EA036997B1 - Растение и семя ярового масличного рапса brassica napus, содержащие мутированные гены синтазы ацетогидроксикислот - Google Patents

Abstract

Предложено растение, представляющее собой яровой масличный рапс Brassica napus, содержащее мутированные нуклеиновые кислоты синтазы ацетогидроксикислот (AHAS) и белки, кодируемые такими мутированными нуклеиновыми кислотами. Также предложено семя канола, несущее мутированные гены.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки и патенты

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 60/977944, поданной 5 октября 2007 г, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки, включая описание, фигуры и таблицы, и для всех целей.

Область техники

Данное изобретение относится к области устойчивых к гербицидам растений и семян, а более конкретно к мутациям в гене и белке синтазы ацетогидроксикислот (AHAS).

Уровень техники

Следующее описание приведено исключительно для того, чтобы облегчить понимание изобретения, при этом никоим образом не предполагается, что оно описывает уровень техники настоящего изобретения или составляет его часть.

Преимущества устойчивых к гербицидам растений известны. Например, устойчивые к гербицидам растения могут снижать потребность в обработке почвы для борьбы с сорняками, что обеспечивает уменьшение эрозии почвы.

Введение экзогенных мутантных генов в растения хорошо описано в литературе. Например, патент США № 4545060 относится к повышению устойчивости растений к глифосату путем введения в геном растений гена, кодирующего вариант EPSPS, содержащий по меньшей мере одну мутацию, которая придает ферменту большую устойчивость к воздействию его конкурентного ингибитора, т.е. глифосата.

Известны примеры некоторых мутаций в генах AHAS. См., например, патент США № 7094606.

Путем химического мутагенеза обнаружили мутацию в гене AHAS I с пониженным уровнем экспрессии. Данную мутацию называют РМ-1 (мутация в эквивалентном положении известна как 653 (по последовательности аминокислот в ацетолактат-синтазе (ALS) Arabidopsis), замена серина на аспарагин, кодируемых соответственно AGT и ААТ). В гене AHAS III с более высоким уровнем экспрессии обнаружили другую мутацию, называемую РМ-2 (мутация в эквивалентном положении известна как 574, замена аминокислот с триптофана на лейцин, соответственно кодируемых TGG и TTG). Эти две мутации, РМ-1 и РМ-2, сочетают в коммерческой разновидности канола, известного как Clearfield Canola (Tan et al., 2005).

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно настоящему изобретению предложено растение, представляющее собой яровой масличный рапс Brassica napus, содержащее ген синтазы ацетогидроксикислот I (AHAS I), кодирующий белок AHAS I, содержащий замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению W574 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанное растение дополнительно содержит ген синтазы ацетогидроксикислот III (AHAS III), кодирующий белок AHAS III, содержащий замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению W574 последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный белок AHAS I и указанный белок AHAS III устойчивы к ингибированию AHAS-ингибирующим гербицидом, выбранным из группы, состоящей из имазамокса, тифенсульфурона, трибенурона, никосульфурона, примисульфурона, флуметсулама, смеси тифенсульфурона и трибенурона 2:1 и смеси никосульфурона и тифенсульфурона 2,22:1.

В одном воплощении указанное растение не является трансгенным.

Согласно настоящему изобретению также предложено семя ярового масличного рапса Brassica napus, содержащее ген синтазы ацетогидроксикислот I (AHAS I), кодирующий белок AHAS I, содержащий замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению W574 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанное семя дополнительно содержит ген синтазы ацетогидроксикислот III (AHAS III), кодирующий белок AHAS III, содержащий замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению W574 последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный белок AHAS I и указанный белок AHAS III устойчивы к ингибированию AHAS-ингибирующим гербицидом, выбранным из группы, состоящей из имазамокса, тифенсульфурона, трибенурона, никосульфурона, примисульфурона, флуметсулама, смеси тифенсульфурона и трибенурона 2:1 и смеси никосульфурона и тифенсульфурона 2,22:1.

В одном воплощении указанное семя не является трансгенным.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано соответствие (совмещение) синтазы ацетогидроксикислот AHAS Arabidopsis (SEQ ID NO: 1), AHAS I Brassica napus (SEQ ID NO: 2) и AHAS III Brassica napus (SEQ ID NO: 3 и 4). SEQ ID NO: 1 - это последовательность аминокислот AHAS Arabidopsis At3g48560 на основании аннотированных последовательностей геномных ДНК базы данных Genebank, номер доступа NC003074. SEQ ID NO: 2 - это последовательность аминокислот AHAS I Brassica napus из элитных линий Cibus BN-2 и BN-11. Данная последовательность идентична транслируемому продукту Genebank, номер доступа Z1 1524. SEQ ID NO: 3 - это последовательность аминокислот AHAS III Brassica napus из линии Cibus elite BN-2. Данная последовательность идентична транслируемому продукту Genebank, номер доступа Z1 1526, за исключением замены D325E в аминокислоте 325. SEQ ID NO: 4 - это последовательность аминокислот AHAS III Brassica napus из линии Cibus elite BN-11. Данная последовательность идентична транслируемому продукту SEQ ID NO: 3, за исключением Е343 в аминокислоте 343 в последовательно- 1 036997 сти SEQ ID NO:1.

На фиг. 2 показана последовательность аминокислот транслируемых генов, приведенных в табл. 2.

Аминокислоты, показанные жирным шрифтом, обозначают мутацию.

На фиг. 3 показаны последовательности нуклеотидов, приведенные в табл. 2. Нуклеотиды, показанные жирным шрифтом, обозначают мутацию.

На фиг. 4 показаны результаты исследования распыления, описанного в примере 4.

Подробное описание изобретения

Согласно одному аспекту предложена изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая белок синтазу ацетогидроксикислот капусты Brassica, содержащую мутацию в одном или более положений аминокислот, соответствующем положению, выбранному из группы, включающей А205, D376, W574, R577 и S653 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым другим вариантам реализации изолированная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий одну или более мутаций, выбранных из группы, включающей: замену аланина на валин в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аланина на аспарагиновую кислоту в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аспарагиновой кислоты на глютаминовую кислоту в положении, соответствующем положению 376 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на цистеин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на метионин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на серин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аргинина на триптофан в положении, соответствующем положению 577 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1, и замену серина на треонин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутация представляет собой замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1, где мутация не является мутацией S653N в гене AHAS I Brassica. Согласно некоторым вариантам реализации, мутация представляет собой замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации, мутация представляет собой замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, где мутация не является мутацией W574L в гене AHAS III Brassica. Согласно некоторым вариантам реализации мутация представляет собой замену аланина на валин в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации мутация представляет собой замену аланина на аспарагиновую кислоту в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации изолированная нуклеиновая кислота кодирует белок с мутацией, выбранной из мутаций, показанных в табл. 2. Согласно определенным вариантам реализации изолированная нуклеиновая кислота кодирует белок с двумя или более мутациями. Согласно некоторым вариантам реализации две или более мутации выбирают из табл. 2. Согласно некоторым вариантам реализации изолированная нуклеиновая кислота кодирует белок с мутацией в положении, соответствующем положению S653 в последовательности SEQ ID NO: 1, и с мутацией в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, включающей А205, D376, W574 и R577 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим вариантам реализации, изолированная нуклеиновая кислота кодирует белок с мутацией в положении, соответствующем положению W574 в последовательности SEQ ID NO: 1, и с мутацией в положении, соответствующем положению R577 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно определенным вариантам реализации изолированная нуклеиновая кислота кодирует белок синтазы ацетогидроксикислот (AHAS), который устойчив к ингибированию AHAS-ингибирующим гербицидом. Согласно некоторым вариантам реализации AHASингибирующий гербицид выбирают из группы, включающей гербициды классов имидазолинона, сульфонилмочевины, пиримидинилтиобензоата, сульфониламинокарбонилтриазолина и их смеси. Согласно некоторым вариантам реализации гербицид представляет собой гербицид класса имидазолинона. Согласно некоторым вариантам реализации гербицид представляет собой гербицид класса сульфонилмочевины. Согласно некоторым вариантам реализации изолированная нуклеиновая кислота кодирует белок AHAS, содержащий последовательность аминокислот, на 70% или более идентичную последовательностям аминокислот, представленных на фиг. 2. Согласно определенным вариантам реализации изолированная нуклеиновая кислота кодирует белок AHAS Brassica napus. Согласно другим вариантам реализации изолированная нуклеиновая кислота кодирует белок AHAS III Brassica napus.

Согласно другому аспекту предложен вектор экспрессии, содержащий изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок синтазу ацетогидроксикислот Brassica с мутацией в одном или более из положений аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, включающей А205, D376, W574, R577 и S653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации, вектор экспрессии содержит изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок с одной или более мутациями, выбранными из группы, включающей замену аланина на валин в положении, соответ- 2 036997 ствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аланина на аспарагиновую кислоту в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аспарагиновой кислоты на глютаминовую кислоту в положении, соответствующем положению 376 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на цистеин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на метионин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на серин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аргинина на триптофан в положении, соответствующем положению 577 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1 и замена серина на треонин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутация представляет собой замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1, где мутация не является мутацией S653N в гене AHAS I Brassica. Согласно некоторым вариантам реализации мутация представляет собой замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации, мутация представляет собой замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, причем мутация не является мутацией W574L в гене AHAS III Brassica. Согласно некоторым вариантам реализации, мутация представляет собой замену аланина на валин в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другому варианту реализации мутация представляет собой замену аланина на аспарагиновую кислоту в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно еще одному аспекту предложено растение, несущее ген синтазы ацетогидроксикислот (AHAS) Brassica, где ген кодирует белок с мутацией в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положениям, выбранным из группы, включающей А205, D376, W574, R577 и S653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно еще одному аспекту предложено растение, несущее ген синтазы ацетогидроксикислот (AHAS) Brassica, причем указанное растение устойчиво к AHAS-ингибирующему гербициду, и при этом ген кодирует белок с мутацией в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положениям, выбранным из группы, включающей А205, D376, W574, R577 и S653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации перечисленных выше аспектов растение несет ген AHAS, который кодирует белок с одной или более мутациями, выбранными из группы, включающей: замену аланина на валин в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аланина на аспарагиновую кислоту в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аспарагиновой кислоты на глютаминовую кислоту в положении, соответствующем положению 376 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на цистеин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на метионин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на серин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аргинина на триптофан в положении, соответствующем положению 577 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1, и замену серина на треонин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутация представляет собой замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1, причем мутация не является мутацией S653N в гене AHAS I Brassica. Согласно некоторым вариантам реализации мутация представляет собой замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутация представляет собой замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO:1, причем мутация не является мутацией W574L в гене AHAS III Brassica. Согласно другим вариантам реализации мутация представляет собой замену аланина на аспарагиновую кислоту в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим вариантам реализации мутацию выбирают из мутаций, представленных в табл. 2. Согласно определенным вариантам реализации растение несет ген AHAS, который кодирует белок с одной или более мутациями в положении, соответствующем положению S653 в последовательности SEQ ID NO: 1 и мутацию в одной или более положениях аминокислот, выбранных из группы, включающей А205, D376, W574 и R577 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим вариантам реализации растение несет ген AHAS, который кодирует белок с одной или более мутациями в положении, соответствующем положению R577 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации растение несет ген AHAS, который кодирует белок, который устойчив к ингибированию AHAS-ингибирующим гербицидом. Согласно некоторым вариантам реализации растение несет ген AHAS, который кодирует белок, содержащий последовательность аминокислот, на 70% или более идентичную последовательностям аминокислот, представленных на фиг. 2. Согласно

- 3 036997 некоторым вариантам реализации растение устойчиво к обработке по меньшей мере одним AHASингибирующим гербицидом. Согласно некоторым вариантам реализации AHAS-ингибирующий гербицид выбран из группы, включающей гербициды классов имидазолинона, сульфонилмочевины, пиримидинилтиобензоата, сульфониламинокарбонилтриазолина и их смеси. Согласно некоторым вариантам реализации гербицид представляет собой гербицид класса имидазолинона. Согласно некоторым вариантам реализации гербицид представляет собой гербицид класса сульфонилмочевины. Согласно некоторым вариантам реализации растение Brassica получают путем выращивания семян линии, выбранной из линий, перечисленных в табл. 2. Согласно некоторым вариантам реализации растение представляет собой вид Brassica. Согласно другим вариантам реализации растение представляет собой Brassica napus. Согласно некоторым вариантам реализации растение выбрано из ярового масличного рапса и озимого масличного рапса. Согласно некоторым вариантам реализации растение несет ген AHAS, который кодирует белок AHAS Brassica napus. Согласно другим вариантам реализации растение несет ген AHAS, который кодирует белок AHAS I Brassica napus. Согласно некоторым вариантам реализации растение несет ген AHAS, который кодирует белок AHAS III Brassica napus. Согласно некоторым вариантам реализации растение является не трансгенным.

