CN102216461B

CN102216461B - 抗除草剂的向日葵植物

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Publication number: CN102216461B
Application number: CN200980138876.XA
Authority: CN
Inventors: 卡洛斯·萨拉; 马里亚诺·布洛斯
Original assignee: ANGLO NETHERLANDS GRAIN BV
Current assignee: Syngenta Participations AG; Syngenta Crop Protection AG Switzerland
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2029-07-30
Also published as: UA108062C2; EP2331694B1; RU2011107239A; RU2551781C2; ES2566150T3; SI2331694T1; BRPI0916434A2; EP2331694A1; AU2009277239A1; ZA201100764B; AR072638A1; HRP20160529T1; AU2009277239B2; CN102216461A; HUE028066T2; US8952222B2; CA2732028C; RS54868B1; US20120058898A1; CA2732028A1

Abstract

本发明提供了相对于野生型向日葵植物对除草剂抗性增加的向日葵植物。这些植物含有AHAS基因中的新基因突变，其赋予对AHAS-抑制性除草剂的广谱抗性。本发明提供了耐受除草剂的向日葵作物生产体系，和为向日葵种植者提供的新的且有效的杂草控制选择。

Description

抗除草剂的向日葵植物

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别地涉及抗除草剂的向日葵植物，其含有编码抗除草剂的向日葵乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的新型多核苷酸序列。

背景技术

乙酰乳酸合酶(ALS)或乙酰羟酸合酶(AHAS)是植物和微生物中支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径中的第一个酶。五个不同的化合物家族抑制AHAS酶，并用作非选择性广谱除草剂：磺酰脲(SU)、咪唑啉酮(IMI)、三唑并嘧啶(TP)、磺酰基氨基羰基三唑啉酮(SCT)和嘧啶基氧苯甲酸酯(pyrimidinyloxybenzoates)(POB)。

由于其高效率和低毒性，某些除草剂有利于农业用途。然而，在特定作物生产体系中，能否使用这些除草剂中的一些依赖于感兴趣作物植物抗性变异的获得。为了生产此种抗性变异，植物育种家需要开发出具有抗性性状(resistant trait)的育种品系。因此，需要抗除草剂的育种品系和植物作物变异，以及用于生产和使用抗性育种品系和变异的方法和组合物。

已通过各种途径，包括体细胞选择、突变育种、植物转化和种间杂交，开发对抑制AHAS的除草剂具有抗性的多种作物，包括玉米(Zea maysL.)、油菜籽(Brassica napusL.)、甜菜(Beta vulgaris L.)、水稻(Oryza sativaL.)、棉花(Gossypium hirsutum L.)、向日葵(Helianthus annuus L.)、亚麻(Linum usitatissimum L.)、大豆[Glycine max(L.)Merr.]和小麦(Triticumaestivum L.)(Anderson and Georgeson，1989；Croughan，1996；D′Halluin等人，1992；Newhouse等人，1991，1992；Hart等人，1992；Wright and Penner，1998；Swanson等人，1989；Subramanian等人，1990；Rajasekaran等人，1996；Sebastian等人，1989；Pozniak and Hucl，2004；Al-Khatib和Miller，2002；Mallory-Smith等人，1990；McHughen，A.1989)。其中在大部分情况下，抗性是由对除草剂抑制不敏感的形式的AHAS引起的，因为编码AHAS催化亚基的基因(多种基因)突变致使除草剂结合降低。多个作者已评论了在植物中赋予对AHAS-抑制性除草剂的抗性的AHAS基因的已知突变(Preston和Mallory-Smith；2001；Tranel和Wright，2002；Tan等人，2005)。在调节亚基中的已知氨基酸置换没有被报道可以赋予除草剂抗性。

已发现野生向日葵(Helianthus annuus L.)种类对咪唑啉酮(IMI)或磺酰脲(SU)的抗性(Al-Khatib等人1998，White等人2002)。为了开发和使用IMI-抗性和SU-抗性栽培种(cultivar)，用传统的育种方法将除草剂抗性性状导入到向日葵优良近交品系(inbred line)中(Al-Khatib和Miller，2002；Miller和Al-Khatib，2002；2004)。以分子研究为基础，Kolkman等人(2004)在向日葵中鉴定并表征三个AHAS基因(AHAS1、AHAS2和AHAS3)，并证明IMI-抗性和SU-抗性基因是相同基因座的等位基因变体(AHASL1)。而且，他们表示，IMI-抗性等位基因在密码子205中含有C到T突变(Arabidopsis thaliana nomenclature)，而SU-抗性等位基因在密码子197中含有C到T突变(Kolkman等人，2004)。

发明内容

本发明提供了具有多种除草剂抗性的向日葵植物。该植物对至少咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂，和嘧啶基氧苯甲酸酯除草剂以及这些除草剂的混合物有抗性。有利地，该植物种子的油含量大于40％，种子产量大于每公顷一吨，和/或向日葵植物具有一个头(singlehead)。在其它实施例中，该植物具有这些特性的结合。在一些实施例中，该抗性植物具有编码氨基酸574突变体的AHAS基因或其等同物，其明显赋予抗性性状，其中该突变体可以是那个位置处色氨酸被另外的氨基酸取代，例如亮氨酸。具体实施例包括含有AHASL1基因的植物，该AHASL1基因具有SEQ ID NO：1中示出的核苷酸序列，或包括含有AHASL1蛋白的植物，该AHASL1蛋白具有SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列。

本发明也提供了编码突变体AHASL1基因的分离的核酸分子，例如，含有序列SEQ ID NO：1的分离的核酸。也提供了用具有SEQ ID NO：1序列的核酸转化的植物细胞，和包括含有SEQ ID NO：1的转基因的转基因向日葵植物。在其它实施例中，该植物包含具有启动子的表达盒，该启动子在向日葵植物中是有活性的，并可操作地连接到分离的核酸上，该核酸编码具有由SEQ ID NO：1编码的序列的蛋白质。

本发明也提供了在上述类型抗性向日葵植物附近控制杂草的方法，其通过将除草剂施用到该杂草和向日葵植物上进行，其中该除草剂是咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂，或嘧啶基氧苯甲酸酯除草剂，或这些除草剂混合物。

本发明也提供了向日葵种子和从这些种子生长的植物。该植物具有对咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧苯甲酸酯除草剂和其混合物的除草剂抗性。在具体实施例中，从该种子生长的植物的种子油含量大于40％、种子产量大于每公顷一吨，和/或向日葵植物具有一个头。其他的实施例包括前述特性的结合。这些植物可以包含如上所述的突变体AHASL1。

本文也提供了改进除草剂在向日葵植物中的耐受性的方法。优选实施例包括，使向日葵细胞再生为向日葵植物，其中该向日葵细胞用具有编码由SEQ ID NO：1编码的蛋白质的核酸序列的构建体转化，使该向日葵细胞再生为向日葵植物并选择对有效剂量的除草剂有植物生长和繁殖抗性的可育(fertile)花卉植物。该除草剂选自由磺酰脲、咪唑啉酮、嘧啶基氧苯甲酸酯、三唑并嘧啶，及其混合物组成的组。

本文也提供了通过回交(back crossing)产生抗除草剂的向日葵植物的方法。优选的实施例包括使具有抗除草剂的AHAS活性的第一向日葵植物与不具有抗除草剂的AHAS活性的第二向日葵植物杂交，其中该第一向日葵植物具有编码由SEQ ID NO：1编码的蛋白质的核酸。有利地，选择具有抗除草剂的AHAS活性的后代植物。进一步优选的实施例包括具有第一向日葵植物的抗除草剂特性的种子。

在具体实施例中，提供了称为RW-B的向日葵栽培种的种子。这种种子和相应的植物具有如上描述的所有生理、除草剂抗性，和形态特征。这种向日葵栽培种的代表种子已经以登录号：PTA-9176保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)。也提供了前述抗性向日葵植物的可再生细胞的组织培养物。优选的实施例包括组织培养物，其中该组织培养物的细胞包含叶子、花粉、胚芽、子叶、胚轴、分生细胞、根、根尖、花粉囊、花、种子、单个茎、胚珠、枝、多个茎(stem)、梗(stalk)、髓囊(pith capsule)或荚。抗性向日葵植物可以从前述组织培养物生长并表达向日葵栽培种RW-B的所有形态和生理特性。

通过下面的详细描述，本发明的其它目的、特性和优点将变得明显。但是，应当注意，虽然指出本发明的优选实施例，但详细描述和具体实施例仅为了说明，因为根据该详细说明，明显地，在本发明的精神和范围内本领域技术人员可以作出各种变化和修饰。

附图说明

图1示出来自HA89，B770品系、抗性品系RW-B、苍耳属(Xanthiumsp.)ALS基因，和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AHASL1基因编码区的部分DNA序列比对。

图2示出来自HA89，B770品系、抗性品系RW-B、苍耳属(Xanthiumsp.)ALS基因，和拟南芥的AHASL1蛋白的部分氨基酸序列比对。

图3示出RW-B中的IMI抗性遗传。

图4以表格形式示出用不同AHAS抑制性除草剂喷洒的七个向日葵品系的植物毒性。

图5示出在F₁、F₂和BC₁F₁代(generation)中的等位测试中向日葵植物对灭草烟的抗性(R)和易感性(S)的反应。

图6示出AHAS1单倍型分离和向日葵植物对以320g a.i.ha^-1速率施用的灭草烟的抗性(R)和易感性(S)反应。

图7示出品系RW-B的AHASL1基因的完整核苷酸序列(SEQ IDNO：1)。

图8示出品系RW-B的AHASL1基因的完整核苷酸序列(SEQ IDNO：2)。

图9示出在以增大的灭草烟速率施用后14天，在向日葵AHASL1基因座上携带不同突变体等位基因的4个品系的高度降低(作为未处理的对照植物百分比)。

图10示出当使用增大的灭草烟速率时，在向日葵的AHASL1基因座上携带不同突变体等位基因的4个向日葵品系的植物毒性。

图11示出当使用增大的灭草烟速率时，在AHASL1基因座上携带不同突变体等位基因的4个向日葵品系的地上干重生物量的剂量反应曲线(作为未处理的对照植物百分比)。

图12示出当使用增大的甲磺隆速率时，在向日葵AHASL1基因座上携带不同突变体等位基因的4个向日葵品系的植物毒性。

图13示出当使用增大的甲磺隆速率时，在AHASL1基因座上携带不同突变体等位基因的4个向日葵品系的地面干重生物质量的剂量反应曲线(作为未处理对照植物的百分比)。

具体实施方式

提供了相对于野生型向日葵植物对除草剂抗性增加的向日葵植物。这些植物含有AHAS基因中的新基因突变体，其赋予对AHAS抑制性除草剂的广谱抗性，并且这种突变体已被鉴定和表征。这种新突变体的可获得性与使用可获得的AHAS抑制性除草剂结合，提供耐受除草剂的向日葵作物生产体系，并代表为向日葵种植者提供的新的且有效的杂草控制选择。

