ES2380867T3 - Plantas de girasol resistentes a herbicidas, polinucleótidos que codifican proteínas correspondientes a la subunidad mayor de la acetohidroxiácido-sintasa resistentes a herbicidas y procedimientos de uso - Google Patents

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Abstract

Una planta de girasol que comprende en su genoma al menos una copia de al menos un gen endógeno que comprende un polinucleótido correspondiente a la subunidad mayor de la acetohidroxiácido-sintasa (AHASL), en que dicho polinucleótido AHASL codifica una proteína AHASL1 resistente al herbicida imidazolinona que comprende la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 2 o una planta de girasol de la progenie de esta y en que dicha planta o la progenie de esta presentan un aumento de la resistencia a al menos un herbicida de imidazolinona en comparación con una planta de girasol natural

Description

Plantas de girasol resistentes a herbicidas, polinucleótidos que codifican proteínas correspondientes a la subunidad mayor de la acetohidroxiácido-sintasa resistentes a herbicidas y procedimientos de uso.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere al campo de la biotecnología agrícola, en particular a plantas de girasol resistentes a herbicidas y a nuevas secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas correspondientes a la subunidad mayorde la acetohidroxiácido-sintasa de girasol naturales y resistentes a herbicidas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La acetohidroxiácido-sintasa (AHAS; EC 4.1.3.18, también conocida como acetolactato-sintasa o ALS) es la primera enzima que cataliza la síntesis bioquímica de los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina eisoleucina (Singh (1999) “Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine”, en Plant Amino Acid, Singh, B. K., ed.,Marcel Dekker Inc. Nueva York, Nueva York, EE. UU., págs. 227-247). La AHAS es el sitio de acción de cincofamilias de herbicidas estructuralmente diversas que incluyen las sulfonilureas (Tan y col. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith y Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626; LaRossa y Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161), las imidazolinonas (Shaner y col. (1984) Plant Physiol. 76:545-546), las triazolopirimidinas (Subramanian y Gerwick (1989) “Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines”, en Biocatalysis inAgricultural Biotechnology, Whitaker, J. R. y Sonnet, P. E. eds., ACS Symposium Series, American ChemicalSociety, Washington, D. C., págs. 277-288), los pirimidiniloxibenzoatos (Subramanian y col. (1990) Plant Physiol. 94:239-244) y las sulfonilaminocarboniltriazolinonas (Tan y col. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith y Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626). Los herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea se usanampliamente en la agricultura moderna debido a su eficacia a dosis de aplicación muy bajas y a su relativa falta detoxicidad para los animales. Al inhibir la actividad de la AHAS, estas familias de herbicidas impiden el crecimiento y desarrollo posterior de las plantas susceptibles, incluidas muchas especies de malas hierbas. Varios ejemplos deherbicidas de imidazolinona disponibles comercialmente son PURSUIT® (imazetapir), SCEPTER® (imazaquín) yARSENAL® (imazapir). Algunos ejemplos de herbicidas de sulfonilurea son clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, tifensulfurón-metilo, tribenurón-metilo, bensulfurón-metilo, nicosulfurón, etametsulfurón-metilo, rimsulfurón, triflusulfurón-metilo, triasulfurón, primisulfurón-metilo, cinosulfurón. amidosulfurón,flazasulfurón, imazosulfurón, pirazosulfurón-etilo y halosulfurón.
Debido a su alta eficacia y baja toxicidad, los herbicidas de imidazolinona se prefieren para aplicaciónmediante pulverización por encima de una amplia área de vegetación. La capacidad de pulverizar un herbicida porencima de una amplia área de vegetación disminuye los costes asociados con el establecimiento y mantenimientodel cultivo y disminuye la necesidad de la preparación del sitio antes del uso de estos compuestos químicos. Lapulverización por encima de una especie tolerante deseada también resulta en la capacidad de conseguir el máximopotencial de rendimiento de la especie deseada debido a la ausencia de especies competidoras. Sin embargo, lacapacidad de usar estas técnicas de pulverización por encima depende de la presencia de especies resistentes aimidazolinona de la vegetación deseada en el área de la pulverización.
Entre los principales cultivos agrícolas, algunas especies leguminosas como la soja son naturalmenteresistentes a los herbicidas de imidazolinona, debido a su capacidad de metabolizar rápidamente los compuestosherbicidas (Shaner y Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471). Otros cultivos como el maíz (Newhouse y col. (1992) Plant Physiol. 100:882-886) y arroz (Barret y col. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, Nueva York, EE. UU., págs. 195-220) son ligeramente susceptibles a los herbicidas de imidazolinona. La sensibilidad diferencial alos herbicidas de imidazolinona depende de la naturaleza química del herbicida concreto y del metabolismodiferencial del compuesto desde una forma tóxica a una forma no tóxica en cada planta (Shaner y col. (1984) Plant Physiol. 76:545-546; Brown y col. (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Otras diferencias relativas a la fisiología de la planta, como la absorción y la translocación, pueden desempeñar también un papel importante en lasensibilidad (Shaner y Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471).
Se han producido con éxito plantas resistentes a imidazolinonas, sulfonilureas, triazolopirimidinas ypirimidiniloxibenzoatos mediante mutagénesis de semillas, microsporas, polen y callo en Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (es decir, colza), Glycine max, Nicotiana tabacum, remolacha azucarera (Beta vulgaris) yOryza sativa (Sebastian y col. (1989) Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson y col. (1989) Theor. Appl. Genet. 78:525530; Newhouse y col. (1991) Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan y col. (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand y col. (1993) J. Heredity 84:91-96; Wright y Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96:612-620; patente de losEE. UU. n° 5.545.822). En todos los casos, la resistencia se debió a un único gen nuclear parcialmente dominante.Previamente también se habían aislado cuatro plantas de trigo resistentes a imidazolinona después de la mutagénesis de semillas de Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse y col. (1992) Plant Physiol. 100:882-886). Losestudios de heredabilidad confirmaron que la resistencia se debía a un único gen parcialmente dominante. Sobre labase de estudios alélicos, los autores concluyeron que las mutaciones en las cuatro líneas identificadas se localizaban en el mismo locus. Uno de los genes de resistencia del cultivar Fidel se designó FS-4 (Newhouse y col. (1992) Plant Physiol. 100:882-886).
Las poblaciones de plantas de origen natural de las que se ha descubierto que son resistentes a herbicidasde imidazolinona y/o sulfonilurea también se han usado para el desarrollo de líneas de mejora de girasol resistentesa herbicidas. Recientemente se han desarrollado dos líneas de girasol resistentes a un herbicida de sulfonilureamediante el uso de germoplasma originario de una población silvestre de girasol común (Helianthus annuus) comofuente del carácter de resistencia al herbicida (Miller y Al-Khatib (2004) Crop Sci. 44:1037-1038). Previamente, White y col. ((2002) Weed Sci. 50:432-437) habían descrito que algunos individuos de una población silvestre de girasolcomún de Dakota del Sur (EE. UU.) presentaban resistencia cruzada a un herbicida de imidazolinona y un herbicida de sulfonilurea. El análisis de una porción de la región codificante de los genes de la subunidad mayor de la acetohidroxiácido-sintasa (AHASL) de individuos de esta población reveló una mutación puntual que resultaba enuna sustitución del aminoácido Ala por Val en la proteína AHASL de girasol, que corresponde a Ala205 en la proteína AHASL natural de Arabidopsis thaliana (White y col. (2003) Weed Sci. 51:845-853). Previamente, Al-Khatib y Miller (2000) Crop Sci. 40:869) describieron la producción de cuatro líneas de mejora de girasol resistentes a imidazolinona.
El modelado por ordenador de la conformación tridimensional del complejo inhibidor de la AHAS predicevarios aminoácidos en la cavidad propuesta de unión del inhibidor como sitios en los que la inducción de mutacionesprobablemente confiera resistencia selectiva a imidazolinonas (Ott y col. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368). De hecho, las plantas de tabaco producidas con algunas de estas mutaciones diseñadas racionalmente en los sitios de uniónpropuestos de la enzima AHAS han mostrado resistencia específica a una única clase de herbicidas (Ott y col. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368).
También se ha descrito la resistencia de plantas a herbicidas de imidazolinona en numerosas patentes. Laspatentes de los EE. UU. nos 4.761.373, 5.331.107, 5.304.732. 6.211.438, 6.211.439 y 6.222.100 describen en general el uso de un gen modificado de AHAS para producir resistencia a herbicidas en plantas y desvelanespecíficamente ciertas líneas de maíz resistentes a imidazolinona. La patente de los EE. UU. n° 5.013.659 desvelaplantas que muestran resistencia a herbicidas debido a mutaciones en al menos un aminoácido en una o másregiones conservadas. Las mutaciones descritas en ese documento codifican resistencia cruzada paraimidazolinonas y sulfonilureas o resistencia específica a sulfonilurea, pero no se describe una resistencia específicaa imidazolinona. Las patentes de los EE. UU. no 5.731.180 y no 5.767.361 discuten un gen aislado que tiene unasustitución de un único aminoácido en una secuencia aminoacídica de una AHAS de monocotiledónea natural queresulta en resistencia específica a imidazolinona. Además, se han desarrollado plantas de arroz que son resistentesa herbicidas que interfieren con la AHAS por mejora por mutación y también por la selección de plantas resistentes aherbicidas de entre un conjunto de plantas de arroz producidas por cultivo de anteras. Véanse las patentes de losEE. UU. nos 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 y 6.274.796. El documento US 2003/0097692describe plantas con una ALS resistente a imidazolinona y el documento 2005/020673 describe plantas de arroz que presentan un aumento de la tolerancia a herbicidas de imidazolinona.
En las plantas, al igual que en todos los demás organismos examinados, la enzima AHAS está formada pordos subunidades: una subunidad mayor (papel catalítico) y una subunidad menor (papel regulador) (Duggleby yPang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36). La subunidad mayor de la AHAS (también denominada AHASL en estedocumento) puede estar codificada por un único gen como en el caso de Arabidopsis y remolacha azucarera o pormúltiples miembros de una familia génica como en maíz, colza y algodón. Las sustituciones específicas de un únicoaminoácido en la subunidad mayor confieren a la enzima un grado de insensibilidad a una o más clases deherbicidas (Chang y Duggleby (1998) Biochem J. 333:765-777).
Por ejemplo, el trigo panadero, Triticum aestivum L., contiene tres genes homeólogos de la subunidadmayor de la acetohidroxiácido-sintasa. Cada uno de los genes muestra una expresión significativa, según los datosbioquímicos y de la respuesta a herbicidas de mutantes en cada uno de los tres genes (Ascenzi y col. (2003)Congreso de la International Society of Plant Molecular Biologists, Barcelona, España, no de ref. S10-17). Las secuencias codificantes de los tres genes presentan gran homología en cuanto a nucleótidos (documento WO03/014357). Mediante la secuenciación de los genes AHASL de varias variedades de Triticum aestivum se encontró que la base molecular de la tolerancia a herbicidas en la mayoría de las líneas tolerantes a IMI (tolerantes aimidazolinona) era la mutación S653(At)N, que indica una sustitución de serina por asparragina en una posiciónequivalente a la serina del aminoácido 653 en Arabidopsis thaliana (documentos WO 03/01436; WO 03/014357).Esta mutación se debe a un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en la secuencia de ADN que codifica laproteína AHASL.
También se sabe que hay genes AHASL múltiples en especies de plantas dicotiledóneas. Recientemente, Kolkman y col. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109:1147-1159) describieron la identificación, clonación y secuenciación de tres genes AHASL (AHASL1, AHASL2 y AHASL3) de genotipos resistentes a herbicidas y naturales de girasol (Helianthus annuus L.). Kolkman y col. describieron que la resistencia a herbicidas era debida a la sustitución Pro197Leu (usando la nomenclatura de las posiciones de los aminoácidos de la AHASL de Arabidopsis) o a lasustitución Ala205Val en la proteína AHASL1 y que cada una de estas sustituciones proporcionaba resistencia aherbicidas tanto de imidazolinona como de sulfonilurea.
Dada su alta eficacia y baja toxicidad, los herbicidas de imidazolinona se prefieren para el uso agrícola. Sinembargo, la posibilidad de usar herbicidas de imidazolinona en un sistema de producción de un cultivo en particulardepende de la disponibilidad de variedades resistentes a imidazolinona de la planta cultivada de interés. Paraproducir tales variedades resistentes a imidazolinona, los mejoradores de plantas necesitan desarrollar líneas demejora con el carácter de resistencia a imidazolinona. Por lo tanto, se necesitan más líneas y variedades de mejorade plantas de cultivo resistentes a imidazolinona, así como procedimientos y composiciones para la producción y eluso de líneas y variedades de mejora resistentes a imidazolinona.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona plantas de girasol que presentan un aumento de la resistencia a herbicidas en comparación con una planta de girasol natural, de acuerdo con las reivindicaciones. En particular, lasplantas de girasol de la invención presentan un aumento de la resistencia a herbicidas de imidazolinona en comparación con una planta de girasol natural. Las plantas de girasol resistentes a herbicidas de la invencióncomprenden al menos una copia de al menos un gen o polinucleótido endógeno que codifica una subunidad mayor de la acetohidroxiácido-sintasa (AHASL) resistente a herbicidas. Una proteína AHASL resistente a herbicidas semejante comprende una treonina en la posición del aminoácido 107 o en una posición equivalente. Una planta degirasol resistente a herbicidas de la invención puede contener una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más copias de ungen o polinucleótido que codifica una proteína AHASL resistente a herbicidas de la invención. Las plantas de girasol
5 10 15 20
25 30 35
40 45
60 65 70
de la invención incluyen también las semillas y las plantas de la progenie que comprenden al menos una copia de almenos un gen o polinucleótido endógeno que codifica una proteína AHASL resistente a herbicidas de la invención.
En una realización, la presente invención proporciona plantas de girasol resistentes a herbicidas o una líneade girasol que se denomina S4897 en este documento y la progenie y derivados de esta que comprenden lascaracterísticas de resistencia a herbicidas de S4897. Una línea genética denominada GM40 en este documento se ha derivado de S4897 y presenta las características de resistencia a herbicidas de esta. Una muestra de semillas dela línea GM40 se ha depositado en la Colección americana de cultivos tipo (ATCC) como el depósito de patenteATCC con el número PTA-6716. Por lo tanto, una planta de girasol de la invención que comprende lascaracterísticas de resistencia a herbicidas de GM40 o una planta de girasol con el número de depósito de patenteATCC PTA-6716 también comprenden las características de resistencia a herbicidas de S4897. Las plantas de girasol S4897, las plantas de girasol GM40 y las plantas de girasol con el número de depósito de patente ATCCPTA-6716 y la progenie y derivados de estas que comprenden las características de resistencia a herbicidas deS4897, GM40 o de una planta de girasol con el número de depósito de patente PTA-6716 comprenden en sus genomas un gen AHASL1 que comprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 1 y que codifica laproteína AHASL1 que comprende la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 2. Al compararla con la secuencia aminoacídica de la proteína AHASL1 (SEQ ID NO: 4) que está codificada por un gen AHASL1 (SEQ IDNO: 3) de una planta de girasol natural, la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 2 tiene un únicoaminoácido diferente respecto a la secuencia aminoacídica natural. En la secuencia aminoacídica expuesta en SEQID NO: 2 hay una treonina en la posición del aminoácido 7. Esta posición corresponde a la posición 107 en laproteína AHASL1 de girasol de longitud completa codificada por la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 12 (número de acceso AY541451). En la secuencia aminoacídica de la AHASL1 natural de la invención (SEQ ID NO: 4), esta posición equivalente presenta una alanina. A menos que se indique lo contrario, las posiciones de aminoácidos a lasque se hace referencia en este documento para las proteínas AHASL de girasol corresponden a las posiciones deaminoácidos de la secuencia aminoacídica completa expuesta en SEQ ID NO: 12.
En otra realización, la presente invención proporciona plantas de girasol resistentes a herbicidas que son la línea de girasol que se denomina GM1606 en este documento. Una muestra de semillas del material genético deGM1606 se ha depositado en la ATCC como el depósito de patente ATCC con el número PTA-7606. Por lo tanto, lapresente invención proporciona plantas de girasol resistentes a herbicidas con el número de depósito de patenteATCC PTA-7606 y la progenie y derivados de estas que comprenden las características de resistencia a herbicidasde las plantas de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606. Al igual que las plantas de girasol S4897 y GM40, GM1606 y la progenie y derivados de esta que comprenden las características de resistencia aherbicidas de GM1606 comprenden en sus genomas un gen AHASL1 que codifica una proteína AHASL1 quecomprende una treonina en la posición 107 de la proteína AHASL1 de girasol de longitud completa. De manerasimilar, las plantas de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606 y la progenie y derivados deestas que comprenden las características de resistencia a herbicidas las plantas de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606 comprenden en sus genomas un gen AHASL1 que codifica una proteínaAHASL1 que comprende una treonina en la posición 107 de la proteína AHASL1 de girasol de longitud completa.
La presente memoria descriptiva proporciona además polinucleótidos aislados y polipéptidos aislados paralas proteínas AHASL de girasol (Helianthus annuus). Los polinucleótidos descritos en este documento abarcansecuencias nucleotídicas que codifican proteínas AHASL resistentes a herbicidas y naturales que incluyen, pero no se limitan a proteínas codificadas por los genes AHASL1, AHASL2 y AHASL3. Las proteínas AHASL de girasolresistentes a herbicidas que se describen en este documento son proteínas AHASL resistentes a imidazolinona quecomprenden un aminoácido distinto de alanina en la posición 107 de una proteína AHASL1 de girasol de longitudcompleta o en una posición equivalente. Preferentemente, el aminoácido en la posición 107 o en una posiciónequivalente es treonina. Los polinucleótidos descritos en este documento abarcan las secuencias nucleotídicas expuestas en SEQ ID NO: 1 y 3, las secuencias nucleotídicas que codifican las secuencias aminoacídicas expuestas en SEQ ID NO: 2 y 4 y fragmentos y variantes de dichas secuencias nucleotídicas que codifican proteínas conactividad AHAS.
La presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la tolerancia a herbicidas en una plantatolerante a herbicidas. El procedimiento es útil para aumentar la resistencia de una planta que ya es resistente a una concentración de un herbicida que destruiría o lesionaría significativamente a una planta natural. Una plantatolerante a herbicidas semejante es una planta tolerante a herbicidas desarrollada por procedimientos que noimplican ADN recombinante como tal, por ejemplo, las plantas de girasol S4897, GM40 y GM1606 de la presenteinvención.
La presente invención proporciona un procedimiento para el control de las malas hierbas en la proximidad de las plantas resistentes a herbicidas de la invención, incluidas las plantas de girasol resistentes a herbicidasdescritas anteriormente.
Las plantas de la presente invención pueden ser transgénicas o no transgénicas. Un ejemplo de una plantade girasol no transgénica que presenta un aumento de la resistencia a herbicidas de imidazolinona y/o sulfonilureaincluye las plantas de girasol S4897, GM40 o GM1606 y las plantas de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o PTA-7606; o un mutante, recombinante o derivado manipulado genéticamente de S4897, GM40
o GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o PTA-7606 o dos o más deS4897, GM40, GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 y la planta degirasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606; o de cualquier descendiente de S4897, GM40 oGM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o PTA-7606 o dos o más de S4897, GM40, GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 y la planta degirasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606; o una planta de la progenie de cualquiera de estasplantas; o una planta que comprende las características de resistencia a herbicidas de S4897, GM40, GM1606, laplanta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 y/o la planta de girasol con el número dedepósito de patente ATCC PTA-7606.
La presente memoria descriptiva proporciona polipéptidos aislados que comprenden proteínas AHASL degirasol resistentes a imidazolinona y naturales. Los polipéptidos aislados comprenden las secuencias aminoacídicasexpuestas en SEQ ID NO: 2 y 4 y las secuencias aminoacídicas codificadas por las secuencias nucleotídicasexpuestas en SEQ ID NO: 1 y 3 y fragmentos y variantes de dichas secuencias aminoacídicas que codificanproteínas con actividad AHAS.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 es un alineamiento de las secuencias nucleotídicas del gen AHASL1 de girasol resistente a herbicidas (SEQ ID NO: 1), el gen AHASL1 de girasol natural (SEQ ID NO: 3), el número de acceso de GenBankU16280 (SEQ ID NO: 5), el número de acceso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 11) y el número de acceso deGenBank AY124092 (SEQ ID NO: 13). El sitio de la mutación en SEQ ID NO: 1 se indica por un asterisco. La mutación es una transición de G a A en la posición del nucleótido 21 de SEQ ID NO: 1.
La figura 2 es un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de la proteína AHASL1 de girasol resistentea herbicidas (SEQ ID NO: 2), la proteína AHASL1 de girasol natural (SEQ ID NO: 4), el número de acceso deGenBank U16280 (SEQ ID NO: 6), el número de acceso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 12) y el número deacceso de GenBank AY124092 (SEQ ID NO: 14). El asterisco indica el sitio de la sustitución de un único aminoácido(Ala por Thr) encontrada en la proteína AHASL1 de girasol resistente a herbicidas. Este sitio de la sustitucióncorresponde a la posición del aminoácido 7 en la secuencia aminoacídica parcial de AHASL1 expuesta en SEQ IDNO: 2. La posición equivalente de esta sustitución en la secuencia aminoacídica completa de AHASL1 de girasolexpuesta en SEQ ID NO: 12 es la 107.
La figura 3 es una ilustración fotográfica que demuestra el aumento de la tolerancia a herbicidas de lasplantas de girasol S4897 (a la derecha) en comparación con las plantas de girasol tolerantes a herbicidas IMISUN-1 (Al-Khatib y Miller (2000) Crop Sci. 40:869-970) en un estudio de invernadero. Las plantas de girasol S4897 eIMISUN-1 se trataron por pulverización con imazamox en una dosis de 200 g p.a./ha. Las plantas de girasolnaturales de control no sobrevivieron después del tratamiento por pulverización con imazamox en una dosis de 100 ó 200 g p.a./ha (no se muestra). La fotografía se tomó unos días después del tratamiento de las plantas porpulverización.
La figura 4 es una ilustración gráfica del daño por herbicidas en un estudio de invernadero después deltratamiento por pulverización de plantas de girasol IMISUN-1, de tipo natural y S4897 con imazamox en dosis de 100(columnas claras) o 200 g p.a./ha (columnas oscuras). Esta figura demuestra que las plantas de girasol resistentes aherbicidas S4897 tienen una resistencia o tolerancia significativamente superior a dos dosis de imazamox encomparación con las plantas resistentes a herbicidas IMISUN-1 y las plantas naturales. El daño por herbicidas seevaluó 17 días después de la aplicación de imazamox. Se sabe que las plantas IMISUN-1 tienen una sustitución dealanina por valina en el aminoácido 190 (Kolkman y col. (2004) Theor. Appl. Genet. 109:1147-1159).
La figura 5 es una ilustración fotográfica que demuestra el aumento de la tolerancia a herbicidas de lasplantas de girasol S4897 (lado derecho) en comparación con las plantas de girasol tolerantes a herbicidas IMISUN-1en el ensayo de invernadero descrito en el ejemplo 4.
La figura 6 es una ilustración fotográfica que demuestra el aumento de la tolerancia a herbicidas de lasplantas de girasol S4897 en comparación con las plantas de girasol de la variedad Clearfield® A en el ensayo deinvernadero descrito en el ejemplo 5.
La figura 7 es la ilustración gráfica de una comparación de la inhibición de la AHAS por Raptor para plantasde girasol de una variedad distinta de Clearfield, una variedad Clearfield y S4897, según se describe en el ejemplo 5.
La figura 8 es la ilustración gráfica de una comparación de la inhibición de la AHAS por Glean para plantasde girasol de una variedad distinta de Clearfield, una variedad Clearfield y S4897, según se describe en el ejemplo 5.
La figura 9 es una ilustración gráfica del efecto de la aplicación foliar de imazapir sobre la altura de la plantaa los 14 días después del tratamiento para dos mutantes de girasol. La altura media (% de las parcelas no tratadas)se representa por cuadrados y las barras de error representan la desviación estándar de las medias.
La figura 10 es una ilustración gráfica del efecto de la aplicación foliar de imazapir sobre el índice defitotoxicidad (PI) a los 14 días después del tratamiento para dos mutantes de girasol. El PI medio se representa porcuadrados y las barras de error representan la desviación estándar de las medias.
La figura 11 es una ilustración gráfica del efecto de la aplicación foliar de imazapir sobre la acumulación debiomasa a los 14 días después del tratamiento para dos mutantes de girasol. La biomasa seca media (% de lasparcelas no tratadas) se representa por cuadrados y las barras de error representan la desviación estándar de lasmedias.
La figura 12 es una ilustración gráfica del efecto de la aplicación foliar de imazapir sobre la biomasa deraíces a los 14 días después del tratamiento para dos mutantes de girasol. La masa seca de raíces media (% de lasparcelas no tratadas) se representa por cuadrados y las barras de error representan la desviación estándar de lasmedias.
LISTADO DE SECUENCIAS
Las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas indicadas en el listado adjunto se muestran con las abreviaturas estándar de una letra para las bases nucleotídicas y el código de tres letras para los aminoácidos. Lassecuencias nucleotídicas satisfacen la convención estándar de comenzar en el extremo 5’ de la secuencia y proceder hacia delante (es decir, de izquierda a derecha en cada línea) hacia el extremo 3’. Solo se muestra una hebra de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la hebra complementaria está incluida porcualquier referencia a la hebra representada. Las secuencias aminoacídicas satisfacen la convención de comenzaren el extremo amino de la secuencia y proceder hacia delante (es decir, de izquierda a derecha en cada línea) haciael extremo carboxilo.
SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia nucleotídica parcial que codifica una proteína AHASL1 resistente a herbicidas de la línea de girasol S4897.
SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia aminoacídica parcial de la proteína AHASL1 resistente a herbicidascodificada por la secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia nucleotídica parcial que codifica la proteína AHASL1 natural de la líneade girasol BTK47.
SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia aminoacídica parcial de la proteína AHASL1 natural codificada por lasecuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 5 es la secuencia nucleotídica de número de acceso de GenBank U16280.
SEQ ID NO: 6 es la secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica del número de accesode GenBank U16280.
SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia nucleotídica del cebador HA1U409 descrito en el ejemplo 2.
SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia nucleotídica del cebador HA1L1379 descrito en el ejemplo 2.
SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia nucleotídica del cebador HA1U1313 descrito en el ejemplo 2.
SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia nucleotídica del cebador HA1L2131 descrito en el ejemplo 2.
SEQ ID NO: 11 es la secuencia nucleotídica del número de acceso de GenBank AY541451.
SEQ ID NO: 12 es la secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica del número de acceso de GenBank AY541451.
SEQ ID NO: 13 es la secuencia nucleotídica del número de acceso de GenBank AY124092.
SEQ ID NO: 14 es la secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica del número de acceso de GenBank AY124092.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a plantas de girasol que presentan un aumento de la resistencia a herbicidas en comparación con una planta de girasol natural de acuerdo con las reivindicaciones. Las plantas degirasol resistentes a herbicidas se produjeron según se describe más adelante en este documento exponiendo lasplantas de girasol naturales (con respecto a la resistencia a herbicidas) a un mutágeno, dejándolas madurar y reproducirse y seleccionando las plantas de la progenie que mostraban un aumento de la resistencia a un herbicidade imidazolinona, en relación a la resistencia de una planta de girasol natural. La invención proporciona las líneas degirasol resistentes a herbicidas que en este documento se denominan S4897, GM40 y GM1606.
A partir de las plantas de girasol resistentes a herbicidas S4897 y de las plantas de girasol naturales BTK47 se aisló la región codificante de un gen de la subunidad mayor de la acetohidroxiácido-sintasa (denominado AHASL1) mediante amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mediante la comparación de las secuencias polinucleotídicas de las plantas de girasol resistentes a herbicidas y naturales se descubrió que la regióncodificante de la secuencia polinucleotídica de AHASL1 de la planta de girasol resistente a herbicidas difería de lasecuencia polinucleotídica de AHASL1 de la planta natural en un único nucleótido, una transición de G a A en elnucleótido 21 (SEQ ID NO: 1). Esta transición de G a A en la secuencia polinucleotídica de AHASL1 resulta en unasustitución de alanina por treonina en el aminoácido 7 (SEQ ID NO: 2) en una región conservada de la secuenciaaminoacídica predicha para la proteína AHASL1 de girasol resistente a herbicidas (SEQ ID NO: 2), en relación con laposición aminoacídica equivalente de la proteína AHASL1 natural de la línea de girasol BTK47 (es decir, el aminoácido 7 de SEQ ID NO: 4).
Dado que la secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 1 no corresponde a la región codificantecompleta de una proteína AHASL, la secuencia aminoacídica codificada por esta que se expone en SEQ ID NO: 2tampoco está completa. Para facilitar la comparación con otras secuencias aminoacídicas de AHASL de girasol, lasposiciones de aminoácidos de las proteínas AHASL de girasol a las que se hace referencia en este documento corresponden a las posiciones de aminoácidos de la secuencia aminoacídica completa de la proteína AHASL1 degirasol codificada por la secuencia con el número de acceso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 12), a menos quese indique lo contrario o resulte evidente del contexto en que aparecen dichas posiciones. Por consiguiente, lasustitución de alanina por treonina en la posición del aminoácido 7 de SEQ ID NO: 2 corresponde a la posición delaminoácido 107 en la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 12.
Por lo tanto, la presente invención desvela una sustitución aminoacídica que puede usarse para producirproteínas AHASL de girasol resistentes a herbicidas, los polinucleótidos que codifican tales proteínas y plantas,tejidos de plantas, células de plantas y semillas resistentes a herbicidas. Dado que la alanina que se encuentra en laposición del aminoácido 107 en las proteínas AHASL1 naturales de girasol de longitud completa o en una posiciónequivalente está dentro de una región de aminoácidos que está conservada en diferentes especies de plantas, se espera que la sustitución con otro aminoácido, preferentemente treonina, en lugar de esta misma alanina conservada en otras proteínas AHASL de girasol (p. ej. AHASL2 y AHASL3) también confiera resistencia a herbicidas. Por lo tanto, un polinucleótido que codifica una proteína AHASL de girasol puede mutarse por cualquierprocedimiento conocido en la técnica, como por ejemplo, mutagénesis dirigida, para producir un polinucleótido de
5 girasol que codifique una proteína AHASL con una treonina en la posición 107 o en una posición equivalente. Las secuencias polinucleotídicas y las secuencias aminoacídicas codificadas por estas correspondientes a los genesAHASL1, AHASL2 y AHASL3 se exponen en los números de acceso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 11 y 12), AY541452, AY541453, AY541454, AY541455, AY541456, AY541457 y AY541458. Por consiguiente, talespolinucleótidos y las proteínas AHASL resistentes a herbicidas codificadas por estos son útiles para la producción deplantas, células de plantas, tejidos de plantas y semillas resistentes a herbicidas por los procedimientos desveladosen este documento.
La presente invención abarca adicionalmente polinucleótidos aislados AHASL1 y AHASL2 de girasol quecodifican las proteínas AHASL1 y AHASL2 resistentes a herbicidas, respectivamente. Cada una de estas proteínasAHASL1 y AHASL2 resistentes a herbicidas comprende un aminoácido distinto de alanina en la posición 107 o en
15 una posición equivalente. Preferentemente, en tales proteínas AHASL1 y AHASL2 resistentes a herbicidas, el aminoácido en la posición 107 o en una posición equivalente es treonina.
La memoria descriptiva se refiere además a moléculas polinucleotídicas aisladas que comprendensecuencias nucleotídicas que codifican proteínas correspondientes a la subunidad mayor de la acetohidroxiácidosintasa (AHASL) y a tales proteínas AHASL. La memoria descriptiva desvela el aislamiento y la secuencia nucleotídica de un polinucleótido que codifica una proteína AHASL1 de girasol resistente a herbicidas a partir de una planta de girasol resistente a herbicidas producida por mutagénesis química de plantas de girasol naturales. Lasproteínas AHASL1 de girasol resistentes a herbicidas de la invención presentan una sustitución de alanina portreonina en la posición 107 o en una posición equivalente de sus secuencias aminoacídicas respectivas, en comparación con la secuencia aminoacídica natural correspondiente. La memoria descriptiva desvela además el
25 aislamiento y la secuencia nucleotídica de una molécula polinucleotídica que codifica una proteína AHASL1 de girasol natural.
La presente memoria descriptiva proporciona moléculas polinucleotídicas aisladas que codifican proteínas AHASL de girasol (Helianthus annuus L.). Específicamente, la memoria descriptiva proporciona moléculas polinucleotídicas aisladas que comprenden: las secuencias nucleotídicas expuestas en SEQ ID NO: 1 y 3, las secuencias nucleotídicas que codifican las proteínas AHASL que comprenden las secuencias aminoacídicas expuestas en SEQ ID NO: 2 y 4 y fragmentos y variantes de tales secuencias nucleotídicas que codifican proteínasAHASL funcionales.
Las moléculas polinucleotídicas AHASL resistentes a herbicidas aisladas de la memoria descriptivacomprenden secuencias nucleotídicas que codifican proteínas AHASL resistentes a herbicidas. Tales moléculas
35 polinucleotídicas pueden usarse en construcciones polinucleotídicas para la transformación de plantas, en particular plantas de cultivo, para aumentar la resistencia de las plantas a herbicidas, en particular a herbicidas de los que se sabe que inhiben la actividad AHAS, más en particular, a herbicidas de imidazolinona. Tales construcciones polinucleotídicas pueden usarse en casetes de expresión, vectores de expresión, vectores de transformación, plásmidos y similares. Las plantas transgénicas obtenidas después de la transformación con tales construccionespolinucleotídicas muestran un aumento de la resistencia a herbicidas inhibidores de la AHAS como, por ejemplo, herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea.
Las composiciones de la memoria descriptiva incluyen secuencias nucleotídicas que codifican proteínasAHASL. En particular, la presente memoria descriptiva proporciona moléculas polinucleotídicas aisladas que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican las secuencias aminoacídicas mostradas en SEQ ID NO: 2 y 4 y
45 fragmentos y variantes de estas que codifican polipéptidos que comprenden actividad AHAS. Además se proporcionan polipéptidos con una secuencia aminoacídica codificada por una molécula polinucleotídica descrita eneste documento, por ejemplo, aquellas expuestas en SEQ ID NO: 1 y 3 y fragmentos y variantes de estas quecodifican polipéptidos que comprenden actividad AHAS.
La memoria descriptiva abarca composiciones aisladas o sustancialmente purificadas de ácido nucleico oproteína. Una molécula polinucleotídica o proteína “aislada” o “purificada” o una porción biológicamente activa deesta no contiene sustancialmente o esencialmente componentes que normalmente acompañan o interaccionan conla molécula polinucleotídica o proteína, tal como se encuentran en su entorno natural. Por lo tanto, una moléculapolinucleotídica o proteína aislada o purificada no contiene sustancialmente otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes o no contiene sustancialmente precursores químicos ni otros
55 compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. Preferentemente, un ácido nucleico “aislado” no contiene secuencias (preferentemente secuencias codificantes de proteínas) que flanquean naturalmente al ácido nucleico(es decir, secuencias situadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del quese deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula polinucleotídica aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de las secuencias nucleotídicas que flanquean naturalmente a la molécula polinucleotídica en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácidonucleico. Una proteína que no contiene sustancialmente material celular incluye preparaciones de proteína conmenos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10%, el 5% o el 1% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o una porción biológicamente activa de esta se produce recombinantemente,preferentemente el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 30%, el 20%, el 10%, el 5% o el 1%
65 (en peso seco) de precursores químicos o de compuestos químicos distintos de la proteína de interés.
La presente memoria descriptiva proporciona polipéptidos aislados que comprenden proteínas AHASL. Lospolipéptidos aislados comprenden una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consta de las secuencias aminoacídicas expuestas en SEQ ID NO: 2 y 4, las secuencias aminoacídicas codificadas por lassecuencias nucleotídicas expuestas en SEQ ID NO: 1 y 3 y fragmentos y variantes funcionales de dichas secuencias aminoacídicas que codifican un polipéptido AHASL que comprende actividad AHAS. Con “fragmentos y variantesfuncionales” se pretende indicar fragmentos y variantes de los polipéptidos de ejemplo que comprenden actividad AHAS.