Согласно одному аспекту предложено семя, несущее ген синтазы ацетогидроксикислот (AHAS) Brassica, кодирующий белок с мутацией в положениях аминокислот, соответствующих положениям, выбранным из группы, включающей А205, D376, W574, R577 и S653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации семя несет ген AHAS, который кодирует белок с одной или более мутациями, выбранными из группы, включающей замену аланина на валин в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аланина на аспарагиновую кислоту в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аспарагиновой кислоты на глютаминовую кислоту в положении, соответствующем положению 376 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на цистеин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на метионин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену триптофана на серин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену аргинина на триптофан в положении, соответствующем положению 577 в последовательности SEQ ID NO: 1, замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1 и замену серина на треонин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализациимутация представляет собой замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1, причем мутация не является мутацией S653N в гене AHAS I Brassica. Согласно некоторым вариантам реализации мутация представляет собой замену серина на треонин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутация представляет собой замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO: 1, причем мутация не является мутацией W574L в гене AHAS III Brassica. Согласно другим вариантам реализации мутация представляет собой замену аланина на валин в положении, соответствующем положению 205 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим вариантам реализации мутацию выбирают из мутаций, представленных в табл. 2. Согласно определенным вариантам реализации семя несет ген AHAS, который кодирует белок с двумя или более мутациями, выбранными из табл. 2. Согласно некоторым вариантам реализации семя несет ген AHAS, который кодирует белок с мутацией в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO: 1, и с мутацией в одном или более положениях аминокислот, выбранных из группы, включающей А205, D376, W574, R577 и S653 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим вариантам реализации семя несет ген AHAS, который кодирует белок с мутацией в положении, соответствующем положению W574 в последовательности SEQ ID NO: 1, и с мутацией в положении, соответствующем положению R577 в последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации семя несет ген AHAS, который кодирует белок, который резистентен к AHAS-ингибирующему гербициду. Согласно некоторым вариантам реализации семя несет ген AHAS, который кодирует белок, содержащий последовательность аминокислот, на 70% или более идентичную последовательностям аминокислот, представленных на фиг. 2. Согласно некоторым вариантам реализации семена резистентны к обработке по меньшей мере одним AHASингибирующим гербицидом. Согласно некоторым вариантам реализации AHAS-ингибирующий гербицид выбран из группы, включающей гербициды классов: имидазолинона, сульфонилмочевины, пиримидинилтиобензоата, сульфониламинокарбонилтриазолина и их смеси. Согласно некоторым вариантам реализации гербицид представляет собой гербицид класса имидазолинона. Согласно некоторым вариантам реализации гербицид представляет собой гербицид класса сульфонилмочевины. Согласно некоторым вариантам реализации семенами являются семена Brassica. Согласно некоторым вариантам реализации семя несет ген AHAS, который кодирует белок AHAS Brassica napus. Согласно другим вариантам реализации семя несет ген AHAS, который кодирует белок AHAS I Brassica napus. Согласно определенным вариантам реализации семя несет ген AHAS, который кодирует белок AHAS III Brassica napus. Согласно

- 4 036997 некоторым вариантам реализации семенами являются семена линии растений Brassica, где данную линию выбирают из линий, перечисленных в табл. 2. Согласно некоторым вариантам реализации семя являются не трансгенным. Согласно некоторым вариантам реализации предложено семя, полученное от растения растением способами, раскрытыми в настоящей заявке. Согласно другим вариантам реализации семя является семенем канола.

Согласно еще одному аспекту предложен способ получения устойчивого к гербициду растения путем введения в клетку растения олигонуклеотида репарации генов (GRON) с направленной мутацией в гене синтазы ацетогидроксикислот (AHAS) с получением клетки растения с геном AHAS, которая экспрессирует AHAS с мутацией в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, включающей А205, D376, W574 и S653 в последовательности SEQ ID NO: 1; и идентификации клетки растения, обладающей, по существу, нормальным ростом и каталитической активностью по сравнению с клеткой соответствующего растения дикого типа, в присутствии AHASингибирующего гербицида; и регенерации нетрансгенного устойчивого к гербицидам растения, несущего мутированный ген AHAS, из указанной клетки растения. Согласно еще одному аспекту предложен способ повышения устойчивости растения путем: (а) скрещивания первого растения Brassica со вторым растением Brassica, причем первое растение содержит ген синтазы ацетогидроксикислот (AHAS), при этом ген кодирует белок с мутацией в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, включающей А205, D376, W574, R577 и S653 в последовательности SEQ ID NO: 1; (b) скрининга популяции, полученной при скрещивании в целях повышения устойчивости AHAS к гербицидам; и (d) получения семян, образующихся при скрещивании. Согласно некоторым вариантам реализации гибридные семена получают любым из перечисленных выше способов. Согласно некоторым вариантам реализации растения выращивают из семян, полученных любым из перечисленных выше способов. Согласно другому аспекту предложен способ борьбы с сорняками на поле, где находятся растения, путем обработки эффективным количеством по меньшей мере одного AHAS-ингибирующего гербицида поля, на котором находятся указанные сорняки и растения, причем указанное растение содержит ген синтазы ацетогидроксикислот (AHAS) Brassica, и при этом ген кодирует белок с мутацией в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, включающей А205, D376, W574, R577 и S653 в последовательности SEQ ID NO: 1. 134. Согласно некоторым вариантам реализации AHAS-ингибирующий гербицид выбран из группы, включающей гербициды классов имидазолинона, сульфонилмочевины, пиримидинилтиобензоата, сульфониламинокарбонилтриазолина и их смеси. Согласно другим вариантам реализации AHAS-ингибирующий гербицид представляет собой гербицид класса имидазолинона. Согласно другим вариантам реализации AHAS-ингибирующий гербицид представляет собой гербицид класса сульфонилмочевины.

Термин нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты относится к олигонуклеотиду, нуклеотиду или полинуклеотиду и к их фрагментам или частям, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и представляют собой смысловые или антисмысловые нити. Нуклеиновая кислота может включать ДНК или РНК и может быть природного или синтетического происхождения. Например, нуклеиновая кислота может включать мРНК или кДНК. Нуклеиновая кислота может включать нуклеиновую кислоту, которая была амплифицирована {например, путем полимеразноцепной реакции}. Условное обозначение NTwt###NTmut применяют для обозначения нуклеотида дикого типа NTwt в положении ### в нуклеиновой кислоте, который был заменен на NTmut. Однобуквенный код для нуклеотидов описан в Руководстве по методике патентной экспертизы для патентов США, раздел 2422, табл. 1. В этом отношении обозначение нуклеотида R обозначает пурин, такой как гуанин или аденин, Y обозначает пиримидин, такой как цитозин или тимин (урацил в случае РНК); М обозначает аденин или цитозин; K обозначает гуанин или тимин; a W обозначает аденин или тимин.

Термин ген относится к последовательности ДНК, которая содержит регуляторные и кодирующие последовательности, необходимые для выработки РНК, которая может выполнять некодирующую функцию {например, рибосомная или транспортная РНК}, или которая может включать полипептид или предшественник полипептида. РНК или полипептид могут кодироваться полноразмерной кодирующей последовательностью или любой частью кодирующей последовательности, пока сохраняется желаемая активность или функция. Термин ген AHAS в настоящей заявке относится к гену, который обладает гомологией с геном AHAS Brassica. Согласно некоторым вариантам реализации, ген AHAS идентичен конкретному гену AHAS Brassica на 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% или 100%, например гену I AHAS Brassica napus или гену III AHAS Brassica napus. Согласно некоторым вариантам реализации ген AHAS обладает 60%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% или 100% гомологией с последовательностью, выбранной из последовательностей на фиг. 3. Согласно некоторым вариантам реализации ген AHAS модифицирован и включает по меньшей мере одну мутацию. Согласно другим вариантам реализации ген AHAS модифицирован и включает по меньшей мере две мутации. Согласно некоторым вариантам реализации ген AHAS модифицирован и включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из мутаций, показанных в табл. 2. Согласно некоторым вариантам реализации, ген AHAS модифицирован и включает по меньшей мере две мутации, выбранные из мутаций, показанных в табл. 2. Согласно некоторым вариантам реализации мутация является консервативной мутацией.

- 5 036997

Под кодирующей последовательностью понимают последовательность нуклеиновых кислот, или комплементарную ей последовательность, или их часть, которые могут транскрибироваться и/или транслироваться с образованием мРНК и/или полипептида или их фрагмента. Кодирующие последовательности содержат экзоны в геномной ДНК или незрелых транскриптах первичной РНК, которые биохимический аппарат клетки соединяет вместе, производя зрелую мРНК. Антисмысловая нить представляет собой комплемент такой нуклеиновой кислоты, и по ней можно вывести кодирующую последовательность.

Под некодирующей последовательностью понимают последовательность нуклеиновых кислот, или комплементарную ей последовательность, или их часть, которые не транскрибируются в аминокислоту in vivo, или в случае, когда тРНК не встраивает аминокислоту или не пытается встраивать аминокислоту. Некодирующая последовательность включает последовательности интронов в геномной ДНК или незрелых транскриптах первичной РНК, и связанные с геном последовательности, такие как промоторы, энхансеры, сайленсеры и др.

Нуклеотидное основание - это основание, которое в некоторых предпочтительных вариантах реализации является пурином, пиримидином или их производным или аналогом. Нуклеозиды - это нуклеотидные основания, содержащие фрагмент пентозофуранозила, например возможно замещенный рибозид или 2'-дезоксирибозид. Нуклеозиды могут быть связаны одним или несколькими линкерными компонентами, которые могут содержать фосфор, а могут и не содержать его. Нуклеозиды, которые связаны незамещенными фосфоэфирными связями, называют нуклеотидами. В настоящем описании термин нуклеотидное основание включает пептидные нуклеотидные основания, субъединицы нуклеиновых кислот пептидов и морфолиновые нуклеотидные основания, а также нуклеозиды и нуклеотиды.

Олигонуклеотид - это полимер, содержащий нуклеотидные основания; предпочтительно по меньшей мере часть которого можно гибридизовать согласно модели спаривания Уотсона-Крика с ДНК, обладающей комплементарной последовательностью. Цепь олигонуклеотида может содержать один 5'конец и один 3'-конец, которые представляют собой последние нуклеотидные основания в полимере. Конкретная цепь олигонуклеотида может содержать нуклеотидные основания всех типов. Соединение олигонуклеотида представляет собой соединение, содержащее одну или более цепей олигонуклеотидов, которые могут быть комплементарны и гибридизованы согласно модели спаривания оснований УотсонаКрика. Нуклеотидные основания рибозного типа включают пентозофуранозил, содержащий нуклеотидные основания, в которых 2'-углерод представляет собой метилен, замещенный гидроксилом, алкокси группой или галогеном. Нуклеотидные основания дезоксирибозного типа представляют собой нуклеотидные основания, отличные от оснований нуклеотидов рибозного типа, которые включают все нуклеотидные основания, которые не содержат пентозофуранозиловый фрагмент.