数个AHAS置换将导致对AHAS抑制剂的抗性，但是，对不同的AHAS抑制性除草剂的抗性大小在各种置换之间差别很大(Saari等人，1994；Tranel and Wright，2002)。虽然存在例外，但以交叉抗性为基础一般可将由改变的AHAS引起的抗性分为三类：(1)SU-特异抗性，(2)IMI-特异抗性，和(3)广泛的交叉抗性。导致脯氨酸(Pro)197置换的点突变赋予高水平的磺酰脲抗性，而对咪唑啉酮和三唑并嘧啶的抗性仅有小幅增加(Haughn等人，1988；Lee等人，1988；Guttieri等人，1992；Harms等人，1992；Mourad and King 1992；Guttieri等人，1995；Wright等人，1998)。另一方面，丙氨酸(Ala)205置换显示广泛的交叉抗性，但是，该抗性水平中等(Saari等人，1994；Tranel and Wright，2002)。(Ala)122置换导致IMI抗性，但无Su抗性(参见，Sala等人，2008a&b)。

向日葵中AHAS-抑制性除草剂的性状和抗性基因已有不同名称。IMI-抗性等位基因被命名为Imrl(Bruniard and Miller，2001)、Arpur或A205V(Kolkman等人.2004)或AhasLl-1(参见，例如Sala等人2008b)，并且其性状被称为IMISUN。SU-抗性等位基因被命名为Ar_kan或P197L(Kolkman等人.2004)或AhasL 1-2(参见，例如Sala等人，2008b)，并且该性状被称为SURES。存在于CLHA-Plus中的高度IMI-抗性等位基因被命名为Ahasll-3或A122T(参见，例如，Sala等人，2008b)。

本发明人意外发现，在向日葵AHASL1基因的密码子574(Arabidopsisthaliana nomenclature)处的新突变赋予对AHAS-抑制性除草剂五个家族中至少四个的高水平和广谱抗性。将AHAS蛋白质中的色氨酸转变成亮氨酸的这种单突变是这种显著的除草剂抗性范围的原因，其中本发明向日葵出乎意料地对除草剂IMI、SU、TP和POB.中的所有除草剂都具有抗性。因此，这种新突变体提供了优于向日葵中目前已知的所有抗性突变体的许多技术优点。这些优点包括，但不局限于以下几点：将新型除草剂施用到通常施用除草剂会对向日葵本身产生副作用的向日葵作物上、同时将不可结合的两种或多种除草剂的混合物施用到向日葵作物上、改变给向日葵施用除草剂的时间和类型，以及由于携带抗性在出苗后施用一种以上的除草剂。

提供了通过在播种之前和/或在催芽之后用AHAS-抑制性除草剂或除草剂混合物处理该抗性植物的向日葵种子，阻止(combat)不期望植物或控制杂草的方法。然后，例如在田地的土壤中或在温室的盆栽基质中播种所处理的种子。也可用AHAS-抑制性除草剂或除草剂混合物处理所得植物从而阻止不期望植物和/或控制该向日葵植物邻近区域中的杂草。

标记物辅助的回交实验允许开发本文描述的商业上有用的多种抗除草剂的向日葵植物。在回交中，可应用直接选择，其中基因位点为部分显性性状，如具有抗除草剂性状。为了对本发明向日葵植物进行选择，在回交之前用除草剂喷洒最初杂交的后代。该喷雾除去了不具有期望抗除草剂特性的植物，将具有抗除草剂特性基因的植物用在随后回交中。对所有其它的回交世代重复这个过程，直至获得真正有多种除草剂抗性的育种的植物。

除了除草剂抗性之外，该向日葵植物还具有许多其它的有利特性。因而，该向日葵种子具有下面特性中的一种或多种，油含量大于40％、种子产量大于每公顷一吨，和向日葵植物具有一个头。意外地，发现这些特性彼此之间以及与由密码子574处突变体赋予的广谱除草剂抗性结合。

由于本文描述的向日葵植物对四种或更多的除草剂家族具有显著的抗性，所以农民可以用比先前用来处理向日葵的更多种除草剂处理该作物。控制向日葵作物中的杂草需要避免生长欠佳和产量减少，并且在生长季节的相同或不同时间使用一种以上除草剂的能力提供了优于传统向日葵品种的显著杂草控制优点。例如，因为由种子生长的向日葵可能需要两周出现，杂草自身可以非常容易地长成并然后遮蔽该向日葵幼苗，其将阻碍向日葵生长。在不控制的情况下，杂草在向日葵作物中的竞争给种植者带来重大的经济损失，因为产量降低高达50％。本发明植物避免了这些忧虑，因为它们对一种以上现有除草剂家族的抗性允许加强除草剂使用方案。

对多种除草剂家族的除草剂抗性的其他优点是，农民可以在商业上利用向日葵作物而不需投入研发新除草剂的费用。由于除草剂注册费用高，所以不可能研发新的向日葵作物的除草剂。对已知除草剂的多种抗性对易感于残留药害的向日葵作物也是有利的。当来自之前作物的除草剂损害目前作物的生长时发生残留。对多种除草剂具有抗性降低了残留对向日葵作物的损害。进一步地，本发明增加的控制向日葵植物中杂草的能力意味着也限制了在向日葵之后生长的作物中将来的杂草问题。

在本发明的上下文中，术语“耐受除草剂的”和“抗除草剂的”可以互换使用，并且具有等同的含义和等同的范围。类似地，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”可以互换使用，并且具有等同的含义和等同的范围。同样地，用于除草剂家族的术语，例如“抗咪唑啉酮的”和“咪唑啉酮抗性”可以互换使用，并且分别具有与术语“耐受咪唑啉酮的”和“咪唑啉酮耐受性”等同的含义和范围。

提供了抗除草剂的AHASL多核苷酸和抗除草剂的AHASL蛋白质。对本发明来说，术语“抗除草剂的AHASL多核苷酸”表示编码包含抗除草剂的AHAS活性的蛋白质的多核苷酸。“耐受除草剂的AHASL蛋白质”或“抗除草剂的AHASL蛋白质”是这样的AHASL蛋白质，当在至少一种已知干扰AHAS活性的除草剂存在下和在已知抑制野生型AHASL蛋白质AHAS活性的除草剂浓度或水平下，其相对于野生型AHASL蛋白质的AHAS活性，显示出显著更高的AHAS活性。“耐受除草剂的”或“抗除草剂的”植物是对以正常将杀死或抑制正常或野生型植物生长的特定量施用的至少一种除草剂有耐受性或抗性的植物。在一个实施例中，本发明耐受除草剂的植物包含耐受除草剂的或抗除草剂的AHASL蛋白质。虽然最近出版物用不同的名称命名，但在此和通篇中，术语AHASL将用来表示AHAS酶的催化或大(L)亚基。参见，例如，Duggleby等人，2008 PlantPhysiol.Biochem.46；309-324。

进一步地，可以通过用编码耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白的核苷酸序列转化植物或其祖先，将耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白引入向日葵植物中。此种耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白由耐受除草剂或抗除草剂的AHASL多核苷酸编码。或者，由于在植物或其祖先基因组中内源AHASL基因中天然发生的或诱导的突变，耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白可在向日葵植物中产生。本发明提供了向日葵植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞，其具有对一种或多种除草剂的增加抗性或耐受性，该除草剂包括但不局限于IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂。有利地，该植物对上述除草剂中的两种或更多具有增加的抗性或耐受性，更有利地，对上述除草剂中的三种或更多具有增加的抗性或耐受性。最有利地，该植物具有对上述除草剂中的四种或更多具有增加的抗性或耐受性。

优选施用到如上描述的植物或种子上的除草剂量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。对于本发明，术语“有效量”和“有效浓度”分别表示足以杀死或抑制类似野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞生长的量和浓度，但所述量不杀死或不同样严重地抑制本发明抗除草剂的植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞的生长。典型地，除草剂的有效量是在农业生产体系中常规用于杀死感兴趣杂草的量。此种量为本领域技术人员所知。“野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”是缺少本发明的抗除草剂特性和/或特定多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。术语“野生型”并不暗指植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在其基因组中缺少重组DNA，和/或不具有与本文描述的那些特性不同的抗除草剂特性。术语“植物”旨在表示处于任何发育阶段的植物，以及可嫁接到或可从整个完整植物中分离的任何植物部分或多个部分。此种植物部分包括，但不局限于植物的器官、组织，和细胞。特定植物部分的实例包括茎、叶、根、花序、花、小花、果实、花梗(pedicle)、花序梗、雄蕊、花粉囊、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛(leaf hair)、种毛(seed hair)、花粉粒、小孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、保卫细胞和任何其他已知的植物的器官、组织和细胞。此外，应认识到种子是植物。

本发明描述了相比野生型植物品种对IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂和/或其混合物具有增加的抗性的向日葵植物。本文详细描述了对IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂和/或其混合物具有此种增加的抗性的向日葵植物的育种和选择。来自这些方法的一种植物利用ATCC(专利保藏号PTA-9176)保藏，并在此称为RW-B向日葵品种。2008年4月25日，利用美国典型培养物保藏中心保藏了RW-B向日葵品种的2500颗种子。这种保藏根据与微生物保藏相关的布达佩斯条款和条文进行。该保藏至少持续30年，并且在ATCC收到提供保藏的样品的最新请求后保藏至少5年。

本发明向日葵植物包括非转基因和转基因植物。“非转基因植物”是在其基因组中缺少重组DNA的植物。“转基因植物”是在其基因组中包含重组DNA的植物并可通过将重组DNA引入植物基因组中产生。当将此种重组DNA整合到转基因植物的基因组中时，该植物后代也可包含该重组DNA。这样的后代植物也是转基因植物，即包含至少一个祖先转基因植物的重组DNA的至少一部分。对IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂和/或其混合物具有增加的抗性的非转基因向日葵实例是向日葵植物RW-B或向日葵植物RW-B，或者向日葵植物RW-B任何后代的基因工程衍生物，或包含向日葵植物RW-B除草剂耐受特性的植物。