En ciertas realizaciones de la invención, los procedimientos implican el uso de plantas tolerantes a
5 herbicidas o resistentes a herbicidas. Con una planta “tolerante a herbicidas” o “resistente a herbicidas” se pretende indicar una planta que es tolerante o resistente a al menos un herbicida a una concentración que normalmentedestruiría o inhibiría el crecimiento de una planta normal o natural. En una realización de la invención, las plantastolerantes a herbicidas de la invención comprenden una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas. Con “proteína AHASL tolerante a herbicidas” o “proteína AHASL resistente a herbicidas” se pretendeindicar que una proteína AHASL tal muestra mayor actividad AHAS respecto a la actividad AHAS de una proteínaAHASL natural, en presencia de al menos un herbicida del que se sabe que interfiere con la actividad AHAS a unaconcentración o nivel del herbicida de los que se sabe que inhiben la actividad AHAS de la proteína AHASL natural.Además, la actividad AHAS de una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas semejante puede denominarse en este documento como actividad AHAS “tolerante a herbicidas” o “resistente a herbicidas”.
15 Para la presente invención, los términos “tolerante a herbicidas” y “resistente a herbicidas” se usan de manera intercambiable y se pretende que tengan un significado equivalente y un alcance equivalente. De manerasimilar, los términos “tolerancia a herbicidas” y “resistencia a herbicidas” se usan de manera intercambiable y sepretende que tengan un significado equivalente y un alcance equivalente. Igualmente, los términos “resistente aimidazolinona” y “resistencia a imidazolinona” se usan de manera intercambiable y se pretende que tengan unsignificado equivalente y un alcance equivalente a los términos “tolerante a imidazolinona” y “tolerancia a imidazolinona”, respectivamente.
La memoria descriptiva abarca polinucleótidos AHASL resistentes a herbicidas y proteínas AHASLresistentes a herbicidas. Con “polinucleótido AHASL resistente a herbicidas” se pretende indicar un polinucleótidoque codifica una proteína que comprende actividad AHAS resistente a herbicidas. Con “proteína AHASL resistente a
25 herbicidas” se pretende indicar una proteína o polipéptido que comprende actividad AHAS resistente a herbicidas.
Además, se reconoce que una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas puede introducirse en una planta mediante la transformación de una planta o de un antecesor de esta con una secuencianucleotídica que codifica una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente a herbicidas. Tales proteínasAHASL tolerantes a herbicidas o resistentes a herbicidas están codificadas por los polinucleótidos AHASL tolerantes a herbicidas o resistentes a herbicidas. Alternativamente, una proteína AHASL tolerante a herbicidas o resistente aherbicidas puede producirse en una planta como resultado de una mutación de origen natural o inducida en un genAHASL endógeno en el genoma de una planta o de un progenitor de esta.
La presente invención proporciona plantas, tejidos de plantas, células de plantas y células huésped quepresentan un aumento de la resistencia o la tolerancia a al menos un herbicida, en particular a un herbicida de
35 imidazolinona o de sulfonilurea. La cantidad o concentración preferida del herbicida es una “cantidad eficaz” o una “concentración eficaz”. Con “cantidad eficaz” y “concentración eficaz” se pretende indicar una cantidad yconcentración, respectivamente, que es suficiente para destruir o inhibir el crecimiento de una planta, tejido de unaplanta, célula de una planta o célula huésped natural similar, pero esta cantidad no destruye o inhibe tanintensamente el crecimiento de las plantas, tejidos de plantas, células de plantas y células huésped resistentes aherbicidas de la presente invención. Típicamente, la cantidad eficaz de un herbicida es una cantidad que se usarutinariamente en los sistemas de producción agrícola para destruir las malas hierbas de interés. Una cantidad tal esconocida por los expertos en la técnica.
Con “planta, tejido de una planta, célula de una planta o célula huésped natural similar” se pretende indicaruna planta, tejido de una planta, célula de una planta o célula huésped, respectivamente, que carece de las
45 características de resistencia a herbicidas y/o de un polinucleótido particular de la invención desvelado en este documento. Por lo tanto, el uso del término “natural” no pretende implicar que una planta, tejido de una planta, célulade una planta u otra célula huésped carece de ADN recombinante en su genoma y/o no tiene características deresistencia a herbicidas diferentes de las desveladas en este documento.
Según se usa en este documento, a menos que claramente se indique lo contrario, el término “planta”pretende indicar una planta en cualquiera en cualquier estado de desarrollo, así como cualquier parte o partes de una planta que pueden estar unidas a la planta entera intacta o separadas de esta. Tales partes de una plantaincluyen, pero no se limitan a los órganos, tejidos y células de una planta. Algunos ejemplos de partes particularesde una planta incluyen un tallo, una hoja, una raíz, una inflorescencia, una flor, un flósculo, un fruto, un pedículo, unpedúnculo, un estambre, una antera, un estigma, un estilo, un ovario, un pétalo, un sépalo, un carpelo, un extremo
55 de raíz, una cofia de raíz, un pelo radical, un pelo foliar, un pelo seminal, un grano de polen, una microspora, un cotiledón, un hipocotilo, un epicotilo, el xilema, floema, parénquima, endospermo, una célula acompañante, unacélula oclusiva y cualquier otro órgano, tejido y célula conocidos de una planta. Además se reconoce que unasemilla es una planta.
Las plantas de la presente invención incluyen tanto plantas no transgénicas como transgénicas. Con “plantas no transgénicas” se pretende indicar una planta que carece de ADN recombinante en su genoma. Con“planta transgénica” se pretende indicar una planta que comprende ADN recombinante en su genoma. Una plantatransgénica semejante puede producirse por la introducción de ADN recombinante en el genoma de la planta.Cuando dicho ADN recombinante se incorpora en el genoma de la planta transgénica, la progenie de la planta puedecomprender también el ADN recombinante. Una planta de la descendencia que comprende al menos una porción del
65 ADN recombinante de al menos una planta transgénica progenitora también es una planta transgénica.
La presente invención proporciona la línea de girasol resistente a herbicidas que en este documento sedenomina S4897 y la progenie y derivados de esta que comprenden las características de resistencia a herbicidas de S4897. El 17 de mayo de 2005 se hizo un depósito de semillas de la línea de girasol GM40, que deriva de la líneaS4897 de girasol y comprende las características de resistencia de S4897, en el Depósito de patentes de laColección americana de cultivos tipo (ATCC), Mansassas, VA 20110, EE. UU., al que le asignó el número dedepósito de patente ATCC PTA-6716. El depósito de la línea GM40 de girasol se hizo por un plazo de al menos 30años y de al menos cinco años tras la petición más reciente recibida por el ATCC para el suministro de una muestradel depósito. Adicionalmente, los solicitantes han cumplido con todos los requerimientos del Título 37 del C.F.R.,1.801-1.809, incluida la provisión de una indicación de la viabilidad de la muestra.
La presente invención proporciona además la línea de girasol resistente a herbicidas que en este documento se denomina GM1606. El 19 de mayo de 2006 se hizo un depósito de semillas de la línea de girasol GM1606 en el Depósito de patentes de la Colección americana de cultivos tipo (ATCC), Mansassas, VA 20110, EE.UU., al que le asignó el número de depósito de patente ATCC PTA-7606. El depósito de la línea GM1606 de girasolse hizo por un plazo de al menos 30 años y de al menos cinco años tras la petición más reciente recibida por elATCC para el suministro de una muestra del depósito. Adicionalmente, los solicitantes han cumplido con todos losrequerimientos del Título 37 del C.F.R., 1.801-1.809, incluida la provisión de una indicación de la viabilidad de la muestra.
La presente invención proporciona plantas de girasol resistentes a herbicidas producidas por mejoragenética por mutación. Las plantas de girasol naturales se mutagenizaron mediante exposición de las plantas a unmutágeno, en particular un mutágeno químico, más en particular metanosulfonato de etilo (EMS). Sin embargo, la presente invención no se limita a las plantas de girasol resistentes a herbicidas producidas por un procedimiento demutagénesis que implica el mutágeno químico EMS. Cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnicapuede usarse para producir las plantas de girasol resistentes a herbicidas de la presente invención. Tales procedimientos de mutagénesis pueden implicar, por ejemplo, el uso de uno o más de los mutágenos siguientes:radiación, como rayos X, rayos y (p. ej., cobalto 60 o cesio 137), neutrones (p. ej., producto de la tisi
ón nuclear de uranio 235 en un reactor atómico), radiación� (p. ej., emitida por radioisótopos como fósforo 32 o carbono 14) y radiación ultravioleta (preferentemente de 2.500 a 2.900 nm) y mutágenos químicos como análogos de bases (p. ej.,5-bromouracilo), compuestos relacionados (p. ej., 8-etoxicafeína), antibióticos (p. ej., estreptonigrina), agentes alquilantes (p. ej., mostazas sulfuradas, mostazas nitrogenadas, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso o acridinas. Las plantas resistentes a herbicidas tambiénpueden producirse por procedimientos de cultivo de tejidos para seleccionar células de plantas que comprendenmutaciones de resistencia a herbicidas y después regenerar plantas resistentes a herbicidas a partir de estas.Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE. UU. nos 5.773.702 y 5.859.348. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre la mejora genética por mutación en “Principles of Cultivar Development” Fehr, 1993, MacmillanPublishing Company, cuya descripción se incorpora en este documento por referencia.
El análisis del gene AHASL1 de las plantas de girasol de las líneas S4897 y GM1606 reveló la mutaciónque resulta en la sustitución por una treonina de la alanina que se encuentra en la posición del aminoácido 7 en lasecuencia aminoacídica de AHASL1 natural de SEQ ID NO: 4. La posición del aminoácido 7 en SEQ ID NO: 2 y 4corresponde a la posición del aminoácido 107 en la secuencia aminoacídica completa de una proteína AHASL1 degirasol expuesta en SEQ ID NO: 12. Por lo tanto, la presente invención desvela que la sustitución de la alanina en laposición del aminoácido 107 o en una posición equivalente de una proteína AHASL por otro aminoácido puede hacerque una planta de girasol presente mayor resistencia a un herbicida, en particular a un herbicida de imidazolinona y/o sulfonilurea. Según se desvela en el ejemplo 6 más adelante, la alanina en la posición del aminoácido 107 está dentro de una región conservada de las proteínas AHASL. De manera similar, se han desvelado sustituciones deaminoácidos en otras regiones conservadas de las proteínas AHASL de las que se sabe que confieren resistencia aherbicidas en una planta que comprende una proteína AHSAL semejante. Por consiguiente, las plantas de girasolresistentes a herbicidas de la invención incluyen, pero no se limitan a aquellas plantas de girasol que comprenden en sus genomas al menos una copia de un polinucleótido AHASL que codifica una proteína AHASL resistente aherbicidas que comprende una treonina en la posición del aminoácido 107 o en una posición equivalente.
Las plantas de girasol de la invención incluyen además plantas que comprenden una treonina u otro aminoácido distinto de alanina en la posición del aminoácido 107 o en una posición equivalente, respecto a laproteína AHASL natural, y una o más sustituciones de aminoácidos adicionales en la proteína AHASL, respecto a laproteína AHASL natural, en que una planta de girasol semejante presenta un aumento de la resistencia a al menosun herbicida en comparación con una planta de girasol natural. Tales plantas de girasol comprenden proteínasAHASL que comprenden una treonina u otro aminoácido distinto de alanina en la posición del aminoácido 107 o enuna posición equivalente y al menos un miembro seleccionado del grupo que consta de: una alanina, treonina,histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina o serina en la posición del aminoácido 182 o en una posición equivalente; una isoleucina o un aminoácido distinto de treonina en la posición del aminoácido 188 o en una posiciónequivalente; un aspartato o valina en la posición del aminoácido 190 o en una posición equivalente; una leucina en laposición del aminoácido 559 o en una posición equivalente y una asparragina, treonina, fenilalanina o valina en la posición del aminoácido 638 o en una posición equivalente.
La presente invención proporciona proteínas AHASL con sustituciones de aminoácidos en posicionesparticulares dentro de regiones conservadas de las proteínas AHASL de girasol desveladas en este documento.Además, los expertos reconocerán que tales posiciones de aminoácidos pueden variar dependiendo de si se añaden
o se eliminan aminoácidos, por ejemplo, del extremo N-terminal de una secuencia aminoacídica. Por lo tanto, lainvención abarca las sustituciones de aminoácidos en la posición indicada o en una posición equivalente (p. ej., “laposición del aminoácido 107 o una posición equivalente”). Con “posición equivalente” se pretende indicar unaposición que está dentro de la misma región conservada que la posición del aminoácido de ejemplo. Tales regionesconservadas son conocidas en la técnica (véase la tabla 4 más adelante) o pueden determinarse mediante alineamientos de secuencias múltiples según se desvela en este documento o por procedimientos conocidos en latécnica.
Además, la presente invención proporciona polipéptidos AHASL que comprenden sustituciones de
aminoácidos de las que se sabe que confieren resistencia a al menos un herbicida, en particular a un herbicida deimidazolinona y/o un herbicida de sulfonilurea. Tales polipéptidos AHASL incluyen, por ejemplo, aquellos quecomprenden una treonina en la posición del aminoácido 107 y al menos un miembro seleccionado del grupo que consta de: una alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina o serina en la posición del
5 aminoácido 182 o en una posición equivalente; una isoleucina u otro aminoácido distinto de treonina en la posición del aminoácido 188 o en una posición equivalente; un aspartato o valina en la posición del aminoácido 190 o en unaposición equivalente; un aspartato o valina en la posición del aminoácido 190 o en una posición equivalente; una leucina en la posición del aminoácido 559 o en una posición equivalente, y una asparragina, treonina, fenilalanina ovalina en la posición del aminoácido 638 o en una posición equivalente. La invención proporciona además polinucleótidos aislados que codifican tales polipéptidos AHASL, así como casetes de expresión, vectores de transformación, células huésped transformadas, plantas transformadas y procedimientos que comprenden talespolinucleótidos.
La presente invención proporciona procedimientos para aumentar la tolerancia o la resistencia de una planta, un tejido de una planta, una célula de una planta u otra célula huésped a al menos un herbicida que interfiere15 con la actividad de la enzima AHAS. Preferentemente, tal herbicida es un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea, un herbicida de triazolopirimidina, un herbicida de pirimidiniloxibenzoato, un herbicida de sulfonilaminocarboniltriazolinona o una mezcla de estos. Con mayor preferencia, tal herbicida es un herbicida deimidazolinona, un herbicida de sulfonilurea o una mezcla de estos. Para la presente invención, los herbicidas deimidazolinona incluyen, pero no se limitan a PURSUIT® (imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox),SCEPTER® (imazaquín), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), un derivado de cualquiera de losherbicidas mencionados anteriormente y una mezcla de dos o más de los herbicidas mencionados anteriormente,por ejemplo imazapir/imazamox (ODYSSEY®). Más específicamente, el herbicida de imidazolinona puede seleccionarse de los siguientes, pero sin limitarse a estos: ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2il)nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolinocarboxílico, ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4
25 metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico y una mezcla de 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-m-toluato de metilo y de 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metilo. Se prefiereel uso de ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)nicotínico y ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)nicotínico. Se prefiere en particular el uso de ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)nicotínico.
Para la presente invención, los herbicidas de sulfonilurea incluyen, pero no se limitan a closulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, tifensulfurón-metilo, tribenurón-metilo, bensulfurón-metilo, nicosulfurón, etametsulfurón-metilo, rimsulfurón, triflusulfurón-metilo, triasulfurón, primisulfurón-metilo, cinosulfurón, amidosulfurón, flazasulfurón, imazosulfurón, pirazosulfurón-etilo, halosulfurón azimsulfurón, ciclosulfurón,
35 etoxisulfurón, flazasulfurón, flupirsulfurón-metilo, foramsulfurón, yodosulfurón, oxasulfurón, mesosulfurón, prosulfurón, sulfosulfurón, trifloxisulfurón, tritosulfurón, un derivado de cualquiera de los herbicidas mencionados anteriormente y una mezcla de dos o más de los herbicidas mencionados anteriormente. Los herbicidas de triazolopirimidina de la invención incluyen, pero no se limitan a cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam,metosulam y penoxsulam.
La presente memoria descriptiva abarca moléculas polinucleotídicas AHASL y fragmentos y variantes de estas. La presente invención también abarca las moléculas polinucleotídicas que son fragmentos de estas secuencias nucleotídicas. Con “fragmento” se pretende indicar una porción de la secuencia nucleotídica que codificauna proteína AHASL de la invención. Un fragmento de una secuencia nucleotídica AHASL de la memoria descriptivapuede codificar una porción biológicamente activa de una proteína AHASL o puede ser un fragmento que puede
45 usarse como sonda de hibridación o cebador de PCR mediante los procedimientos descritos más adelante. Una porción biológicamente activa de una proteína AHASL puede prepararse mediante el aislamiento de una porción deuna de las secuencias nucleotídicas AHASL descritas en este documento, que expresan la porción codificada de laproteína AHASL (p. ej., por expresión recombinante in vitro) y la evaluación de la actividad de la porción codificadade la proteína AHASL1. Las moléculas polinucleotídicas que son fragmentos de una secuencia nucleotídica AHASLcomprenden al menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,800, 850, 900, 950, 1.000, 1.050 o 1.100 nucleótidos o hasta el número de nucleótidos presente en una secuencianucleotídica completa desvelada en este documento (por ejemplo, 1.178 nucleótidos para SEQ ID NO: 1 y 3),dependiendo del uso que se pretenda.
Un fragmento de una secuencia nucleotídica AHASL que codifica una porción biológicamente activa de una
55 proteína AHASL de la invención codificará al menos 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 ó 350 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína AHASL1 completa de lainvención (por ejemplo, 392 aminoácidos para SEQ ID NO: 2 y 4). En general, los fragmentos de una secuencianucleotídica AHASL1 que son útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR no necesitan codificar una porción biológicamente activa de una proteína AHASL1.