Согласно некоторым вариантам реализации нить олигонуклеотида может включать цепи олитгонуклеотидов, а также сегменты или участки цепей олигонуклеотидов. Нить олигонуклеотида может содержать 3'-конец и 5'-конец, и когда нить олигонуклеотида имеет длину, равную длине цепи, 3'- и 5'концы нити являются также 3'- и 5'-концом цепи.

В настоящей заявке термин олигонуклеотид репарации генов обозначает олигонуклеотиды, включающие смешанные дуплексные олигонуклеотиды, молекулы, содержащие не нуклеотиды, одноцепочечные олигодеоксинуклеотиды и другие молекулы репарации генов.

Под изолированной применительно к нуклеиновой кислоте (например, олигонуклеотиду, такому как РНК, ДНК или смешанный полимер) понимают нуклеиновую кислоту, которая отделена от значительной части генома, в котором она в природе существует, и/или, по существу, отделена от других компонентов клетки, которые встречаются вместе с ней в природе. Например, любую нуклеиновую кислоту, которую получили синтетическим путем (например, путем последовательной конденсации оснований), считают изолированной.

Термин последовательность аминокислот относится к последовательности полипептида или белка. Условное обозначение AAwt###AAmut применяют для обозначения мутации, которая приводит к замене аминокислоты дикого типа AAwt в положении ### в полипептиде на мутантную AAmut.

Под комплементом понимают последовательность, комплементарную к последовательности нуклеиновой кислоты, в соответствии со стандартными принципами комплементарности Уотсона-Крика. Комплементарная последовательность также может быть последовательностью РНК, комплементарной последовательности ДНК или комплементарной ей последовательности, а также может представлять собой кДНК.

По существу комплементарный означает, что две последовательности гибридизуются в строгих условиях гибридизации. Специалист в данной области должен понимать, что, по существу, комплементарные последовательности не обязательно должны гибридизоваться по всей своей длине.

В настоящем описании термин кодон относится к последовательности из трех соседних нуклеотидов (либо РНК, либо ДНК), составляющих генетический код, который определяет встраивание конкретной аминокислоты в цепь полипептида в ходе биосинтеза белка или сигнал о прекращении синтеза белка. Термин кодон также применяют для обозначения соответствующих (и комплементарных) последовательностей из трех нуклеотидов в матричной РНК, в которую транскрибируется исходная ДНК.

В настоящем описании термин белок AHAS относится к белку, который гомологичен белку

- 6 036997

AHAS Brassica. Согласно некоторым вариантам реализации белок AHAS идентичен на 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% или 100% конкретному белку AHAS Brassica, такому как, например, белок AHAS I Brassica napus или белок AHAS III Brassica napus. Согласно некоторым вариантам реализации белок AHAS идентичен на 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% или 100% последовательности, выбранной из последовательностей, приведенных на фиг. 2. Согласно некоторым вариантам реализации белок AHAS модифицирован и включает по меньшей мере одну мутацию. Согласно другим вариантам реализации белок AHAS модифицирован и включает меньшей мере две мутации. Согласно некоторым вариантам реализации белок AHAS модифицирован и включает по меньшей мере одну мутацию, выбранную из мутаций, приведенных в табл. 2. Согласно некоторым вариантам реализации белок AHAS модифицирован и включает по меньшей мере две мутации, приведенные в табл. 2. Согласно некоторым вариантам реализации мутация является консервативной мутацией.

Термин дикого типа относится к гену или продукту гена, который обладает характеристиками этого гена или продукта гена, выделенного из природного источника. Ген дикого типа - это ген, который чаще всего встречается в популяции, и, соответственно, его обозначают как нормальную форму или форму гена дикого типа. Термин Дикого типа также может относиться к последовательности в конкретном положении или положениях нуклеотидов, или к последовательности в конкретном положении или положениях кодона, или к последовательности в конкретном положении или положениях аминокислот.

В настоящей заявке термин мутантный или модифицированный относится к нуклеиновой кислоте или белку, имеющему изменения последовательности и/или в функциональных свойств (т.е. измененные характеристики) по сравнению с геном или продуктом гена дикого типа. Мутантный или модифицированный также относится к последовательности в конкретном положении или положениях нуклеотидов, или к последовательности в конкретном положении или положениях кодона, или к последовательности в конкретном положении или положениях аминокислот, которая имеет изменения в последовательности и/или в функциональных свойствах (т.е. измененные характеристики) по сравнению с геном или продуктом гена дикого типа.

Термин мутация включает изменение по меньшей мере одного нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты или изменение одной аминокислоты в полипептиде по сравнению с нормальной последовательностью или последовательностью дикого типа. Мутация может включать замену, делецию, инверсию или вставку.

В настоящем описании термин гомология относится к сходству последовательностей белков и ДНК. Термин гомология или гомологичный относится к степени идентичности. Может иметь место частичная гомология или полная гомология. Частичная гомологичная последовательность - это последовательность, которая идентична другой последовательности менее чем на 100%.

Термин гетерозиготный относится присутствию разных аллелей в одном или более локусах генов в сегментах гомологичных хромосом. В настоящем описании термин гетерозиготный также может относиться к образцу, клетке, популяции клеток или к организму, в котором можно выделить разные аллели в одном или более локусах генов. Гетерозиготные образцы также можно определить при помощи известных в данной области способов, таких как, например, секвенирование нуклеиновых кислот. Например, если электроферограмма при секвенировании показывает два пика в одном локусе, и оба пика имеют примерно одинаковый размер, образец можно охарактеризовать как гетерозиготный. Или, если один пик меньше другого, но составляет по размеру по меньшей мере 25% от большего пика, образец можно охарактеризовать как гетерозиготный. Согласно некоторым вариантам реализации меньший пик составляет по меньшей мере 15% от большего пика. Согласно другим вариантам реализации меньший пик составляет по меньшей мере 10% от большего пика. Согласно другим вариантам реализации меньший пик составляет по меньшей мере 5% от большего пика. Согласно другим вариантам реализации детектируют минимальное значение меньшего пика.

В настоящем описании термин гомозиготный относится к присутствию идентичных аллелей в одном или более локусах генов в сегментах гомологичных хромосом. Также термин гомозиготный может относиться к образцу, клетке, популяции клеток или организму, в котором можно определить одну и ту же аллель в одном или более локусах генов. Гомозиготные образцы можно определить при помощи способов, известных в данной области, таких как, например, секвенирование нуклеиновых кислот. Например, если электроферограмма при секвенировании показывает один пик в определенном локусе, образец можно называть гомозиготным по данному локусу.

В настоящем описании термин гемизиготный относится к гену или сегменту гена, присутствующему только один раз в генотипе клетки или организма, поскольку вторая аллель отсутствует (удалены). В настоящем описании термин гемизиготный также может относиться к образцу, клетке, популяции клеток или организму, в которых аллель в одном или более локусах генов удалена из генотипа однократно.

В настоящем описании термин статус зиготности (зиготность) относится к образцу, популяции клеток или организму, которые проявляют себя как гетерозиготные, гомозиготные или гемизиготные при тестировании способами, известными в технике и описанными в настоящей заявке. Термин статус зиготности нуклеиновой кислоты обозначает определение того, проявляет себя источник нуклеиновой

- 7 036997 кислоты как гетерозиготный, гомозиготный или гемизиготный. Термин статус зиготности может относиться к различиям в одном нуклеотиде или в последовательности. Согласно некоторым способам статус зиготности образца относительно одиночной мутации можно классифицировать как гомозиготный дикий тип, гетерозиготный (один аллель дикого типа и один мутантный аллель), гомозиготный мутант или гемизигота (т.е. единичная копия либо аллеля дикого типа, либо мутантного аллеля).

В настоящем описании термин RTDS относится к системе быстрого выявления признака™ (RTDS), разработанного Cibus. RTDS - это система сайт-специфичной модификации гена, которая эффективна при осуществлении точных изменений в последовательности гена без встраивания чужеродного гена или регуляторной последовательности.

В настоящем описании термин примерно относится к количественным значениям плюс/минус 10%. Например, примерно 3% будет включать 2,7-3,3%, а примерно 10% будет включать 9-11%.

Предложены композиции и способы, относящиеся, в частности, к успешному направленному воздействию на гены синтазы ацетогидроксикислот (AHAS) у растений Brassica при помощи, например, технологии системы быстрого развития признака (RTDS™), разработанной Cibus. В сочетании или сами по себе, растения, содержащие любую из мутаций, раскрываемых в настоящей заявке, могут давать основу для новых устойчивых к гербицидам продуктов. Также предложены семена, производимые мутантными растениями, в которых гены либо гомозиготны, либо гетерозиготны по данным мутациям. Мутации, раскрытые в настоящем описании, можно комбинировать с любой другой известной мутацией или с мутацией, которая будет открыта в дальнейшем.

RTDS основана на изменении гена-мишени за счет использования собственной системы репарации клетки, что позволяет специфично модифицировать последовательность гена in situ без введения чужеродной ДНК и последовательностей, контролирующих экспрессию гена. Эта процедура позволяет произвести точное изменение генетической последовательности, и при этом остальной геном останется без изменений. В отличие от традиционных трансгенных ГМО интеграции чужеродного генетического материала не происходит, и никакой чужеродный генетический материал не остается в растении. Изменения в генетической последовательности проводят при помощи RTDS, а не вводят случайным образом. Поскольку измененные гены остаются в их нативном расположении, никакой случайной, неконтролируемой или нежелательной экспрессии не происходит.

RTDS, которая позволяет осуществлять это изменение, представляет собой химически синтезированный нуклеотид, который может состоять как из оснований ДНК и модифицированных оснований РНК, так и из других химических компонентов, и предназначен для гибридизации в целевом положении гена с образованием спариваемых вопреки принципу комплементарности пар оснований. Такая несовпадающая (некомплиментарная) пара оснований действует как сигнал к привлечению собственно природной системы репарации клетки в этот сайт и к исправлению (замене, вставке или делеции) определенного нуклеотида в гене. Как только процесс исправления завершен, молекула RTDS разрушается и вновь модифицированный или репарированный ген экспрессируется под контролем нормальных эндогенных контролирующих механизмов для данного гена.

Целевые мутации в генах AHAS I и III были описаны для генов и белков AHAS Brassica napus (см. SEQ ID NO: 2, 3 и 4). Композиции и способы также включают мутантные гены AHAS других видов (паралоги). Однако из-за разнообразия генов AHAS разных видов число остатков аминокислот, которое нужно изменить у одного вида, может отличаться у другого вида. Тем не менее, специалист в данной области техники легко идентифицирует аналогичное положение по гомологии последовательностей. Например, на фиг. 1 показаны совмещенные последовательности аминокислот паралогов AHAS Arabidopsis (SEQ ID NO: 1) и AHAS I (SEQ ID NO:2) и AHAS III Brassica napus (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4). Соответственно, аналогичные положения в этих и других паралогов можно идентифицировать и подвергнуть мутации.

Композиции и способы относятся частично к мутациям в гене AHAS, которые придает растению устойчивость или толерантность к гербициду из семейства AHAS-ингибирующих или ALSингибирующих гербицидов. Композиции и способы также относятся к применению олигонуклеотида репарации генов для получения желаемой мутации в последовательностях хромосомы или эписомы растения в гене, кодирующих белок AHAS. Мутированный белок, который, по существу, сохраняет каталитическую активность белка дикого типа, позволяет увеличить устойчивость или толерантность растения к гербициду из семейства AHAS-ингибирующих гербицидов и позволяет, по существу, нормально расти и развиваться растению, его органам, тканям или клеткам по сравнению с растением дикого типа независимо от наличия или отсутствия гербицида. Композиции и способы также связаны с клеткой нетрансгенного растения, в которой был мутирован ген AHAS, с нестрансгенным растением, регенерированном из него, а также с растением, полученным путем скрещивания регенерированного нетрансгенного растения с растением, обладающим мутацией в другом гене AHAS, или с растением, обладающим мутированным геном EPSPS, например.