向日葵植物可以通过组织和细胞培养技术繁殖。实质上，通过组织和细胞培养技术，具有能够细胞分裂的细胞的任何植物组织都可以用于植物繁殖。培养可从叶、花粉、胚芽、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花粉囊、花、种子、单个茎、胚珠、枝、多个茎、梗、髓囊或荚开始。从茎和根血管区中选取的组织特别适合。美国专利4,670,391、4,670,392、4,673,648、4,681,849、4,687,743和5,030,572描述了从源自向日葵组织的细胞培养物中再生向日葵植物的方法。现有技术的状态是这样的，以便从细胞培养物和组织培养物中获得向日葵植物的示例方法现已为本领域技术人员所熟知。多种植物培养技术可用来使整个植物再生，如Gamborg和Phillips，″Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Fundamental Methods″，Springer Berlin，1995)；Evans等人.″Protoplasts Isolation and Culture″，Handbook of Plant Cell Culture，Macmillian Publishing Company，New York，1983；或Binding，″Regeneration of Plants，Plant Protoplasts″，CRC Press，Boca Raton，1985；或Klee等人，Ann.Rev.of Plant Phys.38：467(1987)中所描述的。向日葵培养体系的详细描述可在Chapter 11，SunflowerBiotechnology，Bidney，D.L.and Scelonge，C.J.，pp.559-593中找到，并且其中引用的参考文献，Sunflower Technology and Production，由A.A.Schneiter，Agronomy 35，publishers，American Society of Agronomy Inc.1997，Transformation of Sunflower编辑，这些都以引用的方式合并在此。

抗除草剂的向日葵植物可以通过利用组织培养方法生产，从而选择植物细胞，其包含抗除草剂的突变体并然后由此再生抗除草剂植物。参见，例如美国专利5,773,702和5,859,348，其都以引用的方式整体地合并在此。突变育种的进一步详细信息可以在″Principals of Cultivar Development″Fehr，1993 Macmillan出版公司中找到，该文献的内容以引用的方式合并在此。

突变基因以及它的编码蛋白质赋予向日葵植物广泛的除草剂抗性。

本发明人发现，在AHASL蛋白质中置换氨基酸位置574或等同位置(拟南芥命名)处的色氨酸，可以导致表达那个蛋白质的向日葵植物具有增强的对除草剂的抗性，特别是IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂，和/或其混合物。更具体地，这种突变蛋白赋予该植物多种除草剂抗性。

因此，本文描述的抗除草剂的向日葵植物包括，但不局限于在其基因组中具有至少一个拷贝的AHASL多核苷酸的向日葵植物，该AHASL多核苷酸编码在氨基酸位置574(拟南芥命名)上具有亮氨酸置换的抗除草剂的AHASL蛋白。此外，技术人员将认识到，此种氨基酸位置可以依赖于是否从例如氨基酸序列的N-末端添加或去除氨基酸而变化。因而，本文包括的本发明实施例包含在所引述位置或等同位置(例如，“氨基酸574或等同位置”)处的氨基酸置换。“等同位置”是与示例氨基酸位置相同的区域内的位置。此种区域在本领域中是已知的，或可以通过如本文所述的多个序列比对确定或通过本领域中已知的方法确定。

提供了可用来产生抗除草剂的向日葵AHASL蛋白的单个氨基酸置换，以及编码此种蛋白质的多核苷酸，以及携带此种突变体的抗除草剂的植物、植物组织、植物细胞和种子。而且提供了分离的、分别编码抗除草剂的AHASL1、AHASL2和AHASL3蛋白的向日葵AHASL1、AHASL2和AHASL3多核苷酸。此种抗除草剂的AHASL1、AHASL2和AHASL3蛋白各包含不同于在位置574或等同位置(拟南芥命名)处的色氨酸的氨基酸。优选地，在此种抗除草剂的AHASL1、AHASL2和AHASL3蛋白质中，在位置574或等同位置处的氨基酸是亮氨酸。

进一步地，提供了分离的编码AHASL蛋白的多肽。该分离的多肽编码具有图8中给出的氨基酸序列(系RW-B，SEQ ID NO：2的AHASL1基因的氨基酸序列)的氨基酸序列、由图7(系RW-B，SEQ ID NO：1的AHASL1基因的核苷酸序列)中给出的核苷酸序列编码的氨基酸序列，以及所述氨基酸序列功能片段和变体，其编码包含AHAS活性的AHASL多肽。

认为本文包括的蛋白质序列的缺失、插入和置换不在蛋白质特性方面发生根本的改变。然而，当在这样做之前难以预计置换、缺失或插入的确切效果时，本领域技术人员将认识到，该效果可通过常规筛选测定法评价。即，可通过AHAS活性测定评价活性。参见，例如，Singh等人.(1988)Anal.Biochem.171：173-179，该文献以引用的方式合并在此。因此，本文描述的蛋白质包括天然存在的蛋白质及其变型和修饰形式。此种变体将继续具有期望的AHAS活性。

本发明也提供了分离或纯化的多核苷酸和蛋白质。“分离的”或“纯化的”多核苷酸分子或蛋白质，或者其生物活性部分基本上或实质上不含如在天然存在的环境中发现的正常伴随该多核苷酸分子或蛋白质，或者与其相互作用的组分。因而，当通过重组技术生产时该分离或纯化的多核苷酸分子或蛋白质基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当通过化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物。优选地，“分离的”核酸不含这样的序列(即，位于该核酸的5’和3’末端的序列)(优选地，蛋白质编码序列)，该序列在该核酸所来源的生物体的基因组DNA中天然地位于该核酸的侧翼。例如，在多种实施例中，分离的多核苷酸分子可包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.4kb、0.3kb、0.2kb或0.1kb的这样的核苷酸序列，该核苷酸序列在该核酸所来源的细胞的基因组DNA中天然地位于该多核苷酸分子的侧翼。基本不含细胞材料的蛋白质包括具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(按干重计算)的污染性蛋白质的制剂。当通过重组生产本发明蛋白质或其生物活性部分时，优选培养基具有低于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(按干重计算)的化学前体或非感兴趣蛋白质的化学物。

提供了分离的多核苷酸分子，其具有编码AHASL蛋白质的核苷酸序列和相应的蛋白质。也提供了编码来自抗除草剂的向日葵植物的抗除草剂的AHASL蛋白的核苷酸序列。在一个实施例中，当与相应野生型氨基酸序列相比时，该抗除草剂的向日葵AHASL蛋白在氨基酸位置574或同等位置(拟南芥命名)上具有从色氨酸到亮氨酸的置换。特别地，提供了分离的多核苷酸分子，其包含编码图8中示出的氨基酸序列及其片段和变体的核苷酸序列，该片段和变体编码包含AHAS活性的多肽。进一步提供了多肽，其具有由本文描述的多核苷酸分子编码的氨基酸序列，例如图7中给出的那些及其片段和变体，该片段和变体编码包含AHAS活性的多肽。

另外，技术人员应进一步理解，可通过突变向本发明核苷酸序列中引入变化，从而导致所编码AHASL蛋白的氨基酸序列变化而不改变AHASL蛋白的生物活性。因而，通过向本文描述的相应核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸置换、添加或缺失以便将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失引入到所编码的蛋白质中，可以创建分离的编码AHASL蛋白的多核苷酸分子，该AHASL蛋白具有不同于SEQ ID NO：2序列的序列。突变可通过标准技术引入，如诱变(mutagenesis)和PCR介导的诱变。

可在供转化植物，特别是作物植物用的多核苷酸构建体中使用分离的本发明抗除草剂的AHASL多核苷酸分子，从而增强该植物对除草剂的抗性，特别是已知抑制AHAS活性的除草剂，更特别是IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂和/或其混合物。此种多核苷酸构建体可用在表达盒、表达载体、转化载体、质粒等中。在用此种多核苷酸构建体转化之后获得的转基因植物显示增加的对AHAS-抑制性除草剂的抗性，例如，IMI除草剂、TP除草剂、POB除草剂，和/或其混合物。

分离的具有编码如上所述突变体AHASL蛋白的核苷酸序列的多核苷酸分子可用在载体中，从而转化植物以便所创建的植物具有增强的对除草剂的抗性，特别是IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂，和/或其混合物。该分离的本发明AHASL多核苷酸分子可单独地用在载体中或与这样的核苷酸序列结合，该核苷酸序列编码在植物中赋予除草剂抗性的AHAS(AHASS)酶的小亚基。参见美国专利6,348,643，其以引用的方式合并在此。

本发明也包括不同于本文描述的核苷酸序列的多核苷酸分子。本发明核苷酸序列包括这些序列，其编码本文描述的AHASL蛋白，但由于遗传密码的简并性而保守地不同。这些天然存在的等位基因变体可利用已知的分子生物技术鉴定，如下面概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。核苷酸序列也包括通过合成衍生的核苷酸序列，其已经例如通过使用定位诱变产生但仍编码AHASL蛋白。一般地，本发明核苷酸序列变体将会与本文描述的特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。该AHASL核苷酸序列与本文公开的AHASL蛋白的氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％o、98％o，或99％的序列同一性。

本发明实施例也涉及具有在植物中驱动表达的启动子的植物表达载体，该启动子可操作地连接到分离的本发明多核苷酸分子上。该分离的多核苷酸分子包含编码AHASL蛋白或其功能片段和变体的核苷酸序列。本发明实施例的植物表达载体不依赖于特定启动子，只要此种能够在植物细胞中驱动表达的启动子即可。优选的启动子包括组成型启动子和组织偏爱的启动子。

