核苷酸构建体转化除草剂耐受性植物，和从转化的植物细胞再生出转化的植物。所述核苷酸序列选自编码本发明的抗除草剂的AHASL蛋白的那些核苷酸序列，特别是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列，以及其片段和变体。

本发明提供了包含本发明的选择标记基因的转化载体。所述选择标记基因包含与多核苷酸有效地连接的在宿主细胞中驱动表达的启动子，所述多核苷酸包含编码本发明的抗除草剂的AHASL蛋白的核苷酸序列。转化载体可额外地包含要在宿主细胞中表达的目的基因，如果想要，还可包含与本发明的多核苷酸有效地连接的叶绿体靶向序列。

本发明进一步提供了使用本发明的转化载体来挑选用目的基因转化的细胞的方法。这样的方法涉及用转化载体转化宿主细胞，将所述细胞暴露于可杀死或抑制未转化的宿主细胞生长的咪唑啉酮类除草剂水平，和通过其在除草剂存在的情况下生长的能力来鉴定转化的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是植物细胞，并且选择标记基因包含在植物细胞中驱动表达的启动子。

本发明提供了在本发明的抗除草剂的植物（包括上述的抗除草剂的向日葵和用本发明的抗除草剂的AHASL多核苷酸转化的植物）附近控制杂草的方法。此类转化的植物在其基因组内包含至少一个含有在植物细胞中驱动基因表达的启动子的表达盒，其中所述启动子有效地连接至本发明的AHASL多核苷酸。该方法包括向杂草和向抗除草剂的植物施用有效量的除草剂，其中当与野生型的或未转化的植物相比较时，所述抗除草剂的植物具有增加的对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮类的抗性。

本发明的植物可以是转基因的或非转基因的。具有增加的对咪唑啉酮类和/或磺酰脲类除草剂的抗性的非转基因向日葵植物的实例包括S4897、GM40或GM1606和具有ATCC专利保藏号PTA-6716或PTA-7606的向日葵植物；或S4897、GM40或GM1606和具有ATCC专利保藏号PTA-6716或PTA-7606的向日葵植物的、或两种或更多种S4897、GM40或GM1606和具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物和具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的突变体、重组体或经基因工程改造的衍生物;或S4897、GM40或GM1606和具有ATCC专利保藏号PTA-6716或PTA-7606的向日葵植物的、或两种或更多种S4897、GM40或GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物和具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的后代的突变体、重组体或基因工程衍生物；或为这些植物的任何一种的后代的植物；或包含S4897、GM40或GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物和/或具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的除草剂抗性性质的植物。

本发明还提供了用本发明的至少一种本发明的多核苷酸、表达盒或转化载体转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞。此类经转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞具有增加的对至少一种除草剂的耐受性或抗性，所述除草剂处于分别杀死或抑制未转化的植物、植物组织、植物细胞或非人宿主细胞的除草剂水平。优选地，本发明的经转化的植物、植物组织、植物细胞和种子是拟南芥、向日葵和其他作物植物。

本发明进一步提供了包含抗咪唑啉酮的和野生型的向日葵AHASL蛋白的分离的多肽。所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:2和4所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO:1和3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述氨基酸序列的编码具有AHAS活性的蛋白质的片段和变体。

附图简述

图1是抗除草剂的向日葵AHASL1基因（SEQ ID NO:1）、野生型向日葵AHASL1基因（SEQ ID NO:3）、GenBank登记号U16280(SEQ ID NO:5)、GenBank登记号AY541451(SEQ ID NO:11)和GenBank登记号AY124092(SEQ ID NO:13)的核苷酸序列的核苷酸序列比对。用星号标示(SEQ ID NO:1)中的突变位点。突变是SEQ IDNO:1的核苷酸位置21上的G至A的转换。

图2是抗除草剂的向日葵AHASL1蛋白（SEQ ID NO:2）、野生型向日葵AHASL1蛋白（SEQ ID NO:4）、GenBank登记号U16280(SEQ ID NO:6)、GenBank登记号AY541451(SEQ ID NO:12)和GenBank登记号AY124092(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列比对。星号表示在抗除草剂的向日葵AHASL1蛋白中发现的单一氨基酸置换(Ala至Thr)的位置。该置换位置相应于SEQ ID NO:2所示的部分长度的AHASL1氨基酸序列听氨基酸位置7。SEQ ID NO：12所示的全长向日葵AHASL1氨基酸序列中的该置换的等同位置是107。

图3是证明在温室研究中，与除草剂耐受性IMISUN-1向日葵植物(Al-Khatib和Miller(2000)Crop Sci.40:869-870)相比S4897向日葵植物（右侧）的增加的除草剂耐受性的照相说明。以200g ai/公顷的级别用咪草啶酸喷洒处理S4897和IMISUN-1向日葵植物。在以100或200g ai/ha的比率用咪草啶酸喷洒处理后，对照、野生型向日葵植物不能存活（数据未显示）。在喷洒处理植物数天后进行照相。

图4是在温室试验中以100(浅色柱)或200g ai/ha(深色柱)的用咪草啶酸喷洒处理的IMISUN-1、野生型和S4897向日葵植物后的除草剂损伤的照相说明。该图证明当与抗除草剂的IMISUN-1植物和野生型植物相比，S4897除草剂抗性向日葵植物具有显著更高对两种比率的的咪草啶酸的抗性或耐受性。在咪草啶酸使用后17天评价除草剂的损伤。已知IMISUN-1植物在氨基酸190上具有丙氨酸至缬氨酸的置换(Kolkman等人(2004)Theor.Appl.Genet.109:1147-1159)。

图5是证明在实施例4中描述的温室试验中与除草剂耐受性IMISUN-1向日葵植物相比，S4897向日葵植物（右侧）的增加的除草剂耐受性的照相说明。

图6是证明在实施例5中描述的温室试验中与

Variety A向日葵植物相比，S4897向日葵植物（右侧）的增加的除草剂耐受性的照相说明。

图7是实施例5中描述的是通过Raptor的非Clearfield品种、Clearfield品种和S4897向日葵植物对AHAS的抑制的比较的照相说明。

图8是是实施例5中描述的是通过Glean的非Clearfield品种、Clearfield品种和S4897向日葵植物对AHAS的抑制的比较的照相说明。

图9是在对两种向日葵的突变体处理后14天甲咪唑烟酸（imazapir）的叶片施用应用对植物高度的影响的照相说明。有正方形和代表平均值的标准差的误差棒表示平均高度（未处理的小块土地的%）。

图10是在对两种向日葵的突变体处理后14天甲咪唑烟酸（imazapir）的叶片施用应用对植物毒性指数（PI）的影响的照相说明。用正方形和代表平均值的标准差的误差棒表示平均PI。

图11是在对两种向日葵的突变体处理后14天甲咪唑烟酸（imazapir）的叶片施用应用对生物量累积的影响的照相说明。用正方形和代表平均值的标准差的误差棒表示平均干生物量（未处理的土地的%）。

图12是在对两种向日葵的突变体处理后14天imazapir的叶片施用应用对根生物量的影响的照相说明。用正方形和代表平均值的标准差的误差棒表示平均根干生物量（未处理的土地的%）。

序列表

使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母密码来显示在随附的序列表中所列出的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列遵从始于序列的5'末端并朝向3'末端前行（即，在各行中从左至右）的标准惯例。只显示了每个核苷酸序列的一条链，但应当理解通过对所展示的链的任何参照而包括了互补链。氨基酸序列遵从始于序列的氨基末端并朝向羧基末端前行（即，在各行中从左至右）的标准惯例。

SEQ ID NO:1显示了编码来自向日葵品系S4897的抗除草剂的AHASL1蛋白的部分长度的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2显示了由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的抗除草剂的AHASL1蛋白的部分长度的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3显示了编码来自向日葵品系BTK47的野生型AHASL1蛋白的部分长度的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4显示了由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码的野生型AHASL1蛋白的部分长度的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5显示了GenBank登记号U16280的核苷酸序列。

SEQ ID NO:6是GenBank登记号U16280的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7显示了实施例2中描述的HA1U409引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:8显示了实施例2中描述的HA1L1379引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:9显示了显示了实施例2中描述的HA1U1313引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:10显示了显示了实施例2中描述的HA1L2131引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO:11是GenBank登记号AY541451的核苷酸序列。

SEQ ID NO:12是GenBank登记号AY541451的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13是GenBank登记号AY124092的核苷酸序列。

SEQ ID NO:14是GenBank登记号AY124092的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

发明详述

本发明涉及当与野生型向日葵植物相比较时，具有增加的对除草剂的抗性的向日葵植物。如此处下面所描述的，通过下列过程来产生抗除草剂的向日葵植物：将野生型（就除草剂抗性而言）向日葵植物暴露于诱变剂，使植物成熟和繁殖，并选择相对于野生型向日葵植物的抗性而展现出增强的对咪唑啉酮类除草剂的抗性的后代植物。本发明提供了在此处被称为S4897、GM40和GM1606的抗除草剂的向日葵品系。

通过聚合酶链式反应（PCR）扩增从S4897抗除草剂的向日葵植物和BTK47野生型向日葵植物中分离乙酰羟酸合酶大亚基基因（称为AHASL1)的编码区，并进行测序。通过比较抗除草剂的向日葵植物和野生型向日葵植物的多核苷酸序列，发现来自抗除草剂的向日葵植物的AHASL1多核苷酸序列的编码区和来自野生型植物的AHASL1多核苷酸序列的编码区的不同之处在于在核苷酸21（SEQ ID NO:1）上的单个核苷酸G至A的转换。AHASL1多核苷酸序列中的该G至A的转换导致，相对于来自向日葵品系BTK47的野生型AHASL1蛋白的等同氨基酸位置(即,SEQ ID NO:4的氨基酸7)，在预测的抗除草剂的向日葵AHASL1蛋白（SEQ ID NO：2）的氨基酸序列的保守区域中氨基酸7(SEQ ID NO:2)上的丙氨酸至苏氨酸的置换。

因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列不相应于AHASL蛋白的全长编码区，因此，SEQ ID NO:2所示的编码的氨基酸序列也短于全长。为方便与其他向日葵AHASL氨基酸序列比较，除非另外指出或在其中该位置显现的上下文中是显然的，此处提及的向日葵AHASL的氨基酸位置相应于由具有GenBank登记号AY541451的核苷酸序列(SEQ ID NO:12)编码的向日葵AHASL1的全长氨基酸序列的氨基酸位置。因此，SEQ ID NO:2的氨基酸位置7上的丙氨酸至苏氨酸的置换相应于SEQ ID NO:12的氨基酸序列中的氨基酸位置107。

因此，本发明公开了可用于产生抗除草剂的向日葵AHASL蛋白的氨基酸置换、编码此类蛋白的多核苷酸和抗除草剂的植物、植物组织、植物细胞和种子。因为在野生型的、全长向日葵AHASL1蛋白中的氨基酸位置107或等同位置上发现的丙氨酸在于跨物种中是保守的氨基酸的区域内，因此预期另一种氨基酸优选苏氨酸对来自向日葵的其他AHASL蛋白（例如，AHASL2和AHASL3）中的该相同保守丙氨酸的置换也提供除草剂耐受性。因此，可通过本领域内已知的任何方法例如定点诱变突变编码向日葵AHASL蛋白的多核苷酸，从而产生编码在位置107或等同的位置上具有苏氨酸的AHASL蛋白的向日葵多核苷酸。相应于向日葵AHASL1、AHASL2和AHASL3基因的多核苷酸序列和由此编码的氨基酸序列示于GenBank登记号AY541451(SEQ ID NOS:11和12)、AY541452、AY541453、AY541454、AY541455、AY541456、AY541457和AY541458;其全部在此引用作为参考。因此，通过此处公开的方法将所述多核苷酸和由其编码的抗除草剂的AHASL蛋白用于产生抗除草剂的植物、植物细胞、植物组织和种子。

本发明额外地包含分别编码抗除草剂的AHASL2和AHASL3蛋白的分离的向日葵AHASL2和AHASL3多核苷酸。该抗除草剂的AHASL2和AHASL3蛋白各自在位置107或等同的位置上包含除了丙氨酸外的氨基酸。优选地在该抗除草剂的AHASL2和AHASL3的蛋白中，位置107或等同位置上的氨基酸是苏氨酸。

本发明还涉及包含编码乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)蛋白的核苷酸序列的分离离的多核苷酸分子和涉及此类AHASL蛋白。本发明公开了编码抗除草剂的向日葵AHASL1蛋白的多核苷酸的分离和核苷酸序列，所述抗除草剂的向日葵AHASL1蛋白来自通过野生型向日葵植物的化学诱变而产生的抗除草剂的向日葵植物。本发明的抗除草剂的AHASL1蛋白，当与相应的野生型氨基酸序列相比较时，在其各自的氨基酸序列中的位置107或等同的位置上具有丙氨酸至苏氨酸的置换。本发明还公开了编码野生型向日葵AHASL1蛋白的多核苷酸分子的分离和核苷酸序列。

本发明提供了编码来自向日葵（Helianthus annuus L.）的AHASL蛋白的分离的多核苷酸分子。具体地，本发明提供了分离的多核苷酸分子，其包含：SEQ ID NO:1和3中所示的核苷酸序列，编码包含SEQID NO:2和4中所示的氨基酸序列的AHASL蛋白的核苷酸序列，以及此类核苷酸序列的编码功能性AHASL蛋白的片段和变体。

本发明的分离的抗除草剂的AHASL多核苷酸分子包含编码抗除草剂的AHASL蛋白的核苷酸序列。这样的多核苷酸分子可在用于转化植物特别是作物植物的多核苷酸构建体中使用，以增强植物对除草剂的抗性，特别是已知抑制AHAS活性的除草剂，更特别地是咪唑啉酮类除草剂。这样的多核苷酸构建体可在表达盒、表达载休、转化载体、质粒等中使用。在用这样的多核苷酸构建体转化后获得的转基因植物显示出增加的对AHAS抑制性除草剂例如咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂的抗性。