En este documento también se describen moléculas polinucleotídicas que son variantes de las secuenciasnucleotídicas. Las “variantes” de las secuencias nucleotídicas AHASL descritas en este documento incluyen aquellassecuencias que codifican las proteínas AHASL desveladas en este documento pero que difieren de manera conservadora por la degeneración del código genético. Estas variantes alélicas de origen natural puedenidentificarse mediante el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como la reacción en cadena de la
65 polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación según se ha indicado anteriormente. Las secuencias nucleotídicas variantes incluyen también secuencias nucleotídicas derivadas sintéticamente, generadas, por ejemplo, pormutación dirigida, pero que todavía codifican la proteína AHASL1 desvelada en la presente invención según sediscute más adelante. Generalmente, las variantes de las secuencias nucleotídicas de la invención tendrán al menos una identidad de aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el99% con una secuencia nucleotídica particular desvelada en este documento. Respectivamente, una variante de lasecuencia nucleotídica AHASL codificará una proteína AHASL con una secuencia aminoacídica con una identidad de al menos aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99%con la secuencia aminoacídica de una proteína AHASL desvelada en este documento.
Además, el experto apreciará que es posible introducir cambios por mutación en las secuencias nucleotídicas descritas en este documento, lo que conduce a cambios en la secuencia aminoacídica de las proteínas
5 AHASL codificadas sin que se altere la actividad biológica de las proteínas AHASL. Por lo tanto, es posible crear una molécula polinucleotídica aislada que codifique una proteína AHASL con una secuencia diferente de las de SEQ IDNO: 1 y 3, respectivamente, mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones denucleótidos en la correspondiente secuencia nucleotídica desvelada en este documento, de modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse mediante técnicas estándar, como la mutagénesis dirigida y la mutagénesis mediada por PCR. La presente invención también abarca tales secuencias nucleotídicas variantes.
Por ejemplo, preferentemente pueden hacerse sustituciones de aminoácidos conservadoras en uno o másrestos aminoacídicos predichos, preferentemente no esenciales. Un resto aminoacídico “no esencial” es un restoque puede alterarse en la secuencia natural de una proteína AHASL (p. ej., la secuencia de SEQ ID NO: 2 y 4,
15 respectivamente) sin alterar la actividad biológica, mientras que un resto aminoacídico “esencial” se requiere para la actividad biológica. Una “sustitución de aminoácido conservadora” es aquella en la que el resto aminoacídico sesustituye por un resto aminoacídico con una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restosaminoacídicos con cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas
(p.
ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas lateralespolares sin carga (p. ej., glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas apolares (p. ej.,alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificaciones
(p.
ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidin a). No se llevarán a cabo tales sustituciones para restos aminoacídicos conservados ni para restos aminoacídicosdentro de un dominio conservado.
25 Las proteínas descritas en este documento pueden alterarse de varias maneras que incluyen sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los procedimientos para tales manipulaciones se conocengeneralmente en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencia aminoacídica de las proteínasAHASL por mutaciones en el ADN. Los procedimientos de mutagénesis y de alteración de la secuencia nucleotídicason bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel y col. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; la patente de los EE. UU. no 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York, EE. UU.) y las referencias citadas enestos documentos. En el modelo de Dayhoff y col. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed.Res. Found., Washington, D.C., EE. UU.), incorporado en este documento por referencia, puede encontrarse unaorientación sobre las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan a la actividad biológica de la proteína
35 de interés. Pueden ser preferibles las sustituciones conservadoras, como el intercambio de un aminoácido por otro de propiedades similares.
Alternativamente, pueden crearse variantes de las secuencias nucleotídicas AHASL mediante la introducción de mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de AHASL, por ejemplopor mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden analizarse en cuanto a la actividad AHAS paraidentificar los mutantes que retienen dicha actividad AHAS, incluida la actividad AHAS resistente a herbicidas.Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de manera recombinante y la actividad de laproteína puede determinarse mediante las técnicas de ensayo estándar.
Por lo tanto, las secuencias nucleotídicas descritas en este documento incluyen las secuencias desveladasen este documento así como fragmentos y variantes de estas. Las secuencias nucleotídicas AHASL descritas en
45 este documento y los fragmentos y variantes de estas pueden usarse como sondas y/o cebadores para identificar y/o clonar homólogos de AHASL en otras plantas. Estas sondas pueden usarse para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican la misma proteína o proteínas idénticas.
De este modo, es posible usar procedimientos como PCR, hibridación y similares para identificar lassecuencias que tienen una identidad sustancial con las secuencias de la invención. Por ejemplo, véase Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, EE. UU.) e Innis y col. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY, EE. UU.).La presente invención abarca las secuencias nucleotídicas AHASL aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con las secuencias nucleotídicas de AHASL1 expuestas en este documento o con fragmentos y variantesde estas.
55 En un procedimiento de hibridación puede usarse toda o parte de una secuencia nucleotídica AHASL conocida para el cribado de genotecas de ADNc o genómicas. Los procedimientos de construcción de tales genotecas de ADNc y genómicas son conocidos en la técnica y se desvelan en Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, EE. UU.). Las asídenominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos y pueden marcarse con un grupo detectable como 32P o cualquier otro marcadordetectable, como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Las sondasde hibridación pueden prepararse mediante el marcaje de oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencianucleotídica AHASL conocida desvelada en este documento. Adicionalmente pueden usarse cebadores degenerados diseñados sobre la base de nucleótidos o restos aminoacídicos conservados en una secuencia
65 nucleotídica AHASL conocida o una secuencia aminoacídica codificada por esta. Típicamente, la sonda comprende una región de la secuencia nucleotídica que hibrida en condiciones restrictivas con al menos aproximadamente 12,preferentemente aproximadamente 25, con mayor preferencia aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100 ó 1.178 nucleótidos consecutivos de una secuencia nucleotídica AHASL de la invención o de un fragmento o variante de esta. La preparación de las sondas se conoce generalmente en la técnica y se desvela en Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, EE. UU.).
Por ejemplo, la totalidad de la secuencia AHASL desvelada en este documento o una o más porciones de esta pueden usarse como sonda capaz de hibridar específicamente con las secuencias AHASL y los ARNm correspondientes. Las técnicas de hibridación incluyen el cribado por hibridación de genotecas de ADN extendidasen placas de cultivo (placas o colonias; por ejemplo, véase Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, EE. UU.).
La hibridación de tales secuencias puede llevarse a cabo en condiciones restrictivas. Con “condiciones restrictivas” o “condiciones de hibridación restrictivas” se pretende indicar condiciones en las que una sonda hibridará con su secuencia diana en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (p. ej., al menosdoble de la hibridación de fondo). Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia y serán diferentes encircunstancias diferentes.
Típicamente, las condiciones restrictivas serán aquellas en las que la concentración de sal es inferior aaproximadamente 1,5 M del ión Na, típicamente una concentración del ión Na (u otras sales) de aproximadamente0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas de poca longitud (p. ej., 10 a 50 nucleótidos) y al menos de aproximadamente 60°C para sondas de mayor longitud (p. ej.,mayores de 50 nucleótidos). Unas condiciones restrictivas pueden conseguirse también mediante la adición deagentes desestabilizantes como formamida. Las condiciones poco restrictivas ejemplares incluyen la hibridación conuna disolución tampón con el 30 al 35% de formamida, NaCl 1 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 1% a 37°C y unlavado en SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M, citrato de trisodio 0,3 M) a una temperatura de 50 a 55°C. Lascondiciones moderadamente restrictivas ejemplares incluyen la hibridación en formamida a una concentración del 40al 45%, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en SSC 0,5X a 1X a una temperatura de 55 a 60°C. Lascondiciones muy restrictivas ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C yun lavado en SSC 0,1X a una temperatura de 60 a 65°C. Opcionalmente, los tampones de lavado puedencomprender de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 1% de SDS. La duración de la hibridación esgeneralmente inferior a aproximadamente 24 horas, normalmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12horas.
Típicamente, la especificidad es función de los lavados después de la hibridación, en que los factorescríticos son la fuerza iónica y la temperatura de la disolución de lavado final. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm puede aproximarse de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (logM) + 0,41 (% GC) – 0,61 (% form.) – 500/L; en que M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es elporcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % form. es el porcentaje de formamida en ladisolución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (para una fuerzaiónica y pH definidos) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamenteapareada. La Tm se reduce aproximadamente 1°C por cada 1% de apareamiento incorrecto; por lo tanto, la Tm y lascondiciones de hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por
0% de iejemplo, si se buscan secuencias con �dentidad, la Tm puede reducirse 10°C. Generalmente, lascondiciones restrictivas se seleccionan para quedar aproximadamente 5°C por debajo de la temperatura de fusión(Tm) de la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, unascondiciones muy restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4°C por debajo de la temperaturade fusión (Tm); unas condiciones moderadamente restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o10°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm); unas condiciones poco restrictivas pueden utilizar una hibridacióny/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm). Mediante el uso de la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, los expertos entenderán que se describen inherentemente las variaciones en el rigor de las disoluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado deseado deapareamiento incorrecto resulta en una Tm inferior a 45°C (disolución acuosa) o 32°C (disolución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC, de modo que pueda usarse una temperatura mayor. Una guía exhaustiva sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York, EE. UU.) y Ausubel y col., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishingand Wiley-Interscience, Nueva York, EE. UU.). Véase Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York, EE. UU.).
Se reconoce que las moléculas polinucleotídicas y las proteínas descritas en este documento abarcanmoléculas polinucleotídicas y proteínas que comprenden una secuencia nucleotídica o aminoacídica que essuficientemente idéntica a la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 1 y/o 3 o a la secuencia aminoacídica de SEQID NO: 2 y/o 4. El término “suficientemente idéntica” se usa en este documento para referirse a una primera secuencia aminoacídica o nucleotídica que contiene un número suficiente o mínimo de restos aminoacídicos o nucleótidos idénticos o equivalentes (p. ej., con una cadena lateral similar) a los de una segunda secuenciaaminoacídica o nucleotídica, de modo que la primera y la segunda secuencia aminoacídica o nucleotídica tienen undominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias aminoacídicas o nucleotídicas que contienen un dominio estructural común con al menos una identidad de aproximadamente el 45%,55% o 65%, preferentemente una identidad del 75%, con mayor preferencia una identidad del 85%, 95% o 98% se definen es este documento como suficientemente idénticas.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias aminoacídicas o de dos secuenciasnucleotídicas, las secuencias se alinean con el fin de una comparación óptima. El porcentaje de identidad entre lasdos secuencias es función del número de posiciones idénticas en las dos secuencias (es decir, porcentaje deidentidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (p. ej., posiciones solapantes ) x 100). Enuna realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puededeterminarse mediante técnicas similares a las descritas más adelante, permitiendo huecos o no. Típicamente, alcalcular el porcentaje de identidad se cuentan los apareamientos exactos.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse mediante un algoritmomatemático. Un ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado según Karlin y Altschul (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Un algoritmo semejante está incorporado en los programas
5 NBLAST y XBLAST de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden llevarse a cabo con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuenciasnucleotídicas homólogas a las moléculas polinucleotídicas de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden llevarse a cabo con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuenciasaminoacídicas homólogas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineamientos con huecos confines de comparación puede utilizarse el programa Gapped BLAST según se describe en Altschul y col. (1997)Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, puede usarse PSI-BLAST para realizar una búsqueda iterativa quedetecta relaciones distantes entre moléculas. Véase Altschul y col. (1997) referencia anterior. Cuando se utilizan losprogramas BLAST, Gapped BLAST y PSI-BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivosprogramas (p. ej., XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido no limitante de un
15 algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Un algoritmo semejante está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete deprogramas de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuenciasaminoacídicas puede usarse una tabla de peso de restos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. El alineamiento también puede hacerse manualmente por inspección.
A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en este documento se refieren al valor obtenido con el uso de las secuencias completas de la invención y un alineamiento múltiple por medio del algoritmo Clustal W (Nucleic Acids Research, 22(22):4673-4680, 1994) usando el programaAlignX incluido en el paquete de software Vector NTI Suite, versión 7 (InforMax, Inc., Bethesda, MD, EE. UU.) conlos parámetros por defecto o cualquier programa equivalente de este. Con “programa equivalente” se pretende
25 indicar cualquier programa de comparación de secuencias que genere, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, un alineamiento con idénticos apareamientos de nucleótidos o aminoácidos y un idéntico porcentaje deidentidad de secuencia en comparación con el alineamiento correspondiente generado por AlignX en el paquete desoftware Vector NTI Suite, versión 7.
Las secuencias nucleotídicas AHASL descritas en este documento incluyen tanto las secuencias de origennatural como las formas mutantes, en particular formas mutantes que codifican proteínas AHASL que comprendenactividad AHAS resistente a herbicidas. De manera similar, las proteínas descritas en este documento abarcan tantoproteínas de origen natural como variaciones y formas modificadas de estas. Tales variantes seguirán teniendo laactividad AHAS deseada. Obviamente, las mutaciones que se hagan en el ADN que codifica la variante no debenponer a la secuencia fuera de fase de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarias que podrían
35 producir estructuras secundarias de ARNm. Por ejemplo, véase la publicación de solicitud de patente EP no 75.444.
No se esperar que las deleciones, inserciones y sustituciones de las secuencias de proteína comprendidasen esta invención produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando sea difícilpredecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción antes de llevarla a cabo, el experto en la técnicaapreciará que el efecto puede evaluarse mediante análisis rutinarios. Es decir, la actividad puede evaluarse mediante ensayos de la actividad AHAS. Por ejemplo, véase Singh y col (1988) Anal. Biochem. 171:173-179.
Las secuencias nucleotídicas y proteínas variantes también abarcan secuencias y proteínas derivadas deun procedimiento mutagénico y de recombinación como el barajado de ADN. Con un procedimiento semejante esposible manipular una o más secuencias codificantes AHASL diferentes para crear una nueva proteína AHASL conlas propiedades deseadas. De esta manera se generan colecciones de polinucleótidos recombinantes a partir de
45 una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones en la secuencia con una sustancial identidad de secuencia y que pueden experimentar una recombinación homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, mediante el uso de esta estrategia pueden barajarse motivos de secuencia que codifican un dominio deinterés entre el gen AHASL de la invención y otros genes AHASL conocidos para obtener un nuevo gen quecodifique una proteína con una propiedad de interés mejorada, como una Km mayor, en el caso de una enzima. Lasestrategias para tal barajado de ADN son conocidas en la técnica. Por ejemplo, véase Stemmer (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri y col. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore y col., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:45054509; Crameri y col. (1998) Nature 391:288-291, y las patentes de los EE. UU. nos 5.605.793 y 5.837.458.
Las secuencias nucleotídicas descritas en este documento pueden usarse para aislar secuencias
55 correspondientes en otros organismos, en particular en otras plantas, más en particular en otras dicotiledóneas. De esta manera, es posible usar procedimientos como PCR, hibridación y similares para identificar tales secuenciassobre la base de su homología de secuencia con las secuencias expuestas en este documento. La presenteinvención abarca las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con las secuencias polinucleotídicas AHASL expuestas en este documento en su totalidad o con fragmentos de estas. Por lo tanto, lapresente invención abarca la secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican una proteína AHASL y que hibridanen condiciones restrictivas con la secuencia desvelada en este documento o con fragmentos de esta.
En una estrategia de PCR, pueden diseñarse cebadores oligonucleotídicos para usar en reacciones dePCR para amplificar las correspondientes secuencias de ADN y partir de ADNc o ADN genómico extraído decualquier planta de interés. Los procedimientos para el diseño de cebadores de PCR y la clonación por PCR son
65 generalmente conocidos en la técnica y se desvelan en Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York, EE. UU.). Véase también Innis y col., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York, EE. UU.); Inis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York, EE. UU.), e Inis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York, EE. UU.). Los procedimientos conocidos de PCR incluyen, pero nose limitan a procedimientos que usan cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores específicos únicos, cebadores degenerados, cebadores específicos para el gen, cebadores específicos para el vector, cebadores deapareamiento parcialmente incorrecto y similares.
Según se desvela en este documento, las secuencias nucleotídicas AHASL descritas en este documentoson útiles para mejorar la tolerancia a herbicidas de plantas que comprenden en sus genomas un gen que codifica
5 una proteína AHASL tolerante a herbicidas. Un gen tal es un gen endógeno. Adicionalmente, en ciertas realizaciones, las secuencias nucleotídicas de la presente invención pueden mezclarse con cualquier combinaciónde secuencias polinucleotídicas de interés con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, lospolinucleótidos de la presente invención pueden mezclarse con otros polinucleótidos cualesquiera que codifiquen polipéptidos con actividad pesticida y/o insecticida como, por ejemplo, las proteínas de la toxina de Bacillus thuringiensis (descrita en las patentes de los EE. UU. nos 5.366.892, 5.747.450, 5.737.514, 5.723.756, 5.593.881 y en Geiser y col. (1986) Gene 48:109). Las combinaciones generadas pueden incluir también múltiples copias decualquiera de los polinucleótidos de interés.
La invención se refiere a las plantas no transgénicas de girasol y a la progenie y otros descendientes detales plantas no transgénicas que muestran una mejora o un aumento de la resistencia a herbicidas que interfieren15 con la enzima AHAS, en particular herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea.
Los polinucleótidos AHASL de la invención, en particular aquellos que codifican proteínas AHASL resistentes a herbicidas, son útiles en procedimientos para mejorar la resistencia de plantas tolerantes a herbicidas.En una realización de la invención, las plantas tolerantes a herbicidas comprenden una proteína AHASL tolerante aherbicidas o resistente a herbicidas. Las plantas tolerantes a herbicidas incluyen plantas que comprenden un genendógeno en su genoma que codifica una proteína AHASL tolerante a herbicidas. Las secuencias nucleotídicas quecodifican proteínas AHASL tolerantes a herbicidas y las plantas tolerantes a herbicidas que comprenden un genendógeno que codifica una proteína AHASL tolerante a herbicidas incluyen los polinucleótidos y las plantas de lapresente invención y aquellos que se conocen en la técnica. Por ejemplo, véanse las patentes de los EE. UU. nos 5.013.659, 5.731.180, 5.767.361, 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553 y 6.274.796.