Имидазолиноны представляют собой одно из пяти химических семейств AHAS-ингибирующих гербицидов. Другие четыре семейства - это производные сульфонилмочевины, триазолопиримидины,

- 8 036997 пиримидинилтиобензоаты и сульфониламинокарбонилтриазолины (Tan et al., 2005).

Также предложено трансгенное или нетрансгенное растение или клетка растения с одной или более мутациями в гене AHAS, например, такими, как раскрываются в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации растение или клетка растения с одной или более мутациями в гене AHAS обладает повышенной устойчивостью или толерантностью к члену семейства AHAS-игнгибирующих гербицидов. Согласно некоторым вариантам реализации растение или клетка растения с одной или более мутациями в гене AHAS может проявлять, по существу, нормальный рост или развитие растения, его органов, тканей или клеток по сравнению с соответствующими растением или клеткой дикого типа. Согласно конкретным аспектам и вариантам реализации предложены нетрансгенные растения с мутацией в гене AHAS, например, такой, как раскрываются в настоящей заявке, которая согласно некоторым вариантам реализации увеличивает устойчивость или толерантность к члену семейства AHAS-игнгибирующих гербицидов, которые могут проявлять, по существу, нормальный рост или развитие растения, его органов, тканей или клеток по сравнению с соответствующими растением или клеткой дикого типа, т.е. в присутствии одного или более гербицидов, таких как, например, имидазолинон и/или сульфонилмочевина, мутированный белок AHAS обладает, по существу, такой же каталитической активностью, что и белок AHAS дикого типа.

Дополнительно предложен способ получения растения, содержащего мутантный ген AHAS, например содержащего одну или более мутаций, описанных в настоящей заявке; предпочтительно, чтобы растение, по существу, сохраняло каталитическую активность белка дикого типа, независимо от присутствия или отсутствия соответствующего гербицида. Согласно некоторым вариантам реализации способы включают введение в клетку растения олигонуклеотида репарации генов с одной или более целевыми мутациями в гене AHAS (например, такими, как описано в настоящей заявке) и идентификацию клетки, семени или растения, несущего мутированный ген AHAS.

Согласно разным вариантам реализации растения, раскрытые в настоящем описании, принадлежат к любому виду двудольных, однодольных или голосемянных растений, включая любой вид древесного растения, которое растет в виде дерева или куста, любой травянистый вид, который дает съедобные плоды, семена или овощи, или любой вид, который дает яркие или ароматные цветы. Например, растение может быть выбрано из группы, включающей канола (рапс), подсолнечник, табак, сахарную свеклу, хлопок, кукурузу, пшеницу, ячмень, рис, сорго, томаты, манго, персик, яблоню, грушу, клубнику, банан, дыню, картофель, морковь, салат-латук, лук, сою, сахарный тростник, горох, конский боб, тополь, виноград, цитрус, люцерну, рожь, овес, дерн и кормовые травы, лен, масличные культуры, огурец, ипомею плющевидную, бальзамин, перец, баклажан, бархатцы, лотос, капусту, маргаритки, гвоздику, тюльпаны, ирис, лилии и растения, дающие орехи, при условии, что они особо не упоминались ранее.

Олигонуклеотид репарации генов может быть введен в клетку растения при помощи любого способа, обычно применяемого в данной области техники, включая микроносители (биолистическая доставка), микроволокна, полиэтиленгликоль(ПЭГ)-опсредованный захват, электропорацию и микроинъекцию.

Также предложены способы и композиции, относящиеся к культуре клеток, подвергнутых мутации в соответствии со способами, раскрываемыми в настоящей заявке, с получением растения, которое производит семена, далее именуемого фертильным растением, и к получению семян и других растений из такого фертильного растения.

Также предложены способы селективной борьбы с сорняками на поле, на котором находятся растения, изменениями в гене AHAS согласно настоящему изобретению, причем способ включает обработку поля гербицидом, к которому растение было сделано устойчивым.

Также предложены мутации в гене AHAS, которые придают растению устойчивость или толерантность к члену соответствующего семейства гербицидов, или при которых мутированный ген AHAS, по существу, обладает той же ферментативной активностью по сравнению с AHAS дикого типа.

Олигонуклеотиды репарации генов.

Способы и композиции, раскрытые в настоящем описании, могут быть осуществлены или получены при помощи олигонуклеотидов репарации генов, обладающих конформацией и химическими особенностями, описанными более подробно ниже. Олигонуклеотиды репарации генов согласно настоящему описанию также описаны в опубликованной научной и патентной литературе под другими названиями, включая рекомбинагенные олигонуклеотиды; РНК/ДНК химерные олигонуклеотиды; химерные олигонуклеотиды, смешанные дуплексные олигонуклеотиды (MDON); РНК/ДНК олигонуклеотиды (RDO); елевые олигонуклеотиды генов, генопласты; одноцепочечные модифицированные олигонуклеотиды; мутационные векторы на основе одноцепочечных олигонуклеотидов (SSOMV); дуплексные мутационные векторы и гетеродуплексные мутационные векторы.

Олигонуклеотиды, обладающие конформацией и химическими осбенностями, описанными в патенте США № 5565350 Kmiec (Kmiec I) и в патенте США № 5731181 Kmiec (Kmiec II), включенных в настоящую заявку посредством ссылки, пригодны для применения в качестве олигонуклеотидов репарации генов согласно данному изобретению. Олигонуклеотиды репарации генов в Kmiec I и Kmiec II содержат две комплементарных нити, одна из которых содержит по меньшей мере один сегмент нуклеотидов РНК-типа (РНК-сегмент), которые являются основаниями, спаривающимися с нуклеотидами ДНК

- 9 036997 типа другой нити.

В патенте Kmiec II раскрывается, что нуклеотиды могут быть заменены на ненуклеотиды, содержащие пуриновые и пиримидиновые основания. Дополнительные молекулы репарации генов, которые можно применять для данного изобретения, описаны в патентах США №№ 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804 и 6010907 и в международном патенте № PCT/US 00/23457; в публикации международных патентов №№ WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 и WO 99/40789, каждый из которых введен в настоящее описание посредством ссылки на их полную версию.

Согласно одному варианту реализации олигонуклеотид репарации генов является смешанными дуплексными олигонуклеотидами (MDON), в которых нуклеотиды РНК-типа в смешанном дуплексном нуклеотиде становятся устойчивыми к действию РНКаз вследствие замены 2'-гидроксила на фтор, хлор или бром или вследствие помещения заместителя на 2'-О. Подходящие заместители включают заместители, предложенные в Kmiec II. Альтернативные заместители включают заместители, предложенные в патенте США № 5334711 (Sproat), и заместители, предложенные в патентных публикациях ЕР 629387 и ЕР 679657 (коллективно, заявки Martin), которые включены в настоящую заявку посредством ссылки. В настоящем описании 2'-фтор-, хлор- или бром-производные рибонуклеотида или рибонуклеотид, в котором Т-ОН иммет заместитель, описанный в заявках Martin или Sproat, называют Т-замещенный рибонуклеотид. В настоящем описании термин «нуклеотид РНК-типа обозначает Т-гидроксил или 2'замещенный нуклеотид, который связан с другими нуклеотидами смешанного дуплексного нуклеотида незамещенной фосфоэфирной связью или любыми неприродными связями, предлагаемыми в Kmiec I или Kmiec II. В настоящем описании термин «нуклеотид дезоксириботипа обозначает нуклеотид, содержащий Т-Н, который может быть связан с другими нуклеотидами олигонуклеотида репарации генов незамещенной фосфоэфирной связью или любыми неприродными связями, предлагаемыми в Kmiec I или Kmiec II.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения олигонуклеотид репарации генов представляет собой смешанный дуплексный олигонуклеотид (MDON), который связан исключительно незамещенными фосфоэфирными связями. Согласно альтернативным вариантам реализации связь осуществляется замещенными фосфодиэфирами, производными фосфодиэфиров и связями, не основанными на фосфоре, согласно Kmiec II. Согласно еще одному варианту реализациикаждый нуклеотид РНКтипа в смешанном дуплексном олигонуклеотиде представляет собой 2'-замещенный нуклеотид. Особенно предпочтительные варианты реализации 2'-замещенных рибонуклеотидов - это 2'-фтор, Т-метокси, 2'пропилокси, 2'-аллилокси, 2'-гидроксилэтилокси, 2'-метоксиэтилокси, Т-фторпропилокси и 2'трифторпропилкосизамещенные рибонуклеотиды. Более предпочтительные варианты реализации 2'замещенных рибонуклеотидов - это 2'-фтор, 2'-метокси, 2'-метоксиэтилокси и 2'-аллилоксизамещенные рибонуклеотиды. Согласно другому варианту реализации смешанный дуплексный нуклеотид связан незамещенными фосфоэфирными связями.

Хотя смешанные дуплексные нуклеотиды (MDON), содержащие только один тип 2'-замещенного нуклеотида РНК-типа, синтезировать удобнее, способы согласно настоящему изобретению можно осуществлять с применением смешанных дуплексных нуклеотидов, содержащих два или более типов нуклеотидов РНК-типа. Функция сегмента РНК может не изменяться при разрыве, вызванном введением дезоксинуклеотида между двумя тринуклеотидами РНК-типа, соответственно, термин РНК-сегмент включает термины, такие как прерванный РНК-сегмент. Непрерывный РНК-сегмент непрерывный РНК-сегмент (состоящий из последовательных нуклеотидов НРК-типа). Согласно альтернативному варианту реализации сегмент РНК может содержать альтернативные устойчивые к действию РНКазы и незамещенные 2'-ОН нуклеотиды. Смешанные дуплексные нуклеотиды предпочтительно должны содержать менее 100 нуклеотидов и более предпочтительно менее 85 нуклеотидов, но более 50 нуклеотидов. Первая и вторая нити спарены согласно модели спаривания оснований Уотсона-Крика. Согласно одному варианту реализации нити смешанного дуплексного олигонуклеотида ковалентно связаны с линкером, таким как одиночный гекса-, пента- или тетрануклеотид, так, что первая и вторая нити являются сегментами одной цепи олигонуклеотида, содержащей один 3'- и один 5'- конец. 3'- и 5'-Концы можно защитить путем присоединения кэпа-шпильки, в котором 3'- и 5'-концевые нуклеотиды спарены с соседними нуклеотидами по принципу Уотсона-Крика. Второй кэп-шпильку можно дополнительно поместить на соединение между первой и второй нитью на некотором расстоянии от 3'- и 5'-концов так, чтобы стабилизировать спаривание по принципу Уотсона-Крика между первой и второй нитью.

Первая и вторая нити содержат две области, которые гомологичны двум фрагментам целевого гена, т.е. содержат ту же последовательность, что и целевой ген. Гомологичная область содержит нуклеотиды сегмента РНК и может содержать один или более нуклеотидов ДНК-типа в связанном сегменте ДНК и также может содержать нуклеотиды ДНК-типа, которые не находятся внутри переходного сегмента ДНК. Две области гомологии разделены областью, содержащей последовательность, которая отличается от последовательности целевого гена, называемой гетерологичной областью, и каждая область гомологии является соседней по отношению к указанной гетерологичной области. Гетерологичная область может содержать один, два или три нуклеотида, спаренных вопреки принципу комплементарности. Нук

- 10 036997 леотиды, спаренные вопреки принципу комплементарности, могут быть смежными или, в альтернативном варианте, могут быть разделены двумя нуклеотидами, которые гомологичны целевому гену. В качестве альтернативы гетерологичная область может также содержать вставку одного, двух, трех или пяти или менее нуклеотидов. В качестве альтернативы последовательность смешанного дуплексного олигонуклеотида может отличаться от последовательности целевого гена только делецией одного, двух, трех, пяти или менее нуклеотидов из смешанного дуплексного олигонуклеотида. Длина и положение гетерологичной области, как предполагается в данном случае, имеет длину делеции, даже если нуклеотиды смешанного дуплексного олигонуклеотида находятся внутри гетерологичной области. Расстояние между фрагментами целевого гена, который комплементарен двум гомологичным областям, идентично длине гетерологичной области, где предполагается сделать замену или замены. Если гетерологичная область содержит вставку, гомологичные области в смешанном дуплексном олигонуклеотиде расходятся на большее расстояние, чем то, на котором комплементарные им гомологичные фрагменты расположены в гене. Если гетерологичная область кодирует делецию, справедливо обратное утверждение.