本发明的组合物包含编码AHASL蛋白的核苷酸序列。特别地，本发明提供了分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含编码SEQID NO:2和4中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，和编码具有AHAS活性的多肽的其片段或变体。还提供了多肽，所述多肽具有由此处描述的多核苷酸分子，例如SEQ ID NO:1和3所示的多核苷酸分子，以及编码具有AHAS活性的多肽的其片段和变体所编码的氨基酸序列。

本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸分子或蛋白质或其生物学活性部分大体上或基本上不含这样的组分，即如在多核苷酸分子或蛋白质天然发生的环境中发现的，所述组分通常与所述多核苷酸分子或蛋白质相伴随或相互作用。因此，分离的或纯化的多核苷酸分子或蛋白质，当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或当通过化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。优选地，“分离的”核酸不含这样的序列（即，位于该核酸的5’和3’末端的序列）（优选地，蛋白质编码序列），即所述序列在该核酸所来源的生物体的基因组DNA中天然地位于该核酸的侧翼。例如，在多种不同的实施方案中，分离的多核苷酸分子可包含少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的这样的核苷酸序列，即所述核苷酸序列在该核酸所来源的细胞的基因组DNA中天然地位于该多核苷酸分子的侧翼。基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有低于大约30%、20%、10%、5%或1%（按干重计算）的污染性蛋白质的制剂。当通过重组产生本发明的蛋白质或其生物学活性部分时，优选地，培养基具有低于大约30%、20%、10%、5%或1%（按干重计算）的化学前体或非目的蛋白的化学物质。

本发明提供了包含AHASL蛋白的分离的多肽。分离的多肽包含选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和4所示的氨基酸序列，由SEQID NO:1和3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，和所述氨基酸序列的编码具有AHAS活性的AHASL多肽的功能性片段和变体。“功能性片段和变体”意指示所举例说明的多肽的片段和变体，其具有AHAS活性。

在本发明的某些实施方案中，所述方法包括耐受除草剂或抗除草剂的植物的使用。“除草剂耐受性”或“抗除草剂的”植物，意指对于至少一种处于通常杀死或抑制正常或野生型植物生长的水平的除草剂具有耐受性或抗性的植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的除草剂耐受性植物包含耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白。“除草剂耐受性AHASL蛋白”或“抗除草剂的AHASL蛋白”意指，当至少一种除草剂（已知其干扰AHAS活性，并处于已知抑制野生型AHASL蛋白的AHAS活性的除草剂浓度或水平）存在时，相对于野生型AHASL蛋白的AHAS活性，此类AHASL蛋白展示出更高的AHAS活性。此外，此类耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白的AHAS活性在此处还可称为“除草剂耐受性”或“抗除草剂的”AHAS活性。

对于本发明，术语“除草剂耐受性”和“抗除草剂的”可互换使用，并且认为具有相同的含义和相同的范围。类似地，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”可互换使用，并且认为具有相同的含义和相同的范围。同样，术语“抗咪唑啉酮的”和“咪唑啉酮抗性”可互换使用，并且认为分别与术语“耐受咪唑啉酮的”和“咪唑啉酮耐受性”具有相同的含义和相同的范围。

本发明包括抗除草剂的AHASL多核苷酸和抗除草剂的AHASL蛋白。“抗除草剂的AHASL多核苷酸”意指编码具有抗除草剂的AHAS活性的蛋白质的多核苷酸。“抗除草剂的AHASL蛋白”意指具有抗除草剂的AHAS活性的蛋白质或多肽。

此外，认识到可以通过用编码耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白的核苷酸序列转化植物或其祖先来将耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白导入植物。这样的耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白由耐受除草剂或抗除草剂的AHASL多核苷酸编码。可选择地，由于在植物或其祖先的基因组中于内源AHASL基因中天然发生的或诱导的突变，耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白可在植物中产生。

本发明提供了植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞，其具有增加的对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂的抗性。优选的除草剂的量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。“有效量”和“有效浓度”分别意指这样的量和浓度，即所述量和浓度足以杀死或抑制相似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞的生长，但所述量不杀死或不同样严重地抑制本发明的抗除草剂的植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞的生长。通常，除草剂的有效量是在农业生产系统中为了杀死目的杂草而常规使用的量。这样的量对于本领域技术人员来说是已知的。

“类似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”分别意指缺乏此处公开的本发明的除草剂抗性特征和/或特定多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。因此，术语“野生型”的使用不是想要指，植物、植物组织、植物细胞或其他宿主细胞在其基因组中缺少重组DNA和/或不具有与此处公开的抗除草剂特征不同的抗除草剂特征。

如此处所用的，除非另外清楚地指出，术语“植物”意指处于任何发育阶段的植物，以及可附着至或从整个完整植物分离的任何植物部分。此类植物部分包括，但不限于，植物的器官、组织和细胞。具体的植物部分的实例包括茎、叶、根、花序、花、小花、果实、花梗（pedicle）、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛（leaf hair）、种毛（seed hair）、花粉粒、小孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、保卫细胞和任何其他已知的植物的器官、组织和细胞。此外，要认识到种子是植物。

本发明的植物包括非转基因植物和转基因植物。“非转基因植物”意指在其基因组中缺少重组DNA的植物。“转基因植物”意指在其基因组中包含重组DNA的植物。可通过将重组DNA导入植物的基因组中来产生这样的转基因植物。当这样的重组DNA被整合入转基因植物的基因组中时，植物的后代也可包含该重组DNA。这样的后代植物也是转基因植物，即所述后代植物包含至少一个祖先转基因植物的重组DNA的至少一部分。

本发明提供了此处称作S4897的抗除草剂的向日葵品系和具有S4897的除草剂抗性特征的其后代和衍生物。2005年5月17日，向美国典型培养物保藏中心的专利保藏所（ATCC）,Mansassas,VA 20110USA保藏了来源于向日葵品系S4897并具有S4897的除草剂耐受性特征的GM40向日葵的种子，并被分配以ATCC专利保藏号PTA-6716。进行为期至少30年的向日葵品系GM40的保藏，并且在ATCC收到提供保藏的样品的最新请求后保藏至少5年。此外，申请者已满足37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品的存活证明。

本发明提供了此处称作GM1606的抗除草剂的向日葵品系。2006年5月19日，向美国典型培养物保藏中心（ATCC）的专利保藏所（ATCC）,Mansassas,VA 20110USA保藏了向日葵GM1606的种子，并被分配以ATCC专利保藏号PTA-7606。进行为期至少30年的向日葵GM1606的保藏，并且在ATCC收到提供保藏的样品的最新请求后保藏至少5年。此外，申请者已满足37 C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供样品的存活证明。

本发明提供了通过诱变育种产生的GM1606品系的抗除草剂的向日葵植物。通过将野生型向日葵植物暴露于诱变剂，特别是化学诱变剂，更特别是甲磺酸乙酯（EMS），来对植物进行诱变。然而，本发明不限于由涉及化学诱变剂EMS的诱变方法产生的抗除草剂的向日葵植物。本领域已知的任何诱变方法可用于产生本发明的抗除草剂的向日葵植物。此类诱变方法可涉及，例如，使用任何一种或多种下列诱变剂：放射线，例如X-射线、γ射线（例如，钴60或铯137）、中子（例如，原子反应堆中铀235的核裂变产物）、β射线（例如，从放射性同位素例如磷32或碳14发射的）和紫外射线（优选地，从2500至2900nm），和化学诱变剂，例如碱基类似物（例如，5-溴-尿嘧啶）、相关化合物（例如，8-乙氧基咖啡因）、抗生素（例如，链黑菌素）、烷化剂（例如，硫芥（sulfur mustards）、氮芥、环氧化物、ethylenamines、硫酸盐、磺酸盐、砜、内酯）、叠氮化合物、羟胺、亚硝酸或吖啶。也可通过下列方法来产生抗除草剂的植物：使用组织培养方法来挑选包含除草剂抗性突变的植物细胞，然后从其再生出抗除草剂的植物。参见，例如，美国专利号5,773,702和5,859,348，两者以其全部内容在此引用作为参考。诱变育种的更详细内容可参见"Principals ofCultivar Development"Fehr,1993 Macmillan Publishing Company，其公开内容在此引用作为参考。

S4897和GM1606品系的向日葵植物的AHASL1基因的分析揭示出，在SEQ ID NO:4的野生型AHASL1氨基酸序列的氨基酸位置7上发现了导致苏氨酸对丙氨酸的置换的突变。SEQ ID NOS:2和4中氨基酸位置7相应于SEQ ID NOS:12中所示的向日葵AHASL1蛋白的全长氨基酸序列中的氨基酸位置107。因此，本发明公开了，在AHASL蛋白的位置107或等同的位置上用另一种氨基酸置换丙氨酸可导致向日葵植物具有增强的对除草剂特别是咪唑啉酮类和/或磺酰脲类除草剂的抗性。如下面实施例6中所公开的，氨基酸位置107上的丙氨酸发生于AHASL蛋白的保守区域中。类似地，已经公开了已知可为包含这样的AHASL蛋白的赋予植物除草剂抗性的在AHASL的其他保守区域的氨基酸置换。因此，本发明的抗除草剂的向日葵植物包括，但不限于，在其基因组中包含至少一个拷贝的AHASL多核苷酸的向日葵植物，所述AHASL多核苷酸编码在氨基酸位置107或等同位置上包含苏氨酸的抗除草剂的AHASL蛋白。

本发明的向日葵植物还包括这样的植物，即所述植物相对于野生型AHASL蛋白在氨基酸位置107或等同位置上包含苏氨酸或除了丙氨酸外的另一种氨基酸，以及相对于野生型AHASL蛋白在AHASL蛋白中包含一个或多个另外的氨基酸置换，其中这样的向日葵植物，与野生型向日葵植物相比较，具有增加的对至少一种除草剂的抗性。这样的向日葵植物包含AHASL蛋白，所述AHASL蛋白在氨基酸位置107或等同的位置和至少一个成员上包含苏氨酸或除了丙氨酸外的另一种氨基酸，所述成员选自：氨基酸位置182或等同位置上的丙氨酸、苏氨酸、组氨酸、亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸；氨基酸位置188或等同位置上的异亮氨酸或除了苏氨酸外的氨基酸；氨基酸位置190或等同位置上的天冬氨酸或缬氨酸；氨基酸位置559或等同位置上的亮氨酸；和氨基酸位置638或等同位置上的天冬酰胺、苏氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸。

本发明提供了此处公开的在向日葵AHASL蛋白的保守区域内的特定氨基酸位置上具有氨基酸置换的AHASL蛋白。此外，本领域技术人员将认识到，这样的氨基酸位置可依赖于是否从例如氨基酸序列的N-末端添加或去除氨基酸而变化。因此，本发明包括在所引述的位置或等同位置（例如，“氨基酸位置107或等同位置”）上的氨基酸置换。“等同位置”意指位于与所举例说明的氨基酸位置相同的保守区域内的位置。这样的保守区域在本领域内是已知的（参见下列表4）或可通过此处公开的多个序列比对或通过本领域内已知的方法来确定。

此外，本发明提供了AHASL多肽，其包含已知为植物提供对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮类除草剂和/或磺酰脲类除草剂的抗性的氨基酸置换。这样的AHASL多肽包括，例如，在氨基酸位置107和至少一个选自下列的成员上包含苏氨酸的多肽，所述成员选自：氨基酸位置182或等同位置上的丙氨酸、苏氨酸、组氨酸、亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸；氨基酸位置188或等同位置上的异亮氨酸或除了苏氨酸外的另一种氨基酸；氨基酸位置190或等同位置上的天冬氨酸或缬氨酸；氨基酸位置559或等同位置上的亮氨酸；和氨基酸位置638或等同位置上的天冬酰胺、苏氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸。本发明还提供了编码此类AHASL多肽的分离的多核苷酸，以及包括此类多核苷酸的表达盒、转化载体、转化的宿主细胞、转化的植物和方法。

本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞或其他宿主细胞对至少一种干扰AHAS酶的活性的除草剂的耐受性或抗性的方法。优选地，这样的AHAS抑制性除草剂是咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类除草剂或其混合物。更优选地，这样的除草剂是咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂或其混合物。对于本发明，咪唑啉酮类除草剂包括，但不限于，

（咪草烟）、

（甲灭草烟）、

（咪草啶酸）、

（灭草喹）、

（imazethabenz）、

（灭草烟）、前述除草剂中任一种的衍生物和前述除草剂中两种或更多种的混合物，例如，灭草烟/咪草啶酸

更具体地，咪唑啉酮类除草剂可选自，但不限于，2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基)-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧酸、5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸、和6-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯与2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。优选使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。特别优选使用2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。

对于本发明，磺酰脲类除草剂包括，但不限于，绿磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、砜嘧磺隆、氟胺磺隆、醚苯磺隆、氟嘧磺隆、醚磺隆、酰嘧磺隆、啶嘧黄隆、唑吡嘧磺隆、吡嘧磺隆、吡氯磺隆、四唑嘧磺隆、cyclosulfuron、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆（iodosulfuron）、环氧嘧磺隆、甲磺胺磺隆、氟磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、三氟甲磺隆、前述除草剂中任一种的衍生物、和前述除草剂中两种或更多种的混合物。本发明的三唑并嘧啶类除草剂包括，但不限于，氯酯磺草胺（cloransulam）、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺。本发明的嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂包括，但不限于，双草醚（bispyribac）、嘧草硫醚（pyrithiobac）、嘧草醚（pyriminobac）、嘧啶肟草醚和环酯草醚。磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类除草剂包括，但不限于，氟酮磺隆（flucarbazone）和丙苯磺隆（propoxycarbazone）。

要认识到，嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂和嘧啶基硫代苯甲酸酯类除草剂紧密相关，并且由Weed Science Society of America都归纳在后一名称的标题之下。因此，本发明的除草剂还包括嘧啶基硫代苯甲酸酯类除草剂，包括，但不限于，上述的嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂。