该转化载体可用来产生用感兴趣基因转化的植物。该转化载体将具有可选择的本发明标记基因和待被引入和典型地在该转化植物中表达的感兴趣基因。具有本发明抗除草剂的AHASL多核苷酸的此种可选择标记基因可操作地连接到在宿主细胞中驱动表达的启动子上。为了在植物和植物细胞中使用，该转化载体具有可选择标记基因，其包含本发明抗除草剂的AHASL多核苷酸，该AHASL多核苷酸可操作地连接到在宿主细胞中驱动表达的启动子上。本发明感兴趣的基因依赖于期望的效果而改变。例如，各种表型变化可以是感兴趣的，包括修饰植物中的脂肪酸组成，改变植物的氨基酸含量，改变植物的昆虫和/或病原体防御机制，等等。通过在植物中提供异源产物的表达或内源产物的增大表达，可以实现这些结果。或者，通过在该植物中减少一种或多种内源产物，特别是酶或辅助因子的表达可以实现该结果，这些变化导致转化植物的表型发生变化。

在一个实施例中，感兴趣基因包括昆虫抗性基因，例如，苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(美国专利5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881，和Geiser等人.(1986)Gene 48：109)。本文描述的AHASL蛋白或多肽可从例如向日葵植物中纯化。并且，分离的编码本发明AHASL蛋白的多核苷酸分子可用于在微生物例如大肠杆菌(E.coli)或酵母中表达本发明AHASL蛋白。可根据本领域技术人员已知的任何方法，从大肠杆菌或酵母的提取物中纯化表达的AHASL蛋白。

本发明实施例包括AHASL多核苷酸分子及其片段和变体。对于本发明，术语“片段和变体”表示示例的包含AHAS活性的多肽片段和变体。在某些实施例中，该方法涉及使用耐受除草剂的或抗除草剂的植物。本发明的AHASL核苷酸序列片段可以编码AHASL蛋白的生物活性部分，或它可以是片段，该片段可用作使用下述方法的杂交探针或PCR引物。可以通过下述过程来制备AHASL蛋白的生物活性部分：表达所编码的AHASL蛋白的部分(例如，通过体外重组表达)，和评估所编码的AHASL1蛋白的活性。作为AHASL核苷酸序列片段的多核苷酸分子，依赖于期望的用途，包含至少约15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050，或1100个核苷酸，或者高达本文描述的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目。

编码本发明AHASL蛋白生物活性部分的AHASL核苷酸序列片段将编码至少约15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或350个连续氨基酸，或高达本发明全长AHASL蛋白中存在的氨基酸总数目。用作PCR引物的杂交探针的AHASL核苷酸序列片段不需要编码AHASL蛋白的生物活性部分。

通过沿着AHASL编码序列的全部或部分而随机地引入突变，例如通过饱和诱变可以制得变体AHASL核苷酸序列，并且可以就AHAS活性对所得突变体进行筛选，从而鉴定保留了AHAS活性，包括抗除草剂的AHAS活性的突变体。诱变之后，可重组地表达所编码的蛋白质，并可使用标准测定技术来确定蛋白质活性。因此，本发明核苷酸序列包括本文描述的序列及其片段和变体。本发明AHASL核苷酸序列及其片段和变体，可用作探针和/或引物从而在其他植物中鉴定和/或克隆AHASL同系物(homologue)，此种探针可用于检测编码相同或同一蛋白质的转录物或基因组序列。以这种方式，可使用诸如PCR、杂交等的方法来鉴定与本发明序列基本同一的此类序列。参见，例如，Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)，和Innis等人，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methodsand Applications(Academic Press，NY)。本发明包括基于其与此处所示的AHASL核苷酸序列或其片段和变体的序列同一性而分离的AHASL核苷酸序列。

转基因

本文描述了创建对除草剂有抗性的转基因植物的方法。该方法包括用具有在植物中促进表达的启动子的植物表达载体转化植物，该启动子可操作地连接到分离的本发明多核苷酸分子上。该分离的多核苷酸分子具有编码AHASL蛋白质或该氨基酸序列功能片段和变体的核苷酸序列。

本发明实施例提供了用至少一个多核苷酸分子转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子，和非人宿主细胞，表达盒，或本发明转化载体。在分别杀死或抑制未转化的植物、植物组织、植物细胞，或非人宿主细胞生长的除草剂水平下，此种转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子，和非人宿主细胞具有增强的对至少一个除草剂的耐受性或抗性。

本文描述的AHASL多核苷酸用于增强耐受除草剂的植物的抗性。在一个实施例中，耐受除草剂的植物具有耐受除草剂或抗除草剂的AHASL蛋白。该耐受除草剂的植物包括用耐受除草剂的AHASL核苷酸序列转化的植物，和在其基因组中具有编码耐受除草剂的AHASL蛋白的内源基因的植物。编码耐受除草剂的AHASL蛋白的核苷酸序列，和具有编码耐受除草剂的AHASL蛋白的内源基因的耐受除草剂的植物包括本文描述的多核苷酸和植物以及现有技术中已知的那些。参见，例如美国专利5,013,659、5,731,180、5,767,361、5,545,822、5,736,629、5,773,703、5,773,704、5,952,553和6,274,796，这些专利都以引用的方式合并在此。用于增强耐受除草剂的植物抗性的此种方法包含，用至少一个多核苷酸构建体转化耐受除草剂的植物，该多核苷酸构建体具有在植物细胞中促进表达的启动子，该启动子可操作地连接到本发明抗除草剂的AHASL多核苷酸，特别是编码抗除草剂的AHASL蛋白的多核苷酸，以及所述多核苷酸的片段和变体，其编码包含抗除草剂的AHAS活性的多肽。但是，在本发明之前，AHASL蛋白中没有一个能够赋予利用本发明AHASL基因获得的广谱而有效的除草剂抗性。

用于转化植物的许多植物转化载体和方法是可获得的。参见，例如，An，G.等人，(1986)Plant Pysiol.81：301-305；Fry，J.等人，(1987)Plant CellRep.6：321-325；Block，M.(1988)Theor.Appl.Genet.76：767-77；Hinchee，等人，(1990)Stadler.Genet.Symp.203212.203-212；Cousins等人，(1991)Aust.J.Plant Physiol.18：481-494；Chee，P.P.和Slightom，J.L.(1992)Gene.118：255-260；Christou等人，(1992)Trends.Biotechnol 10：239-246；D′Halluin等人，(1992)Bio/Technol.10：309-314；Dhir等人，(1992)PlantPhysiol.99：81-88；Casas等人，(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：11212-11216；Christou，P.(1993)In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant，29P：119-124；Davies，等人，(1993)Plant Cell Rep.12：180-183；Dong，J.A.和Mchughen，A.(1993)Plant Sci.91：139-148；Franklin，C.I.和Trieu，T.N.(1993)Plant.Physiol.102：167；Golovkin等人，(1993)Plant Sci.90：41-52；Guo Chin Sci.Bull.38：2072-2078；Asano等人，(1994)Plant Cell Rep.13；Ayeres N.M.和Park，W.D.(1994)Crit.Rev.Plant.Sci.13：219-239；Barcelo等人，(1994)Plant.J.5：583-592；Becker，等人，(1994)Plant.J.5：299-307；Borkowska等人，(1994)Acta.Physiol Plant.16：225-230；Christou，P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.5：17-27；Eapen等人，(1994)Plant Cell Rep.13：582-586；Hartman，等人，(1994)Bio-Technology 12：919923；Ritala等人，(1994)Plant.Mol.Biol.24：317-325；以及Wan，Y.C.和Lemaux，P.G.(1994)Plant Physiol.104：3748。

本发明的方法实施例包括向植物中引入多核苷酸构建体。术语“引入”表示以使构建体进入植物细胞内部的方式将该多核苷酸构建体呈递给植物。该方法不依赖于用于将多核苷酸构建体导入到植物中的特定方法，只要该多核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸构建体导入到植物中的方法在本领域中是已知的，其包括，但不限于，稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的方法。术语“稳定转化”表示被导入到植物中的多核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够通过其后代进行遗传。术语“瞬时转化”表示被导入到植物中的多核苷酸构建体不整合入植物的基因组中。

为了转化植物和植物细胞，利用标准技术将本发明核苷酸序列插入到现有技术中已知的任何载体中，该载体适合于在植物或植物细胞中表达核苷酸序列。载体的选择依赖于优选的转化技术和待转化的目标植物种。在本发明实施例中，AHASL核苷酸序列可操作地连接到已知用于在植物细胞中高水平表达的植物启动子上，并且然后将这种构建体引入到易感于下面除草剂中的一种或多种的植物中，即，IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂或POB除草剂，并再生所转化的植物。所转化的植物对于在将会杀死或严重损伤未转化植物的IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂和/或其混合物水平下的暴露具有耐受性。这种方法可应用于任何植物种，但是应用到向日葵植物上时更有利。

用于构建植物表达盒和将外来核酸导入到植物中的方法在本领域内一般是已知的，且先前已进行了描述。例如，可使用肿瘤诱导(Ti)质粒栽体将外来DNA导入到植物中。外来DNA递送的其他方法包括使用PEG介导的原生质体转化、电穿孔、显微注射whiskers和生物射弹或微粒轰击法以进行直接的DNA摄取。这样的方法在本领域中是已知的。(属于Vasil等人的美国专利号5,405,765；Bilang等人，(1991)Gene 100：247-250；Scheid等人，(1991)Mol.Gen.Genet，228：104-112；Guerche等人，(1987)Plant Science 52：111-116；Neuhause等人，(1987)Theor.Appl Genet.75：30-36；Klein等人，(1987)Nature 111：70-73；Howell等人，(1980)Science 208：1265；Horsch等人，(1985)Science 227：1229-1231；DeBlock等人，(1989)Plant Physiology 91：694-701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach，eds.)Academic Press，Inc.(1988)和Methods inPlant Molecular Biology(Schuler和Ziel inski，eds.)Academic Press，Inc.(1989))。该转化方法取决于待转化的植物细胞、所用载体的稳定性、基因产物的表达水平和其他参数。

将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的其他合适的方法包括，如Crossway等人，(1986)Biotechniques 4：320-334的显微注射，由Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606所描述的电穿孔，由Townsend等人，美国专利号5,563,055，Zhao等人，美国专利号5,981,840描述的土壤杆菌介导的转化，由Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3：2717-2722所描述的直接基因转移，以及描述于例如，Sanford等人，美国专利4,945,050；Tomes等人，美国专利号5,879,918；Tomes等人，美国专利5,886,244；Bidney等人，美国专利5,932,782；Tomes等人(1995)″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment″Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-926)；和Lecl transformation(WO 00/28058)中的弹道颗粒加速(ballistic particle acceleration)。也参见：De Wet等人.(1985)在Experimental Manipulation of Ovule Tissues中，ed.Chapman等人.(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人.(1990)Plant Cell Reports9：415-418和Kaeppler等人.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(whisker-介导的转化)；D′Halluin等人.(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人.(1993)Plant Cell Reports 12：250-255，所有这些都以引用的方式合并于此。