Каждый РНК-сегмент смешанного дуплексного олигонуклеотида каждый частью гомологичной области, т.е. области, которая идентична по последовательности фрагменту целевого гена, сегменты которого вместе предпочтительно содержат по меньшей мере 13 нуклеотидов РНК-типа и предпочтительно от 16 до 25 нуклеотидов РНК-типа, или еще предпочтительнее 18-22 нуклеотида РНК-типа и наиболее предпочтительно 20 нуклеотидов. Согласно одному варианту реализации РНК-сегменты гомологичных областей разделены промежуточным ДНК-сегментом и являются соседними по отношению к нему, т.е. соединены с ним. Согласно одному варианту реализации каждый нуклеотид гетерологичной области является нуклеотидом переходного ДНК-сегмента. Промежуточный ДНК-сегмент, который содержит гетерологичную область смешанного дуплексного олигонуклеотида, называют сегмент-мутатор.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения олигонуклеотид репарации генов (GRON) представляет собой мутационный вектор из одноцепочечного олигодезоксинуклеотида (SSOMV), который раскрыт в международной заявке на патент PCT/US 00/23457, в патентах США №№ 6271360, 6479292 и 7060500, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки на их полную версию. Последовательность SSOMV основана на тех же принципах, что и мутационные векторы, описанные в патентах США №№ 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804 и 6010907, в международных публикациях №№ WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 и WO 99/40789. Последовательность SSOMV содержит две области, которые гомологичны целевой последовательности, разделенные областью, которая содержит желаемое генетическое изменение, называемое областью-мутатором. Область-мутатор может иметь последовательность, которая имеет ту же длину, что и последовательность, которая разделяет гомологичные области в целевой последовательности, но обладающая отличной последовательностью. Такая область-мутатор может приводить к замене. В качестве альтернативы гомологичные области в SSOMV могут быть соседними по отношению друг к другу, а области в целевом гене, обладающие той же последовательностью, разделены одним, двумя или более нуклеотидами. Такой SSOMV приводит к делеции нуклеотидов из целевого гена, которые отсутствуют в SSOMV. Наконец, последовательность целевого гена, которая идентична гомологичным областям, может в целевом гене быть соседней, но быть отделена одним, двумя или более нуклеотидами в последовательности SSOMV. Такой SSOMV приводит к вставке в последовательность целевого гена.

Нуклеотиды SSOMV являются дезоксирибонуклеотидами, которые связаны немодифицированными фосфоэфирными связями за исключением связи между нуклеотидами на 3'- и/или 5'-конце, или в качестве альтернативы две связи между нуклеотидами на 3'- и/или 5'-конце могут быть фосфотиоатными или фосфоамидатными. В настоящем описании связь между нуклеотидами представляет собой связь между нуклеотидами SSOMV, и не включает связь между нуклеотидом 3'-конца или нуклеотидом 5'-конца и блокирующим заместителем. Согласно конкретному варианту реализации длина SSOMV составляет от 21 до 55 дезоксинуклеотидов, а гомологичные области совместно имеют длину по меньшей мере 20 дезоксинуклеотидов, и по меньшей мере две гомологичные области должны иметь длину по меньшей мере 8 дезоксинуклеотидов каждая.

SSOMV может иметь такую конструкцию, чтобы быть комплементарным либо кодирующей, либо некодирующей нити целевого гена. Когда желаемой мутацией является замена одного основания, предпочтительно, чтобы и нуклеотид-мутатор, и целевой нуклеотид были пиримидинами. Если это согласуется с желаемым функциональным результатом, предпочтительно, чтобы и нуклеотид-мутатор, и целевой нуклеотид в комплементарной цепи были пиримидинами. Особенно предпочтительны SSOMV, которые кодируют мутации трансверсии, т.е. нуклеотид-мутатор С или Т спаривается вопреки принципам комплементарности, соответственно, с нуклеотидом С или Т в комплементарной цепи.

Помимо олигодезоксинуклеотидов SSOMV могут содержать 5'-блокирующий заместитель, который присоединенн к атомам углерода 5'-конца через линкер. Химическое строение линкера не является критичным, за исключением его длины, которая должна составлять предпочтительно по меньшей мере 6 атомов, и необходимости, чтобы линкер был гибким. Можно применять целый ряд нетоксичных заместителей, таких как биопин, холестерин или другие стероиды, или неинтеркалирующий катионный флуо

- 11 036997 ресцентный краситель. Особенно предпочтительные реагенты для получения SSOMV представляют собой реагенты, продаваемые под маркой Су3™ и Су5™ компанией Glen Research, Sterling Va. (в настоящее время GE Healthcare), которые представляют собой заблокированные фосфороамидиты, которые при включении в олигонуклеотид дают 3,3,3',3'-тетраметил N,N'-изопропилзамещенный индомонокарбоцианиновый и индодикарбоцианиновый красители соответственно. Су3 особо предпочтителен. В случае, если индокарбоцианин представляет собой замещенный N-оксиалкил, его удобно связать с 5'-концом олигодезоксинуклеотида как фосфодиэфир с 5'-концевым фосфатом. Химические особенности линкера красителя, расположенного между красителем и олигодезоксинуклеотидом, не являются критичными, и его выбирают из соображений удобства синтеза. Если для указанных целей применяют коммерческий фосфорамидит Су3, получаемая модификация 5' состоит из блокирующего заместителя и линкера, вместе с которым присутствует N-гидроксипропил, N'-фосфатидилпропил 3,3,3',3'-тетраметилиндомонокарбоциамин.

Согласно предпочтительному варианту реализации индокарбоцианиновый краситель является четырехзамещенным в положении 3 и 3' индольных колец. Без определенного теоретического обоснования данные заместители не дают красителю быть интеркалирующим красителем. Идентичность заместителей в этих положениях не является критичной. Дополнительно SSOMV может содержать 3'-блокирующий заместитель. Опять же, химические особенности 3'-блокирующего заместителя не являются критичными.

Раскрытые в настоящей заявке мутации также можно получить путем мутагенеза (случайного, соматического или направленного) и методик редактирования или рекомбинации, включая направлено воздействие на ген с применением сайт-специфичной гомологичной рекомбинации с помощью нуклеаз с цинковыми пальцами., но не ограничиваясь им.

Доставка олигонуклеотидов репарации генов в клетки растений.

Для доставки олигонуклеотидов репарации генов можно применять любой широкоизвестный способ трансформации клеток растений. Примеры способов перечислены ниже.

Микроносители и микроволокна.

Применение металлических микроносителей (микросфер) для введения больших фрагментов ДНК в клетки растений, обладающих клеточной стенкой из целлюлозы, путем бомбардировки хорошо известно специалистам в данной области техники (в дальнейшем - биолистическая доставка). В патентах США №№ 4945050; 5100792 и 5204253 описаны обычные методики выбора микроносителей и устройств для их проектирования.

Специфические условия для применения микроносителей в способах согласно настоящему изобретению описаны в международной публикации WO 99/07865. В примере способа охлажденные на льду мирокносители (60 мг/мл), смешанный дуплексный нуклеотид (960 мг/мл), 2,5М CaCl и 0,1М спермидин добавляют в порядке упоминания; смесь осторожно взбалтывают, например, путем переворачивания в течение 10 мин и затем оставляют при комнатной температуре на 10 мин, после чего микроносители разбавляют в 5 объемах этанола, центрифугируют и ресуспендируют в 100% этаноле. Хорошие результаты можно получить при следующих концентрациях в растворе для прикрепления: 8-10 мкг/мл микроносителей, 14-17 мкг/мл смешанного дуплексного олигонуклеотида, 1,1-1,4М CaCl и 18-22 мМ спермидина. Оптимальные результаты получали при условиях: 8 мкг/мл микроносителей, 16,5 мкг/мл смешанного дуплексного олигонуклеотида, 1,3М CaCl и 21 мМ спермидина.

При осуществлении настоящего изобретения олигонуклеотиды репарации генов также можно вводить в клетки растений при помощи микроволокон, проникающих через клеточную стенку и мембрану клетки. В патенте США № 5302523(Coffee и др.) описано применение 30x0,5 мкм и 10x0,3 мкм волокон карбида кремния для облегчения трансформации суспензии культур кукурузы Black Mexican Sweet. Для доставки олигонуклеотидов репарации генов в целях трансмутации можно применять любой механический метод, который можно применять для введения ДНК с целью трансформации клетки растения с применением микроволокон.

Пример методики доставки олигонуклеотидов репарации генов с помощью микроволокна состоит в следующем.

Стерильные микроволокна (2 мкг) суспендируют в 150 мкл культуральной среды для культивирования растений, содержащей около 10 мкг смешанного дуплексного олигонуклеотида. Суспензии культуры дают осесть, и равные объемы упакованных клеток и стерильной суспензии волокна/нуклеотида взбалтывают в течение 10 мин и наносят на чашку Петри. Селективную среду наносят немедленно или с задержкой примерно до 120 ч, как следует для конкретного признака.

Электропорация протопластов.

Согласно альтернативному варианту реализации олигонуклеотиды репарации генов могут быть доставлены в клетку растения путем электропорации протопласта, полученного из части растения. Протопласты получают путем ферментативной обработки части растения, в частности листа, в соответствии с методами, хорошо известными специалистам в данной области техники. См., например, Gallois et al., 1996, в Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp et al., 1999, в Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, N.J. Протопласты не нужно культивировать в рос- 12 036997 товой среде перед электропорацией. Примеры условий для электропорации - это 3х10⁵ протопластов в общем объеме 0,3 мл при концентрации олигонуклеотида репарации генов от 0,6 до 4 мкг/мл.

Опосредованное ПЭГ поглощение ДНК протопластами.

Согласно альтернативному варианту реализации протопласты растений поглощают нуклеиновые кислоты в присутствии мембрано-модифицирующего агента - полиэтиленгликоля в соответствии с методами, хорошо известными специалистам в данной области техники (см., например, Gharti-Chhetri et al., 1992; Datta et al., 1992).

Микроинъекции.

Согласно альтернативному варианту реализации олигонуклеотиды репарации генов можно доставлять путем инъекции при помощи микрокапилляра в клетки растений или в протопласты (см., например, Miki et al., 1989; Schnorf et al., 1991).

Отбор устойчивых к гербицидам растений и обработка гербицидом.

Растения и клетки растений можно тестировать на устойчивость или толерантность к гербициду при помощи широкоизвестных методов, например, путем выращивания растения или клетки растения в присутствии гербицида и измерения скорости роста по сравнению с ростом в отсутствии гербицида.

В настоящем описании, по существу, нормальный рост растения, органа растения, ткани растения или клетки растения определяют как скорость роста или скорость деления клеток растения, органа растения, ткани растения или клетки растения, которая составляет по меньшей мере 35%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 75% от скорости роста или скорости деления соответствующего растения, органа растения, ткани растения или клетки растения, экспрессирующих белок AHAS дикого типа.

В настоящем описании, по существу, нормальное развитие растения, органа растения, ткани растения или клетки растения определяют как одно или более событий развития в растении, органе растения, ткани растения или клетке растения, которые, по существу, сходны с таковыми событиями, имеющими место в соответствующем растении, органе растения, ткани растения или клетке растения, экспрессирующих белок AHAS дикого типа.

Согласно некоторым вариантам реализации органы растения согласно настоящему изобретению включают листья, стебли, корни, вегетативные почки, цветопочки, меристему, эмбрионы, семядоли, эндоспермы, чашелистики, лепестки, пестики, плодолистики, тычинки, пыльники, микроспоры, пыльцу, пыльцевые трубки, семяпочки, завязи и плоды или срезы, слои или диски, полученные из указанных элементов, но не ограничиваются ими. Ткани растений включают ткань каллуса, основную паренхиму, проводящую ткань, запасающую ткань, меристематические ткани, ткани листьев, ткани побегов, ткани корня, ткани галла, ткани опухолей растений и репродуктивные ткани, но не ограничиваются ими. Клетки растений включают изолированные клетки с клеточной стенкой, разного размера, агрегаты и протопласты таких клеток, но не ограничиваются ими.