本发明提供了用于增强植物中的AHAS活性的方法，其包括用包含与本发明的AHASL1核苷酸序列有效地连接的启动子的多核苷酸构建体转化植物。所述方法涉及将本发明的多核苷酸构建体导入至少一个植物细胞中，并从其再生出转化的植物。所述方法涉及使用能够在植物细胞中驱动基因表达的启动子。优选地，这样的启动子是组成型启动子或组织偏爱型启动子。所述方法可用于增强或增加植物对至少一种干扰AHAS酶的催化活性的除草剂特别是咪唑啉酮类除草剂的抗性。

本发明提供了用于在植物、植物组织、植物细胞和其他宿主细胞中表达本发明多核苷酸的表达盒。所述表达盒包含可在目的植物、植物组织、植物细胞和其他宿主细胞中表达的并与本发明多核苷酸有效地连接的启动子，所述多核苷酸包含编码全长的（即包括叶绿体转运肽）或成熟的AHASL1蛋白（即无叶绿体转运肽）的核苷酸序列。如果想在植物或植物细胞的质体或叶绿体中表达，表达盒还可包含有效地连接的编码叶绿体转运肽的叶绿体靶向序列。

本发明的表达盒可在用于增强植物或宿主细胞的除草剂耐受性的方法中使用。所述方法涉及用本发明的表达盒转化植物或宿主细胞，其中所述表达盒包含可在目的植物或宿主细胞中表达的启动子，和该启动子有效地连接至本发明的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本发明的抗咪唑啉酮的AHASL蛋白的核苷酸序列。

此处所用的术语“多核苷酸构建体”并不希望将本发明限定于包含DNA的多核苷酸构建体。本领域技术人员将认识到，由核糖核苷酸以及由核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合所构成的多核苷酸构建体，特别是多核苷酸和寡核苷酸，也可用于此处公开的方法。因此，本发明的多核苷酸构建体包括可在本发明的用于转化植物的方法中使用的所有多核苷酸构建体，包括但不限于，由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其组合构成的多核苷酸构建体。这样的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然发生的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸构建体还包括所有形式的多核苷酸构建体，包括但不限于，单链形式、双链形式、发夹结构、干环结构等。此外，本领域技术人员会理解，此处公开的每个核苷酸序列还包括该示例性核苷酸序列的互补序列。

此外，将会认识到，本发明的方法可使用能够在转化的植物中指导至少一种蛋白，或至少一种RNA例如与mRNA的至少一部分互补的反义RNA的表达的多核苷酸构建体。通常，这样的多核苷酸构建体由蛋白质或RNA的编码序列组成，所述编码序列有效地连接至5'和3'转录调控区。可选择地，还将会认识到，本发明的方法可使用在转化的植物中不能指导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸构建体。

此外，将会认识到，为了在目的宿主细胞中表达本发明的多核苷酸，所述多核苷酸通常有效地连接至能够在目的宿主细胞中驱动基因表达的启动子。用于在宿主细胞中表达多核苷酸的本发明方法不依赖于特定的启动子。所述方法包括使用本领域已知的并能够在目的宿主细胞中驱动基因表达的任何启动子。

本发明包括AHASL多核苷酸分子及其片段和变体。本发明还包括作为这些核苷酸序列的片段的多核苷酸分子。“片段”意指编码本发明的AHASL蛋白的核苷酸序列的一部分。本发明的AHASL核苷酸序列的片段可编码AHASL蛋白的生物学活性部分，或者其可以是片段，所述片段能够用作使用下面公开的方法的杂交探针或PCR引物。可以通过下述过程来制备AHASL蛋白的生物活性部分：分离本发明的AHASL核苷酸序列中的一种核苷酸序列的一部分，表达被编码的AHASL蛋白的部分（例如，通过体外重组表达），和评估被编码的AHASL1蛋白的部分的活性。作为AHASL核苷酸序列的片段的多核苷酸分子，依赖于想要的用途，包含至少大约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050或1100个核苷酸，或高达在此处公开的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目（例如，对于SEQ ID NO:1和3，1178个核苷酸）。

编码本发明AHASL蛋白的生物学活性部分的AHASL核苷酸序列的片段将编码至少大约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300或350个连续氨基酸，或高达在本发明的全长AHASL1蛋白中存在的氨基酸总数（例如，对于SEQ ID NO:2和4，392个氨基酸）。用作PCR引物的杂交探针的AHASL1核苷酸序列片段通常不需要编码AHASL1蛋白的生物学活性部分。

本发明还包括作为此处公开的核苷酸序列的变体的多核苷酸分子。本发明AHASL核苷酸序列的“变体”包括这样的序列，即所述序列编码此处公开的AHASL蛋白，但由于遗传密码的简并性而保守地不同。可使用熟知的分子生物学技术例如下面概述的聚合酶链式反应（PCR）和杂交技术来鉴定这些天然发生的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括通过合成方法衍生出的核苷酸序列，其如下所述已经通过例如使用定位诱变而产生，但仍编码在本发明中公开的AHASL1蛋白。一般地，本发明的核苷酸序列变体将会与此处公开的特定核苷酸序列具有至少大约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。变体AHASL核苷酸序列将分别编码具有这样的氨基酸序列的AHASL蛋白，所述氨基酸序列与此处公开的AHASL蛋白的氨基酸序列具有至少大约70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

此外，本领域技术人员还会认识到，可通过突变向本发明的核苷酸序列中引入变化，从而导致所编码的AHASL蛋白的氨基酸序列的变化而不改变AHASL蛋白的生物学活性。因此，通过向此处公开的相应核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸置换、添加或缺失，从而将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失引入所编码的蛋白质中，可以产生编码AHASL蛋白的分离的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子分别具有与SEQ ID NO:1或3的序列不同的序列。可通过标准技术例如定位诱变和PCR介导的诱变来导入突变。本发明还包括这样的变体核苷酸序列。

例如，优选地，可在一个或多个预测的、优选地非必需的氨基酸残基上进行保守氨基酸置换。“非必需的”氨基酸残基是可从AHASL蛋白的野生型序列（例如，分别为SEQ ID NO:2和4的序列）进行改变而不改变生物学活性的残基，然而“必需的”氨基酸残基是生物学活性所必需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的置换。在本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、具有酸性侧链的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非极性侧链的氨基酸（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。不对保守氨基酸残基或存在于保守基元中的氨基酸残基进行这样的置换。

可以以许多途径来改变本发明的蛋白质，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。用于这样的操作的方法在本领域中是普遍已知的。例如，可通过DNA中的突变来制备AHASL蛋白的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Kunkel,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492;Kunkel等人,(1987)Methods in Enzymol.154:367-382;美国专利号4,873,192;Walker和Gaastra,eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company,New York)和在此引用的参考文献。关于不影响目的蛋白的生物学活性的合适氨基酸置换的指南可在Dayhoff等人,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到，所述参考文献在此处引用作为参考。保守置换，例如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸互换，可以是优选的。

可选择地，通过沿着AHASL编码序列的全部或部分而随机地引入突变（例如通过饱和诱变）可以制得变体AHASL核苷酸序列，和可以就AHAS活性对所得的突变体进行筛选，以鉴定保留了AHAS活性（包括抗除草剂的AHAS活性）的突变体。诱变后，可重组地表达所编码的蛋白质，并可使用标准测定技术来确定蛋白质的活性。

因此，本发明的核苷酸序列包括此处公开的序列及其片段和变体。本发明的AHASL核苷酸序列及其片段和变体，可用作探针和/或引物以用于在其他植物中鉴定和/或克隆AHASL同系物(homologue)。这样的探针可用于检测编码相同或同一蛋白质的转录物或基因组序列。

以该方式，可使用诸如PCR、杂交等的方法来鉴定与本发明的序列基本上同一的此类序列。参见，例如，Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:Laboratory Manual(第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Plainview,NY)，和Innis等人,(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,NY)。本发明包括基于其与此处所示的AHASL1核苷酸序列或其片段和变体的序列同一性而分离的AHASL核苷酸序列。

在杂交方法中，已知的AHASL核苷酸序列的全部或部分可以用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建这样的cDNA和基因组文库的方法在本领域中是普遍已知的，并公开于Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Plainview,NY)中。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并可以用可检测的基团例如³²P，或任何其他可检测的标记物例如其他同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子，来进行标记。可通过对基于此处公开的已知AHASL核苷酸序列的合成的寡核苷酸进行标记来制备用于杂交的探针。另外可使用简并引物，所述引物是基于在已知的AHASL核苷酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计的。探针通常包含这样的核苷酸序列区域，所述核苷酸序列区域在严紧条件下与本发明的AHASL核苷酸序列或其片段或变体的至少大约12，优选地大约25，更优选地大约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1100或1178个连续核苷酸杂交。用于杂交的探针的制备在本领域中是普遍已知的，并公开于Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)，该文献在此处引用作为参考。

例如，此处公开的完整的AHASL序列或者其一个或多个部分可用作能够特异性地与相应AHASL序列和信使RNA杂交的探针。杂交技术包括涂板的DNA文库(斑或集落;参见，例如，Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Plainview,New York)的杂交筛选。

可在严紧条件下进行此类序列的杂交。“严紧条件”或“严紧杂交条件”意指这样的条件，即在该条件下，探针与其靶序列的杂交程度将会比与其他序列的杂交程度可检测地更高（例如，高于背景至少2倍）。严紧条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下将会不同。

一般地，严紧杂交条件是，在pH 7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，通常为大约0.01至1.0M Na离子浓度（或其他盐），并且对于短探针（例如，10至50个核苷酸）温度为至少大约30℃和对于长探针（例如，大于50个核苷酸）温度为至少大约60℃。还可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺来获得严紧条件。示例性的低严紧条件包括，在37℃下使用30-35%的甲酰胺、1M NaCl、1% SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲溶液进行杂交，和在50-55℃下在1×至2×SSC（20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠）中进行洗涤。示例性的中等严紧条件包括，在37℃下在40-45%的甲酰胺、1.0M NaCl、1% SDS中进行杂交，和在55-60℃下在0.5×至1×SSC中进行洗涤。示例性的高严紧条件包括，在37℃下在50%的甲酰胺、1M NaCl、1% SDS中进行杂交，和在60-65℃下在0.1×SSC中进行洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含大约0.1%至大约1%的SDS。杂交的持续时间通常少于大约24小时，通常为大约4至大约12小时。

特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交物，可根据Meinkoth和Wahl,(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：T_m＝81.5℃＋16.6（log M）＋0.41（%GC）－0.61（%form）－500/L，估算出T_m；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，%form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，和L是以碱基对表示的杂交物的长度。T_m是这样的温度（在确定的离子强度和pH下），即在该温度下50%的互补靶序列与完美匹配的探针杂交。对于每1%的错配，T_m下降大约1℃；因此，可调整T_m、杂交和/或洗涤条件以使与具有所希望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有≥90%的同一性的序列，那么可将T_m下降10℃。一般地，选择严紧条件以使其比在确定的离子强度和pH下特定序列与其互补序列的热解链点(T_m)低大约5℃。然而，非常严紧条件可在比热解链点（T_m）低1、2、3或4℃下进行杂交和/或洗涤；中等严紧条件可在比热解链点（T_m）低6、7、8、9或10℃下进行杂交和/或洗涤；低严紧条件可在比热解链点（T_m）低11、12、13、14、15或20℃下进行杂交和/或洗涤。使用公式、杂交和洗涤组合物、以及想要的T_m，本领域技术人员将会理解，固有地描述了杂交和/或洗涤溶液的严紧度的变化。如果想要的错配程度导致低于45℃（水溶液）或32℃（甲酰胺溶液）的T_m，则优选地增加SSC浓度以使得能够使用更高的温度。关于核酸的杂交的详尽指导可见于Tijssen,(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I部分,第2章(Elsevier,New York);和Ausubel等人,eds.(1995)Current Protocolsin Molecular Biology,第2章（Greene Publishing andWiley-Interscience,New York）。参见Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Plainview,New York）。

将会认识到，本发明的多核苷酸分子和蛋白质包括，包含与SEQID NO:1和/或3的核苷酸序列或者与SEQ ID NO:2和/或4的氨基酸序列充分同一的核苷酸或氨基酸序列的多核苷酸分子和蛋白质。术语“充分同一的”在此处涉及这样的第一氨基酸或核苷酸序列，所述第一氨基酸或核苷酸序列相对于第二氨基酸或核苷酸序列来说包含足够或最少数目的相同的或等同的（例如，具有相似的侧链）氨基酸残基或核苷酸，这样第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，此处将包含具有至少大约45%、55%或65%的同一性，优选地75%的同一性，更优选地85%、95%或98%的同一性的共同结构域的氨基酸或核苷酸序列定义为是充分同一的。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分数是由这些序列共有的相同位置的数目的函数（即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置的总数（例如，重叠位置）×100)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。可使用与下面描述的技术相似的技术来确定两个序列之间的同一性百分数，允许或不允许缺口。在计算同一性百分数时，一般计算准确匹配的数目。

可使用数学算法来确定两个序列之间的同一性百分数。用于两个序列的比较的数学算法的优选并且非限定性实例是Karlin和Altschul,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法，在Karlin和Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中改进的算法。将此类算法整合入Altschul等人,(1990)J.Mol.Bio1.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可使用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12，来进行BLAST核苷酸搜寻，以获得与本发明的多核苷酸分子同源的核苷酸序列。可使用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3，来进行BLAST蛋白搜寻，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对（gapped alignment），可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述使用Gapped BLAST。可选择地，可使用PSI-Blast来进行可检测分子之间远缘关系的迭代搜寻。参见Altschul等人,（1997）,同上。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各自程序（例如，XBLAST和NBLAST）的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一个优选并且非限定性实例是Myers和Miller,(1988)CABIOS 4:11-17的算法。将此类算法整合入ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表（PAM120 weight residue table）、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。也可通过检查而人工地进行比对。