可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将本发明的多核苷酸引入植物。一般地，此种方法涉及将本发明的多核苷酸构建体并入病毒DNA或RNA分子中。要认识到，本发明的AHASL蛋白最初可作为病毒多蛋白的一部分来合成，其在后来可在体内或体外通过蛋白水解进行加工，从而产生期望的重組蛋白。进一步地，要认识到，本发明的启动子还包括用于通过病毒RNA聚合酶进行转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸构建体引入植物并在其中表达所编码蛋白质的方法在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931，其通过引用合并在此。

按照传统方法可将已被转化的细胞养成植物。参见，例如，McCormick等人，(1986)Plant Cel Reports 5：81-84。然后可让这些植物生长，并用相同的转化株或不同株进行授粉，所得杂交体具有经鉴定的所期望的表型特性的组成型表达。可生长两代或更多代从而确保期望的表型特性的表达得到稳定地保持和遗传，然后收获种子从而确保期望的表型特性的表达已获得。用这种方式，本发明的实施例提供了转化种子(也称作”转基因种子”)，其具有本发明多核苷酸构建体，例如，稳定地并入到本发明的基因组中表达盒。本文描述的抗除草剂的植物可用于控制杂草的方法中。因而，本发明实施例包括在本发明抗除草剂的植物附近控制杂草的方法。该方法包含向该杂草和向抗除草剂的植物施用有效量的除草剂，其中当与野生型植物相比时，该植物具有增加的对下述除草剂中的一种或多种的抗性，即，IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂，和/或其混合物。

本发明的实施例提供了非转基因和转基因种子，其具有增加的对一种或多种除草剂，特别是AHAS-抑制性除草剂，更特别是IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂，和/或其混合物的耐受性。此种种子包括，例如，包含向日葵植物RW-B的除草剂耐受特性的非转基因向日葵种子，和包含编码抗除草剂的AHASL蛋白的本发明多核苷酸分子的转基因种子。

对突变体AHASL基因存在的检测

本发明实施例的核苷酸序列可用于分离来自其他生物，特别是其他植物，更特别是其他双子叶植物的相应序列。这样，使用诸如PCR、杂交等的方法，基于其与本文所示序列的序列同一性，可以鉴定此种序列。本发明包括基于其与本文所示完整的AHASL序列或其片段的序列同一性分离的序列。因此，本发明包括分离的序列，其为AHASL蛋白编码，并在严格条件下与本文描述的序列或其片段杂交。

在PCR方法中，可设计用于PCR反应的寡核苷酸引物，从而从提取自任何感兴趣植物的cDNA或基因组DNA中扩增出相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中是普遍已知的。参见Innis和Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis和Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，NewYork)。已知的PCR的方法包括，但不限于，使用成对引物、嵌套引物、单一特异性引物(single specific primers)、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等方法。本发明的AHASL多核苷酸序列提供在用于在感兴趣植物中进行表达的表达盒中。该表达盒将包括可操作地连接到本发明的AHASL多核苷酸序列的5′和3′调控序列。“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起动和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般地，可操作地连接是指，被连接的核酸序列是紧邻的，并且在需要将两个蛋白质编码区连在一起时，它们是紧邻的并在同一个阅读框架内。表达盒可额外地包含至少一个将被共转化到生物体中的另外的基因。可替换地，可在多个表达盒上提供该另外的基因(或另外的多种基因)。

此种表达盒具有多个限制位点，该限制位点用于插入AHASL多核苷酸序列以使其在调控区的转录调控之下。该表达盒可额外地包含可选的标记基因。该表达盒将在5′-3′的转录方向包含转录和翻译的起始区(即，启动子)、本发明的AHASL多核苷酸序列，以及在植物中具有功能的转录和翻译终止区(即，终止区)。启动子对于植物宿主和/或对于本发明的AHASL多核苷酸序列来说可以是天然的或类似的，或是外源的或异源的。另外，该启动子可以是天然的序列或者合成的序列。当该启动子对于植物宿主来说是“外源的”或“异源的”时，旨在表示该启动子不是在导入该启动子的天然植物中发现的。当该启动子对于AHASL多核苷酸序列来说是“外源的”或“异源的”时，旨在表示该启动子对于可操作地连接的AHASL多核苷酸序列来说不是天然的或天然发生的启动子。如本文所用的，嵌合基因包含编码序列，该编码序列可操作地连接到与编码序列异源的转录起始区。

虽然本文描述的抗除草剂的AHASL多核苷酸可用作供植物转化用的可选择的标记基因，但是含有这些多核苷酸的表达盒可以包括用于选择该转化细胞的另外的可选择的标记基因。可选择的标记基因用于选择转化的细胞或组织。标记基因包括，但不局限于编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些，以及赋予对除草剂5化合物的抗性的基因，该化合物为，如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基醋酸盐(2，4-D)。通常参见，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等人.(1992)Cell 1：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人.(1980)in The Operon，pp.177-220；Hu等人.(1987)Cell 48：555-566；Brown等人.(1987)Cell 1049：603-612；Figge等人.(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404；Fuerst等人.(1989)Proc.Natl.Acad Sci.USA86：2549-2553；Deuschle等人.(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921；Labow等人.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 15 89：3952-3956；Baim等人.(1991)Proc.Natl.Acad，Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等人.(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等人.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschr M等人.(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)PhD.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人.(1992)Proc.Natl.Acad Sci.USA 89：5547-5551；Oliva等人.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人.(1985)Handbookof Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人.(1988)Nature 334：721-724。这些发明以引用的方式合并在此。可选择的标记基因的上述列表不是限定性的，并且需要时可以使用任何可选择的标记基因。

在杂交方法中，已知的AHASL核苷酸序列的全部或部分可以用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此种cDNA和基因组文库的方法在本领域中是普遍已知的。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并可以用可检测的基团例如³²P，或任何其他可检测的标记物如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子，来进行标记。可通过对基于本文公开的已知AHASL核苷酸序列的合成的寡核苷酸进行标记来制备用于杂交的探针。另外可使用简并引物，该引物是基于在已知的AHASLl核苷酸序列或所编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计的。该探针通常包含这样的核苷酸序列区域，该核苷酸序列区域在严格条件下与本发明的AHASL核苷酸序列或其片段或变体的至少大约12，优选地大约25，更优选地大约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1100个或更多连续核苷酸杂交。用于杂交的探针的制备在本领域中是普遍已知的。

例如，本文描述的完整的AHASL序列或其一个或多个部分可用作能够特异性地与相应AHASL序列和信使RNA杂交的探针。杂交技术包括涂板的DNA文库(斑或集落)的杂交筛选。此类序列的杂交可在严格条件下进行。对于本发明，术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指这样的条件，即在该条件下，探针与其靶序列的杂交程度将会比与其他序列的杂交程度可检测地更高(例如，高于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下将会不同。典型地，严格杂交条件是，在pH7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，通常为大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度至少为大约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)温度至少为大约60℃。还可以通过加入去稳定剂如甲酰胺来获得严格条件。示例性低严格条件包括，在37℃下利用30-35％的甲酰胺、lM NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的緩冲溶液进行杂交，和在50-55℃下在1x至2xSSC(20xSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中进行洗涤。示例性中等严格条件包括，在37℃下在40-45％的甲酰胺、1.0M NaCl、1％ SDS中进行杂交，和在55-60℃下在0.5x至1x SSC中进行洗涤。示例性高严格条件包括，在37℃下在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中进行杂交，和在60-65℃下在0.1xSSC中进行洗涤。任选地，洗涤緩冲液可包含大约0.1％至大约1％的SDS。杂交的持续时间通常少于大约24小时，通常为大约4至大约12小时。

特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交物，可根据Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.138：267-284：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，估算出Tm，其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是以碱基对形式的杂交物的长度。Tm是这样的温度(在限定的离子强度和pH下)，即在该温度下50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交。对于每1％的错配，Tm下降大约1℃，因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件从而与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有＞90％的同一性的序列，那么可将Tm降低10℃。一般地，选择严格条件从而使其比在限定的离子强度和pH下特定序列与其互补体的热力学熔点(T_m)低大约5℃。然而，非常严格条件可在比热力学熔点(T_m)低1、2、3或4℃下进行杂交和/或洗涤；中等严格条件可在比热力学熔点(T_m)低6、7、8、9或10℃下进行杂交和/或洗涤；低严格条件可在比热力学熔点(T_m)低11、12、13、14、15或20℃下进行杂交和/或洗涤。使用等式、杂交和洗涤组合物，以及期望的T_m，本领域技术人员将会理解，固有地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格度的变化。如果期望的错配程度导致低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，则优选地增加SSC浓度以便能够使用更高的温度。关于核酸的杂交的详尽指导可见于Tijssen，(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第1部分，第2章(Elsevier，NewYork)；和Ausubel等人，eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。

转基因和表达优化

提供了通过用多核苷酸构建体转化植物以增强植物中AHAS活性的方法，该多核苷酸构建体具有可操作地连接到本发明AHASL1核苷酸序列的启动子。该方法涉及将本发明多核苷酸构建体引入到至少一个植物细胞中，并利用能够在植物细胞中驱动基因表达的启动子再生出所转化的植物。优选地，此种启动子是组成型启动子或组织偏爱的启动子。该方法可用于增加植物对至少一种除草剂，有利地对干扰AHAS酶催化活性的两种、三种，或四种或更多除草剂的抗性或耐受性，特别是IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂，和/或其混合物。

在适当的时候，可以优化基因(多种基因)以便增加所转化的植物中的表达。即，为了提高表达，可使用植物偏爱的密码子来合成基因。关于宿主偏受的密码子使用的讨论可参见，例如，Campbell和Gowri，(1990)Plant Physiol.92：1-11。在本领域可获得合成植物偏受的基因的方法。参见，例如美国专利号5,380,831和5,436,391，和Murray等人，(1989)NucleicAcids Res.17：477-498，其以引用的方式合并在此。