25 Se dispone de numerosos vectores de transformación de plantas y procedimientos para la transformación de plantas. Por ejemplo, véanse An, G. y col. (1986) Plant Pysiol. 81:301-305; Fry, J. y col. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl. Genet. 76:767-774; Hinchee y col. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212:203-212; Cousins y col. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P. P. y Slightom, J. L. (1992) Gene 118:255-260; Christou y col. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin y col. (1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir y col. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas y col. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216; Christou,
P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 29P:119-124; Davies y col. (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. y Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148; Franklin, C. I. y Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167; Golovkin y col. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asano y col. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N.
M. y Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo y col. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker y col.
35 (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska y col. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food.Ind. Hi Tech. 5:17-27; Eapen y col. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman y col. (1994) Bio-Technology 12:919923; Ritala y col. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325, y Wan, Y. C. y Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748.
Los procedimientos descritos en este documento implican la introducción de una construcción polinucleotídica en una planta. Con “introducción” se pretende indicar la presentación a la planta de la construcciónpolinucleotídica de tal manera que la construcción adquiere acceso al interior de una célula de la planta. Losprocedimientos de la invención no dependen de un procedimiento particular para la introducción de una construcciónpolinucleotídica en una planta, solamente de que la construcción polinucleotídica adquiera acceso al interior de almenos una célula de la planta. Los procedimientos para la introducción de construcciones polinucleotídicas en
45 plantas son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a procedimientos de transformación estable, procedimientos de transformación transitoria y procedimientos mediados por virus.
Con “transformación estable” se pretende indicar que la construcción polinucleotídica introducida en unaplanta se integra en el genoma de la planta y es capaz de heredarse por la progenie de esta. Con “transformacióntransitoria” se pretende indicar que una construcción polinucleotídica introducida en una planta no se integra en elgenoma de la planta.
Para la transformación de plantas y de células de plantas, las secuencias nucleotídicas de la invención seinsertan mediante técnicas estándar en cualquier vector conocido en la técnica adecuado para la expresión de lassecuencias nucleotídicas en una planta o en una célula de una planta. La selección del vector depende de la técnicade transformación preferida y de la especia de planta diana que ha de transformarse.
55 Las metodologías para la construcción de casetes de expresión en plantas y para la introducción de ácidos nucleicos extraños en plantas son generalmente conocidas en la técnica y se han descrito previamente. Por ejemplo,el ADN extraño puede introducirse en las plantas por medio de vectores del plásmido inductor de tumores (Ti). Otros procedimientos para la introducción de ADN extraño implican el uso de la transformación de protoplastos mediadapor PEG, electroporación, microinyección, fibras y biolística o bombardeo de microproyectiles para la absorcióndirecta de ADN. Estos procedimientos son conocidos en la técnica (patente de los EE. UU. no 5.405.765 a Vasil y col.; Bilang y col. (1991) Gene 100:247-250; Scheid y col., (1991) Mol. Gen. Genet. 228:104-112; Guerche y col. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause y col. (1987) Theor. Appl Genet. 75:30-36; Klein y col. (1987) Nature 327:70-73; Howell y col. (1980) Science 208:1265; Horsch y col. (1985) Science 227:1229-1231; DeBlock y col. (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, eds.) Academic
65 Press, Inc. (1988) y Methods in Plant Molecular Biology (Schuler y Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989)). El procedimiento de transformación depende de la célula de la planta que ha de transformarse, la estabilidad de losvectores usados, el nivel de expresión de los productos génicos y de otros parámetros.
Otros procedimientos adecuados para la introducción de secuencias nucleotídicas en células de plantas y para la subsiguiente inserción en el genoma de la planta incluyen la microinyección según Crossway y col. (1986)Biotechniques 4:320-334, la electroporación según se describe en Riggs y col. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, la transformación mediada por Agrobacterium según se describe en Townsend y col., patente de los
5 EE. UU. no 5.563.055, Zhao y col., patente de los EE. UU. no 5.981.840, la transferencia génica directa según se describe en Paszkowski y col. (1984) EMBO J. 3:2717-2722 y la aceleración balística de partículas según sedescribe, por ejemplo, en Sanford y col., patente de los EE. UU. no 4.945.050; Tomes y col., patente de los EE. UU. no 5.879.918; Tomes y col., patente de los EE. UU. no 5.886.244; Bidney y col., patente de los EE. UU. no 5.932.782; Tomes y col. (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment” en Plant Cell,
10 Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín, Alemania); McCabe y col. (1988) Biotechnology 6:923-926); y la transformación de Lec1 (documento WO 00/28058). Véase también Weissinger y col. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford y col. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y col. (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe y col. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh y col.
15 (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta y col. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y col. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, patente de los EE. UU. no 5.240.855; Buising y col., patentes de los EE. UU. nos 5.322.783 y 5.324.646; Tomes y col. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlín, Alemania) (maíz); Klein y col. (1988) Plant
20 Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm y col. (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren y col. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen y col., patente de los EE. UU. no 5.736.369 (cereales); Bytebier y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (liliáceas); De Wet y col. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y col. (Longman, Nueva York, EE. UU.) págs. 197-209 (polen); Kaeppler y col. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler y col. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación
25 mediada por fibras); D'Halluin y col. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li y col. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda y col. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por medio de Agrobacterium tumefaciens).
Los polinucleótidos pueden introducirse en las plantas poniendo estas en contacto con un virus o conácidos nucleicos víricos. Generalmente, tales procedimientos implican la incorporación de una construcción 30 polinucleotídica de la invención dentro de una de una molécula de ADN o ARN vírico. Se reconoce que una proteína AHASL de la invención puede sintetizarse inicialmente como parte de una poliproteína vírica, que después puedeprocesarse por proteolisis in vivo o in vitro para producir la proteína recombinante deseada. Además, se reconoceque los promotores de la invención también abarcan promotores utilizados para la transcripción por polimerasas deARN víricas. Los procedimientos para la introducción de construcciones polinucleotídicas en plantas y la expresión
35 de una proteína codificada en estas que implican moléculas de ADN o ARN vírico son conocidos en la técnica. Por ejemplo, véanse las patentes de los EE. UU. nos 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 y 5.316.931.
Las células que han sido transformadas pueden dejarse crecer hasta obtener plantas de acuerdo conprocedimientos convencionales. Por ejemplo, véase McCormick y col. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden dejarse crecer y después polinizarse con la misma estirpe transformada o con estirpes diferentes
40 para identificar el híbrido resultante con expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada. Puede ser necesario el crecimiento de dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípicadeseada se mantiene y se hereda de manera estable y después las semillas se recogen para asegurar que se haconseguido la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semillas transformadas (también denominadas “semillas transgénicas”) que tienen una construcción polinucleotídica
45 de la invención, por ejemplo, una casete de expresión de la invención, incorporada de manera estable en el genoma.
Las plantas resistentes a herbicidas de la invención tienen utilidad en procedimientos para el control demalas hierbas. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un procedimiento para el control de las malashierbas en la proximidad de una planta resistente a herbicidas de la invención. El procedimiento comprende laaplicación de una cantidad eficaz de un herbicida a las malas hierbas y a la planta resistente a herbicidas, en que la
50 planta presenta un aumento de la resistencia a al menos un herbicida, en particular un herbicida de imidazolinona o de sulfonilurea, en comparación con una planta natural. En un procedimiento semejante para el control de las malashierbas, las plantas resistentes a herbicidas de la invención son plantas de girasol.
Al proporcionar plantas que presentan un aumento de la resistencia a herbicidas, en particular a herbicidasde imidazolinona y sulfonilurea, es posible emplear una amplia diversidad de formulaciones para proteger las plantas55 de las malas hierbas, con el fin de mejorar el crecimiento de dichas plantas y reducir la competencia por los nutrientes. Un herbicida puede usarse por sí mismo para el control de malas hierbas en preemergencia,postemergencia, antes de plantar o al plantar en áreas que rodean a las plantas descritas en este documento o puede usarse una formulación de un herbicida de imidazolinona que contiene otros aditivos. El herbicida puede usarse también como tratamiento de las semillas. Los aditivos que se encuentran en una formulación de un
60 herbicida de imidazolinona o sulfonilurea incluyen otros herbicidas, detergentes, adyuvantes, agentes de esparcido, adherentes, estabilizantes o similares. La formulación del herbicida puede ser una preparación húmeda o seca y puede incluir, pero sin limitarse a polvos fluidos, concentrados emulsionables y concentrados líquidos. El herbicida y las formulaciones de herbicidas pueden aplicarse de acuerdo con procedimientos convencionales, por ejemplo, porpulverización, riego, espolvoreo o similares.
65 La presente invención proporciona semillas transgénicas y no transgénicas que presentan un aumento de la tolerancia a al menos un herbicida, en particular un herbicida inhibidor de la AHAS, más en particular, herbicidas deimidazolinona y sulfonilurea. Tales semillas incluyen, por ejemplo, semillas de girasol no transgénicas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40,la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta
70 de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606 y semillas transgénicas que comprenden una molécula polinucleotídica endógena de la invención que codifica una proteína AHASL resistente a herbicidas.
La presente invención proporciona procedimientos para la producción de una planta de girasol resistente aherbicidas mediante mejora genética de plantas convencional que implica la reproducción sexual. Losprocedimientos comprenden el cruzamiento de una primera planta que es resistente a un herbicida con una segundaplanta que no es resistente al herbicida. La primera planta puede ser cualquiera de las plantas resistentes a herbicidas de la presente invención, incluidas plantas de girasol no transgénicas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, laplanta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número dedepósito de patente ATCC PTA-7606. La segunda planta puede ser cualquier planta que es capaz de producir una progenie de plantas viables (es decir, semillas) al cruzarla con la primera planta. Típicamente, pero no necesariamente, la primera y la segunda planta son de la misma especie. Los procedimientos de la invenciónpueden implicar además una o más generaciones de retrocruzamiento de las plantas de la progenie del primercruzamiento con una planta de la misma línea o genotipo que la primera o la segunda planta. Alternativamente, laprogenie del primer cruzamiento o de cualquier cruzamiento subsiguiente puede cruzarse con una tercera planta deuna línea o genotipo diferente que la primera o la segunda planta. Los procedimientos de la invención pueden implicar adicionalmente la selección de plantas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la primera planta.
La presente invención proporciona además procedimientos para aumentar la resistencia a herbicidas de una planta, en particular una planta de girasol resistente a herbicidas, mediante mejora genética de plantasconvencional que implica la reproducción sexual. Los procedimientos comprenden el cruzamiento de una primeraplanta que es resistente a un herbicida con una segunda planta que puede ser o no resistente al herbicida o quepuede ser resistente a un herbicida o herbicidas diferentes de los de la primera planta. La primera planta puede sercualquiera de las plantas resistentes a herbicidas de la presente invención, incluidas, por ejemplo, plantas de girasoltransgénicas que comprenden al menos una de las moléculas polinucleotídicas de la presente invención que codifican una proteína AHASL resistente a herbicidas y plantas de girasol no transgénicas que comprenden lascaracterísticas de tolerancia a herbicidas de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasolcon el número de depósito de patente ATCC PTA-7606. La segunda planta puede ser cualquier planta que es capazde producir una progenie de plantas viables (es decir, semillas) al cruzarla con la primera planta. Típicamente, perono necesariamente, la primera y la segunda planta son de la misma especie. Las plantas de la progenie producidaspor este procedimiento de la presente invención presentan un aumento de la resistencia a un herbicida en comparación con la primera o la segunda planta o con las dos. Cuando la primera y la segunda plantas sonresistentes a diferentes herbicidas las plantas de la progenie tendrán características de tolerancia a herbicidascombinadas de la primera y la segunda plantas. Los procedimientos de la invención pueden implicar además una omás generaciones de retrocruzamiento de las plantas de la progenie del primer cruzamiento con una planta de lamisma línea o genotipo que la primera o la segunda planta. Alternativamente, la progenie del primer cruzamiento o de cualquier cruzamiento subsiguiente puede cruzarse con una tercera planta de una línea o genotipo diferente quela primera o la segunda planta. Los procedimientos de la invención pueden implicar adicionalmente la selección deplantas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la primera planta, de la segunda planta ode las dos plantas, primera y segunda.
Las plantas de la presente invención pueden ser transgénicas o no transgénicas. Un ejemplo de una plantade girasol no transgénica que presenta un aumento de la resistencia a imidazolinona es la planta de girasol S4897,la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patenteATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606; o un mutante,recombinante o derivado genéticamente manipulado de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, laplanta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606; o de cualquier progenie de la planta de girasolS4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasol con el número de depósito depatente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patente ATCC PTA-7606; o una plantade la progenie de cualquiera de estas plantas; o una planta que comprende las características de tolerancia aherbicidas de la planta de girasol S4897, la planta de girasol GM40, la planta de girasol GM1606, la planta de girasolcon el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 o la planta de girasol con el número de depósito de patenteATCC PTA-7606.
La presente invención proporciona procedimientos que implican el uso de al menos un herbicida inhibidorde la AHAS seleccionado del grupo que consta de herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilurea, herbicidasde triazolopirimidina y mezclas de estos. En estos procedimientos, el herbicida inhibidor de la AHAS puede aplicarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos, pero sin limitarse al tratamiento de semillas, eltratamiento del suelo y el tratamiento foliar.
Antes de su aplicación, el herbicida inhibidor de la AHAS puede transformarse en las formulaciones acostumbradas, por ejemplo, disoluciones, emulsiones, suspensiones, polvo, polvos, pastas y gránulos. La forma deuso depende del propósito particular que se pretenda; en cada caso deberá asegurarse una distribución fina y uniforme del compuesto de acuerdo con la invención.
Las formulaciones se preparan de manera conocida (p. ej., véanse como revisión la patente de los EE. UU. 3.060.084, el documento EP-A 707445 (para concentrados líquidos), Browning, “Agglomeration”, ChemicalEngineering, 4 de diciembre de 1967, 147-48, Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 4a edición, McGraw-Hill, Nueva York, (EE. UU.), 1963, páginas 8-57 y siguientes, los documentos WO 91/13546, US 4.172.714, US 4.144.050, US 3.920.442, US 5.180.587, US 5.232.701, US 5.208.030, GB 2.095.558, US 3.299.566, Klingman,Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, (EE. UU.), 1961, Hance y col., Weed ControlHandbook, 8a edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford (Gran Bretaña), 1989 y Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Alemania), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (Países Bajos), 1998 (ISBN 07514-0443-8)), por ejemplo mediante mezcla del principio activo con sustancias auxiliares adecuadas para la formulación de productos agroquímicos como disolventes y/o vehículos, si se desean, emulsionantes, tensioactivos y dispersantes, conservantes, antiespumantes, anticongelantes, para formulaciones para tratamiento de semillas opcionalmente también colorantes y/o aglutinantes y/o gelificantes.
Algunos ejemplos de disolventes adecuados son agua, disolventes aromáticos (por ejemplo productosSolvesso, xileno), parafinas (por ejemplo fracciones de aceite mineral), alcoholes (por ejemplo metanol, butanol,pentanol, alcohol bencílico), cetonas (por ejemplo ciclohexanona, -butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP),
yacetatos (diacetato de glicol), glicoles, dimetilamidas de ácidos grasos, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos. Enprincipio, también pueden usarse mezclas de disolventes.
Algunos ejemplos de vehículos adecuados son minerales naturales molidos (por ejemplo caolines, arcillas,talco, creta y minerales sintéticos molidos (por ejemplo, sílice de alta dispersión, silicatos).
Los emulsionantes adecuados son emulsionantes no iónicos y aniónicos (por ejemplo, éteres de alcoholesgrasos y polioxietileno, sulfonatos de alquilo y sulfonatos de arilo).
Algunos ejemplos de dispersantes son las lejías sulfíticas de lignina y metilcelulosa.
Los tensioactivos adecuados usados son sales de metales alcalinos, de metales alcalinotérreos y deamonio, sales de ácido lignosulfónico, ácido naftalenosulfónico, ácido fenolsulfónico, ácido dibutilnaftalenosulfónico,sulfonatos de alquilarilo, sulfatos de alquilo, sulfonatos de alquilo, sulfatos de alcohol graso, ácidos grasos y éteresglicólicos de alcoholes grasos sulfatados, además condensados de naftaleno sulfonado y derivados de naftaleno con formaldehído, condensados de naftaleno o de ácido naftalenosulfónico con fenol y formaldehído, éter octilfenólico depolioxietileno, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol, éteres poliglicólicos de alquilfenol, éter poliglicólico detributilfenilo, éter poliglicólico de triestearilfenilo, alcoholes de poliéter de alquilarilo, condensados de alcohol y alcohol graso y óxido de etileno, aceite de ricino etoxilado, éteres alquílicos de polioxietileno, polioxipropileno etoxilado, acetal de éter poliglicólico de alcohol laurílico, ésteres de sorbitol, lejías sulfíticas de lignina ymetilcelulosa.
Las sustancias que son adecuadas para la preparación de disoluciones directamente pulverizables,emulsiones, pastas o dispersiones oleosas son fracciones de aceites minerales de punto de ebullición medio a alto, como queroseno o gasóleo, además aceites de alquitrán de carbón y aceites de origen vegetal o animal, hidrocarburos alifáticos, cíclicos y aromáticos, por ejemplo tolueno, xileno, parafina, tetrahidronaftaleno, naftalenosalquilados o sus derivados, metanol, etanol, propanol, butanol, ciclohexanol, ciclohexanona, isoforona, disolventes muy polares, por ejemplo dimetilsulfóxido, N-metilpirrolidona o agua.
También pueden añadirse a la formulación anticongelantes como glicerina, etilenglicol, propilenglicol y bactericidas.
Los antiespumantes adecuados son, por ejemplo, agentes antiespumantes a base de silicio o estearato demagnesio.
Los conservantes adecuados son, por ejemplo, diclorofeno y hemiformal de alcohol bencílico.
Las formulaciones para el tratamiento de semillas pueden comprender adicionalmente aglutinantes y opcionalmente colorantes.
Los aglutinantes pueden añadirse para mejorar la adhesión de los materiales activos a las semillas despuésdel tratamiento. Los aglutinantes adecuados son tensioactivos de copolímeros de bloques EO/PO, pero tambiénalcoholes polivinílicos, polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos, poliisobutilenos, poliestireno,polietilenaminas, polietilenamidas, polietileniminas (Lupasol®, Polymin®), poliéteres, poliuretanos, acetato de polivinilo, tilosa y copolímeros derivados de estos polímeros.