除非另外指出，此处提供的序列同一性/相似性值是指使用本发明的全长序列和使用多重比对而获得的值，所述多重比对借助于使用软件包Vector NTI Suite Version 7(InforMax,Inc.,Bethesda,MD,USA)中包含的程序AlignX（使用缺省参数）或其任何等同的程序，通过算法Clustal W(Nucleic Acid Research,22(22):4673-4680,1994)来进行。“等同的程序”意指任何序列比较程序，其对于所研究的任何两个序列，当与由软件包Vector NTI Suite Version 7中的AlignX产生的相应比对进行比较时，产生具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。

本发明的AHASL核苷酸序列包括天然发生的序列和突变体形式，特别是编码具有抗除草剂的AHAS活性的AHASL蛋白的突变体形式。同样地，本发明的蛋白质包括天然发生的蛋白质以及其变异和经修饰的形式。这样的变体将继续拥有想要的AHAS活性。明显地，将在编码变体的DNA中产生的突变必须不能将序列置于阅读框架之外，且优选地将不形成可产生二级mRNA结构的互补区。参见，EP专利申请公开号75,444。

预期此处包括的蛋白质序列的缺失、插入和置换不在蛋白质的特征方面产生根本的改变。然而，当在这样做之前难以预测置换、缺失或插入的确切效果时，本领域技术人员将认识到，可通过常规筛选测定法来评估所述效果。即，可通过AHAS活性测定法来评估活性。参见，例如，Singh等人,(1988)Anal.Biochem.171:173-179，此处引用作为参考。

变体核苷酸序列和蛋白质还包括从致诱变的和诱重组的（recombinogenic）过程例如DNA混编而衍生出的序列和蛋白质。通过这样的过程，可操作一个或多个不同的AHASL编码序列以产生具有想要的特性的新的AHASL蛋白。这样，从一群相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库，所述相关序列多核苷酸包含具有充分序列同一性且可在体外或体内进行同源重组的序列区域。例如，使用该方法，可在本发明的AHASL基因和其他已知AHASL基因之间混编编码目的结构域的序列基序以获得编码具有改进的目的性质（例如在酶的情况下，增加的K_m）的蛋白质的新基因。用于这样的DNA混编的策略在本领域中是已知的。参见，例如，Stemmer,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751;Stemmer,(1994)Nature 370:389-391;Crameri等人,(1997)Nature Biotech.15:436-438;Moore等人,(1997)J Mol.Biol.272:336-347;Zhang等人,(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4504-4509;Crameri等人,(1998)Nature 391:288-291;和美国专利号5,605,793和5,837,458。

本发明的核苷酸序列可用于分离来自其他生物,特别是其他植物,更特别是其他双子叶植物的相应序列。这样，使用诸如PCR、杂交等的方法，基于其与此处所示的序列的序列同一性，可以鉴定这样的序列。本发明包括基于其与此处所示的完整的AHASL序列或其片段的序列同一性而分离的序列。因此，本发明包括分离的序列，其编码AHASL蛋白，并在严紧条件下与此处公开的序列或其片段杂交。

在PCR方法中，可设计用于PCR反应的寡核苷酸引物，以从提取自任何目的植物的cDNA或基因组DNA中扩增出相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中是普遍已知的，并公开于Sambrook等人,(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)。还可参见Innis等人,eds.(1990)PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications(Academic Press,New York);Innis和Gelfand,eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press,New York);以及Innis和Gelfand,eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,New York)。已知的PCR的方法包括，但不限于，使用成对引物、嵌套引物、单一特异性引物（single specific primers）、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在用于在目的植物中进行表达的表达盒之中提供本发明的AHASL多核苷酸序列。表达盒将包含与本发明的AHASL多核苷酸序列有效地连接的5'和3'调控序列。“有效地连接的”意指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起动和介导相应于第二序列的DNA序列的转录。一般地，“有效地连接的”是指，被连接的核酸序列是紧邻的，并且在需要将两个蛋白质编码区连在一起时，它们是紧邻的并在同一个阅读框架内。表达盒可额外地包含至少一个将被共转化入生物体中的另外的基因。可选择地，可在多个表达盒上提供所述另外的基因。

提供具有多个限制位点的这样的表达盒，所述限制位点用于插入AHASL多核苷酸序列以使其在调控区的转录调控之下。表达盒可额外地包含选择标记基因。

表达盒将以5'-3'的转录方向包含转录和翻译的起始区（即，启动子）、本发明的AHASL多核苷酸序列、以及在植物中具有功能的转录和翻译的终止区（即，终止区）。启动子对于植物宿主和/或对于本发明的AHASL多核苷酸序列来说可以是天然的或类似的，或是外源的或异源的。此外，启动子可以是天然的序列或可选择地是合成的序列。当启动子对于植物宿主来说是“外源的”或“异源的”时，是想表示该启动子不是在导入该启动子的天然植物中发现的。当启动子对于本发明的AHASL多核苷酸序列来说是“外源的”或“异源的”时，是想表示该启动子对于有效地连接的本发明的AHASL多核苷酸序列来说不是天然的或天然发生的启动子。如此处所用的，嵌合基因包含编码序列，所述编码序列有效地连接至与其异源的转录起始区。

虽然使用异源启动子表达本发明的AHASL多核苷酸可以是优选的，但可使用天然的启动子序列。这样的构建体可在植物或植物细胞中改变AHASL蛋白的表达水平。因此，改变了植物或植物细胞的表型。

终止区可以和转录起始区一起是天然的，可以和有效地连接的目的AHASL序列一起是天然的，可以和植物宿主一起是天然的，或者可以源自另一种来源（即，对于启动子、目的AHASL多核苷酸序列、植物宿主或其任何组合来说是外源的或异源的）。可从根癌土壤杆菌（A.tumefaciens)的Ti-质粒获得方便的终止区，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还可参见Guerineau等人,(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Cell 64:671-674;Sanfacon等人,(1991)Genes Dev.5:141-149;Mogen等人,(1990)Plant Cell 2:1261-1272;Munroe等人,(1990)Gene 91:151-158;Ballas等人,(1989)NucleicAcids Res.17:7891-7903;和Joshi等人,(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。

当适当的时候，可以对基因进行优化以为了在转化的植物中具有增加的表达。即，为了具有提高的表达，可使用植物偏爱的密码子来合成基因。关于宿主偏受的密码子使用的讨论可参见，例如，Campbell和Gowri,(1990)Plant Physiol.92:1-11。在本领域可获得的用于合成植物偏受的基因的方法。参见，例如美国专利号5,380,831和5,436,391，和Murray等人,(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498,此处引用作为参考。

已知的额外的序列修饰可增强在细胞宿主中的基因表达。这些修饰包括去除编码假多腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复和可能对基因表达有害的其他这样的经详尽表征的序列。可调节序列的G-C含量至给定细胞宿主的平均水平，如参照在该宿主细胞中表达的已知基因而计算出的水平。当可能时，对序列进行修饰以避免预测的发夹二级mRNA结构。

还可在植物表达载体中使用用于增强基因表达的核苷酸序列。这些序列包括玉米AdhI，intron1基因的内含子（Callis等人,Genes andDevelopment 1:1183-1200,1987），和来自烟草花叶病毒（TMV）、玉米褪绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒的前导序列，（W-序列）（Gallie等人,Nucleic Acid Res.15:8693-8711,1987;和Skuzeski等人,PlantMol.Biol.15:65-79,1990）。已显示，来自玉米的shrunken-1基因座的第一个内含子增加嵌合基因构建体中的基因的表达。美国专利号5,424,412和5,593,874公开了基因表达构建体中的特定内含子的用途，Gallie等人（Plant Physiol.106:929-939,1994）也已显示，在组织特异的基础上，内含子可用于调节基因表达。为进一步增强或优化AHAS小亚基基因表达，本发明的植物表达载体还可包含含有基质附着区（MAR）的DNA序列。然后，用这样的经修饰的表达系统转化的植物细胞可展示出本发明核苷酸序列的过表达或组成型表达。

表达盒可额外地在表达盒构建体中包含5'前导序列。这样的前导序列可起着增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域中是已知的，并包括：小RNA病毒前导序列，例如，EMCV前导序列（脑心肌炎5'非编码区）（Elroy-Stein等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6126-6130）;马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV前导序列（烟草蚀纹病毒）（Gallie等人,(1995)Gene 165(2):233-238）,MDMV前导序列（玉米矮花叶病毒）（Virology 154:9-20）,和人免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）（Macejak等人,(1991)Nature 353:90-94）；来自苜蓿花叶病毒（AMV RNA 4）的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列（Jobling等人,(1987)Nature 325:622-625）；烟草花叶病毒前导序列（TMV)(Gallie等人,(1989)Molecular Biology of RNA,ed.Cech(Liss,New York),pp.237-256）；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列（MCMV）（Lommel等人,(1991)Virology 81:382-385）。还参见，Della-Cioppa等人,(1987)Plant Physiol.84:965-968。还可使用已知用于增强翻译的其他方法，例如，内含子等。

在制备表达盒的过程中，可操作各种不同的DNA片段，从而以正确的方向，和在合适时以正确的阅读框架，提供DNA序列。为此目的，可使用接合体或连接体来连接DNA片段，或可采用其他操作来提供方便的限制位点、多余DNA的去除、限制位点的去除等。为了该目的，可涉及体外诱变、引物修补、限制（restriction）、退火、再置换（resubstitutions）,例如转换和颠换。

许多启动子可用于本发明的实践中。可基于想要的结果来选择启动子。可将核酸与组成型启动子、组织偏爱型启动子或其他启动子组合用于在植物中表达。

这样的组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子以及在WO 99/43838和美国专利号6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子（Odell等人,(1985)Nature 313:810-812）；水稻肌动蛋白（McElroy等人,(1990)Plant Cell 2:163-171）；遍在蛋白（Christensen等人,(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632，和Christensen等人,(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689）；pEMU（Last等人,(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588）；MAS（Velten等人,(1984)EMBO J.3:2723-2730）；ALS启动子（美国专利号5,659,026）等。其他组成型启动子包括，例如，美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。

组织偏爱型启动子可用于靶定在特定植物组织内增强的AHASL1表达。这样的组织偏爱型启动子包括，但不限于，叶偏爱型启动子、根偏爱型启动子、种子偏爱型启动子和茎偏爱型启动子。组织偏爱型启动子包括Yamamoto等人,(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等人,(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等人,(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell等人,(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart等人,(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp等人,(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等人,(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等人,(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam,(1994)Results Probl.CellDiffer.20:181-196；Orozco等人,(1993)Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia等人,(1993)Plant J.4(3):495-505。如果需要，可修饰这样的启动子以获得弱表达。

在一个实施方案中，将目的核酸靶向叶绿体以进行表达。这样，当目的核酸未被直接插入叶绿体时，表达盒将会额外地包含叶绿体靶向序列，所述叶绿体靶向序列包含编码用于指导目的基因产物至叶绿体的叶绿体转运肽的核苷酸序列。这样的转运肽在本领域中是已知的。关于叶绿体靶向序列，“有效地连接的”是指将编码转运肽（即，叶绿体靶向序列）的核酸序列连接至本发明的AHASL多核苷酸以使两个序列是紧邻的并在同一个阅读框架中。参见，例如，Von Heijne等人；(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等人,(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人,(1987)Plant Physiol.84:965-968；Romer等人,(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等人,(1986)Science 233:478-481。虽然本发明的AHASL蛋白包含天然的叶绿体转运肽，但可通过将叶绿体靶向序列有效地连接至编码本发明的成熟AHASL蛋白的5'-末端，来将本领域中已知的任何叶绿体转运肽融合至本发明的成熟AHASL蛋白的氨基酸序列。

叶绿体靶向序列在本领域中是已知的，并包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco）的叶绿体小亚基（de Castro Silva Filho等人,(1996)Plant Mol.Biol.30:769-780；Schnell等人,(1991)J.Biol.Chem.266(5):3335-3342）;5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）（Archer等人,(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810）；色氨酸合酶（Zhao等人,(1995)J.Biol.Chem.270(11):6081-6087）；质体蓝素（Lawrence等人,(1997)J.Biol.Chem.272(33):20357-20363）；分支酸合酶（Schmidt等人,(1993)J.Biol.Chem.268(36):27447-27457）；和集光叶绿素a/b结合蛋白（LHBP）（Lamppa等人,(1988)J.Biol.Chem.263:14996-14999）。还可参见Von Heijne等人,(1991)Plant Mol.Biol Rep.9:104-126；Clark等人,(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人,(1987)Plant Physiol.84:965-968；Romer等人,(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等人,(1986)Science 233:478-481。

用于转化叶绿体的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Svab等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8526-8530；Svab和Maliga,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:913-917；Svab和Maliga,(1993)EMBO J.12:601-606。所述方法依靠对包含选择标记的DNA进行基因枪递送，和通过同源重组将DNA靶向至质体基因组。此外，通过经核编码的并质体定向的RNA聚合酶的组织偏爱型表达而反式激活沉默的由质体承载的转基因，可进行质体转化。在McBride等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7301-7305中已报导了这样的系统。

可为了在叶绿体中表达而优化被靶向叶绿体的目的核酸，从而解决植物细胞核与该细胞器之间的密码子使用的差异。这样，可使用叶绿体偏爱型密码子来合成目的核酸。参见，例如，美国专利号5,380,831，此处引用作为参考。

如此处所公开的，本发明的AHASL核苷酸序列可用于增强植物的除草剂耐受性，所述植物在其基因组中包含编码除草剂耐受性AHASL蛋白的基因。这样的基因可以是内源基因或转基因。此外，在某些实施方案中，可以用目的核苷酸序列的任何组合来堆叠本发明的核酸序列，以产生具有想要的表型的植物。例如，可以用任何其他编码多肽的多核苷酸来堆叠本发明的多核苷酸，所述多肽具有杀虫和/或杀昆虫活性，例如，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）毒素蛋白（描述于美国专利号5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756、5,593,881;和Geiser等人,(1986)Gene 48:109）。产生的组合还可包含多个拷贝的任一目的多核苷酸。