Растения, по существу, толерантны к соответствующему гербициду, если при воздействии на них данного гербицида они дают кривую доза-ответ, которая сдвинута вправо при сравнении с кривой, полученной для подобного нетолерантного растения при аналогичной обработке. На таких кривых дозаответ дозу откладывают по оси X, а процент поражения, гербицидное действие и пр. строят по оси Y. Для толерантных растений требуется больше гербицида, чем для подобных не обладающих толерантностью растений, чтобы получить тот же эффект гербицида. У растения, которые по существу устойчивы к гербициду, наблюдают малые некротические, литические, хлорозные или другие поражения, если такие поражения вообще возникают, при воздействии на растение гербицидом при концентрациях и количествах, которые обычно применяют в сообществе агрохимиков для уничтожения сорняков на поле. Растения, которые устойчивы к гербициду, также толерантны к гербициду.

Примеры

Далее следуют примеры, которые иллюстрируют процедуры осуществления настоящего изобретения на практике. Эти примеры не следует рассматривать как ограничивающие. Все проценты приведены как массовые доли, а все соотношения смесей растворителей - в объемных долях, если не указано иное.

Пример 1. Приготовление устойчивых к гербициду образцов Brassica.

Если не указано иное, применяемая в настоящем описании нумерация гена(ов) основана на последовательности аминокислот синтазы ацетолактата (ALS) или синтазы ацетогидроксикислот (AHAS) Arabidopsis At3g48560 (SEQ ID NO: 1). В лабораторных справочниках до октября 2005 г. положение S653 (на основании последовательности аминокислот у Arabidopsis) называли S621 на основании последовательности аминокислот зерновых ZmAHAS 108 и ZmAHAS 109 (Fang et al., 1992).

Одна цель состояла в том, чтобы получить резистентную к имазетапиру (Imi) замену аминокислоты S653N или и в BnAHAS I и III ярового канола (Brassica napus, яровой масличный рапс, обозначаемый BN-2), и озимого масличного рапса (WOSR, также Brassica napus, обозначаемый BN-11).

Чтобы амплифицировать целевые области BnAHAS I и III из Brassica napus (первоначально элитная линия канола BN-2), разработали пару олигонуклеотидов BnALS1 и BnALS2 (SEQ ID NO: 9 и 10). Поскольку BnAHAS I и III не содержат интронов, BnALS 1 и BnALS2 амплифицируют целевую область из 284 п.о. как из геномной ДНК, так и из кДНК, фланкирующей сайт S653. Данная пара праймеров также

- 13 036997 предназначена для обеспечения возможности амплификации целевой области ALS из Arabidopsis. Праймеры получали и ресуспендировали в стерильной воде.

Сначала пару праймеров BnALS 1/BnALS2 использовали в ПНР для амплификации С-концевых областей BnAHAS I и III из BN-2. Далее целевые области амплифицировали из дополнительных образцов BN-2 и клонировали в pGEM-T. Готовили клонированные вставки из 12 колоний из каждой из 3 проб геномных ДНК и к ДНК выращенных в ночных культурах, и секвенировали при помощи плазмид, подтверждая целевую последовательность. Матричные растворы в глицерине готовили для BN-2 ALS 2с-21, как для представителя BnAHAS I, и для BN-2 ALS YB10-2g-14, как для представителя BnAHAS III для данных целевых областей в 284 п.о.

Исследовали целевую область BnALS геномной ДНК и кДНК из BN-2 и регистрировали ошибки ПНР. На основании последовательности BnAHAS I и III из BN-2 создавали один GRON (олигонуклеотид репарации генов) BnALS1621/C/41/5'Cy3/3'idC (SEQ ID NO: 5), чтобы осуществить замену серина на аспарагиновую кислоту (AGT>ААТ) в положении 653 (См. табл. 1). Исходные продукты синтеза ресуспендировали и определяли их концентрации. Ресуспендированные олигонуклеотиды хранили замороженными при -70°С. Некодирующщий вариант обозначили BnALS1621/NC/41/5'Cy3/3'idC (SEQ ID NO: 6). Позже BnALS1621/NC сравнивали с последовательностями из Genebank. При этом только последовательности с >16 нуклеотидами из 41 гибридизованных были BnAHAS I и III, и при этом олигонуклеотиды содержали единственный спариваемый вопреки принципам комплементарности G>A, предназначенный для введения замены аминокислот S653.

Таблица 1

Последовательности GRON

GRON	Последовательность
BnALS1621/C/41/5'Cy3/3'idC	VTGTGTTACCGATGATCCCAAATGGTGGCACT TTC AAAGATGH (SEQ ID NO: 5)
BnALS1621/NC/41/5'Cy3/3'idC	VCATCTTTGAAAGTGCCACCATTTGGGATCAT CGG T AAC AC AH (SEQ ID NO: 6)
BnALS 1574/C/4 l/5'Cy3/3'idC	VCTTGGGATGGTCATGCAATTGGAAGATCGG TTCT ACAAAGCH (SEQ ID NO: 7)
BnALS 1574/NC/4 l/5'Cy3/3'idC	VGCTTTGTAGAACCGATCTTCCAATTGCATGA CCA TCCCAAGH (SEQ ID NO: 8)

Преобразование оснований показано жирным шрифтом. V=CY3; H=3'DMT dC CPG.

Целевые области BnALS из элитной линии озимого масличного рапса (WOSR) Cibus BN-11 амплифицировали из геномной ДНК и кДНК отдельных растений, установленных представителей BN-11. Последовательности BN-11 BnALS анализировали и регистрировали ошибки ПЦР.

Дополнительно к исследованию целевых областей BnALS из BN-2 и BN-11 те же целевые области исследовали в коммерческой разновидности Clearfield Canola (BN-15). Последовательности BnAHAS из Clearfield Canola анализировали и регистрировали ошибки ПЦР, демонстирующие ожидаемые изменения аминокислот, S653N (AGT >ААТ) в BnAHAS I и W574L (TGG >TTG) в BnAHAS III. В итоге, полные кодирующие последовательности для BnAHAS I и III амплифицировали с применением BnALS3/BnALSOR2 (SEQ ID NOs: 11 и 12) и BnALS3/BnALSOR3 (SEQ ID NO: 11 и 13), соответственно, клонировали и секвенировали из линий BN-2, BN-11 и BN-15, которые служили эталонными последовательностями для целей сравнения.

Образцы каллуса Imi-устойчивого BN-2 (Канола) BnALS1621N-44-53, полученные при разных видах обработки, подвергали экстракции с применением способа Edwards et al. (1991). Геномную ДНК из этого материала подвергали скринингу, применяя микс аллель-специфичной ПЦР (AS-PCR) (ММ#23, состоящий из олигонуклеотидов BnALSOF1, BnALSOR2, BnALSOR3 и BnALSIR1A) (SEQ ID nO: 14, 12, 13, и 15 соответственно) для специфичной детекции изменения S653N и микс аллель-специфической ПЦР (ММ#29, состоящий из олигонуклеотидов BnALSOF2, BnALSOR4 и BnALSIF1T) (SEQ ID NOs: 16, 17 и 18 соответственно) для специфичной детекции изменения W574L в BnAHAS I или III. Такие первичные результаты AS-PCR были неопределенными, и, соответственно, брали дополнительные образцы BnALS1 621N-54-58 для большинства образцов BnALS1621N-44-53, и подвергали их экстракции с применением способа Edwards et al. (1991) с дополнительными этапами очистки в целях получения более чистой геномной ДНК.

В данном пункте образцы BnALS1 621N-54-58 амплифицировали с сочетанием праймеров BnALSOF2, BnALSOR2 и BnALSOR3 и получали небольшое количество амплифицированного продукта. Данные продукты обычным способом клонировали в pGEM-T и 12 белых колоний на линию получали как ночные культуры, приготовленные при помощи плазмид (с применением набора Qiagen plasmid miniprep) и секвенировали с использованием реагентов для секвенирования BigDye 3.1.

- 14 036997

Предварительный анализ последовательностей позволил определить, что BnALS1621N-55-13 содержит мутацию S653N в BnAHAS III (AGT^ААТ), а два других клона из данной линии, BnALS 1621N55-15 и 19, были дикого типа по BnAHAS III. Регистрировали результат полного анализа последовательности. Чтобы подтвердить, что данный единственный положительный результат не является следствием ошибки ПНР, еще 38 колоний из данной линии при помощи скринингу подвергли методом аллельспецифичной ПЦР. 8 самых сильных по результатом данного отбора методом AS-PCR положительных образцов BnALS1621N-55-1-8 выращивали как ночные культуры, изолировали и секвенировали ДНК плазмид. Семь из 8 положительных колоний BnALS1621N-55-2 - 8 по данным секвенирования методом AS-PCR были положительными на мутацию S653N в BnAHAS III; другой BnALS1621N-55-1 представлял собой последовательность BnAHAS I дикого типа. В совокупности эти результаты указывали на то, что линия BnALS1 621N-55 гетерозиготна по мутации S653N в BnAHAS III.

Образец BnALS1621N-55 был параллельным образцом каллуса из того же исходного Imiустойчивого каллуса, что и BnALS1621N-49. Геномную ДНК из этих образцов амплифицировали с сочетанием праймеров BnALSOF2, BnALSOR2 и BnALSOR3 и фрагменты легко клонировали в pGEM-T и трансформировали. ММ#23 применяли для скрининга 38 белых колоний на мутацию S653N и идентифицировали 4 положительных колонии (BnALS1621N-49-9 - 12). Данные колонии были секвенированы. Три из четырех колоний (BnALS1621N-49 - 9, 10 и 12) содержали мутацию S653N в BnAHAS III.

Аналогичный способ клонирования целевой области при помощи аллель-специфичной-ПЦР с подтверждением последовательности применяли для идентификации других линий с полиморфизмом S653N. Среди них была линия BnALS-97. BnALS-97 регенерировали в растение и ждали, пока оно даст семена. Поскольку данная линия была прототипом (как растение), клонировали и секвенировали полные кодирующие последовательности и BnAHAS I и III. В данной линии единственным полиморфизмом по сравнению с последовательностью BN-2 дикого типа было изменение в кодоне AGT^ААТ. которое приводило к замене аминокислот S653N в BnAHAS III.

Предварительный анализ последовательности клонированных случайным образом ампликонов BnALSOF2/BnALSOR2 и BnALSOF2/BnALSOR3 из линии BnALS1621N-57 указывал на то, что оба клона BnALS1621N-57-43 и 46 содержали мутацию W574L (TGG^TTG) в BnAHAS I. Провели анализ полной последовательности и показали, что линия 57 гетерозиготна, поскольку клоны 38 и 41 включали W574. Соответственно, для амплификации данного фрагмента из BnALS1621N-57 и BnALS1621N-45 применяли сочетание праймеров BnALSOF2, BnALSOR2 и BnALSOR3, параллельный образец каллуса из того же исходного Imi-устойчивого каллуса как BnALS1621N-57, вшиваемого обычным образом в pGEM-T, трансформировали и наносили на чашки с применением синей/белой селекции.

ММ#29 применяли для скрининга 19 белых колоний на наличие W574L из каждой чашки на BnALS1621N-57 и BnALS 1621N-45, причем из 4 положительных колоний для каждого (BnALS1621N45-1, 2, 9 и 18, и BnALS1621N-57-1, 7, 13 и 16) получали плазмиды и секвенировали их. Анализ последовательностей показал, что все 8 колоний содержали мутацию W574L в BnAHAS I. Оптимизировали температуру отжига для ММ#29 и проводили скрининг дополнительных 19 колоний с применением новых условий, из трех положительных колоний (BnALS1621N-57-17, 18 и 19) получали плазмиды и секвенировали их.