已知额外的序列修饰可增强细胞宿主中的基因表达。这些修饰包括去除编码假多腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复和可能对基因表达有害的其他这样的经详尽表征的序列。可调节序列的G-C含量至给定细胞宿主的平均水平，如参照在该宿主细胞中表达的已知基因而计算出的水平。在可能的时候，对序列进行修饰从而避免预测的发夹二级mRNA结构。还可在植物表达载体中使用用于增强基因表达的核苷酸序列。这些序列包括玉米Adhl，intronl基因的内含子(Callis等人，Genes and Development 1：1183-1200，1987)，和来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑驳病毒和苜蓿花叶病毒的前导序列，(W-序列)(Gallie等人，Nucleic Acid Res.15：8693-8711，1987；和Skuzeski等人，Plant Mol.Biol.15：65-79，1990)。已显示，来自玉米的shrunken-1基因座的第一个内含子增加嵌合基因构建体中基因的表达。美国专利号5,424,412和5,593,874描述了基因表达构建体中特定内含子的用途，并且Gailie等人(Piant Physiol.106：929-939，1994)也已显示，在组织特异的基础上，内含子可用于调节基因表达。为进一步增强或优化AHAS大亚基基因表达，本发明的植物表达载体还可包含含有基质附着区(MAR)的DNA序列。然后，用此种经修饰的表达系统转化的植物细胞可展示出本发明核苷酸序列的过表达或组成型表达。

表达盒可额外地在表达盒构建体中包含5′前导序列。此种前导序列可起着增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域中是已知的，并包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein等人，(1989)Proc.Nat J.Acad.Sci.USA 86：6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人，(1995)Gene 165(2)233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Virology 154：9-20)，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人，(1991)Nature 353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒(AMV RNA 4)的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(Jobling等人，(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人，(1989)Molecular Biology ofRNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人，(1991)Virology 81：382-385)。还可参见，Della-Cioppa等人，(1987)Plant Physiol.84：965-968。还可使用已知用于增强翻译的其他方法，例如，内含子等。在制备表达盒的过程中，可操作各种不同的DNA片段，以便以正确的方向，和在合适时以正确的阅读框架，提供DNA序列。为此目的，可使用接头(adapter)或连接体(linker)来连接DNA片段，或可采用其他操作来提供方便的限制位点、多余DNA的去除、限制位点的去除等。为了该目的，可涉及体外诱变、引物修补、限制(restriction)、退火、再置换(resubstitution)，例如，转换和颠换。

本发明提供了用于在植物、植物组织、植物细胞和其他宿主细胞中表达多核苷酸的表达盒。该表达盒具有可在感兴趣植物、植物组织、植物细胞和其他宿主细胞中表达的并与本发明多核苷酸可操作地连接的启动子，该多核苷酸包含编码全长的(即包括叶绿体转运肽)或成熟的AHASL蛋白(即无叶绿体转运肽)的核苷酸序列。如果期望在植物或植物细胞的质体或叶绿体中表达，该表达盒还可以包含可操作地连接的编码叶绿体转运肽的叶绿体靶向序列。此种表达盒可在用于增强植物或宿主细胞的除草剂耐受性的方法中使用。该方法涉及用表达盒转化植物或宿主细胞，其中该表达盒包含可在感兴趣植物或宿主细胞中表达的启动子，并且该启动子有效地连接到本发明实施例的多核苷酸，该多核苷酸包含这样的核苷酸序列，其编码，例如抗IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂，或POB除草剂的AHASL蛋白。

术语“多核苷酸构建体”的使用并不限于DNA。本领域技术人员将认识到，在本文描述的方法中也可以采用多核苷酸构建体，特别是多核苷酸和寡核苷酸，其由核糖核苷酸，以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合构成。此种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸构建体还包括多核苷酸构建体的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。此外，本领域技术人员应理解，本文描述的每个核苷酸序列还包括该示例性核苷酸序列的补体。

本发明方法可采用能够在所转化的植物中指导至少一种蛋白，或至少一种RNA，例如与mRNA的至少一部分互补的反义RNA表达的多核苷酸构建体。典型地，此种多核苷酸构建体由蛋白质或RNA的编码序列组成，该编码序列可操作地连接到5′和3′转录调控区。或者，可以使用在转化的植物中不能指导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸构建体。为了在感兴趣的宿主细胞中表达本发明的多核苷酸，该多核苷酸典型地有效地连接到能够在感兴趣宿主细胞中驱动基因表达的启动子。用于在宿主细胞中表达多核苷酸的方法不依赖于特定的启动子，并包括使用本领域已知的并能够在感兴趣宿主细胞中驱动基因表达的任何启动子。

虽然使用异源启动子表达AHASL多核苷酸可以是优选的，但可使用天然的启动子序列。此种构建体可在植物或植物细胞中改变AHASL蛋白的表达水平。因此，改变了植物或植物细胞的表型。终止区可以和转录起始区都是天然的，可以和可操作地连接的感兴趣的AHASL序列都是天然的，可以和植物宿主都是天然的，或者可以源自另一种来源(即，对于启动子、感兴趣的AHASL多核苷酸序列、植物宿主或其任何组合来说是外源的或异源的)。可从根癌土壤杆菌(A.tunwfaciens)的Ti-质粒获得方便的终止区，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还可参见Guerineau等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfaeon等人，(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人，(1990)PlantCell 2：1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；和Joshi等人，(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

许多启动子可用于本发明的实践中，并可基于期望的结果进行选择。可将核酸与组成型启动子、组织偏爱型启动子或其他启动子组合用于在植物中表达。此种组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子以及在WO 99/43838和美国专利号6,072,050中描述的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632，和Christensen等人，(1992)PlantMol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括，例如，美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。组织偏爱型启动子可用于靶定在特定植物组织内增强的AHASL表达。此种组织偏爱型启动子包括，但不限于，叶偏爱型启动子、根偏爱型启动子、种子偏爱型启动子和茎偏爱型启动子。组织偏爱型启动子描述在这些文献中，例如Yamamoto等人，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russel等人，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam，(1994)Results Prob I.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要，可修饰这样的启动子以获得弱表达。

在一个实施例中，将感兴趣的核酸靶向叶绿体以进行表达。这样，当感兴趣的核酸未被直接插入到叶绿体中时，表达盒将会额外地包含叶绿体靶向序列，该叶绿体靶向序列包含编码用于引导感兴趣的基因产物至叶绿体的叶绿体转运肽的核苷酸序列。此种转运肽在本领域中是已知的。关于叶绿体靶向序列，“可操作地连接”是指将编码转运肽(即，叶绿体靶向序列)的核酸序列连接到AHASL多核苷酸，以便该两个序列是紧邻的并在同一个阅读框架中。参见，例如，Von Heijne等人；(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人，(1989)J.Biol.Chew.264：17544-17550；Della-Cioppa等人，(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人，(1986)ScienceWh：478-481。

虽然本文描述的AHASL蛋白可包括天然的叶绿体转运肽，但可通过将叶绿体靶向序列可操作地连接至编码成熟AHASL蛋白的核苷酸序列的5′-末端，来将本领域中已知的任何叶绿体转运肽融合至本发明成熟AHASL蛋白的氨基酸序列。

叶绿体靶向序列在本领域中是已知的，并包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人，(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等人，(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人，(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao等人，(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人，(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人，(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；和集光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人，(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。还可参见Von Heijne等人，(1991)Plant Mol.Biol Rep.9：104-126；Clark等人，(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人，(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人，(1986)Science 233：478-481。

用于转化叶绿体的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Svab等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga，(1993)EMBO J.12：601-606。该方法依靠对包含可选择的标记的DNA进行基因枪递送，和通过同源重組将DNA靶向至质体基因组。另外，通过经核编码的并质体定向的RNA聚合酶的组织偏爱型表达而反式激活沉默的质体承载的转基因，可完成质体转化。在McBride等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：7301-7305中已报导了此种系统。

靶向叶绿体中感兴趣的核酸可优化叶绿体的表达，从而解决植物细胞核与这个细胞器之间的密码子使用的差异。这样，可使用叶绿体偏爱型密码子来合成感兴趣的核酸。参见，例如，美国专利号5,380,831，其以引用的方式合并在此。

如本文所描述的，本发明实施例的AHASL核苷酸序列可用于增强植物的除草剂耐受性，该植物在其基因组中包含编码耐受除草剂的AHASL蛋白的基因。此种基因可以是内源基因或转基因。另外，在某些实施例中，可以用感兴趣的多核苷酸序列的任何组合来组成本发明的核酸序列，以便产生具有期望的表型的植物。例如，可以用任何其他编码多肽的多核苷酸来组成本发明的多核苷酸，该多肽具有杀虫和/或杀昆虫活性，例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白(描述于美国专利号5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756，5,593,881，和Geiser等人，(1986)Gene 48：109)。产生的组合还可包含感兴趣的多核苷酸中任何一个的多个拷贝。

还可以以有义方向使用本文描述的核苷酸序列，从而抑制植物中的内源基因的表达。使用有义方向的核苷酸序列来抑制植物中基因表达的方法在本领域中是已知的。该方法一般涉及用包含在植物中驱动表达的启动子的DNA构建体转化植物，该启动子可操作地连接至对应于内源基因转录物的核苷酸序列的至少一部分。典型地，此种核苷酸序列与内源基因转录物的序列具有实质的序列同一性，优选地大于约65％的序列同一性，更优选地大于约85％的序列同一性，最优选地大于约95％的序列同一性。参见，美国专利号5,283,184和5,034,323，其以引用的方式合并在此。

进一步提供了通过涉及有性繁殖的常规植物育种方法增加向日葵植物的除草剂抗性的方法。该方法包括将抗除草剂的第一向日葵植物和第二向日葵植物杂交，该第二向日葵植物可以抗或不抗该除草剂，或者可以抗不同于第一植物的除草剂或多种除草剂。该第一植物可以是本文描述的抗除草剂的植物中的任一种，例如RW-B。该第二植物可以是当与第一植物杂交时能够产生有生活力的后代植物(即，种子)的任一种植物。典型地，但非必需地，该第一和第二植物是相同的物种。由该方法产生的后代植物，当与第一或第二植物或两者相比较时，具有增加的对除草剂的抗性。当该第一和第二植物抗不同的除草剂时，后代植物将具有组合的第一植物和第二植物的除草剂耐受性特性。这些方法可进一步涉及将第一次杂交的后代植物回交一代或多代，产生具有与第一或第二植物相同的品系或基因型的植物。或者，可使第一次杂交或任何随后的杂交的后代进行杂交，从而产生具有与第一或第二植物不同的品系或基因型的第三植物。进一步地，这些方法可额外地涉及选择包含第一植物、第二植物，或第一和第二植物两者的除草剂耐受性特性的植物。