将会认识到，使用这些核苷酸序列，可以构建出与AHASL多核苷酸序列的信使RNA（mRNA）的至少一部分互补的反义构建体。构建反义核苷酸以便与相应的mRNA杂交。可进行反义序列的修饰，只要所述序列与相应的mRNA杂交并干扰其表达。这样，可使用与相应的被反义的序列具有70%、优选地80%、更优选地85%的序列同一性的反义构建体。此外，可使用反义核苷酸的部分以扰乱靶基因的表达。一般地，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或更多个核苷酸的序列。

还可以以有义方向使用本发明的核苷酸序列，以抑制植物中的内源基因的表达。使用有义方向的核苷酸序列来抑制植物中的基因表达的方法在本领域中是已知的。所述方法通常涉及用包含在植物中驱动表达的启动子的DNA构建体转化植物，所述启动子有效地连接至相应于内源基因转录物的核苷酸序列的至少一部分。通常，这样的核苷酸序列与内源基因转录物的序列具有实质的序列同一性，优选地大于大约65%的序列同一性，更优选地大于大约85%的序列同一性，最优选地大于大约95%的序列同一性。参见，美国专利号5,283,184和5,034,323；此处引用作为参考。

虽然本发明的抗除草剂的AHASL1多核苷酸可用作植物转化的选择标记，但本发明的表达盒可包含另一种用于选择转化的细胞的选择标记基因。选择标记基因，包括本发明的选择标记基因，用于转化的细胞或组织的选择。标记基因包括，但不限于，编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II（NEO）和潮霉素磷酸转移酶（HPT）的基因，以及提供对除草剂化合物例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮类和2,4-二氯苯氧基乙酸酯（2,4-D）的抗性的基因。一般可参见，Yarranton,(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christopherson等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6314-6318；Yao等人,(1992)Cell 71:63-72；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422；Barkley等人,(1980)The Operon,pp.177-220；Hu等人,(1987)Cell 48:555-566；Brown等人,(1987)Cell 49:603-612；Figge等人,(1988)Cell52:713-722；Deuschle等人,(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:5400-5404；Fuerst等人,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2549-2553；Deuschle等人,(1990)Science 248:480-483；Gossen,(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg；Reines等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1917-1921；Labow等人,(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356；Zambretti等人,(1992)Proc.Natl Acad.Sci.USA 89:3952-3956；Baim等人,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5072-5076；Wyborski等人,(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman,(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162；Degenkolb等人,(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595；Kleinschnidt等人,(1988)Biochemistry 27:1094-1104；Bonin,(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg；Gossen等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551；Oliva等人,(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919；Hlavka等人,(1985)Handbook ofExperimental Pharmacology,第78卷(Springer-Verlag,Berlin)；Gill等人,(1988)Nature 334:721-724。这些公开内容在此处引用作为参考。

选择标记基因的上述列表并不是限定性的。在本发明中可使用任何选择标记基因。

可在载体中使用分离的的多核苷酸分子以转化植物，所述多核苷酸分子包含编码本发明的AHASL蛋白的核苷酸序列，从而使所产生的植物具有增加的对除草剂特别是咪唑啉酮类除草剂的抗性。可将本发明的分离的AHASL多核苷酸分子单独地或与编码AHAS酶的小亚基（AHASS）的核苷酸序列相组合地用于载体中，以在植物中提供除草剂抗性。参见，美国专利号6,348,643；其在此引用作为参考。

本发明还涉及包含在植物中驱动表达的启动子的植物表达载体，所述启动子有效地连接至本发明的分离的多核苷酸分子。所述分离的多核苷酸分子包含编码AHASL蛋白，特别是具有SEQ ID NO:2或4中所示的氨基酸序列的AHASL蛋白或其功能性片段和变体的核苷酸序列。本发明的植物表达载体不依赖于特定的启动子，只要这样的启动子能够在植物细胞中驱动基因表达即可。优选的启动子包括组成型启动子和组织偏爱型启动子。

本发明的转化载体可用于产生用目的基因转化的植物。转化载体可包含本发明的选择标记基因和待导入且通常在转化的植物中表达的目的基因。这样的选择标记基因包含本发明的抗除草剂的AHASL多核苷酸，所述多核苷酸有效地连接至在宿主细胞中驱动表达的启动子。为了在植物和植物细胞中使用，转化载体包含选择标记基因，所述选择标记基因包含本发明的抗除草剂的AHASL多核苷酸，所述多核苷酸有效地连接至在植物细胞中驱动表达的启动子。

本发明的目的基因依赖于想要的结果而改变。例如，表型的各种变化可作为目的，包括修饰植物中的脂肪酸组成，改变植物的氨基酸含量，改变植物的昆虫和/或病原体防御机制等。这些结果可通过在植物中提供异源产物的表达或内源产物的增加的表达来获得。可选择地，所述结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物特别是酶或辅因子的表达来实现。这些变化导致转化的植物的表型发生改变。

在本发明的一个实施方案中，目的基因包括昆虫抗性基因，例如苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因(美国专利号5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881；和Geiser等人,(1986)Gene 48:109)。

本发明的AHASL蛋白或多肽可从例如向日葵植物中纯化，并可用于组合物中。此外，编码本发明AHASL蛋白的分离的多核苷酸分子还可用于在微生物例如大肠杆菌（E.coli）或酵母中表达本发明的AHASL蛋白。可通过本领域技术人员已知的任何方法从大肠杆菌或酵母的提取物中纯化表达的AHASL蛋白。

本发明还涉及用于形成抗除草剂的转基因植物的方法，其包括用包含在植物中驱动表达的启动子的植物表达载体转化植物，所述启动子有效地连接至本发明的分离的多核苷酸分子。所述分离的多核苷酸分子包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本发明的AHASL蛋白，特别是包含下列序列的AHASL蛋白：SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列，或所述氨基酸序列的功能性片段和变体。

本发明还涉及非转基因的向日葵植物、由本发明的方法产生的转基因植物以及此类非转基因和转基因植物的后代和其他后裔，所述植物展现出增强的或增加的对干扰AHAS酶的除草剂特别是咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂的抗性。

本发明的AHASL多核苷酸，特别是编码抗除草剂的AHASL蛋白的多核苷酸可在用于增加抗除草剂的植物的抗性的方法中使用。在本发明的一个实施方案中，抗除草剂的植物包含耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白。除草剂耐受性植物包括用除草剂耐受性AHASL核苷酸序列转化的植物和在其基因组中包含编码除草剂耐受性AHASL蛋白的内源基因的植物。编码除草剂耐受性AHASL蛋白的核苷酸序列和包含编码除草剂耐受性AHASL蛋白的内源基因的除草剂耐受性植物包括本发明的多核苷酸和植物以及本领域已知的那些。参见，例如，美国专利号5,013,659、5,731,180、5,767,361、5,545,822、5,736,629、5,773,703、5,773,704、5,952,553和6,274,796；所有这些文献在此引用作为参考。用于增强除草剂耐受性植物的抗性的此类方法包括用至少一种多核苷酸构建物转化除草剂耐受性植物，所述多核苷酸构建物包含在植物细胞中驱动表达的启动子，所述启动子有效地连接至本发明的抗除草剂的AHASL多核苷酸，特别是SEQ ID NO:1所示的编码抗除草剂的AHASL蛋白的多核苷酸，编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸，以及所述多核苷酸的片段和变体，其编码具有抗除草剂的AHAS活性的多肽。

用于转化植物的许多植物转化载体和方法是可获得的。参见，例如，An,G.等人,(1986)Plant Pysiol.81:301-305；Fry,J.等人,(1987)Plant Cell Rep.6:321-325；Block,M.(1988)Theor.Appl.Genet.76:767-774；Hinchee,等人,(1990)Stadler.Genet.Symp.203212.203-212；Cousins等人,(1991)Aust.J.Plant Physiol.18:481-494；Chee,P.P.和Slightom,J.L.(1992)Gene.118:255-260；Christou等人,(1992)Trends.Biotechnol.10:239-246；D’Halluin等人,(1992)Bio/Technol.10:309-314；Dhir等人,(1992)Plant Physiol.99:81-88；Casas等人,(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA90:11212-11216；Christou,P.(1993)In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant;29P:119-124；Davies,等人,(1993)Plant Cell Rep.12:180-183；Dong,J.A.和Mchughen,A.(1993)Plant Sci.91:139-148；Franklin,C.I.和Trieu,T.N.(1993)Plant.Physio1.102:167；Golovkin等人,(1993)PlantSci.90:41-52；Guo Chin Sci.Bull.38:2072-2078；Asano等人,(1994)Plant Cell Rep.13；Ayeres N.M.和Park,W.D.(1994)Crit.Rev.Plant.Sci.13:219-239；Barcelo等人,(1994)Plant.J.5:583-592；Becker,等人,(1994)Plant.J.5:299-307；Borkowska等人,(1994)Acta.PhysiolPlant.16:225-230；Christou,P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.5:17-27；Eapen等人,(1994)Plant Cell Rep.13:582-586；Hartman,等人,(1994)Bio-Technology 12:919923；Ritala等人,(1994)Plant.Mol.Biol.24:317-325；以及Wan,Y.C.和Lemaux,P.G.(1994)PlantPhysiol.104:3748。

本发明的方法涉及将多核苷酸构建体导入植物。“导入”意指以使构建体进入植物细胞内部的方式将所述多核苷酸构建体呈递给植物。本发明的方法不依赖于用于将多核苷酸构建体导入植物的特定方法，只要所述多核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸构建体导入植物的方法在本领域中是已知的，其包括，但不限于，稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的方法。

“稳定转化”意指被导入植物的多核苷酸构建体整合入植物的基因组中，并能够通过其后代而进行遗传。“瞬时转化”意指被导入植物的多核苷酸构建体不整合入植物的基因组中。

关于植物和植物细胞的转化，使用标准的技术将本发明的核苷酸序列插入本领域内已知的任何载体之中，所述载体适合于在植物或植物细胞中表达所述核苷酸序列。载体的选择取决于优选的转化技术和待转化的靶植物物种。在本发明的一个实施方案中，将AHASL1核苷酸序列与已知用于在植物细胞中高水平表达的植物启动子有效地连接，然后将该构建体导入对咪唑啉酮类除草剂易感的植物中，并再生出转化的植物。所述转化的植物对于在可杀死或严重损伤未转化的植物的咪唑啉酮类除草剂水平下的暴露具有耐受性。可将该方法用于任何植物物种；然而，当用于作物植物，其是最有益的。

用于构建植物表达盒和将外源核酸导入植物的方法在本领域内是普遍已知的，且在前面已进行了描述。例如，可使用根瘤诱导（Ti）质粒载体将外源DNA导入植物。用于外源DNA递送的其他方法包括使用PEG介导的原生质体转化、电穿孔、显微注射whiskers和生物射弹或微粒轰击法以进行直接的DNA摄取。这样的方法在本领域中是已知的。（属于Vasil等人的美国专利号5,405,765；Bilang等人,(1991)Gene 100:247-250；Scheid等人,(1991)Mol.Gen.Genet，228:104-112；Guerche等人,(1987)Plant Science52:111-116；Neuhause等人,(1987)Theor.Appl Genet.75:30-36；Klein等人,(1987)Nature 327:70-73；Howell等人,(1980)Science 208:1265；Horsch等人,(1985)Science 227:1229-1231；DeBlock等人,(1989)Plant Physiology 91:694-701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach,eds.)Academic Press,Inc.(1988)和Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski,eds.)Academic Press,Inc.(1989)。转化的方法取决于待转化的植物细胞、所用载体的稳定性、基因产物的表达水平和其他参数。

将核苷酸序列导入植物细胞并随后插入植物基因组的其他合适方法包括由Crossway等人,(1986)Biotechniques 4:320-334所描述的显微注射，由Riggs等人,(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606所描述的电穿孔，由Townsend等人,美国专利号5,563,055，Zhao等人,美国专利号5,981,840所描述的土壤杆菌介导的转化，由Paszkowski等人,(1984)EMBO J.3:2717-2722所描述的直接的基因转移，以及描述于例如，Sanford等人,美国专利号4,945,050;Tomes等人,美国专利号5,879,918;Tomes等人,美国专利号5,886,244;Bidney等人,美国专利号5,932,782;Tomes等人(1995)"Direct DNATransfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment",Plant Cell，Tissue，and Organ Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag,Berlin);McCabe等人,(1988)Biotechnology 6:923-926;和Lecl transformation(WO 00/28058)中的弹道颗粒加速（ballistic particle acceleration）。还可参见，Weissinger等人,(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等人,(1987)Particulate Science and Technology 5:27-37(洋葱)；Christou等人,(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe等人,(1988)Bio/Technology 6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In VitroCell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh等人,(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta等人,(1990)Biotechnology 8:736-740(水稻)；Klein等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305-4309(玉米)；Klein等人,(1988)Biotechnology 6:559-563(玉米)；Tomes,美国专利号5,240,855；Buising等人,美国专利号5,322,783和5,324,646；Tomes等人,(1995)"Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment",Plant Cell，Tissue，and Organ Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg(Springer-Verlag,Berlin)(玉米)；Klein等人,(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm等人,(1990)Biotechnology 8:833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人,(1984)Nature(London)311:763-764；Bowen等人,美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349(百合科（Liliaceae）)；De Wet等人,(1985)TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman等人,(Longman,New York),pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人,(1990)Plant Cell Reports 9:415-418和Kaeppler等人,(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(whisker-介导的转化)；D’Halluin等人,(1992)PlantCell 4:1495-1505(电穿孔)；Li等人,(1993)Plant Cell Reports 12:250-255和Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75:407-413(水稻)；Osjoda等人,(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(通过根癌土壤杆菌转化玉米)；所有这些文献在此引用作为参考。

可通过将植物与病毒或病毒核酸接触而将本发明的多核苷酸导入植物。一般地，这样的方法涉及将本发明的多核苷酸构建体整合入病毒DNA或RNA分子中。要认识到，本发明的AHASL蛋白在开始时可作为病毒多蛋白的一部分来合成，其在后来可在体内或体外通过蛋白水解进行加工，从而产生想要的重组蛋白。此外，要认识到，本发明的启动子还包括用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸构建体导入植物并在其中表达所编码的蛋白质的方法，在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931；此处引用作为参考。