Получали дополнительные образцы Imi-устойчивого канола BnALS-68-91 и экстрагировали ДНК при помощи способа Edwards et al., (1991). Из каждого образца для амплификации фрагментов BnAHAS I and III применяли сочетание праймеров BnALSOF2, BnALSOR2 и BnALSOR3 и легко их клонировали в pGEM-T.

Применяя ММ#23 в реакциях AS-ПЦР для детекции мутации S653N, проводили скрининг 12 колоний на одну линию и результаты выявили 2 позитива из линии BnALS-81 (BnALS-81-203 и 208) и 4 из линии BnALS-76 (BnALS-76-153, 154, 156 и 162) на содержание мутации S653N мутации в BnAHAS III путем секвенирования. Проводили анализ полной последовательности. Путем скрининга методом аллель-специфичной ПНР с ММ#23 определили, что и амплифицированные путем ПНР целевые области и области колоний бактерий с одиночными клонированными вставками, линии BnALS-159 (молекулярнобиологический образец 102; колония 655) обладают мутацией S653N в BnAHAS I ( S653N в исходной последовательности Cibus) в данном неге.

Наконец, определили, что в линии BnALS-83 (молекулярно-биологический образец 91), дикий тип (колония 408) и мутант (колонии 403, 405 и 406) гетерозиготны по мутации S653T (AGT^ACT) в BnAHAS I. Что касается растений, было подтверждено, что линия BnALS-83 была гетерозиготной по BnAHAS I в отношении мутации S653T. Провели дальнейший скрининг с применением ММ#23 (S653N) и ММ#29 (W574L) новых Imi-устойчивых линий канола BN-2 BnALS-76 и BnALS-123. Поскольку вышеупомянутые ожидаемые мутации не обнаружили в данных образцах, 12 BnALSOF2/OR2/3 клонировали и секвенировали. Все 7 клонов BnAHAS III по BnALS-123 (колонии 5, 17-19, 21, 22, 26 и 28) были положительными в отношении мутации S653T. Однако семена от R1 генотипировали как гетерозиготы.

Кроме того, N-концевые фрагменты каждого из BnAHAS I and III, полученные путем ПЦР, клонировали и секвенировали на BnALS-58, 68 и 69 с применением, соответственно, сочетаний олигонуклео

- 15 036997 тидов BnALS3/BnALS8 (SEQ ID NO: 11 и 19 соответственно). Получали новый образец ткани на BnALS96, и N-концевые фрагменты BnAHAS I and III, полученные путем ПЦР, клонировали и секвенировали, и показали, что линия на BnALS-96 содержит мутацию A205V (GCCaGTC) в BnAHAS I. Все четыре клона полноразмерной кодирующей последовательности ампликона BnALS3/OR2 из материала растения, полученного из каллуса линии BnALS-68, содержали изменение A205V (GCGaGTG) в BnAHAS III, идентичное изменению в BnALS-69.

У линий определяли наличие мутации; эксперимент, в ходе которого их получали, и обработка представлены в обобщенном виде в табл. 2. Линия BnALS-159 погибла как линия каллуса и не дала побегов. В табл. 3 представлены примеры олигонуклеотидов, применяемых в экспериментах, описываемых в настоящее заявке.

Таблица 2 Мутации в образцах imi-устойчивых тканей Bn канола

Линия (CS#)	Мутация	SNP	Ген	Линия
BnALS-96	A205V	GCC — GTC	I	ΒΝ2
BnALS-68	A205V	GCG — GTG	III	ΒΝ2
BnALS-69	A205V	GCG — GTG	III	ΒΝ2
BnALS-58	A205D	GCC — GAC	I	ΒΝ2
BnALS-63	W574C	TGG TGT	III	ΒΝ2
BnALS-57	W574L	TGG -+ TTG	I	ΒΝ2
BnALS-67	W574L	TGG -+ TTG	I	ΒΝ2
BN02-204-A01	W574L;R577W	TGG -+ TTG; CGG -+ TGG	III	ΒΝ2
BN02-224-C01	W574L (HET)	TGG -+ TTG	III	ΒΝ2
BN02-224-B01	W574M (HET)	TGG -+ ATG	III	ΒΝ2
BnALS-76	W574S	TGG -+ TCG	III	ΒΝ2
BnALS-159*	S653N	AGT -+ AAT	I	ΒΝ2
BnALS-55	S653N	AGT -+ AAT	III	ΒΝ2
BnALS-97	S653N	AGT -+ AAT	III	ΒΝ2
BnALS-61	S653N	AGT -+ AAT	III	ΒΝ2
BnALS-84	S653N	AGT -+ AAT	III	ΒΝ2
BnALS-83	S653T	AGT ACT	I	ΒΝ2
BnALS-123	S653T	AGT ACT	III	ΒΝ2
BN02-139-E07	W574C(het);S653N	TGG -+ TGC; AGT -+ AAT	III	ΒΝ2
BN02-139-D05	A205V;S653N	GCG -+ GTG; AGT -+ AAT	III	ΒΝ2
BN02-139-F08	A205V;S653N	GCG -+ GTG; AGT -+ AAT	III	ΒΝ2
BN02-139-C03	A205V(het);S653N	GCC -+ GTC; AGT -+ AAT	Ι;ΠΙ	ΒΝ2
BN02-139-D06	W574C;S653N	TGG^TGC; AGT^AAT	Ι;ΠΙ	ΒΝ2
BN02-139-E10	W574L;S653N	TGG^ TTG; AGT^AAT	Ι;ΠΙ	ΒΝ2
BN02-139-A13	W574L(het);S653N	TGG^TTG; AGT^AAT	III	ΒΝ2
BN02-139-A12	D376E;S653N	GAC^ GAG; AGT^AAT	III	ΒΝ2
BN02-139-F09	A122V;S653N	GCT—>GTT; AGT -+AAT	Ι;ΠΙ	ΒΝ2
BN02-139-A01	A205D,S653N	GCG-+ GAC; AGT^AAT	Ι;ΠΙ	ΒΝ2
BN02-139-D-04	W574C; S653N	TGG^TGC; AGT^AAT	Ι;ΠΙ	ΒΝ2
BN02-139-B11	W574C; S653N	TGG^TGC; AGT^AAT	Ι;ΠΙ	ΒΝ2

- 16 036997

Таблица 3

Примеры олигонуклеотидов

Название	Длина	Последовательность олигонуклеотида
BnALSl (SEQID NO: 9)	24	ATGCAATGGGAAGATCGGTTCTAC
BnALS2 (SEQ Ш NO: 10)	29	CCATCYCCTTCKGTTATKACATCKTTGA A
BnALS3 (SEQ ID NO: 11)	20	CTAACCATGGCGGCGGCAAC
BnALSOR2 (SEQ ID NO: 12)	28	AGTCTGGGAACAAACCAAAAGCAGTAC A
BnALSOR3 (SEQ ID NO: 13)	28	CGTCTGGGAACAACCAAAAGTAGTACA A
BnALSOFl (SEQ ID NO: 14)	28	AGTGACGAAGAAAGAAGAACTCCGAG AA
BnALSIRlA(SEQ ID NO: 15)	30	CTGTTATTACATCTTTGAAAGTGCCACA AT
BnALSOF2 (SEQ ID NO: 16)	28	TGACGGTGATGGAAGCTTCATAATGAA C
BnALSOR4 (SEQ ID NO: 17)	28	GTCCWGGTGTATCCAGCATTGTCTGAA T
BnALSIFlT(SEQID NO: 18)	26	CAGCATCTTGGGATGGTCATGCAGTT
BnALS8 (SEQ ID NO: 19)	21	CCCATCAAAGTACTCGCACCG
BnALS9 (SEQ ID NO: 20)	21	CCCATCAACGTACTCGCACCA

После появления побегов проводили скрещивание во всех перестановках и сочетаниях. Линия BnALS-97 является эталоном S653N в BnAHAS III. Линия BnALS-57 является эталоном W574L в BnAHAS I. И BnALS-68 и 69 выдвинули в качестве эталонных линий для A205V в BnAHAS III. Линия BnALS-83 является первой линией, которая была гетерозиготна по S653T в BnAHAS I как каллус, который также должен быть гетерозиготен, как и растение.

Пример 2. Материалы и методы.

Рабочее описание культуры клеток.

Побеги, полученные из семян и из эмбрионов, полученных из микроспор, выращивали в стерильных условиях in vitro. Черенки субкультивировали каждые 2-4 недели и культивировали на чашках Петри (25 мм х 90 мм) в объеме 40-45 мл среды RS (Dovzhenko, 2001). Чашки запечатывали лентой Micropore (3M Company). Молодые листья применяли для выделения протопластов.

Выделение и очищение протопластов.

Примерно 600 мг ткани листьев 2-3 побегов недельного возраста, выращенных in vitro, разрезали на маленькие полоски скальпелем в чашку Петри с 5 мл среды В (Pelletier et al., 1983), рН доводили до 5,8. Спустя приблизительно 1 ч среду В заменяли на раствор ферментов, состоящий из среды В, в которой были растворены 0,5% (м/о) целлюлазы YC и 0,75% (м/о) мацерозима RIO (оба от компании Karlan Research Products, Коттонвуд, Аризона), 1 г/л бычьего сывороточного альбумина и 1 г/л 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты. Раствор ферментов нагнетали под вакуумом в ткань листьев и чашку с кусочками листьев в растворе ферментов инкубировали при 25°С в темноте. Очистку протопласта проводили при помощи градиента плотности йодиксанола (адаптировано из краткой инструкции Optiprep Cl 8; очищение интактных протопластов растений; Axis-Shield USA, 10 Commerce Way, Norton, MA 02776). После центрифугирования в градиенте плотности полосу с очищенными протопластами отбирали вместе с приблизительно 5 мл среды W5 (Frigerio et al., 1998). Выход протопласта определяли при помощи гемоцитометра и протопласты хранили в течение 2 ч при 4 °С.

Введение олигонуклеотида репарации генов.

Суспензию протопластов смешивали с равным объемом среды W5, переносили в пробирку для центрифугирования объемом 50 мл и центрифугировали в течение 5 мин при минимальной установке клинической центрифуги (около 50xg). Надосадочную жидкость отбирали и заменяли на среду ТМ (Klaus, 2001), корректируя плотность протопласта до 5x10 /мл. Аликвоты по 100 мкл, содержащие 5x10 протопластов в каждой, распределяли в пробирки для центрифугирования с круглым дном, после этого GRON, предназначенные для обеспечения мутаций в одном из генов AHAS, вводили в протопласты путем обработки ПЭГ. Чтобы ввести GRON в протопласты, 1 2,5 мкг GRON растворяли в 25 мкл очищенной воды и 125 мкл раствора полиэтиленгликоля (5 г ПЭГ MW 1500, 638 мг маннитола, 207 мг CaNO₃ х 4Н₂О и 8,75 мл очищенной воды); рН доводили приблизительно до 9,0). Через 30 мин инкубации на льду суспензию

- 17 036997 протопластов-ПЭГ промывали средой 5W и ресуспендировали в среде В. Суспензию хранили в течение ночи в холодильнике приблизительно при 4°С.

Введение протопластов в альгинат кальция.

Через один день после введения GRON протопласты вводили в альгинат кальция. Было показано, что внедрение протопластов в гелиевых субстратах (например, агароза, альгинат) увеличивает выживание протопластов и повышает частоту делений клеток, полученных из протопластов. Применяемый способ был основан на способе, описанном Dovzhenko (2001).

Культура протопластов и селекция имазетапир-устойчивых клеток.

Селекцию имазетапир-устойчивых каллусов проводили с применением последовательных подкультур альгинатов в среде по Pelletier et al. (1983). Селекцию начинали через неделю после обработки ПЭГ/GRON при концентрации 0,5 мкМ имазетапира. Гербицид не обладал немедленным эффектом. Сначала все микроколонии, которые сформировались в ранней фазе культивирования без имазетапира, продолжали расти, но медленнее, чем контроль без добавления гербицида. Через одну-две недели после начала селекции колонии замедляли рост или прекращали расти.