杂草控制方法

向日葵作物通常与谷物轮作，如小麦。SU除草剂通常用作小麦杂草控制系统中的一部分。除了SU除草剂以外，当种植IMI小麦时还可以将IMI除草剂用作小麦杂草控制系统中的一部分。在小麦/向日葵轮作中使用这些除草剂导致残留损伤。在SU或IMI施用到小麦的这个实例中，当施用到先前作物上的除草剂的残留物存在于土壤中时，当种植向日葵作物时，发生向日葵除草剂残留损伤。确实，数种除草剂可以引起对向日葵的残留损伤，包括许多AHAS-抑制剂(Blamey等人，1997)。对向日葵作物的损伤可以通过使用抗除草剂的向日葵栽培种降低。

但是，抗除草剂的向日葵栽培种表现出很大的特异性，并且它们的使用仅允许在出苗后喷洒相同家族的除草剂。例如，为了保护向日葵作物免受SU残留的影响，可以使用抗SU的栽培品。抗SU的栽培品的使用仅允许对向日葵作物喷洒SU除草剂。当前，仅抗SU或抗IMI的特异栽培种已显示-没有栽培种被描述对不同AHAS-抑制剂表现出交叉抗性。惊人地，并且意外地，本文描述的存在的基因和相应AHAS蛋白的表达保护向日葵作物不受由AHAS-抑制性除草剂引起的潜在残留损伤的影响，并且随后，允许喷洒各种AHAS-抑制性除草剂，从而控制出苗后的杂草。在向日葵作物中使用各种除草剂进行杂草控制的这种能力为种植者提供了大大提高的控制向日葵作物中杂草丛生的机会。

对多种除草剂具有抗性的AHAS蛋白的惊人发现允许：

1.在向日葵作物中施用新类型的AHAS抑制性除草剂(即：POB和TP)进行杂草控制，或用于另外作物中的熟知的除草剂在向日葵中注册的可能性。

2.因为对AHAS-抑制性除草剂的不同家族存在高水平的交叉抗性，所以可以对同时施用在向日葵作物上的除草剂中的两种或多种进行混合。另外，该交叉抗性允许设计和开发新的除草剂制剂，其可以结合不同的AHAS-抑制性除草剂，其目的是加强向日葵中的杂草谱控制。

3.对于向日葵中杂草控制的除草剂使用更灵活，即，根据待控制杂草的类型，可以在相同季节的不同时间选择和施用多于一种类型的除草剂。

4.对来自先前作物的除草剂残留的抗性和，同时对在出苗后施用的另外的AHAS抑制性除草剂的抗性。

控制不期望的植物应理解为，杀死杂草和/或以其它方式延缓或抑制杂草的正常生长。杂草，在广义上应理解为在不期望其生长的位置处生长的所有植物。杂草的实例包括但不限于，例如双子叶杂草和单子叶杂草。双子叶杂草包括，但不限于下列属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿览属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、獰菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、刺酸模属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草(Trifolium)、毛茛属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括，但不限于下列属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属、(Poa)、羊茅属(Festuca)、蟋蟀草属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)，莎草属(Cyperus)、高梁属(Sorghum)，冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、蔫草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、阿披拉草属(Apera)。

另外，该杂草可以包括，例如，生长在不期望位置处的作物植物。例如，如果在向日葵植物的田地中不想要玉米植物，则可以将在主要具有向日葵植物的田地中自行生长的玉米植物视为杂草。

本发明的实施例描述了增加植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞对一种或多种干扰AHAS酶活性的除草剂的耐受性或抗性的方法。优选地，此种除草剂是IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂，和/或其混合物。有利地，增加了对上述除草剂中的两种或多种的抗性或耐受性。更有利地，增加了对上述除草剂中的三种或多种的抗性或耐受性。最有利地，增加了对上述除草剂中的四种或多种的抗性或耐受性。该IMI除草剂可以包括，但不限于，(咪草烟)、(甲灭草烟)、(咪草啶酸)、(灭草全)、(imazethabenz)、(灭草烟)、前述除草剂中任一种的衍生物，以及前述除草剂中的两种或多种的混合物，例如，灭草烟/咪草啶酸该IMI除草剂可以选自，但不限于，2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、[2-(4-异丙基)-4-][甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基]-3-喹啉羧]酸、[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸，和[6-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯与[2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。优选使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-]基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。特别优选使用[2-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。

该SU除草剂包括，但不局限于，绿磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、砜嘧磧隆、氟胺磺隆、醚苯磺隆、氟嘧磺隆、醚磺隆、amidosulfiuon，fluzasulfuron、唑吡嘧磺隆、吡嘧磺隆、吡氯磺隆、四唑嘧磺隆、cyclosulfuron、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆(iodosulfuron)、环氧嘧磺隆、甲磺胺磺隆、氟磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、三氟甲磺隆、前述除草剂中任一种的衍生物，和前述除草剂中两种或更多种的混合物。

该TP除草剂包括，但不限于，氯酯磺草胺(cloransulam)、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺。

该POB除草剂包括，但不限于，双草醚(bispyribac)、嘧草硫醚(pyrithiobac)、嘧草醚(pyriminobac)、嘧啶肟草醚和环酯草醚。

要认识到，POB除草剂和嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂紧密相关，并且由Weed Science Society of America归纳在后一名称的标题之下。因此，该除草剂还可包括嘧啶基硫代苯甲酸酯类除草剂，包括，但不限于，上述POB除草剂。根据上述内容，申请人使用术语嘧啶基硫代苯甲酸酯和可与缩写词POB互换的嘧啶基氧基苯甲酸酯。

本文所列除草剂的使用并不是要将本发明限制于特定除草剂或特定除草剂家族。本领域技术人员将认识到还可以采用其他除草剂。

通过提供具有增加的对除草剂的抗性的植物，多种制剂可用于保护向日葵植物免受杂草的侵害，以便增强向日葵植物的生长和减少对营养的竞争。可单独地使用除草剂，以便在本文描述的植物的周围区域内进行杂草的出苗前(Pre-emergence)、出苗后(post-emergence)、种植前(pre-planting)和种植时(at planting)的控制。在实施例中，可以施用包含其他添加剂的IMI除草剂制剂。在另一个实施例中，可使用含有其它添加剂的SU除草剂制剂。在另一个实施例中，可使用含有其它添加剂的TP除草剂制剂。在另一个实施例中，可使用含有其它添加剂的POB除草剂制剂。该除草剂(多种除草剂)也可用于种子处理。在IMI除草剂、SU除草剂、TP除草剂、POB除草剂，和/或其混合物中发现的添加剂可以包括其他除草剂、去污剂、佐剂、分散剂、粘着剂、稳定剂等。除草剂制剂可以是湿润的或干燥的制剂，并可包括，但不限于，可流动性粉剂(flowable powders)、可乳化的浓缩剂和液体浓缩剂(liquidcon centrates)。可按照常规方法，例如通过喷洒、灌溉、撒粉(dusting)等来施用除草剂和除草剂制剂。在这些方法中，可通过本领域已知的任何方法，包括，但不限于，种子处理、土壤处理和叶处理，来施用AHAS抑制性除草剂。

在施用之前，可将AHAS抑制性除草剂转变成惯用制剂，例如溶液、乳液、悬浮液、粉末(dusts)、粉剂、糊剂和颗粒剂。使用形式取决于特定的所希望的目的；在各个情况下，应当确保本发明化合物的精细和均匀分布。

以已知的方式制备制剂(参见例如，关于综述可见US 3,060,084，EP-A 707 445(对于液体浓缩剂)，Browning，″Agglomeration″，ChemicalEngineering，Dec.4，1967，147-48，Perry′s Chemical Engineer′s Handbook，第4版，McGraw-Hill，New York，1963，pages 8-57，以及下列，WO 91/13546，US4,172,714，US 4,144,050，US 3,920,442，US 5,180,587，US 5,232,701，US 5,208,030，GB 2,095,558,US 3,299,566，Klingman，Weed Control as a Science，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，Hance等人，Weed Control Handbook，第8版，Blackwell ScientificPublications，Oxford，1989，和Mollet，H.，Grubemann，A.，Formulationtechnology，Wiley VCH Verlag GmbH，Weinheim(Germany)，2001，2.D.A.Knowles，Chemistry and Technology of Agrocheraical Formulations，KluwerAcademic Publishers，Dordrecht，1998(ISBN 0-7514-0443-8)，例如通过用适合于配置农用化学药品的辅助剂，例如溶剂和/或载体扩充活性化合物，如果期望，可使用乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、防沫剂、防冻剂，对于种子处理制剂还任选地可用着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂。

合适的溶剂实例是水、芳香族溶剂(例如Solvesso产品，二甲苯)、石蜡(例如矿物油级分)、醇(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮(例如环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP，NOP)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、二醇、脂肪酸二乙酰胺、脂肪酸和脂肪酸酯。原则上，也可使用溶剂混合物。

合适的载体实例是磨细的天然矿物(例如高岭土、粘土、滑石、白垩)和磨细的合成矿物(例如高度分散的二氧化硅、硅酸盐)。合适的乳化剂是非离子和阴离子型乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸盐/酯和芳基磺酸盐/酯)。

分散剂的实例是木质素-亚硫酸盐(酯)废液和甲基纤维素。

所用的合适的表面活性剂是木素质磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸、烷基芳基磺酸、烷基硫酸、烷基磺酸、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸和硫酸化脂肪醇二醇醚的碱金属、碱土金属和铵盐，此外还有磺化萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯酚醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基苯酚、烷基苯酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨糖醇酯、木质素亚硫酸盐(酯)废液和甲基纤维素。

适合用于制备可直接喷洒的溶液、乳液、糊剂或油分散体的物质是具有中至高沸点的矿物油级分，例如煤油或柴油，此外还有煤焦油和植物或动物来源的油，脂族烃、环烃和芳族烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘或其衍生物，甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛尔酮，高极性溶剂，例如二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮或水。