按照常规方法可将已被转化的细胞培养成植物。参见，例如，McCormick等人,(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可让这些植物生长，并用相同的转化的株系或不同的株系进行授粉，所得的杂交体具有经鉴定的所想要的表型特征的组成型表达。可生长两代或更多代以确保想要的表型特征的表达得到稳定地保持和遗传，然后收获种子以确保想要的表型特征的表达已被获得。这样，本发明提供了具有本发明的多核苷酸构建体(例如,稳定地整合入其基因组中的本发明的表达盒)的经转化的种子（也称作“转基因种子”）。

本发明可用于任何植物物种的转化，所述物种包括，但不限于，单子叶植物和双子叶植物。目的植物物种的实例包括，但不限于，玉米或玉蜀黍（Zea mays），芸苔属物种（Brassica sp.）（例如,欧洲油菜（B.napus）、芜菁（B.rapa）、芥菜（B.juncea）），特别是用作种子油来源的芸苔属物种，苜蓿（紫苜蓿（Medicago sativa）），水稻（Oryza sativa），黑麦（Secale cereale），高梁（两色高梁（Sorghumbicolor）、高梁（Sorghum vulgare）），稷（例如，珍珠粟（Pennisetumglaucum）、黍（Panicum miliaceum）、小米（Setaria italica）、龙爪稷（Eleusine coracana）），向日葵（Helianthus annuus），红花（Carthamus tinctorius），小麦（普通小麦（Triticum aestivum）、硬粒小麦（T.Turgidum ssp.durum）），大豆（Glycine max），烟草（Nicotiana tabacum），马铃薯（Solanum tuberosum），落花生（Arachishypogaea），棉花（海岛棉（Gossypium barbadense）、陆地棉（Gossypiumhirsutum）），甘薯（Ipomoea batatus），木薯（Manihot esculenta），咖啡（咖啡属物种（Coffea spp.）），椰子（Cocos nucifera），菠萝（Ananas comosus），柑桔树（柑桔属物种（Citrus spp.）），可可（Theobroma cacao），茶（Camellia sinensis），香蕉（芭蕉属物种（Musa spp.）），鳄梨（Persea americana），无花果（Ficus casica），番石榴（Psidium guajava），芒果（Mangifera indica），橄榄（油橄榄（Olea europaea）），番木瓜（Carica papaya），腰果（Anacardiumoccidentale），全缘叶澳洲坚果（Macadamia integrifolia），扁桃（Prunusamygdalus），甜菜（Beta vulgaris），甘蔗（甘蔗属物种（Saccharumspp.）），燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。优选地，本发明的植物是作物植物（例如，向日葵、芸苔属物种、棉花、甜菜、大豆、花生、苜蓿、红花、烟草、玉米、水稻、小麦、黑麦、大麦、黑小麦（triticale）、高梁、稷等)。

本发明的抗除草剂植物可在用于控制杂草的方法中使用。因此，本发明还提供了在本发明的抗除草剂的植物附近控制杂草的方法。所述方法包括向杂草和向抗除草剂的植物施用有效量的除草剂，其中，所述植物，当与野生型植物相比较时，具有增加的对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂的抗性。在此类用于控制杂草的方法中，本发明的抗除草剂的植物优选地是作物植物，包括，但不限于，向日葵、苜蓿、芸苔属物种、大豆、棉花、红花、花生、烟草、西红柿、马铃薯、小麦、水稻、玉米、高梁、大麦、黑麦、稷和高梁。

通过提供具有增加的对除草剂特别是咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂的抗性的植物，多种制剂可用于保护植物免受杂草的侵害，从而增强植物的生长和减少对营养的竞争。可单独地使用除草剂在此处描述的植物的周围区域内进行杂草的苗前（pre-emergence）、苗后（post-emergence）、植前（pre-planting）和植时（at planting）的控制，或者可使用包含其他添加剂的咪唑啉酮类除草剂制剂。也可将除草剂用于种子处理。咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂制剂中发现的添加剂包括其他除草剂、去污剂、佐剂、铺展剂、粘着剂、稳定剂等。除草剂制剂可以是湿润的或干燥的制剂，并可包括，但不限于，可流动性粉剂（flowable powders）、乳油和液体浓缩剂（liquidconcentrates）。可按照常规方法，例如通过喷洒、灌溉、撒粉（dusting）、包被等来使用除草剂和除草剂制剂。

本发明提供了具有增加的对至少一种除草剂特别是AHAS抑制性除草剂更特别地咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂的抗性的非转基因和转基因种子。这样的种子包括，例如，具有向日葵植物S4897、向日葵植物GM40、向日葵植物GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物或具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的除草剂抗性特征的非转基因向日葵种子，和包含编码抗除草剂的AHASL蛋白的本发明多核苷酸分子的转基因种子。

本发明提供了用于通过常规的植物育种法（包括有性繁殖）来产生抗除草剂的植物特别是抗除草剂的向日葵植物的方法。所述方法包括将抗除草剂的第一植物和不抗除草剂的第二植物杂交。第一植物可以是本发明的抗除草剂的植物中的任一种植物，其包括，例如，包含至少一种编码抗除草剂的AHASL的本发明多核苷酸的转基因植物，和具有向日葵植物S4897、向日葵植物GM40、向日葵植物GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物或个有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的除草剂抗性特征的非转基因向日葵植物。第二植物可以是当与第一植物杂交时能够产生有生活力的后代植物（即，种子）的任一种植物。通常，但非必需地，第一和第二植物是相同的物种。本发明的方法还可包括将第一次杂交的后代植物回交一代或多代，产生具有与第一或第二植物相同的品系或表型的植物。可选择地，可使第一次杂交或任何随后的杂交的后代进行杂交，以产生具有与第一或第二植物不同的品系或表型的第三植物。本发明的方法可额外地包括选择包含第一植物的除草剂抗性特征的植物。

本发明还提供了通过常规的植物育种方法（包括有性繁殖）来增加植物特别是抗除草剂的向日葵植物的除草剂抗性的方法。所述方法包括将抗除草剂的第一植物和第二植物杂交，所述第二植物可以抗或不抗除草剂，或者可以抗相对于第一植物来说不同的除草剂。第一植物可以是本发明的抗除草剂的植物中的任一种植物，其包括，例如，包含至少一种编码抗除草剂的AHASL的本发明多核苷酸的转基因植物，和具有向日葵植物S4897、向日葵植物GM40、向日葵植物GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物或具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的除草剂抗性特征的非转基因向日葵植物。第二植物可以是当与第一植物杂交时能够产生有生活力的后代植物（即，种子）的任一种植物。通常，但非必需地，第一和第二植物是相同的物种。由该本发明方法产生的后代植物，当与第一或第二植物或两者相比较时，具有增加的对除草剂的抗性。当第一和第二植物抗不同的除草剂时，后代植物将具有组合的第一植物和第二植物的除草剂抗性特征。本发明的方法还可包括将第一次杂交的后代植物回交一代或多代，产生具有与第一或第二植物相同的品系或表型的植物。可选择地，可使第一次杂交或任何随后的杂交的后代进行杂交，以产生具有与第一或第二植物不同的品系或表型的第三植物。本发明的方法可额外地包括选择包含第一植物、第二植物或第一和第二植物两者的除草剂抗性特征的植物。

本发明的植物可以是转基因的或非转基因的。具有增加的对咪唑啉酮类的抗性的非转基因向日葵植物的实例是向葵植物S4897、向日葵植物GM40、向日葵植物GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物或具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物；或向葵植物S4897、向日葵植物GM40、向日葵植物GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物或具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的突变体、重组体或经基因工程改造的衍生物；或向葵植物S4897、向日葵植物GM40、向日葵植物GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物或具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的任何后代的突变体、重组体或经基因工程改造的衍生物；或作为这些植物的任一植物的后代的植物；或具有向葵植物S4897、向日葵植物GM40、向日葵植物GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物或具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的除草剂抗性特征的植物。

本发明也提供了用至少一个本发明的多核苷酸分子、表达盒或转化载体转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞。所述转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞对处于分别杀死或抑制非转化的植物、植物组织、植物细胞或非人宿主细胞的生长的除草剂水平上具有增强的对至少一种除草剂的耐受性或抗性。优选地，本发明的转化的植物、植物组织、植物细胞和种子是拟南芥和作物植物。

本发明提供了包括使用至少一种AHAS抑制性除草剂的方法，所述除草剂选自咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类除草剂或其混合物。在这些方法中，可通过本领域已知的任何方法，包括，但不限于，种子处理、土壤处理和叶处理，来施用AHAS抑制性除草剂。

在施用之前，可将AHAS抑制性除草剂转变成惯用的制剂，例如溶液、乳液、悬浮液、粉末（dusts）、粉剂、糊剂和颗粒剂。使用形式取决于特定的所希望的目的；在各个情况下，应当确保本发明的化合物的精细和均匀的分布。

以已知的方式制备制剂(参见例如，关于综述可见US 3,060,084，EP-A 707 445(对于液体浓缩剂),Browning,"Agglomeration",Chemical Engineering,Dec.4,1967,147-48,Perry’s ChemicalEngineer’s Handbook,第4版,McGraw-Hill,New York,1963,pages8-57，以及下列，WO 91/13546，US 4,172,714，US 4,144,050，US3,920,442，US 5,180,587，US 5,232,701，US 5,208,030，GB 2,095,558，US 3,299,566，Klingman,Weed Control as a Science,John Wiley andSons,Inc.,New York,1961,Hance等人,Weed Control Handbook,第8版,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1989，和Mollet,H.,Grubemann,A.,Formulation technology,Wiley VCH Verlag GmbH,Weinheim(Germany),2001,2.D.A.Knowles,Chemistry andTechnology of Agrochemical Formulations,Kluwer AcademicPublishers,Dordrecht,1998(ISBN 0-7514-0443-8))，例如通过用适合于配制农用化学药品的辅助剂例如溶剂和/或载体扩充活性化合物，如果想要，可使用乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、防沫剂、防冻剂，对于种子处理制剂还任选地可用着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂。

合适的溶剂的实例是水、芳香族溶剂（例如Solvesso产品，二甲苯)、石蜡(例如矿物油级分)、醇类(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮类(例如环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP,NOP)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、二醇类、脂肪酸二甲基酰胺、脂肪酸和脂肪酸酯。原则上，也可使用溶剂混合物。

合适的载体的实例是磨细的天然矿物（例如高岭土、粘土、滑石、白垩）和磨细的合成矿物（例如高度分散的二氧化硅、硅酸盐）。

合适的乳化剂是非离子和阴离子型乳化剂（例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐）。

分散剂的实例是木质素-亚硫酸盐（酯）废液和甲基纤维素。

所用的合适的表面活性剂是木素质磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸、烷基芳基磺酸、烷基硫酸、烷基磺酸、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸和硫酸化脂肪醇二醇醚的碱金属、碱土金属和铵盐，此外还有磺化萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯酚醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基苯酚、烷基苯酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨糖醇酯、木质素亚硫酸盐（酯）废液和甲基纤维素。

适合用于制备可直接喷施的溶液、乳液、糊剂或油分散体的物质是具有中至高沸点的矿物油级分，例如煤油或柴油，此外还有煤焦油和植物或动物来源的油，脂族烃、环烃和芳族烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘或其衍生物，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛尔酮，高极性溶剂，例如二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮或水。

也可向制剂中加入防冻剂，例如甘油、乙二醇、丙二醇和杀菌剂。

合适的防沫剂是例如基于硅氧烷或硬脂酸镁的防沫剂。

合适的防腐剂是例如双氯酚和enzylalkoholhemiformal。

种子处理制剂可额外地包含粘合剂和任选的着色剂。

可加入粘合剂以在处理后促进活性材料在种子上的附着。合适的粘合剂是嵌段共聚物EO/PO表面活性剂，还有聚乙烯醇类、聚乙烯吡咯烷酮类、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚丁烯类、聚异丁烯类、聚苯乙烯、聚乙烯胺类、聚乙烯酰胺类、聚乙烯亚胺类

聚醚、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、纤基乙酸钠和源自这些聚合物的共聚物。

任选地，制剂中还可包含着色剂。种子处理制剂的合适的着色剂或染料是罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。

合适的胶凝剂的实例是角叉菜

可通过将活性物质与固体载体混合或相伴碾磨来制备粉末、用于撒播的材料和粉剂产品（dustable products）。

可通过将活性物质结合至固体载体来制备颗粒剂，例如包被的颗粒剂、浸渍的颗粒剂和均质的颗粒。固体载体的实例是矿物土，例如硅胶，硅酸盐，滑石，高岭土，attaclay，石灰石，石灰，白垩，红玄武土，黄土，粘土，白云石，硅藻土，硫酸钙，硫酸镁，氧化镁，磨细的合成材料，肥料，例如，硫酸铵、磷酸铵、硝酸氨、尿素和植物来源的产物，例如谷类粗粉、树皮粗粉、木材粗粉和坚果壳粗粉、纤维素粉末和其他固体载体。

一般地，制剂包含按重量计算0.01－95%的，优选地按重量计算0.1－90wt%的AHAS抑制性除草剂。在该情况下，以按重量计算90%－100%的纯度，优选地以按重量计算95%－100%的纯度（根据NMR谱）使用AHAS抑制性除草剂。对于种子处理目的，可将各个制剂稀释2－10倍，从而导致即时可用的制备物中的浓度为按重量计算0.01－60%，优选地按重量计算0.1－40%的活性化合物。

可就这样使用AHAS抑制性除草剂，或者以其制剂的形式或从中制备的使用形式进行使用，例如以可直接喷洒的溶液、粉剂、悬浮液或分散体、乳液、油分散体、糊剂、粉剂产品、用于撒播的材料、或颗粒剂的形式进行使用，通过喷洒、雾化、撒粉、撒播或灌注进行施用。使用形式完全取决于想要的目的；其希望在每种情况下确保本发明的AHAS抑制性除草剂的最佳可能的分布。