Opcionalmente también pueden incluirse colorantes en la formulación. Los colorantes o tintes adecuados para las formulaciones para el tratamiento de semillas son rodamina B, pigmento rojo C.I. 112, disolvente rojo C.I. 1,pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2, pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarillo 1, pigmento Amarillo 13, pigmento rojo 112, pigmento rojo 48:2, pigmento rojo 48:1, pigmento rojo 57:1,pigmento rojo 53:1, pigmento naranja 43, pigmento naranja 34, pigmento naranja 5, pigmento verde 36, pigmentoverde 7, pigmento blanco 6, pigmento marrón 25, violeta básico 10, violeta básico 49, rojo ácido 51, rojo ácido 52, rojo ácido 14, azul ácido 9, amarillo ácido 23, rojo básico 10, rojo básico 108.
Un ejemplo de un gelificante adecuado es carrageno (Satiagel®).
Los polvos, los materiales para esparcido y los productos espolvoreables pueden prepararse por mezcla omolienda simultánea de los principios activas con un vehículo sólido.
Los gránulos, por ejemplo, gránulos recubiertos, gránulos impregnados y gránulos homogéneos, puedenprepararse mediante la unión de los principios activos a vehículos sólidos. Algunos ejemplos de vehículos sólidosson tierras minerales como geles de sílice, silicatos, talco, caolín, ataclay, piedra caliza, cal, creta, bol, loess, arcilla,dolomita, tierra de diatomeas, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, óxido de magnesio, materiales sintéticosmolidos, fertilizantes como, por ejemplo, sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, ureas y productos de origen vegetal como harina de cereales, harina de corteza de árboles, serrín y harina de cáscaras de nuez,polvos de celulosa y otros vehículos sólidos.
En general, las formulaciones comprenden del 0,01 al 95% en peso, preferentemente del 0,1 al 90% enpeso del herbicida inhibidor de la AHAS. En este caso, los herbicidas inhibidores de la AHAS se emplean con unapureza del 90% al 100% en peso, preferentemente, del 95% al 100% en peso (de acuerdo con el espectro de RMN).
Para el tratamiento de semillas, las formulaciones respectivas pueden diluirse de 2 a 10 veces, lo que conduce aconcentraciones en las preparaciones listas para usar del 0,01 al 60% en peso del principio activo, preferentementedel 0,1 al 40% en peso.
El herbicida inhibidor de la AHAS puede usarse como tal, en forma de sus formulaciones o las formas deuso preparadas a partir de estas, por ejemplo, en forma de disoluciones directamente pulverizables, polvos,suspensiones o dispersiones, emulsiones, dispersiones oleosas, pastas, productos espolvoreables, materiales paraesparcir o gránulos, por medio de pulverización, atomización, espolvoreo, esparcido o vertido. Las formas de usodependen enteramente de la finalidad que se pretenda; en cada caso se pretende asegurar la distribución más finaposible del herbicida inhibidor de la AHAS de acuerdo con la invención.
Las formas de uso acuosas pueden prepararse a partir de concentrados de emulsión, pastas o polvosmojables (polvos pulverizables, dispersiones oleosas) mediante la adición de agua. Para preparar emulsiones, pastas o dispersiones oleosas, las sustancias, como tales o disueltas en un aceite o disolvente, puedenhomogeneizarse en agua por medio de un humectante, un taquificante, un dispersante o un emulsionante. Sinembargo, también es posible preparar concentrados compuestos del principio activo, humectante, taquificante, dispersante o emulsionante y, en caso apropiado, el disolvente o aceite y tales concentrados son adecuados para sudilución con agua.
Las concentraciones del principio activo en las preparaciones listas para usar puede variar en intervalosrelativamente amplios. En general, son del 0,0001 al 10%, preferentemente del 0,01 al 1% en peso.
El herbicida inhibidor de la AHAS puede usarse también satisfactoriamente en el procedimiento de ultrabajo volumen (ULV), en el que es posible aplicar formulaciones que comprenden más del 95% en peso del principioactivo o incluso aplicar el principio activo sin aditivos.
A continuación se incluyen ejemplos de formulaciones:
1. Productos para diluir con agua para aplicaciones foliares. Para el tratamiento de semillas, tales productos pueden aplicarse a la semilla diluidos o sin diluir.
A) Concentrados solubles en agua (SL, LS)
Se disuelven 10 partes en peso del herbicida inhibidor de la AHAS en 90 partes en peso de agua o de undisolvente soluble en agua. Como alternativa se añaden humectantes u otros agentes auxiliares. El herbicidainhibidor de la AHAS se disuelve al diluirlo con agua, por lo que se obtiene una formulación con el 10% (p/p) delherbicida inhibidor de la AHAS.
B) Concentrados dispersables (DC)
Se disuelven 20 partes en peso del herbicida inhibidor de la AHAS en 70 partes en peso de ciclohexanonacon la adición de 10 partes en peso de un dispersante, por ejemplo, polivinilpirrolidona. La dilución con agua da lugara una dispersión, por lo que se obtiene una formulación con el 20% (p/p) del herbicida inhibidor de la AHAS.
C) Concentrados emulsionables (EC)
Se disuelven 15 partes en peso del herbicida inhibidor de la AHAS en 7 partes en peso de xileno con laadición de dodecilbencenosulfonato de calcio y aceite de ricino etoxilado (en cada caso 5 partes en peso). Ladilución con agua da lugar a una emulsión, por lo que se obtiene una formulación con el 15% (p/p) del herbicidainhibidor de la AHAS.
D) Emulsiones (EW, EO, ES)
Se disuelven 25 partes en peso del herbicida inhibidor de la AHAS en 35 partes en peso de xileno con laadición de dodecilbencenosulfonato de calcio y aceite de ricino etoxilado (en cada caso 5 partes en peso). Estamezcla se introduce en 30 partes en peso de agua por medio de una máquina emulsionadora (p. ej., Ultraturrax) y setransforma en una emulsión homogénea. La dilución con agua da lugar a una emulsión, por lo que se obtiene unaformulación con el 25% (p/p) del herbicida inhibidor de la AHAS.
E) Suspensiones (SC, OD, FS)
En un molino de bolas con agitación se trituran 20 partes en peso del herbicida inhibidor de la AHAS con laadición de 10 partes en peso de dispersantes, humectantes y 70 partes en peso de agua o de un disolvente orgánicopara dar una fina suspensión del herbicida inhibidor de la AHAS. La dilución con agua da lugar a una suspensiónestable del herbicida inhibidor de la AHAS, por lo que se obtiene una formulación con el 20% (p/p) del herbicidainhibidor de la AHAS.
F) Gránulos dispersables en agua y gránulos solubles en agua (WG, SG)
Se muelen finamente 50 partes en peso del herbicida inhibidor de la AHAS con la adición de 50 partes enpeso de dispersantes y humectantes y se preparan como gránulos dispersables en agua o gránulos solubles enagua por medio de dispositivos técnicos (por ejemplo, extrusión, torre de pulverización, lecho fluidizado). La dilucióncon agua da lugar a una dispersión o disolución estable del herbicida inhibidor de la AHAS, por lo que se obtieneuna formulación con el 50% (p/p) del herbicida inhibidor de la AHAS.
G) Polvos dispersables en agua y polvos solubles en agua (WP, SP, SS, WS)
En un molino de rotor y estator se muelen 75 partes en peso del herbicida inhibidor de la AHAS con laadición de 25 partes en peso de dispersantes, humectantes y gel de sílice. La dilución con agua da lugar a unadispersión o disolución estable del herbicida inhibidor de la AHAS, por lo que se obtiene una formulación con el 75%(p/p) del herbicida inhibidor de la AHAS.
I) Formulación en gel (GF)
En un molino de bolas con agitación se trituran 20 partes en peso del herbicida inhibidor de la AHAS con laadición de 10 partes en peso de dispersantes, 1 parte en peso de un gelificante y 70 partes en peso de agua o de undisolvente orgánico para dar una fina suspensión del herbicida inhibidor de la AHAS. La dilución con agua da lugar auna suspensión estable del herbicida inhibidor de la AHAS, por lo que se obtiene una formulación con el 20% (p/p)del herbicida inhibidor de la AHAS. Esta formulación en gel es adecuada para el uso como tratamiento de semillas.
2. Productos para aplicar sin diluir para aplicaciones foliares. Para el tratamiento de semillas, tales productos pueden aplicarse a la semilla diluidos.
A) Polvos espolvoreables (DP, DS)
Se muelen finamente 5 partes en peso del herbicida inhibidor de la AHAS y se mezclan íntimamente con 95partes en peso de caolín finamente dividido. Esto da lugar a un producto espolvoreable con el 5% (p/p) del herbicidainhibidor de la AHAS.
B) Gránulos (GR, FG, GG, MG)
Se muele finamente media parte en peso del herbicida inhibidor de la AHAS y se asocia con 95,5 partes enpeso de vehículos, por lo que se obtiene una formulación con el 0,5% (p/p) del herbicida inhibidor de la AHAS. Losprocedimientos actuales son extrusión, secado por pulverización o el lecho fluidizado. Esto da lugar a gránulos paraaplicar sin diluir para uso foliar.
Las formulaciones convencionales para el tratamiento de semillas incluyen, por ejemplo, concentradosfluidos FS, disoluciones LS, polvos para tratamiento en seco DS, polvos dispersables en agua para el tratamiento delechada WS, polvos solubles en agua SS y emulsiones ES y EC y la formulación en gel GF. Estas formulaciones pueden aplicarse a las semillas diluidas o sin diluir. La aplicación a las semillas se lleva a cabo antes de la siembra,directamente sobre las semillas.
En una realización preferida, se usa una formulación FS para el tratamiento de semillas. Típicamente, unaformulación FS puede comprender de 1 a 800 g/l del principio activo, de 1 a 200 g/l de tensioactivo, de 0 a 200 g/l deanticongelante, de 0 a 400 g/l de aglutinante, de 0 a 200 g/l de un pigmento y hasta 1 litro de un disolvente, preferentemente agua.
La presente invención abarca semillas transgénicas y no transgénicas de las plantas resistentes aherbicidas de la presente invención. Tales semillas incluyen, por ejemplo, semillas de girasol no transgénicas que comprenden las características de tolerancia a herbicidas de la planta con el número de acceso de la colección NCIMB 41262 y semillas transgénicas que comprenden una molécula polinucleotídica de la invención que codificauna proteína IMI.
Para el tratamiento de las semillas, las semillas de las plantas resistentes a herbicidas de acuerdo con lapresente invención se tratan con herbicidas, preferentemente herbicidas seleccionados del grupo que consta de losherbicidas inhibidores de la AHAS como amidosulfurón, azimsulfurón, bensulfurón, clorimurón, clorsulfurón, cinosulfurón, ciclosulfamurón, etametsulfurón, etoxisulfurón, flazasulfurón, flupirsulfurón, foramsulfurón, halosulfurón,imazosulfurón, mesosulfurón, metsulfurón, nicosulfurón, oxasulfurón, pirazosulfurón, primisulfurón, prosulfurón, rimsulfurón, sulfometurón, sulfosulfurón, tifensulfurón, triasulfurón, tribenurón, trifloxisulfurón, triflusulfurón, tritosulfurón, yodosulfurón, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquín, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribaco, piriminobaco, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxima, piriftalida, piritiobaco y mezclas de estos o con una formulación que comprende unherbicida inhibidor de la AHAS.
El término tratamiento de semillas comprende todas las técnicas de tratamiento de semillas adecuadasconocidas en la técnica, como el revestimiento de semillas, el recubrimiento de semillas, el espolvoreo de semillas,la inmersión de semillas y la peletización de semillas.
De acuerdo con una variante de la presente invención, otro objeto de la invención es un procedimiento parael tratamiento del suelo mediante la aplicación, en particular en la sembradora, de una formulación granular que contiene el herbicida inhibidor de la AHAS como una composición/formulación (p. ej., una formulación granular,opcionalmente con uno o más vehículos sólidos o líquidos aceptables desde el punto de vista agrícola y/oopcionalmente con uno o más tensioactivos aceptables desde el punto de vista agrícola. Este procedimiento seemplea ventajosamente, por ejemplo, en los lechos de siembra de cereales, maíz, algodón y girasol.
La presente invención también comprende semillas recubiertas o que contienen una formulación de tratamiento de semillas que comprende al menos un herbicida inhibidor de la AHAS seleccionado del grupo queconsta de amidosulfurón, azimsulfurón, bensulfurón, clorimurón, clorsulfurón, cinosulfurón, ciclosulfamurón, etametsulfurón, etoxisulfurón, flazasulfurón, flupirsulfurón, foramsulfurón, halosulfurón, imazosulfurón, mesosulfurón,metsulfurón, nicosulfurón, oxasulfurón, pirazosulfurón, primisulfurón, prosulfurón, rimsulfurón, sulfometurón, sulfosulfurón, tifensulfurón, triasulfurón, tribenurón, trifloxisulfurón, triflusulfurón, tritosulfurón, yodosulfurón, imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquín, imazetapir, cloransulam, diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribaco, piriminobaco, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxima,piriftalida y piritiobaco.
El término semilla abarca semillas y propágulos de plantas de todo tipo e incluye, pero no se limita asemillas verdaderas, fragmentos de semillas, renuevos, cormos, bulbos, frutos, tubérculos, granos, esquejes, talloscortados y similares y en una realización preferida significa semillas verdaderas.
El término “recubierto y/o que contiene” significa generalmente que el principio activo, en su mayoría seencuentra en la superficie del producto de propagación en el momento de la aplicación, aunque una mayor o menorparte del principio activo puede penetrar en el producto de propagación, dependiendo del procedimiento deaplicación. Cuando dicho producto de propagación se (re)planta, puede absorber el principio activo.
La aplicación del tratamiento de semillas con el herbicida inhibidor de la AHAS o con una formulación que comprende el herbicida inhibidor de la AHAS se lleva a cabo por pulverización o por espolvoreo de las semillasantes de sembrar las plantas y antes de la emergencia de las plantas.
En el tratamiento de semillas, las formulaciones correspondientes se aplican mediante el tratamiento de las semillas con una cantidad eficaz del herbicida inhibidor de la AHAS o una formulación que comprende el herbicidainhibidor de la AHAS. En este documento, las dosis de aplicación son generalmente de 0,1 g a 10 kg del principioactivo (o de la mezcla de principios activos o de la formulación) por 100 kg de semilla, preferentemente de 1 g a 5 kgpor 100 kg de semilla, en particular de 1 g a 2,5 kg por 100 kg de semilla. Para cultivos específicos como lechuga ladosis puede ser mayor.
La presente invención proporciona un procedimiento para combatir la vegetación no deseada o controlar lasmalas hierbas que comprende la puesta en contacto de las semillas de las plantas resistentes de acuerdo con lainvención antes de la siembra y/o después de la pregerminación con un herbicida inhibidor de la AHAS. El procedimiento puede comprender además la siembra de las semillas, por ejemplo en el suelo en un campo o en unmedio para macetas en el invernadero. El procedimiento es particularmente útil para combatir la vegetación nodeseada o controlar las malas hierbas en la inmediata proximidad de la semilla.
Se entiende que el control de la vegetación no deseada significa la destrucción de las malas hierbas y/o,aparte de esto, el retraso o la inhibición del crecimiento normal de las malas hierbas. Se entiende que las malashierbas, en el sentido más amplio, significan todas aquellas plantas que crecen en lugares donde no se desean.
Las malas hierbas de la presente invención incluyen, por ejemplo, malas hierbas dicotiledóneas ymonocotiledóneas. Las malas hierbas dicotiledóneas incluyen, pero no se limitan a malas hierbas de los géneros:Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus,Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus y Taraxacum Las malas hierbas monocotiledóneas incluyen, pero no se limitan a malas hierbas de los géneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis,Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus y Apera.
Además, las malas hierbas de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, plantas de cultivo quecrecen en un lugar no deseado. Por ejemplo, una planta de maíz espontánea en un campo que predominantementecomprende plantas de soja puede considerarse una mala hierba si la planta de maíz no es deseada en el campo delas plantas de soja.
Los artículos “un” y “uno” se usan en este documento para referirse a uno o más de uno (es decir, al menosuno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa uno o más elementos.
Según se usa en este documento, se entiende que la palabra “comprender” o variaciones como “comprende” o “comprendiendo” implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa dado, o grupo deelementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa ogrupo de elementos, números enteros o etapas.
Los ejemplos siguientes se ofrecen como ilustración y no como limitación.
EJEMPLO 1: Mutagénesis de la línea BTK47 de Helianthus annuus y selección de plantas resistentes a imidazolinona
La línea de mejora BTK47 de Helianthus annuus L. se sometió a mutagénesis química de la manerasiguiente. Se trataron 60.000 semillas de la línea BTK47 con una disolución de metanosulfonato de etilo (EMS) durante 15 horas. Después, las semillas tratadas se sembraron en condiciones de campo el 16 de diciembre de2002 en la estación experimental de Nidera en Venado Tuerto, Santa Fe, Argentina. Aproximadamente 30.000plantas M1 florecieron y se cubrieron con bolsas para la autopolinización de cada planta. Todas las plantas serecolectaron y trillaron a mano. El 10 de mayo de 2003 se sembraron 20 M2 semillas de cada cabeza de girasol encondiciones de invernadero en la estación experimental de Nidera en Formosa. Aproximadamente 590.000 plantasse pulverizaron en el estadio V2-V4 con imazapir a una dosis de 80 g p.a./ha. Ocho plantas sobrevivieron altratamiento de herbicida y se autopolinizaron y recolectaron. Las semillas M3 de cada una de estas ocho plantas se evaluaron en cuanto a su resistencia a imazapir. De estas ocho familias M3, una familia (S4897) mostró segregación de la resistencia a herbicidas en una relación de 1 resistente (es decir, que confiere tolerancia a las dosis comerciales de los herbicidas de imidazolinona) : 2 intermedias (es decir, parcialmente resistentes) : 1 susceptible. Las plantas totalmente fértiles se autopolinizaron y recolectaron para propagar la línea S4897.
El tejido de las hojas de las plantas M3 S4897 de las clases resistente e intermedia se usó como fuente de ADN para el análisis de la secuencia del gen AHASL1 según se describe en el ejemplo 2.