Перед окончанием фазы селекции в жидкой среде клетки и колонии выделяли из альгината путем обработки их в течение 30-45 мин культуральной средой, содержащей 50 мМ цитрата натрия. В момент переноса выделенных колоний из жидкой среды в твердую большинство колоний либо погибали, либо образовывали зеленоватый центр, покрытый наружными слоями отмерших клеток. На затвердевшей среде Е для селекции большинство микрокаллусов, которые сохраняли живые клетки, прекращали расти и становились коричневатыми. Ограниченный рост отдельных каллусов продолжался в редких случаях, но каллусы, не обладающие устойчивостью, в итоге становились коричневыми и погибали. Через две-три недели после переноса на затвердевшую среду для селекции (редко - раньше) среди фона коричневатых клеток и мирокаллусов появлялись каллусы, растущие активно.

Регенерация растений из устойчивых к гербицидам каллусов, полученных из протопластов с подтвержденной мутацией в гене AHAS. Imi-устойчивые каллусы, которые развились на отвердевшей среде для селекции, и у которых при анализе определили наличие в ДНК мутации, переносили в среду Е без гербицида (Pelletier et al., 1983), чтобы ускорить развитие. Отдельные линии каллусов варьировали по скорости роста и по морфологии. В целом, развитие в направлении регенерации побегов проходило следующие стадии: недифференцированный, зеленый каллус ^ каллус с темно-зелеными областями ^ развитие корней ^ развитие первых побегов ^ развитие мелких побегов с гипергидрированными (застеклованными) листьями.

Развитие отдельной линии каллуса варьировало, но вследствие постоянного субкультивирования и размножения на среде Е или модификациях среды Е с более низкой концентрацией α-нафталин уксусной кислоты (NAA) в итоге многие линии каллусов дали побеги.

После того как в среде Е формировались побеги с тремя или четырьмя листьями, их переносили на среду RS (Dovzhenko, 2001). На этой среде со временем ткань побегов и листьев развивалась так, что была морфологически нормальной (т.е. не гипергидрированной).

Пример 4. Результаты распыления гербицидов.

Растения В. napus на стадии 5-6 листьев опрыскивали разными AHAS-ингибирующими гербицидами. Растения В. napus, включая материнскую линию BN02 (или при необходимости BN 11), BN 15 (Clearfield, проверка двух коммерческих генов) и мутанты, опрыскивали, как подробно описано ниже. Гербициды распыляли в присутствии 0,25% сурфактанта AU391 в следующих количествах (расход):

Имазамокс (Beyond™) 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 32 и 48 унций активного ингредиента/акр (аи/А), Тифенсульфурон 0,028, 0,056, 0,112, 0,168 фунтов аи/А, Трибенурон 0,015, 0,03, 0,06, 0,12, 0,18 фунтов аи/А, Никосульфурон фунтов 0,06, 0,120, 0,24, 0,36 аи/А, Римсульфурон 0,015, 0,03, 0,06, 0,12, 0,18 фунтов аи/А, 2:1 массы:массы Тифенсульфурон/Трибенурон 0,056, 0,1 12, 0,224, 0,336 фунтов аи/А, 2,22:1 Тифенсульфурон/Никосульфурон 0,058, 0,1 16, 0,232 фунтов аи/А, Примисульфурон 0,035, 0,070, 0,140 фунтов аи/А, Флуметсулам 0,040, 0,080, 0,16 фунтов аи/А, Хлорамсулам 0,039, 0,078, 0,156 фунтов аи/А.

Гербициды наносили путем опрыскивания листьев, причем контрольные растения не опрыскивали. За исключением имазамокса, все исследованные AHAS-ингибирующие гербициды оценивали через 14 дней после распыления по шкале повреждения 1-10, где 10 означало гибель, а 1 означало неповрежденный необработанный контроль. Индивидуальные линии растений оценивали при каждом объеме распыления по сравнению с поведением контроля при данном объеме. Результаты исследований распыления представлены на фиг. 4.

- 18 036997

Тестируемые химикаты: Генотип (число сеянцев при всех объемах)

Тифенсульфурон: BN2 (6), BN1 5 (6), BN15xBnALS-57 (18)

Трибенурон: BN2 (6), BN 15 (6), BN15xBnALS-57 (18), 63 (9)

Никосульфурон: BN2 (6), BN 15 (6), BN15xBnALS-57 (18) THI / TRI: BN2 (6), BN 15 (6), BN15xBnALS-57 (18)

Римсульфурон: BN2 (6), BN 15 (6), BN15xBnALS-57 (18), 63 (9) THI / Nic: BN2 (18), 63 (9), BN15xBnALS-57 (36), BN1 5 (18)

Примисульфурон: BN2 (9), 63 (9), BN1 5 (9), BN15xBnALS-57 (18)

Флуметсулам: BN2 (9), 63 (9), BN 15 (9), BN15xBnALS-57 (18)

Хлорамсулам: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18) [0116]

Исследования с Имазамоксом оценивали следующим образом:

баллов за: 8, 16, 32 и 48 унций/А BnALS-83xBnALS-123, BnALS-96xBnALS123, BnALS-97xBnALS-57, BN15xBnALS-57, BN2, BN15, BnALS-97xBN15 балов за: 4 и 12 унций/А BnALS-97xBnALS-57, BN15xBnALS-97, BN2 балов за: 2, 4, 6, 8 унций/А для всех отдельных факторов мутаций.

Имазамокс:

унций/А: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (6), BnALS-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS-57 (12) унций/А: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (9), BnALS-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS-57 (12), BnALS-97xBN15 (15), BnALS97xBnALS-57 (14) унций/А: BN2 (9), BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-97 (9), BnALS-83 (12), BnALS-76 (9), BnALS-57 (12)

- 19 036997 унций/А: BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-83 (12), BnALS-83xBnALS123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (18), BN1 5 (18), BN15xBnALS-57 (15),

BnALS- 97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18) унций/А: BnALS-97xBN15 (15), BnALS-97xBnALS-57 (14), BN2 (12) унций/А: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (15),

BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18) унций/А: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (13),

BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18) унций/А: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (6),

BN15 (18), BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)

Ссылки

Datta SK, Datta K, Soltanifar N, Donn G, Potrykus 1 (1992) Herbicide-resistant Indica rice plants from IRR1 breeding line IR72 after PEG-mediated transformation of protoplasts.

Plant Molec. Biol. 20:619-629

Dovzhenko A (2001) Towards plastid transformation in rapeseed (Brassica napus L.) and sugarbeet {Beta vulgaris L.). PhD Dissertation, LMU Munich, Faculty of Biology

Edwards K, Johnstone C, Thompson C (1991) A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19:1349.

Frigerio L, Vitale A, Lord JM, Ceriotti A, Roberts LM (1998) Free ricin A chain, proricin, and native toxin have different cellular fates when expressed in tobacco protoplasts.

J Biol Chern 273: 14194-14199

Fang LY, Gross PR, Chen CH, Lillis M (1992) Sequence of two acetohydroxyacid synthase genes from Zea mays. Plant Mol Biol. 18(6): 1185-7

Gharti-Chhetri GB, Cherdshewasart W, Dewulf J, Jacobs M, Negrutiu I (1992)

Polyethylene glycol-mediated direct gene transfer in Nicotiana spp. Physiol. Plant. 85:345351

Klaus S (2003) Markerfreie transplastome Tabakpflanzen (Marker-free transplastomic tobacco plants). PhD Dissertation, LMU Munich, Faculty of Biology

Miki B, Huang B, Bird S, Kemble R, Simmonds D, Keller W (1989) A procedure for the microinjection of plant cells and protoplasts. Meth. Cell Science 12: 139-144

Pelletier G, Primard C, Vedel F, Chetrit P, Remy R, Rouselle P, Renard M (1983)

Intergeneric cytoplasm hybridization in Cruciferae by protoplast fusion. Mol. Gen. Genet.

191: 244-250

Schnorf M, Neuhaus-Uri G, Galli A, Iida S, Potrykus I, Neuhaus G (1991) An improved approach for transformation of plant cells by microinjection: molecular and genetic analysis. Transgen. Res. 1:23- 30

Tan S, Evans RR, Dahmer ML, Singh BK, Shaner DL (2005) Imidazolinone-tolerant crops: history, current status and future. PestManag Sci. 61(3):246-57.

Если не указано иное, все технические и научные термины в настоящей заявке имеют те же значения, которые обычно подразумевает любой специалист в данной области, к которой относится это изобретение.

Примеры реализации изобретения, приведенные в данной заявке, могут быть корректно осуществлены и в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые не указаны особо. Так, например, термины содержащий, включающий и др. следует понимать широко и без ограничений. Кроме того, термины и выражения, применяемые в настоящей заявке, применяются для описания, а не для ограничения, без намерения применять такие термины и выражения для исключения каких-либо признаков, эквивалентных показанным и описанным, или их частей. Следует понимать, что

- 20 036997 разные модификации возможны в пределах области заявленного изобретения.

Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение раскрыто, в частности, путем описания предпочтительных вариантов реализации и возможных признаков, специалисты в данной области техники могут прибегать к модификациям, усовершенствованиям и вариациям изобретений, раскрытых в настоящем описании. Такие модификации, усовершенствования и вариации считаются включенными в объем данного изобретения. Материалы, способы и примеры, представленные в настоящей заявке, являются примерами предпочтительных вариантов реализации, приведены в качестве примеров, и не предназначены для ограничения объема изобретения.

Изобретение было раскрыто в настоящем описании и в общем. Каждый из более узких видов и подродов, подпадающих под родовые понятия, также являются частью изобретения. Также включено общее описание изобретения с оговоркой или отрицательным ограничением, исключающим какие-либо объекты из родового понятия, независимо от того, цитировался ли исключенный материал в настоящей заявке.

Кроме того, когда признаки или аспекты изобретения раскрываются в терминах групп Маркуша, специалисты в данной области техники должны понимать, что изобретение равным образом описано в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша.

Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие источники, упоминаемые в настоящей заявке, прямо включены в настоящую заявку посредством ссылки на их полную версию, так же как если бы каждый источник был включен посредством ссылки индивидуально. В случае несоответствий настоящее описание, включая определения, будет приоритетным.

Другие варианты реализации изложены ниже в формуле изобретения.

Claims (4)

1. Растение, представляющее собой яровой масличный рапс Brassica napus, содержащее ген синтазы ацетогидроксикислот I (AHAS I), кодирующий белок AHAS I, содержащий замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению W574 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанное растение дополнительно содержит ген синтазы ацетогидроксикислот III (AHAS III), кодирующий белок AHAS III, содержащий замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению W574 последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный белок AHAS I и указанный белок AHAS III устойчивы к ингибированию AHAS-ингибирующим гербицидом, выбранным из группы, состоящей из имазамокса, тифенсульфурона, трибенурона, никосульфурона, примисульфурона, флуметсулама, смеси тифенсульфурона и трибенурона 2:1 и смеси никосульфурона и тифенсульфурона 2,22:1.

2. Растение по п.1, где указанное растение не является трансгенным.

3. Семя ярового масличного рапса Brassica napus, содержащее ген синтазы ацетогидроксикислот I (AHAS I), кодирующий белок AHAS I, содержащий замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению W574 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанное семя дополнительно содержит ген синтазы ацетогидроксикислот III (AHAS III), кодирующий белок AHAS III, содержащий замену триптофана на лейцин в положении, соответствующем положению W574 последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный белок AHAS I и указанный белок AHAS III устойчивы к ингибированию AHAS-ингибирующим гербицидом, выбранным из группы, состоящей из имазамокса, тифенсульфурона, трибенурона, никосульфурона, примисульфурона, флуметсулама, смеси тифенсульфурона и трибенурона 2:1 и смеси никосульфурона и тифенсульфурона 2,22:1.

4. Семя по п.3, где указанное семя не является трансгенным.