可通过加入水而从乳液浓缩物、糊剂或可湿性粉剂（可喷洒的粉末、油分散体）制备水性使用形式。为制备乳剂、糊剂或油分散体，借助于湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂可将就这样的或溶解在油或溶剂中的物质在水中进行均质化。然而，也可能制备由活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂和如果合适还有溶剂或油组成的浓缩物，这样的浓缩物适合于用水进行稀释。

即时可用的制剂中的活性化合物浓度可在相对宽的范围内变化。一般地，其为每重量0.0001－10%，优选地0.01－1%。

AHAS抑制性除草剂还可成功地用于超低容量过程（ULV）中，可能施用包含按重量计算超过95%的活性化合物的制剂，或甚至施用无添加剂的活性化合物。

下面是制剂的实例：

1.用于叶面施用的用水稀释的产品。对于种子处理目的，可将这样的产品以稀释或未稀释的形式施用于种子。

A)水溶性浓缩物（SL、LS）

将按重量计算10份的AHAS抑制性除草剂溶解在按重量计算90份的水或水溶性溶剂中。作为选择，可加入湿润剂或其他辅助剂。在用水稀释时，AHAS抑制性除草剂溶解，由此获得具有10%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的制剂。

B)可分散的浓缩物（DC）

将按重量计算20份的AHAS抑制性除草剂溶解在添加了按重量计算10份的分散剂例如聚乙烯吡咯烷酮的按重量计算70份的环己酮中。用水稀释产生分散体，由此获得具有20%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的制剂。

C)乳油（EC）

将按重量计算15份的AHAS抑制性除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物（在每种情况下为按重量计算5份）的按重量计算7份的二甲苯中。用水稀释产生乳剂，由此获得具有15%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的制剂。

D)乳剂（EW、EO、ES）

将按重量计算25份的AHAS抑制性除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物（在每种情况下为按重量计算5份）的按重量计算35份的二甲苯中。借助于乳化器（例如Ultraturrax）将该混合物导入按重量计算30份的水中，并制备成均一的乳剂。用水稀释产生乳剂，由此获得具有25%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的制剂。

E)悬浮剂（SC、OD、FS）

在搅动式球磨机中，将按重量计算20份的AHAS抑制性除草剂在加入了按重量计算10份的分散剂、湿润剂和按重量计算70份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，从而产生精细的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的制剂。

F)水分散性颗粒剂和水溶性颗粒剂（WG、SG）

将按重量计算50份的AHAS抑制性除草剂在加入了按重量计算50份的分散剂和湿润剂的情况下精细地进行碾磨，并借助于技术器具（例如挤出、喷雾塔、流化床）而制备为水分散性或水溶性的颗粒。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有50%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的制剂。

G)水分散性粉剂和水溶性粉剂（WP、SP、SS、WS）

将按重量计算75份的AHAS抑制性除草剂在加入了按重量计算25份的分散剂、湿润剂和硅胶的情况下在转子-定子研磨机中进行碾磨。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有75%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的制剂。

I)凝胶制剂（GF）

在搅动式球磨机中，将按重量计算20份的AHAS抑制性除草剂在加入了按重量计算10份的分散剂、按重量计算1份凝胶剂湿润剂和按重量计算70份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，从而产生精细的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的制剂。该凝胶制剂适合用于种子处理。

2.用于叶面施用的非稀释地施用的产品。对于种子处理目的，可将这样的产品以稀释的形式施用于种子。

A)粉剂（DP、DS）

将按重量计算5份的AHAS抑制性除草剂精细地碾磨，并紧密地与按重量计算95份的精细粉碎的高岭土混合。这产生了具有5%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的粉剂产品。

B)颗粒剂（GR、FG、GG、MG）

将按重量计算0.5份的AHAS抑制性除草剂精细地碾磨并将其与按重量计算95.5份的载体组合，由此获得具有0.5%（w/w）的AHAS抑制性除草剂的制剂。现有的方法是挤出、喷雾干燥或流化床。这产生了用于叶面使用的非稀释地施用的颗粒剂。

常规的种子处理制剂包括例如可流动性浓缩物（flowableconcentrates）FS、液剂LS、用于干处理的粉剂DS、用于浆处理的水分散性粉剂WS、水溶性粉剂SS和乳剂ES和EC以及凝胶制剂GF。这些制剂可以以稀释的或未稀释的形式施用于种子。在播种前施用于种子，或直接施用在种子上。

在优选的实施方案中，使用FS制剂进行种子处理。一般地，FS制剂可包含1－800g/l的活性成分、1－200g/l的表面活性剂、0－200g/l的防冻剂、0－400g/l的粘合剂、0－200g/l的色素和直至1升的溶剂，所述溶剂优选地是水。

本发明提供了本发明的抗除草剂的植物的非转基因和转基因种子。这样的种子包括，例如，包含具有NCIMB登录号NCIMB 41262的植物的除草剂抗性特征的非转基因向日葵种子，和包含编码IMI蛋白的本发明的多核苷酸分子的转基因种子。

关于种子处理，使用除草剂，优选地选自下列AHAS抑制性除草剂或用包含AHAS抑制性除草剂的制剂处理本发明的抗除草剂的植物的种子，所述AHAS抑制性除草剂是例如酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、绿磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸（imazamethabenz）、咪草啶酸、甲灭草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚、嘧草硫醚及其混合物。

术语种子处理包括本领域已知的所有合适的种子处理技术，例如拌种（seed dressing）、种子包衣（seed coating）、种子涂粉（seeddusting）、浸种（seed soaking）和种子丸粒化（seed pelleting）。

根据本发明的一个变化形式，本发明的进一步目的是处理土壤的方法，其通过施用作为组合物/制剂的包含AHAS抑制性除草剂的颗粒制剂（例如任选地具有一种或多种固体或液体的、农业上可接受的载体和/或任选地具有一种或多种农业上可接受的表面活性剂的颗粒制剂）来进行，特别是施用到条播机中。有利地，在例如谷类、玉米、棉花和向日葵的苗床中使用该方法。

本发明还包括用含有至少一种AHAS抑制剂的种子处理制剂包被的或包含所述种子处理制剂的种子，所述AHAS抑制剂选自酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、绿磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸、咪草啶酸、甲灭草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚和嘧草硫醚。

术语“种子”包括所有种类的种子和植物繁殖体，其包括但不限于真正的种子、插条、吸根、球茎、鳞茎、果实、块茎、谷粒、扦插条（cuttings）、伐条（cut shoot）等，和在优选的实施方案中表示真正的种子。

术语“用...包被和/或包含”一般表示，活性成分在施用时绝大部分存在于繁殖产品的表面上，尽管依赖于施用方法，或多或少的成分可能渗透入繁殖产品中。当（重新）种植所述繁殖产品时，其可能吸收活性成分。

在植物播种前和植物出苗前，通过对种子进行喷洒或撒粉，使用AHAS抑制性除草剂或使用包含AHAS抑制性除草剂的制剂来施行种子处理应用。

在种子的处理中，通过用有效量的AHAS抑制性除草剂或包含AHAS抑制性除草剂的制剂处理种子来施用相应的制剂。此处，施用率通常是0.1g－10kg a.i./100kg种子（或a.i.的混合物，或制剂），优选地1g－5kg/100kg种子，特别地1g－2.5kg/100kg种子。对于特定的作物例如莴苣，施用率可更高。

本发明提供了用于防治不希望的植被或控制杂草的方法，所述方法包括在播种前和/或在催芽后将本发明的抗性植物的种子与AHAS抑制性除草剂接触。所述方法还可包括在田间的土壤中或在温室中的盆栽介质中播种种子。所述方法特别地可用于在紧邻种子的附近防治不希望的植被或控制杂草。

“控制不希望的植被”可理解为表示，杀死杂草和/或延缓或抑制杂草的正常生长。杂草，在广义上理解为表示在不希望其生长的位置处生长的所有植物。

本发明的杂草包括，例如，双子叶和单子叶的杂草。双子叶杂草包括，但不限于下列属的杂草：白芥属（Sinapis）、独行菜属（Lepidium）、拉拉藤属（Galium）、繁缕属（Stellaria）、母菊属（Matricaria）、春黄菊属（Anthemis）、牛膝菊属（Galinsoga）、藜属（Chenopodium）、荨麻属（Urtica）、千里光属（Senecio）、苋属（Amaranthus）、马齿苋属（Portulaca）、苍耳属（Xanthium）、旋花属（Convolvulus）、番薯属（Ipomoea）、蓼属（Polygonum）、田菁属（Sesbania）、豚草属（Ambrosia）、蓟属（Cirsium）、飞廉属（Carduus）、苦苣菜属（Sonchus）、茄属（Solanum）、蔊菜属（Rorippa）、节节菜属（Rotala）、母草属（Lindernia）、野芝麻属（Lamium）、婆婆纳属（Veronica）、苘麻属（Abutilon）、刺酸模属（Emex）、曼陀罗属（Datura）、堇菜属（Viola）、鼬瓣花属（Galeopsis）、罂粟属（Papaver）、矢车菊属（Centaurea）、车轴草属（Trifolium）、毛茛属（Ranunculus）和蒲公英属（Taraxacum）。单子叶杂草包括，但不限于下列属的杂草：稗属（Echinochloa）、狗尾草属（Setaria）、黍属（Panicum）、马唐属（Digitaria）、梯牧草属（Phleum）、早熟禾属（Poa）、羊茅属（Festuca）、蟋蟀草属（Eleusine）、臂形草属（Brachiaria）、黑麦草属（Lolium）、雀麦属（Bromus）、燕麦属（Avena）、莎草属（Cyperus）、高梁属（Sorghum）、冰草属（Agropyron）、狗牙根属（Cynodon）、雨久花属（Monochoria）、飘拂草属（Fimbristyslis）、慈姑属（Sagittaria）、荸荠属（Eleocharis）、藨草属（Scirpus）、雀稗属（Paspalum）、鸭嘴草属（Ischaemum）、尖瓣花属（Sphenoclea）、龙爪茅属（Dactyloctenium）、剪股颖属（Agrostis）、看麦娘属（Alopecurus）、阿披拉草属（Apera）。

此外，本发明的杂草可包括，例如，生长在不希望的位置处的作物植物。例如，如果在大豆植物的田中不想要玉米植物，那么可以将在主要包含大豆植物的田中的自生自长的玉米植物当作杂草。

此处所用的冠词“a”和“an”是指该冠词的一个或多于一个（即，至少一个）的语法对象。举例来说，“成分”表示一种或多种成分。

如此处所用的，单词“包含”或“包括”，将理解为表示包括所述的成分、整数或步骤或者成分、整体或步骤的组，但不排除任何其他的成分、整数或步骤或者成分、整数或步骤的组。

通过举例说明但非限定性地提供下列实施例。

实施例1：向日葵品系BTK47的诱变和抗咪唑啉酮的植物的选择

如下化学突变BTK47（向日葵繁殖系）。在第1个生长季节的秋季，用甲磺酸乙酯（EMS）处理6万粒BTK47品系的种子，进行15小时。然后于2002年12月16日在Venado Tuerto,Santa Fe,Argentina的Nidera试验站在田间条件下播种处理的种子。大约30,000M₁植物开花并用袋子套住以使各植物自花传粉。收获各植物，然后手工脱粒。在2003年5月10日在Formosa的Nidera试验站，在温室条件下播种来自各头状花序（capitulum）的20粒M₂种子。在V2至V4阶段以80g ai/公顷的级别用灭草烟喷洒大约590,000株植物。8株植物在除草剂处理中存活下来，将其自花传粉，然后收获。就其对灭草烟的抗性评价来自这8株植物的各植物的M₃种子。在这8个M₃家族中，一个家族(S4897)就除草剂抗性以1个抗性（即，提供对商业等级的咪唑啉酮类除草剂的耐受性）：2个中等抗性（即，部分抗性）：1个易感的比率发生分离。将完全可育的抗性植物自花传粉，并进行收获以繁殖品系S4897。

将来自抗性和中等抗性类别的M3 S4897植物的叶组织用作用于实施例2中描述的AHASL1基因的序列分析的DNA来源。

实施例2：编码抗咪唑啉酮的和野生型的AHASL1蛋白的向日葵多核苷酸的PCR扩增和测序

以两个交叠片段的形式通过PCR从分离自M₃S4897和BTK47(野生型)向日葵植物的DNA扩增AHASL1基因。使用标准方法，用热启动Taq DNA聚合酶和相关试剂(Qiagen Inc,Valencia,California,USA;Cat.No.203205)进行PCR扩增。用于两个片段的PCR引物示于表1中和序列表中。HA1U409(SEQ ID NO:7)是第一片段的正向引物且相应于GenBank登记号AY541451的碱基对254。HA1L1379(SEQ ID NO:8)是第一片段的反向引物且相应于GenBank登记号AY541451的碱基对1214。HA1U1313(SEQ ID NO:9)是第二片段的正向引物且相应于GenBank登记号AY541451的碱基对1149。HA1L2131(SEQ ID NO:10)是第二片段的反向引物且相应于GenBank登记号AY541451的碱基对1962。引物对HA1U409-HA1L1379产生962个碱基对的片段。引物对HA1U1313-HA1L2131产生814个碱基对的片段。

对所得的PCR产物测序，从而产生S4897和BTK47的AHASL1序列。图1中提供了这些核苷酸序列和苍耳（Xanthium sp.）ALS基因的核苷酸序列(GenBank登记号U16280;SEQ ID NO:5)的比对。所述比对揭示来自S4897的AHASL1基因相对于BTK47的AHASL1具有单一突变。突变的位置在图1中用星号标示。该突变是相应于的SEQID NO:1的核苷酸21的G至A的转换。