EJEMPLO 2: Amplificación por PCR y secuenciación de polinucleótidos de girasol que codifican proteínas AHASL1resistentes a imidazolinona y naturales.
El gen AHASL1 se amplificó por PCR a partir de ADN aislado de plantas de girasol M3 S4897 y BTK47
5 (naturales) como dos fragmentos solapantes. La amplificación por PCR se llevó a cabo con la polimerasa de ADN Hotstart Taq y los reactivos asociados (Quiagen Inc, Valencia, California, EE. UU.; no de catálogo 203205) por losprocedimientos estándar. Los cebadores de PCR para los dos fragmentos se exponen en la tabla 1 y en el listado desecuencias. HA1U409 (SEQ ID NO: 7) es el cebador directo para el primer fragmento y corresponde al par de bases409 del número de acceso de GenBank AY124092. HA1L1379 (SEQ ID NO: 8) es el cebador inverso para el primer
10 fragmento y corresponde al par de bases 1.379 del número de acceso de GenBank AY124092. HA1U1313 (SEQ ID NO: 9) es el cebador directo para el segundo fragmento y corresponde al par de bases 1.313 del número de acceso de GenBank AY124092. HA1L2131 (SEQ ID NO: 10) es el cebador inverso para el segundo fragmento ycorresponde al par de bases 2.131 del número de acceso de GenBank AY124092. El primer par HA1U409-HA1L1379 produjo un fragmento de 970 pares de bases. El segundo par HA1U1313-HA1L2131 produjo un
15 fragmento de 818 pares de bases.
Los productos de PCR resultantes se secuenciaron para producir las secuencias AHASL1 de S4897 y BTK47. Un alineamiento de estas secuencias nucleotídicas y la secuencia nucleotídica del gen ALS de Xanthium sp.(número de acceso de GenBank U16280; SEQ ID NO: 5) se muestra en la figura 1. El alineamiento reveló que el gen AHASL1 de S4897 tenía una única mutación respecto al AHASL1 de BTK47. El sitio de la mutación se indica
20 por un asterisco en la figura 1. Esta mutación es una transición de G a A que corresponde al nucleótido 21 de SEQ ID NO: 1.
En la figura 2 se muestra un alineamiento de las secuencias aminoacídicas predichas para las secuencias nucleotídicas AHASL1 de S4897, BTK47 y Xanthium sp. En comparación con la secuencia aminoacídica de AHASL1de BTK47, la secuencia aminoacídica de S4897 tiene una sustitución de alanina por treonina en la posición del
25 aminoácido 7 (SEQ ID NO: 2). Esta posición aminoacídica en SEQ ID NO: 2 corresponde a la posición del aminoácido 107 en la secuencia aminoacídica completa codificada por la secuencia nucleotídica AHASL1 de girasol del número de acceso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 4) y a la posición del aminoácido 122 en la secuenciaaminoacídica completa codificada por la secuencia nucleotídica AHASL de Arabidopsis thaliana del número de acceso de GenBank X51514.
30 Tabla 1. Cebadores de PCR para amplificar la región codificante del gen AHASL1 de girasol
Nombre del cebador
Secuencia del cebador
HA1U409
CAGACGTGTTGGTGGAAGC (SEQ ID NO: 7)
HA1L1379
CTGTAACGCGACCTTAATATC (SEQ ID NO: 8)
HA1U1313
TGCTGAAATTGGGAAGAATAAG (SEQ ID NO: 9)
HA1L2131
TTTCGTTCTGCCATCACCC (SEQ ID NO: 10)
EJEMPLO 3: Producción de una línea de girasol homocigótica para las características de resistencia a herbicidas deS4897
Se produjo una línea de girasol homocigótica para el carácter de resistencia a herbicidas a partir de S4897
35 por autofecundación y análisis de la resistencia a imazapir. Esta línea de girasol y las plantas de la misma se designaron GM40. Después de confirmar la homogenicidad de la progenie para la resistencia a herbicidas, lasplantas de la línea GM40 de girasol se trasplantaron en condiciones de invernadero y se autopolinizaron para laproducción de semillas.
EJEMPLO 4: Resistencia de S4897 a imazapic
40 En ensayos de campo en Argentina se analizaron plantas S4897 en cuanto a la resistencia a imazapic. La resistencia a imazapic fue claramente superior a la de IMISUM-1 (mutación Ala190 a Val; la posición equivalente en Arabidopsis thaliana es la 205; véase la tabla 4 más adelante). Este ensayo tenía parcelas de una sola hilera y eltratamiento se llevó a cabo en un día de viento, con lo que la dosis real de herbicida que alcanzó las plantas fuemenor que la aplicada. No obstante, S4897 mostró una tolerancia a imazapic superior a la de la sustitución de Ala190
45 por Val. No presentamos datos de este ensayo de campo.
Las plantas de S4897 e IMISUN-1 se sometieron también a un tratamiento de imazapic en condiciones deinvernadero. La fotografía de la figura 5 muestra esta comparación cuando las plantas se trataron con 100 g p.a./hade imazapic.
EJEMPLO 5: Resumen de tolerancia y actividad AHAS para la línea de girasol S4897 y otras variedades Clearfield®50 de girasol resistentes a herbicidas
Procedimientos: La línea de girasol S4897, las variedades de girasol Clearfield® A, B, C y una variedadconvencional distinta de Clearfield se pulverizaron con tres dosis de imazamox (RaptorTM), 100, 200 y 300 g p.a./ha más el 0,5% de Sun It II y dos dosis de imazapir (ArsenalTM), 160 y 360 g p.a./ha más el 0,5% de Sun It II cuando lasplantas estaban en el estadio de dos a tres hojas. El daño se evaluó a los 14 días después del tratamiento (DDT). Se
5 usó una escala de 0 a 9 para el daño en que 0 = sin daño y 9 = planta muerta. Se pulverizaron 12 plantas por cada tratamiento de herbicida/dosis. El análisis estadístico se llevó a cabo con STATGRAPHICS Plus 5.0 mediante el usode los procedimientos ANOVA y LSD.
El análisis de la actividad AHAS también se realizó mediante la selección de hojas jóvenes en crecimientoactivo de plantas que no habían sido pulverizadas con el herbicida a aproximadamente cuatro semanas después de10la siembra.
Resultados: Después de pulverizar las plantas, se observó que una diferencia de altura entre S4897 y lasotras variedades de girasol podría haber afectado a la dosis real de herbicida aplicada. La altura del brazo depulverización se había calibrado frente a S4897 y dado que las otras variedades eran más altas y estaban máspróximas al brazo habrían recibido una dosis mayor del herbicida. Las dosis se recalibraron para las otras
15 variedades para determinar la dosis aproximada que habrían recibido. La evaluación se realizó según se presenta en la tabla 2, dado que no fue posible hacer una comparación directa de las dosis por el efecto de la altura. Porejemplo, la puntuación del daño se comparó para S4897 tratada con una dosis de imazamox de 100 g p.a./ha y lasotras variedades tratadas con 75 g p.a./ha. La dosis de tratamiento de 300 g p.a./ha para la línea S4897 fueequivalente al tratamiento con 200 g p.a./ha para las otras variedades, que fue aproximadamente de 300 g p.a./ha.
20 Tabla 2. Ajuste debido a la dosis de herbicida recibida
Dosis real recibida Comparación efectuada (g p.a./ha) (g p.a./ha)
Herbicida S4897 Otras variedades S4897 Otras variedades
Imazamox 50 75 100 150 100 75 200 300 200 150 300 450 300 300
Imazapir 160 240 360 540 360 240
La línea S4897 presentó significativamente menos daño en todos los tratamientos de herbicida (tabla 3). Dehecho se observó muy poco daño con las dosis mayores de imazamox o de imazapir. Las otras variedadesmostraron un aumento del daño con la dosis de herbicida según lo esperado. La figura 6 muestra una comparacióndel daño para 200/150 g p.a./ha para la líneas S4897, la variedad Clearfield® A y el control distinto de Clearfield. El
25 meristemo apical de S4897 mostró muy poco o ningún daño, mientras que la variedad Clearfield® A estaba significativamente dañada y había dejado de crecer.
Tabla 3. Datos de daño a los 14 después del tratamiento para tres líneas IMISUN1 y S4897 pulverizadas con imazamox o imazapir
Imazapir (gImazamox (g pa/ha) pa/ha)
Líneas 100/75 200/150 300 360/240 S4897 0,5 a 0,8 a 0,8 a 0,8 a Girasol Clearfield variedad A 4,3 c 4,6 c 6,5 d 5,0 c Girasol Clearfield variedad B 1,9 b 4,8 c 5,3 c 4,3 b Girasol Clearfield variedad C 1,8 b 2,9 b 4,6 b 4,9 c Variedad convencional distinta
7,2 d 8,2 d 8,7 e 8,2 d
de Clearfield LSD = 0,7 LSD = 0,7 LSD = 0,6 LSD = 0,7 El análisis estadístico se realizó con STATGRAPHICS Plus 5.0.
30 Cada valor es la media de aproximadamente 12 observaciones.
Los resultados de la actividad AHAS mostraron también menor inhibición a la concentración más alta de imazamox en comparación con una variedad de girasol Clearfield® y una variedad convencional distinta de Clearfield (figura 7). La inhibición por GleanTM fue similar para las tres variedades de girasol (figura 8). No sepresentó una respuesta ya que no se disponía de los antecesores de la línea S4897. Dado que las dos mutaciones
35 se encuentran en el mismo locus de AHASL1 y todas las variedades ensayadas eran homocigóticas, existe una diferencia cualitativa en la tolerancia conferida por la sustitución aminoacídica en la proteína AHASL1 de S4897. Porlo tanto, la misma cantidad de la enzima AHAS con esta nueva sustitución (es decir, Ala107 por Thr) es capaz decatalizar la formación de más producto en presencia de herbicida que la enzima AHAS con la sustitución Ala190 por Val. Esto indica que la enzima AHAS con la sustitución Ala107 por Thr tiene mayor tolerancia a herbicidas de
40 imidazolinona que la enzima AHAS con la sustitución Ala190 por Val.
EJEMPLO 6: Proteínas AHASL de girasol resistentes a herbicidas
La presente invención desvela las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de polipéptidos AHASL degirasol naturales y resistentes a herbicidas. Las plantas que comprenden polipéptidos AHASL resistentes a herbicidas se han identificado previamente y en estos polipéptidos AHASL se han descrito una serie de regiones
5 conservadas que son los sitios de sustituciones de aminoácidos que confieren resistencia a herbicidas. Véase Devine y Eberlein (1997) “Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on alteredtarget sites”. En: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe y col. (eds.), págs. 159185, IOS Press, Amsterdam, Países Bajos; Devine y Shukla (2000) Crop Protection 19:881-889.
Mediante el uso de las secuencias AHASL de la invención y de procedimientos conocidos por los expertos
10 en la técnica, es posible producir polinucleótidos adicionales que codifican polipéptidos AHASL resistentes a herbicidas con una, dos, tres o más sustituciones de aminoácidos en los sitios identificados en estas regionesconservadas. La tabla 4 proporciona las regiones conservadas de las proteínas AHASL, las sustituciones deaminoácidos de las que se sabe que confieren resistencia a herbicidas dentro de estas regiones conservadas y loscorrespondientes aminoácidos en la proteína AHASL1 expuesta en SEQ ID NO: 4.
15 Tabla 4. Mutaciones en regiones conservadas de los polipéptidos AHASL1 de las que se sabe que confieren resistencia a herbicidas y su posición equivalente en la proteína AHASL1 de girasol
Región conservada1
Mutación2 Referencia Posición del aminoácido en girasol
VFAYPGGASMEIHQALTRS3
Ala122 a Thr Bernasconi y col.6 Ala107
Wright y Penner14
AITGQVPRRMIGT4
Pro197 a Ala Boutsalis y col.7 Pro182
Pro197 a Thr
Guttieri y col.8
Pro197 a His
Guttieri y col.9
Pro197 a Leu
Guttieri y col.8 Kolkman y col.15
Pro197 a Arg
Guttieri y col.8
Pro197 a Ile
Boutsalis y col.7
Pro197 a Gln
Guttieri y col.8
Pro197 a Ser
Guttieri y col.8
AFQETP4
Ala205 a Asp Harnett y col.10 Ala190
Ala205 a Val
Simpson11 Kolkman y col.15 White y col.16
QWED4
Trp574 a Leu Boutsalis y col.7 Trp559
IPSGG5
Ser653 a Asn Devine y Eberlein13 Ala638
Ser653 a Thr
Chang y Duggleby17
Ser653 a Phe
1Regiones conservadas según Devine y Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects ofherbicide resistance based on altered target sites". En: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular 20 Biology, Roe y col. (eds.), págs. 159-185, IOS Press, Amsterdam, Países Bajos y Devine y Shukla, (2000) Crop
Protection 19:881-889. 2La numeración de aminoácidos corresponde a la secuencia aminoacídica del polipéptido AHASL1 de Arabidopsis thaliana.
3Las secuencias aminoacídicas de AHASL1 de girasol expuestas en SEQ ID NO: 2 y 4 no tienen la longitud25 completa y comienzan con las secuencias aminoacídicas FAYPGGASMEIHQALTRS y FAYPGGTSMEIHQALTRS, respectivamente.
4Las secuencias aminoacídicas de AHASL de girasol expuestas en SEQ ID NO: 2 y 4 tienen esta región conservada. 5La región de AHASL1 de girasol (número de acceso de GenBank AY541451) correspondiente a esta regiónconservada tiene la secuencia IPAGG.
30 6Bernasconi y col. (1995) J.Biol.Chem. 270(29):17381-17385. 7Boutsalis y col. (1999) Pestic. Sci. 55:507-516. 8Guttieri y col. (1995) Weed Sci. 43:143-178. 9Guttieri y col. (1992) Weed Sci. 40:670-678.
10Hartnett y col. (1990) "Herbicide-resistant plants carrying mutated acetolactate synthase genes", en: Managing Resistance to Agrochemicals: Fundamental Research to Practical Strategies, Green y col. (eds.), American Chemical Soc. Symp., número de serie 421, Washington, DC, EE. UU.
11Simpson (1998) Down to Earth 53(1):26-35.
5 12Bruniard (2001) Inheritance of imidazolinone resistance, characterization of cross-resistance pattern, and identification of molecular markers in sunflower (Helianthus annuus L.). Tesis doctoral, Universidad del Estado de Dakota del Norte, Fargo, ND, EE. UU., págs. 1-78.
13Devine y Eberlein (1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based onaltered target sites". En: Herbicide Activity: Toxicology, Biochemistry and Molecular Biology, Roe y col. (eds.), págs.
10 159-185, IOS Press, Amsterdam, Países Bajos.
14Wright y Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96:612-620.
15Kolkman y col. (2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159.
16White y col. (2003) Weed Sci. 51:845-853.
17Chang y Duggleby (1998) Biochem J. 333:765-777.
15 EJEMPLO 7: Producción de una línea de girasol GM1606
Se produjo una segunda línea de girasol resistente a herbicidas por mutagénesis de semillas que eran detipo natural en cuanto a la resistencia a herbicidas por un procedimiento esencialmente según se describe en elejemplo 1. La nueva línea y las plantas de esta línea se denominan GM1606 en este documento. La línea GM1606de girasol comprende la misma mutación en el gen de AHASL1 que la línea S4897. En GM1606, esta mutación es
20 una transición de G a A que corresponde al nucleótido 21 de SEQ ID NO: 1. Una mutación tal da lugar a una sustitución de alanina por treonina en la posición del aminoácido 7 (SEQ ID NO: 2). Esta posición aminoacídica enSEQ ID NO: 2 corresponde a la posición del aminoácido 107 en la secuencia aminoacídica completa codificada porla secuencia nucleotídica de AHASL1 de girasol del número de acceso de GenBank AY541451 (SEQ ID NO: 4) y ala posición del aminoácido 122 en la secuencia aminoacídica completa codificada por la secuencia nucleotídica de
25 AHASL de Arabidopsis thaliana del número de acceso de GenBank X51514.
EJEMPLO 8: Respuesta de las mutaciones A122T y A205V a imazapir
Se llevó a cabo un estudio de invernadero para cuantificar y contrastar la sensibilidad a imazapir de losmutantes A122T y A205V en diferentes fondos genéticos a nivel de toda la planta en girasol. Las semillas de lasdiferentes líneas de girasol usadas en este estudio se obtuvieron en condiciones de campo. Las líneas usadas en
30 este estudio se listan en la tabla 5.
Tabla 5. Materiales de girasol
Código del híbrido/línea
Tipo de material Mutación
TH1
híbrido A205V
TH9
híbrido A205V
TH10
línea restauradora A205V
GIM 5-7
línea de mantenimiento A205V
IB920
línea de mantenimiento A205V
IR79
línea restauradora A205V
TH6
híbrido A122T
TH11
híbrido A122T
TH12
línea restauradora A122T
GM40
línea de mantenimiento A122T
GM1606
línea de mantenimiento A122T
GIM 5-6
línea restauradora A122T
TH13
línea de mantenimiento natural
Procedimientos
Las semillas se sembraron en placas de Petri y después de la germinación las plántulas se trasplantaron a
35 macetas de 10 cm de diámetro en un medio de macetas compuesto por partes iguales de vermiculita, suelo y arena. Las plantas se dejaron crecer en un invernadero en condiciones de luz natural suplementadas con lámparas dehaluro de sodio de 400 W para proporcionar un día de 16 horas de duración. Las temperaturas día/noche fueron de25 y 20°C, respectivamente. En el estadio V2, diez plantas de cada genotipo se asignaron al azar a cada tratamiento, que constaba de siete dosis de imazapir (0, 40, 80, 160, 240, 320, 400 y 480 g p.a./ha) y una
40 determinación de biomasa en el tiempo cero. El experimento se organizó con un diseño de bloques al azar y una disposición totalmente factorial (línea de girasol x tratamiento) de los tratamientos y diez réplicas.