图2中提供了S4897、BTK47和苍耳的AHASL1核苷酸序列的预测的氨基酸序列的比对。相对于BTK47的AHASL1氨基酸序列，S4897的AHASL1氨基酸序列在氨基酸位置7上具有丙氨酸至苏氨酸的置换(SEQ ID NO:2)。SEQ ID NO:2中的该氨基酸位置相应于由GenBank登记号AY541451的向日葵AHASL1核苷酸序列(SEQ IDNO:11)编码的全长氨基酸序列中的氨基酸位置107和由GenBank登记号X51514的拟南芥AHASL核苷酸序列编码的全长氨基酸序列中的氨基酸位置122。

表1.用于扩增向日葵AHASL1基因的编码区的PCR引物

实施例3：对于S4897的除草剂抗性特征是纯合的向日葵品系的产生

通过自花授粉（selfing）和筛选对灭草烟的抗性来从S4897产生对于除草剂抗性性状是纯合的向日葵品系。该向日葵品系和其植物被称为GM40。在确认后代对于除草剂抗性的同质性后，在温室条件下移植来自GM40向日葵品系的植物，然后自花传粉以进行种子生产。

实施例4：S4897对甲咪唑烟酸的抗性

在Argentina的田间试验中，就对甲咪唑烟酸的抗性检验S4897植物。对甲咪唑烟酸的抗性明显优于IMISUN-1(Ala₁₉₀至Val的突变;拟南芥中的等同位置是205;参见下面的表4)。该试验具有单行的小块土地并在有风的天中进行处理，这样到达植物的实际除草剂剂量可能低于施用的剂量。然而，S4897展示优于Ala₁₉₀至Val的置换（我们未从该田间试验提供数据）的对甲咪唑烟酸的抗性。

也将S4897和IMISUN-1的植物在温室条件下接受甲咪唑烟酸处理。图5中的照片显示当以100g ai/公顷的甲咪唑烟酸处理植物时的该比较。

实施例5：向日葵品系S4897和抗除草剂的向日葵的其他

品种的耐受性和AHAS活性的总结

方法：当植物处于二至三叶期时，用三种级别的咪草啶酸(Raptor^TM)100、200和300gm ai/公顷+0.5% Sun It II以及两种级别的灭草烟(Arsenal^TM)160和360gm ai/公顷+0.5%Sun It II喷洒处理种向日葵品系S4897、

向日葵品种A、B、C和常规非Clearfield品种。在施用后（DAT）第14天就损伤进行评级。基于从0至9（其中0=无损伤至9=死亡的植物）的标度对损伤评级。每除草剂/级别处理喷洒12种植物。通过使用ANOVA和LSD方法使用STATGRAPHICS Plus 5.0进行统计学分析。

也通过从植物中选择活跃生长的嫩叶进行AHAS活性分析，所述植物在种植后大约四周时未用除草剂进行喷洒。

结果:在喷洒植物后，了解到S4897和其他向日葵品种之间的高度差异影响了实际递送的除草剂剂量。已针对S4897校准喷杆的高度，然而因为其他品种较高从而更接近喷杆，因而其他品种将接受更多的除草剂的剂量。重新校准其他品种的等级以确定其已接受的大致剂量。如表2中所显示的进行评估，因为由于高度效应的原因，不可能进行直接的等级比较。例如，将比较以咪草啶酸级别100gm ai/公顷处理的S4897的损伤与以75gm ai/公顷处理的其他品种的损伤。对于品系S4897的300gm ai/公顷的处理剂量等于对于其他品种的200gm ai/公顷的处理（其大致为300gm ai/公顷）。

表2.调整量/接受的除草剂剂量

品系S4897在所有除草剂处理中具有显著较低的损伤(表3)。事实上，在高级别的咪草啶酸或灭草烟上观察到非常小的损伤。其他品种在所有除草剂级别上显示如所预期的增加的损伤。图6显示在200/150gm ai/公顷上品系S4897、

品种A和非Clearfield对照的损伤的比较。S4897的生长锥显示很小的损伤至无损伤，然而

品种A受到严重损伤并且已停止生长。

表3.用咪草啶酸或灭草烟喷洒的三种IMISUN1品系和S4897在14DAT的损伤数据。

AHAS活性结果也显示了，当

向日葵和常规非Clearfield品种相比，在更高浓度的咪草啶酸上的更低的抑制性(图7)。Glean^TM产生的抑制在三种向日葵品种中是相似的(图8)。因为品系S4897的亲本背景是不可获得的，因此未提供反馈。因为两个突变都位于相同的AHASL1的基因座，因此所有受试品种是纯合的，在由S4897的AHASL1蛋白中的氨基酸置换提供的耐受性中存在定性差异。因此，相同量的具有新的置换（即，Ala₁₀₇至Thr)的AHAS酶能够在除草剂存在的情况下相对于具有Ala₁₉₀至Val的置换的AHAS催化更多的产物形成。这表明具有Ala₁₀₇至Thr置换的AHAS具有比具有Ala₁₉₀至Val的置换的AHAS更优的对咪唑啉酮类除草剂的耐受性。

实施例6:抗除草剂的向日葵AHASL蛋白

本发明公开了野生型的和抗除草剂的向日葵AHASL多肽的核苷酸和氨基酸序列。前面已鉴定了包含抗除草剂的AHASL肽的植物，和已描述了AHASL多肽的许多保守区域，其为可赋予除草剂抗性的氨基酸置换的位点。参见，Devine和Eberlein(1997),"Physiological,biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based onaltered target sites",Herbicide Activity:Toxicology,Biochemistry andMolecular Biology,Roe等人,(eds.),pp.159-185,IOS Press,Amsterdam;和Devine和Shukla,(2000)Crop Protection 19:881-889。

通过使用本发明的AHASL序列和本领域技术人员已知的方法，可产生另外的编码抗除草剂的AHASL多肽的多核苷酸，所述抗除草剂的AHASL多肽在这些保守区域中的已鉴定的位置上具有1、2、3或更多个氨基酸置换。表4提供了AHASL蛋白的保守区域，这些保守区域内的已知可赋予除草剂抗性的氨基酸置换，和SEQ ID NO:4所示的向日葵AHASL1蛋白中的相应氨基酸。

表4.已知可赋予除草剂抗性的在AHASL1多肽的保守区域中的突变及其在向日葵AHASL1中的等同位置

¹来自Devine和Eberlein,(1997)"Physiological,biochemical andmolecular aspects of herbicide resistance based on altered targetsites",Herbicide Activity:Toxicology,Biochemistry and MolecularBiology,Roe等人,(eds.),pp.159-185,IOS Press,Amsterdam，以及Devine和Shukla,(2000)Crop Protection 19:881-889的保守区域。

²氨基酸编号相应于拟南芥AHASL1多肽的氨基酸序列。

³SEQ ID NOS:2和4所示的向日葵AHASL1氨基酸序列不是全长，其分别始于氨基酸序列FAYPGGASMEIHQALTRS和FAYPGGTSMEIHQALTRS。

⁴SEQ ID NOS:2和4中所示的向日葵AHASL氨基酸序列具有该保守区。

⁵相应于该保守区的向日葵AHASL1的区域(GenBank登记号AY541451)具有序列IPAGG。

⁶Bernasconi等人,(1995)J.Biol.Chem.270(29):17381-17385。

⁷Boutsalis等人,(1999)Pestic.Sci.55:507-516。

⁸Guttieri等人,(1995)Weed Sci.43:143-178。

⁹Guttieri等人,(1992)Weed Sci.40:670-678。

¹⁰Hartnett等人,(1990)"Herbicide-resistant plants carryingmutated acetolactate synthase genes",Managing Resistance toAgrochemicals:Fundamental Research to Practical Strategies,Green等人,(eds.),American Chemical Soc.Symp.,Series No.421,Washington,DC,USA。

¹¹Simpson(1998)Down to Earth 53(1):26-35。

¹²Bruniard(2001)Inheritance of imidazolinone resistance,characterization of cross-resistance pattern,and identification ofmolecular markers in sunflower(Helianthus annuus L.).Ph.D.Thesis,North Dakota State University,Fargo,ND,USA,pp 1-78。

¹³Devine和Eberlein,(1997)"Physiological,biochemical andmolecular aspects of herbicide resistance based on altered targetsites",Herbicide Activity:Toxicology,Biochemistry and MolecularBiology,Roe等人,(eds.),pp.159-185,IOS Press,Amsterdam。

¹⁴Wright和Penner,(1998)Theor.Appl.Genet.96:612-620。

¹⁵Kolkman等人,(2004)Theor.Appl.Genet.109:1147-1159。

¹⁶White等人,(2003)Weed Sci.51:845-853。

¹⁷Chang和Duggleby,(1998)Biochem J.333:765-777。

实施例7：GM1606向日葵品系的产生

基本上按照上面实施例1中所述的方法通过诱变向日葵种子（所述向日葵种子就抗除草剂而言是野生型的）产生第二抗除草剂的向日葵品系。所述新型品系和该品系的植物此处称为GM1606。GM1606向日葵品系在AHASL1基因中包含与S4897向日葵品系中的突变相同的突变。GM1606中的该突变是相应于SEQ ID NO:1的核苷酸序列21的G至A的转换。该突变在氨基酸位置7上产生丙氨酸至苏氨酸的置换(SEQ ID NO:2)。SEQ ID NO:2中的该氨基酸位置相应于GenBank登记号AY541451的向日葵AHASL1核苷酸序列(SEQ IDNO:11)编码的全长氨基酸序列中的氨基酸位置107和由GenBank登记号X51514的拟南介AHASL核苷酸序列编码的全长氨基酸序列中的氨基酸位置122。

实施例8：突变事件A122T和A205V对灭草烟的反应

进行温室研究以在向日葵的整体植物水平上定量和比较在不同遗传背景中突变体A122T和A205V的甲咪唑烟酸（imazapir）的敏感性。在田间条件下获得用于本研究的不同向日葵品系的种子。用于研究的品系列于表5中。

表5.向日葵材料

杂交体/品系代码	材料的类型	突变事件
			TH1	杂交体	A205V
TH9	杂交体	A205V
			TH10	恢复系	A205V
GIM5-7	保持系	A205V
			IB920	保持系	A205V
IR79	恢复系	A205V
			TH6	杂交体	A122T
TH11	杂交体	A122T
			TH12	恢复系	A122T
GM40	保持系	A122T
			GM1606	保持系	A122T
GIM5-6	恢复系	A122T
			TH13	保持系	野生型

方法

将种子播种在陪替培养皿中，在萌发后，将小植株移植至直径10cm的花盆的由等份的蛭石、土壤和沙子组成的盆栽基质中。在补充下有400W卤化钠灯的天然光照条件下将植物生长在温室中以提供16小时的昼长。昼/夜温度分别为25和20℃。在V2阶段，随机将各基因型的10株分配至由7种剂量(0、40、80、160、240、320、400和480g ai/公顷)组成的各处理,并在第0时间确定生物量。按照具有处理的全因子(向日葵品系x处理)排列的随机区组设计安排实验，进行10个重复。

在使用除草剂的当天，在子叶节切开各基因型的10株植物，然后在60℃下干燥48小时，在0时间确定干重。在imazapir处理(DAT)后将植物的其余植物保持10天，记录其高度以及根和地上部分的干生物量。高度确定为各植物的子叶节和顶端之间的距离。关于根生物量的确定，从花盆取出各植物，从根部洗去盆栽基质。通过减去来自各样品的合适的第0时间的平均生物量将来自各品系的地上生物量转换成施用后的生物量量累积。将干生物量数据转换成各品系内的未处理对照植物的百分数以允许组之间的直接比较。

结果

1.高度

当使用0.5X或1X的imazapir的等级时，具有A205V突变的向日葵品系与未处理的对照没有差异。从2X至6X,这些品系显示高度的显著减少，所述高度达到未处理对照的68.9%+/-3.1(表6和图9)。相反地，具有A122T突变的向日葵品系显示较少的高度减少(对于0.5X和6X级别的imazapir，分别为未处理对照的0.6至15.8%)。就其对从2X至6X的除草剂级别的增加的反应而言，两组品系都显示它们之间的显著差异(表6和图9)。

2.植物毒性指数

两种突变体在基对其对从0.5X至6X的除草剂级别的增加的反应中显示极大的差异(图10)。随着除草剂级别的增加，与对照植物相比，具有A122T突变的向日葵品系在叶的大小显示轻微的减小和显示更浅的绿色（表7）。相反地，具有A205V突变的植物在0.5X或1X的除草剂级别上未显示任何损伤，但损伤水平(淡黄色、叶子变形和叶坏死)从2X至6X快速增加(表7)。就植物毒性指数而言，从2X至6X，两种突变体都在它们之间显著不同(表7)。

3.地上干重生物量

突变体A122T和A205V的干重的剂量反应曲线示于图11中。在4X、5X和6X级别，相对于对照植物，事件A122T的生物量重量减少，并且对于更高的剂量，该减少达到25%。同时，从0.5X(40gai./公顷)至6X，相对于对照植物，事件A205V的重量减少。就该变量而言，从0.5X至6X，两种突变体都在它们之间显示显著的差异(表8)。就干物质累积而言获得相同的趋势（未显示），但就其在第0时间的干重而言基因型之间不存在不能区分的初始差异的效应。

4.根生物量

随着imazapir的剂量增加，与对照植物相比，两种突变体的根干生物量都减少，但A122T和A205V之间减少的程度极其不同（图12）。事实上，A205V在干重量根生物量上显示从0.5X(40g.a.i/公顷)时的12.8%至6X时的75.6%的显著减少（表9）。相反地，A122T载体从3X至6X显示根重量生物量的显著减少，在更高的剂量上减少达到38.3%(表9)。在其根干重量对除草剂的级别的反应上，从0.5X至6X，两种突变体都在它们之间显示显著的差异（表9和图12）。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请在此引用作为参考，就如同具体地和单独地指明每一个单个的出版物或专利申请在此引用作为参考一样。

尽管已通过举例说明和用于使能够理解得清楚的目的的实施例在一定程度上详述了上述发明，但很显然的是，可在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修饰。