En el día de la aplicación del herbicida se cortaron diez plantas de cada genotipo por el nudo cotiledonar y se secaron a 60°C durante 48 horas, el tiempo 0 para la determinación del peso seco. El resto de las plantas semantuvo durante diez días después del tratamiento con imazapir (DDT) y se registró su altura y la biomasa seca delas raíces y de la parte aérea. La altura se determinó como la distancia entre el nudo cotiledonar y el ápice de cadaplanta. Para la determinación de la biomasa de raíces, las plantas se extrajeron de la maceta y el medio se lavó delas raíces. La biomasa de la parte aérea de cada línea se transformó en acumulación de biomasa después de laaplicación por sustracción de la biomasa media en el tiempo cero apropiada para cada muestra. Los datos debiomasa seca se transformaron en porcentajes respecto a las plantas control sin tratar dentro de cada línea parapermitir comparaciones directas entre grupos.
Resultados
1. Altura
La altura de las líneas de girasol con la mutación A205V no difirió de la de los controles sin tratar al aplicaruna dosis de imazapir de 0,5X o 1X. De 2X a 6X, estas líneas mostraron una reducción significativa de la altura quealcanzó el 68,9% +/- 3,1 de los controles sin tratar (tabla 6 y figura 9). En contraste, las líneas de girasol con lamutación A122T mostraron una menor reducción de la altura (del 0,6 al 15,8% de los controles sin tratar para dosis de imazapir de 0,5X y 6X, respectivamente). Ambos grupos de líneas mostraron una diferencia significativa entre sípara su respuesta a un aumento de la dosis de herbicida de 2X a 6X (tabla 6 y figura 9).
2. Índice de fitotoxicidad
Ambos mutantes mostraron grandes diferencias en su respuesta al aumento de la dosis de herbicida de0,5X a 6X (figura 10). Las líneas de girasol con la mutación A122T mostraron una ligera reducción del tamaño de lahoja y un color verde más claro que las plantas de control a medida que aumentó la dosis de herbicida (tabla 7). Encontraste, las plantas con la mutación A205V no mostraron ningún daño para una dosis de herbicida de 0,5X o 1X,pero el nivel de daño (amarilleo, deformación de las hojas y necrosis de las hojas) aumentó rápidamente de 2X a 6X(tabla 7). Ambos mutantes difirieron entre sí significativamente en cuanto al índice de fitotoxicidad de 2X a 6X (tabla7).
3. Peso seco de biomasa de la parte aérea
Las curvas de respuesta a la dosis para el peso seco de los mutantes A122T y A205V se muestran en lafigura 11. El peso de biomasa de la mutación A122T se redujo con respecto a las plantas de control para las dosis4X, 5X y 6X y esta reducción alcanzó en 25% para la dosis mayor. Entretanto, el peso seco de la mutación A205Vse redujo con respecto a las plantas de control de 0,5X (40 g p.a./ha) a 6X. Ambos mutantes mostraron diferenciassignificativas entre sí con respecto a esta variable de 0,5X a 6X (tabla 8). Las mismas tendencias se obtuvieron parala acumulación de materia seca (no se muestra), pero sin los efectos confusos de las diferencias iniciales entregenotipos por su peso seco en el tiempo cero.
4. Biomasa de raíces
A medida que aumentaron las dosis de imazapir, la biomasa seca de raíces de ambos mutantes se redujocon respecto a las plantas de control, pero la tasa de reducción fue muy diferente entre A122T y A205V (figura 12).De hecho, A205V mostró una reducción significativa del peso seco de biomasa de raíces del 12,8% para 0,5X (40 gp.a./ha) al 75,6% para 6X (tabla 9). En contraste, las plantas con A122T mostraron una disminución significativa enel peso de biomasa de raíces de 3X a 6X, y a la dosis más alta, la reducción alcanzó el 38,3% (tabla 9). Ambosmutantes mostraron diferencias significativas entre sí en su peso seco de raíces en respuesta a dosis de herbicidade 0,5X a 6X (tabla 9 y figura 12).
Tabla 6. Efecto de diferentes dosis de imazapir en la altura de las plantas a los 14 días después del tratamiento para seis genotipos de girasol con la mutación A205V y seis genotipos con la mutación A122TTabla 7. Efecto de diferentes dosis de imazapir en el índice de fitotoxicidad a los 14 días después del tratamiento para tres genotipos de girasol con la mutación A205V y tres genotipos con la mutación A122TTabla 8. Efecto de diferentes dosis de imazapir en la acumulación de biomasa a los 14 días después del tratamiento para seis genotipos de girasol con la mutación A205V y seisgenotipos con la mutación A122TTabla 9. Efecto de diferentes dosis de imazapir en el peso seco de raíces a los 14 días después del tratamiento para seis genotipos de girasol con la mutación A205V y seis genotipos con la mutación A122T
A205V
Dif. con control A122T Dif. con control Dif. A122T -A205 V
Dosis
TH1 TH9 TH10 GIM 5-7 IB920 IR79 Media SD Valor P TH6 TH11 TH12 GM 40 GM 5-6 GM 1606 Media SD Valor P Valor P
0
100 100 100 100 100 100 100 0,0 - - 100 100 100 100 100 100 100 0 - -
0,5
99,5 100,0 99,2 79,1 96,2 92,8 94,4 8,0 5,6 0,15070 99,2 100,4 100,0 99,6 100,0 97,0 99,4 1,2 0,6 0,2517 0 4,9 0,19611
1
99,5 100,0 98,1 76,7 80,0 80,9 89,2 11,1 10,8 0,06194 98,6 99,9 100,0 97,4 100,0 95,7 98,6 1,8 1,4 0,1082 4 9,4 0,09183
2
78,6 78,9 63,6 57,7 61,5 74,9 69,2 9,4 30,8 0,00048 100,3 92,0 101,8 95,2 99,1 95,2 97,3 3,7 2,7 0,1318 4 28,0 0,00033
3
48,4 50,0 51,9 55,3 40,9 55,7 50,4 5,5 49,6 0,00000 99,6 90,5 97,0 93,0 98,1 95,7 95,6 3,4 4,4 0,0246 6 45,3 0,00000
4
28,9 38,1 27,5 27,3 27,9 52,8 33,7 10,2 68,3 0,00002 101,0 90,8 92,1 93,0 91,0 94,1 93,7 3,8 6,3 0,0097 0 59,9 0,00001
5
25,3 31,8 26,0 37,2 30,0 41,7 32,0 6,4 66,0 0,00000 87,0 84,4 84,8 93,9 94,3 94,3 89,8 4,9 10,2 0,0037 1 57,8 0,00000
6
27,1 34,7 29,3 30,0 27,1 33,2 30,2 3,1 69,6 0,00000 79,6 84,4 79,8 84,3 85,8 91,4 84,2 4,4 15,8 0,0003 1 54,0 0,00000
A205V
A122T Dif. A205V-A122T
Dosis
TH1 TH9 TH10 Media SD Valor P TH6 TH11 TH12 Media SD Valor P Valor P
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0,5
0 0 0 0 0 ns 0,5 0,4 0,0 0,3 0,3 0,19171 -0,29 0,19171
1
0 0 0 0 0 ns 0,5 0,4 0,0 0,3 0,3 0,19461 -0,29 0,19461
2
1,8 1,6 3,1 2,2 0,8 0,04648 0,5 0,4 0,0 0,3 0,3 0,18981 1,87 0,05030
3
6,4 5,1 3,9 5,1 1,2 0,01793 0,5 0,5 0,0 0,3 0,3 0,18350 4,81 0,01622
4
8,0 6,4 5,9 7,4 1,3 0,01084 0,5 1,0 0,0 0,5 0,5 0,22540 6,92 0,00657
5
8,9 8,9 6,9 8,2 1,1 0,00601 0,5 2,0 0,0 0,8 1,0 0,29986 7,38 0,00111
6
9,0 8,9 6,7 8,2 1,3 0,00799 0,5 2,5 0,5 1,2 1,2 0,22222 7,03 0,00219
A205V
Dif. con control A122T Dif. con control Dif. A122T-A205V
Dosis
TH1 TH9 TH10 GIM 5-7 IB920 IR79 Media SD Valor P TH6 TH11 TH12 GM 40 GM 5-6 GM 1606 Media SD Valor P Valor P
0,0
100 100 100 100 100 100 100 0,0 - - 100 100 100 100 100 100 100 0 - -
0,5
95,0 91,7 99,2 92,9 93,9 94,4 94,5 2,6 5,5 0,00338 100 96,6 100,0 96,5 100,0 100,0 98,9 1,8 1,1 0,18453 4,3 0,00823
1,0
89,6 81,7 85,0 75,1 87,9 74,0 82,2 6,5 17,8 0,00116 97,2 93,9 99,1 94,1 98,4 100,0 96,8 2,5 3,2 0,02634 14,5 0,00182
2,0
75,5 54,7 58,1 55,1 58,8 67,7 61,6 8,2 38,4 0,00039 97,9 81,6 97,0 97,6 97,7 97,6 94,9 6,5 5,1 0,11375 33,2 0,00002
3,0
60,4 35,7 48,1 45,6 46,4 49,1 47,6 7,9 52,4 0,00002 98,2 75,8 96,1 95,8 95,8 95,4 92,8 8,4 7,2 0,09241 45,3 0,00000
4,0
46,5 25,3 28,8 31,8 35,5 44,5 35,4 8,5 64,6 0,00001 97,8 75,0 84,3 88,3 90,8 90,5 87,8 7,6 12,2 0,01127 52,4 0,00000
5,0
38,9 19,8 27,4 34,2 33,9 40,1 32,4 7,6 67,6 0,00000 85,1 60,1 77,5 85,6 81,9 85,3 79,3 9,9 20,7 0,00362 46,9 0,00001
6,0
33,9 19,5 24,9 36,8 29,4 35,3 30,0 6,7 70,0 0,00000 79,5 59,6 70,7 78,8 78,0 83,0 74,6 8,4 25,4 0,00070 44,6 0,00000
A205V
Dif. con control A122T Dif. con control Dif. A122T-A205V
Dosis
TH1 TH9 TH10 GIM 5-7 IB920 IR79 Media SD Valor P TH6 TH11 TH12 GM 40 GM 5-6 GM 1606 Media SD Valor P Valor P
0
100 100 100 100 100 100 100 0,0 0,0 - 100 100 100 100 100 100 100 0,0 0,0 - 0,0
0,5
79,4 81,5 90,3 79,2 94,0 96,6 87,2 8,3 12,6 0,01281 100 100 99,4 100 100 100 99,9 0,2 0,1 0,36322 12,7 0,01314
1
70,7 84,9 69,9 56,3 89,6 53,4 70,8 14,6 29,2 0,00447 98,1 99,0 100 100 88,0 100,0 97,5 4,7 2,5 0,25371 26,7 0,00520
2
69,6 58,8 41,3 40,6 50,7 42,5 50,6 11,7 49,4 0,00014 96,2 86,1 100 100 90,0 92,5 94,1 5,6 5,9 0,05070 43,6 0,00006
3
42,3 34,1 42,6 40,2 37,3 38,4 39,2 3,3 60,8 0,00000 79,3 81,5 100,0 92,2 98,0 85,2 89,4 8,7 10,6 0,02997 50,2 0,00001
4
38,6 27,3 22,3 34,0 32,8 31,5 31,1 5,7 68,9 0,00000 78,4 72,6 74,5 96,1 80,0 87,0 81,4 8,7 18,6 0,00346 50,3 0,00000
5
34,7 29,9 22,7 48,5 25,4 23,3 30,7 9,8 69,3 0,00001 85,8 68,9 65,0 84,2 80,0 88,1 78,7 9,5 21,3 0,00273 47,9 0,00001
6
23,1 22,1 16,4 43,1 19,4 21,9 24,4 9,5 75,6 0,00001 57,3 45,3 57,8 74,3 65,8 69,5 61,7 10,4 38,3 0,00028 37,3 0,00007
Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas delnivel de los expertos en la técnica a los que concierne esta invención.
Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle por medio de ilustraciones y ejemplos confines de claridad y entendimiento, será obvio que es posible practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Sala, Carlos Echarte, Mariel Bulos, Mariano Whitt, Sherry R. Ascenzi, Robert
<120> PLANTAS DE GIRASOL RESISTENTES A HERBICIDAS, POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN PROTEÍNAS CORRESPONDIENTES A LA SUBUNIDAD MAYOR DE LA ACETOHIDROXIÁCIDO-SINTASA RESISTENTES A HERBICIDAS Y PROCEDIMIENTOS DE USO
<130> 038867/310344
<150> US 60/695.952
<151>
<160> 14
<170> FastSEQ para Windows, versión 4.0
<210> 1
<211> 1.178
<212> ADN
<213> Helianthus annus
<220>
<221> Secuencia codificante
<222> (3)...(1.178)
<400> 1
<210> 2
<211> 392
<212> Proteína
<213> Helianthus annus
<400> 2
<210> 3
<211> 1.178
<212> ADN
<213> Helianthus annus
<220>
<221> Secuencia codificante
<222> (3)...(1.178)
<400> 3
<210> 4
<211> 392
<212> Proteína
<213> Helianthus annus
<400> 4
<210> 5
<211> 2.156
5 <212> ADN
<213> Xanthium sp.
<220>
<221> Secuencia codificante
<222> (111)...(2.057) 10 <221> Elemento mixto
<222> (0)...(0)
<223> Número de acceso de GenBank U16280
<400> 5
<210> 6
<211> 648
<212> Proteína
<213> Xanthium sp.
<400> 6
<210> 7
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador HA1U409
<400> 7
<210> 8
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador HA1L1379
<400> 8
<210> 9
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador HA1U1313
<400> 9
<210> 10
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador HA1L2131
<400> 10
<210> 11
<211> 1.968
10 <212> ADN
<213> Helianthus annuus
<220>
<221> Secuencia codificante
<222> (1)...(1.965) 15 <221> Elemento mixto
<222> (0)...(0)
<223> Número de acceso de GenBank AY541451
<400> 11
<210> 12
<211> 655
<212> Proteína
<213> Helianthus annuus
<400> 12
<210> 13
<211> 2.013
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> Secuencia codificante
<222> (1)...(2.013)
<400> 13
<210> 14
<211> 670
<212> Proteína
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 14

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una planta de girasol que comprende en su genoma al menos una copia de al menos un gen endógeno que comprende un polinucleótido correspondiente a la subunidad mayor de la acetohidroxiácido-sintasa (AHASL), en que dicho polinucleótido AHASL codifica una proteína AHASL1 resistente al herbicida imidazolinona que comprende lasecuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 2 o una planta de girasol de la progenie de esta y en que dichaplanta o la progenie de esta presentan un aumento de la resistencia a al menos un herbicida de imidazolinona encomparación con una planta de girasol natural.
  2. 2.
    La planta de girasol de la reivindicación 1, en que dicha planta presenta un aumento de la resistencia a al menos un herbicida seleccionado del grupo que consta de los herbicidas de sulfonilurea y los herbicidas de triazolopirimidina.
  3. 3.
    La planta de girasol de la reivindicación 1 ó 2, en que dicho polinucleótido AHASL resistente a herbicidascomprende la secuencia nucleotídica expuesta en SEQ ID NO: 1.
  4. 4.
    La planta de girasol de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en que dicha proteína AHASL resistente a herbicidas comprende además al menos un miembro seleccionado del grupo que consta de: (a) una leucina en laposición del aminoácido 559 o en una posición equivalente respecto a la secuencia aminoacídica expuesta en SEQID NO: 12 y (b) uno cualquiera de asparragina, treonina, fenilalanina o valina en la posición del aminoácido 638 o enuna posición equivalente respecto a la secuencia aminoacídica expuesta en SEQ ID NO: 12.
  5. 5.
    Una semilla de la planta de girasol de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en que dicha semillacomprende en su genoma al menos una copia de dicho polinucleótido AHASL.
  6. 6.
    Una planta de girasol de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende lascaracterísticas de resistencia a herbicidas de imidazolinona de la línea GM40 o GM1606, en que una muestra desemilla de cada línea se ha depositado, respectivamente, con el número de depósito de patente ATCC PTA-6716 y el número de depósito de patente PTA-7606, en que dicha planta (a) es de la progenie de la línea GM40 o GM1606;
    (b) es un mutante, recombinante o derivado manipulado genéticamente de la línea GM40 o GM1606 o (c) es unaplanta de la progenie de al menos una cualquiera de las plantas de (a) o (b).
  7. 7.
    Una semilla de la planta de girasol de la reivindicación 6, en que dicha semilla comprende lascaracterísticas de resistencia a herbicidas de imidazolinona de la línea GM40 o GM1606.
  8. 8.
    Un procedimiento para el control de las malas hierbas en la proximidad de una planta de girasol, en quedicho procedimiento comprende la aplicación de una cantidad eficaz de un herbicida de imidazolinona o una mezclade un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea y/o un herbicida de triazolopirimidina a las malashierbas y a la planta de girasol, en que dicha planta de girasol es una planta de girasol de acuerdo con unacualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6.
  9. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 8, en que dicho herbicida de imidazolinona se selecciona del grupo que consta de: ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-3-quinolinocarboxílico, ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)nicotínico, ácido 2-(4isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)5-metilnicotínico y una mezcla de 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato de metilo y de 2-(4isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato de metilo y mezclas de estos.
  10. 10.
    El procedimiento de la reivindicación 8, en que dicho herbicida de sulfonilurea se selecciona del grupo queconsta de: clorsulfurón, metsulfurón-metilo, sulfometurón-metilo, clorimurón-etilo, tifensulfurón-metilo, tribenurónmetilo, bensulfurón-metilo, nicosulfurón, etametsulfurón-metilo, rimsulfurón, triflusulfurón-metilo, triasulfurón, primisulfurón-metilo, cinosulfurón. amidosulfurón, flazasulfurón, imazosulfurón, pirazosulfurón-etilo, halosulfurón y mezclas de estos.
  11. 11.
    Una semilla de la planta de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6, en que dicha semilla se trata conun herbicida de imidazolinona inhibidor de la AHAS o una mezcla de un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea y/o un herbicida de triazolopirimidina.
  12. 12.
    Un procedimiento para combatir la vegetación no deseada que comprende la puesta en contacto de una semilla de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6 antes de la siembra y/o después de la pregerminación con un herbicida de imidazolinona inhibidor de la AHAS o una mezcla de un herbicida de imidazolinona, un herbicida de sulfonilurea y/o un herbicida de triazolopirimidina.
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