也可向制剂中加入防冻剂，例如甘油、乙二醇、丙二醇和杀菌剂，例如可直接添加到该制剂中的。合适的防沫剂是例如基于硅氧烷或硬脂酸镁的防沫剂。

合适的防腐剂是例如双氯酚和enzylalkoholhemiformal。向日葵种子处理制剂可额外地包含粘合剂和任选的着色剂。可加入粘合剂从而在处理后促进活性材料在种子上的附着。合适的粘合剂是嵌段共聚物EO/PO表面活性剂，还有聚乙烯醇类、聚乙烯吡咯烷酮类、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚丁烯类、聚异丁烯类、聚苯乙烯、聚乙烯胺类、聚乙烯酰胺类、聚乙烯亚胺类聚醚、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、纤基乙酸钠和源自这些聚合物的共聚物。

任选地，制剂中还可包含着色剂。种子处理制剂的合适的着色剂或染料是罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红I4、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。

合适的胶凝剂的实例是角叉菜可通过将活性物质与固体载体混合或相伴碾磨来制备粉末、用于撒播的材料和粉剂产品(dustableproducts)。可通过将活性化合物结合至固体载体来制备颗粒剂，例如包被的颗粒剂、浸渍的颗粒剂和均质的颗粒。固体载体的实例是矿物土，例如硅胶，硅酸盐，滑石，高岭土，attaclay，石灰石，石灰，白垩，红玄武土，黄土，粘土，白云石，硅藻土，硫酸钙，硫酸镁，氧化镁，磨细的合成材料，肥料，例如，硫酸铵、磷酸铵、硝酸氨、尿素和植物来源的产物，例如谷类粗粉、树皮粗粉、木材粗粉和坚果壳粗粉、纤维素粉末和其他固体载体。

一般地，该制剂包含0.01-95重量％的，优选0.1-90重量％的AHAS抑制性除草剂。在这种情况下，以90重量％-100重量％的纯度，优选以95重量％-100重量％的纯度(根据NMR谱)采用AHAS抑制性除草剂。对于向日葵种子处理目的，可将各个制剂稀释2-10倍，从而导致即时可用的制备物中的浓度为0.01-60重量％，优选0.1-40重量％的活性化合物。

可就这样使用AHAS抑制性除草剂，或者以其制剂的形式或从中制备的使用形式使用，例如以可直接喷洒的溶液、粉剂、悬浮液或分散体、乳液、油分散体、糊剂、粉剂产品、用于撒播的材料、或颗粒剂的形式使用，通过喷洒、雾化、撒粉、撒播或灌注进行施用。使用形式完全取决于想要的目的；其希望在每种情况下确保本发明的AHAS抑制性除草剂的最佳可能分布。

可通过加入水而从乳液浓缩物、糊剂或可湿性粉剂(可喷洒的粉末、油分散体)制备水性使用形式。为制备乳剂、糊剂或油分散体，借助湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂可将就此种或溶解在油或溶剂中的物质在水中均质化。然而，也可以制备由活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂和如果合适还有溶剂或油组成的浓缩物，这样的浓缩物适合于用水进行稀释。

即时可用的制剂中的活性化合物浓度可在相对宽的范围内变化。一般地，其为0.0001-10重量％，优选地0.01-1重量％。

在本发明的一个实施例中，本发明的进一步目的是处理土壤的方法，其通过施用作为组合物/制剂的包含AHAS抑制性除草剂的颗粒制剂(例如，颗粒制剂，其任选地具有一种或多种固体或液体的农业上可接受的载体，和/或任选地具有一种或多种农业上可接受的表面活性剂)来进行，特别是施用到条播机中。有利地，在向日葵的苗床中使用该方法。

本发明还描述了用包含至少一种AHAS抑制剂的种子处理制剂包被的和/或包含所述种子处理制剂的向日葵种子，该AHAS抑制性除草剂选自由以下物质组成的组，即，酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、绿磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸、咪草啶酸、甲灭草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚和嘧草硫醚。

术语种子包括所有种类的种子和植物繁殖体，其包括但不限于真正的种子、插条、吸根、球茎、鳞茎、果实、块茎、谷粒、扞插条(cuttings)、伐条(cut shoot)等，和在优选的实施例中表示真正的种子。

术语“用...包被和/或包含”一般表示，活性成分在施用时绝大部分存在于繁殖产品的表面上，尽管依赖于施用方法，或多或少的成分部分可能渗透入繁殖产品中。当(重新)种植该繁殖产品时，它可能吸收活性成分。

在植物播种前和植物出苗前，通过对种子进行喷洒或撒粉，利用AHAS抑制性除草剂或利用包含AHAS抑制性除草剂的制剂来对向日葵种子进行处理。

在向日葵种子的处理中，通过用有效量的AHAS抑制性除草剂或包含AHAS抑制性除草剂的制剂处理种子来施用相应的制剂。此处，施用率一般为0.1g-10kg活性成分(a.i.)(或者a.i.，或制剂的混合物)/100kg种子，优选1g-5kg/100kg种子，特别地1g-2.5kg/100kg种子。

下面的实例是为了说明而提供的，并不是加以限制。

抗性植物的鉴定

在Venado Tuerto，Santa Fe，Argentina的Nidera Experimental Station中，在温室条件下，播种已知抗IMI的300颗野生型向日葵群体的种子，以及对照品系HA89，B770(易感性-“S”)、BTI-M1和RHA426(抗性-“R”)。在V4阶段，以80gr ai/ha的施用率用灭草烟喷洒所有植物。处理之后两周，通过目视检查评价对所有植物的损害。S品系HA89和B770被该处理杀死。R品系RHA426表现出萎黄(chlorosis)迹象，并且R品系BTI-M1没有呈现任何损伤迹象。总的来说，野生群体中159个植物抵抗了该除草剂处理，129个被杀死(归类为S)。进一步地，在除草剂处理之后存活的159个植物中18个未表现出类似于突变R品系BT1-MI的除草剂损害症状，并被归类为R。

抗性遗传

利用一个R植物(RW-73)作为与所栽培的易感性品系HA89和B770杂交的雄性植物。以80gr ai/ha的施用率，用灭草烟喷洒来自每次杂交的10至20个F1植物，使用B770(S)和BT1-M1(R)作为对照。该F1植物中没有一个表现出与BT1-M1植物类似的除草剂损害症状。然而，灭草烟处理杀死了B770植物。

使来自杂交HA89/RW-73的一个F1植物与易感性亲本回交。并且，使来自杂交B770/RW-73的一个植物与B770回交。通过对它们当中的F1植物进行授粉获得了F2种子。

在温室条件下，播种所获得的BC1F1和F2种子，和分别用作易感性和抗性对照的B770和BT1-M1。在V3-V4阶段，以80gr ai/ha的施用率，用灭草烟喷洒所有植物。在处理后14天，将植物评价分为R、S或I(中间的)。如果它们没有表现出除草剂损伤，则归类为R，如果它们死亡或如果它们出现高度降低或萎黄，则归类为S。咪唑啉酮除草剂在RW-73中的抗性结果在图3中示出的表1中给出。

特别地，表1给出在由抗性品系RW-73与易感性品系B770和HA89之一杂交产生的F₁、F₂和BC₁F₁群体中，向日葵植物对以80g a.i.ha^-1施用率施用的灭草烟的反应[抗性(R)、中间的(I)、易感性(S)]，以及用于抗性对照的单个基因座模型的卡方测验。

由易感性x抗性杂交产生的F2群体良好地符合1∶2∶1 R∶I∶S比率，表示抗灭草烟的单个基因的分离。为了证实来自F2群体的这些结果，试验了与感性亲本杂交的F1植物，并评价所得后代对灭草烟的反应。BC1F1群体良好地符合1∶1 I∶S比率，证实了单个基因座的假设(表1)。

遗传研究结果指示，RW-73中的抗性作为由单个核编码的基因赋予的部分显性特征而被遗传。这种遗传模式与已报道对AHAS抑制性除草剂的抗性遗传控制的其他结果一致。

纯合的RW-73的除草剂抗性特性的向日葵品系的开发

上面分析的野生向日葵群体的异源和杂合条件，指导了其可用于相对于携带除草剂抗性性状的栽培品系的相对抗性水平的比较。利用标记辅助的回交，开发了非常类似于B770的抗性品系，其是所编码的RW-B。RW-B是抗性基因的纯合子，因为在施用灭草烟之后其通过自身获得的后代不能因易感性分离。

RW-B对不同AHAS-抑制性除草剂的抗性

向日葵品系：在确定AHAS抗性方面使用下面遗传的向日葵品系：两个S品系(“B770”和“HA89”)、两个对源自群体SURES(SuBL和SuRL)的SU有抗性的品系、两个对源自群体IMISUN(“Rha 426”和B770imi″)的IMI有抗性的品系，和品系“RW-B”。HA89和Rha426是由USDA发布的公共近交品系(public inbred line)。SURES和IMISUN是由USDA发布的育种群体。B770是来自Nidera的专有品系(proprietary line)。B770imi是专有品系，其具有携带抗性基因Imrl的B770背景(backgroud)。按照上面的描述获得RW-B。

方法：在20×20×30cm盆中播种来自七个品系中每个品系的八颗种子。在出苗之后，手动使植株变稀，使得每个盆中有4个植株。每个品系的五个盆用不同除草剂或剂量处理。每个实验均包括每个品系的未处理对照盆。植物于温室下在自然光条件下生长，用400W卤化物灯补充该自然光条件从而提供14h的日长。日/夜温度分别为25和20℃。在发育的V4阶段(Schneiter和Miller 1981)，用三种SU除草剂(氯磺隆、烟嘧磺隆和甲酰胺磺隆)、三种IMI(咪草啶酸、灭草烟和甲灭草烟)、POB(Bispyribac-Na)和TP(氯酯磺草胺(Cloransulam-methyl))喷洒植物。在该处理后14天，利用植物毒性(PI)按表型打分。PI是0至9的表型级别(phenotypic scale)，其是通过目视检查每个盆评估的。没有任何症状的植物记录为“0”，发育迟缓和萎黄相对于未处理对照组的水平升高记录为“1”至“4”，叶畸形和叶坏死的水平升高记录为“5”至“8”，并且具有顶端完全坏死的死亡植物记录为“9”。每个实验的PI数据通过ANOVA试验分析，平均值通过LSD试验比较。

该结果在图4的表2中给出，其示出用不同AHAS-抑制性除草剂喷洒的七个向日葵品系的植物毒性；表2.向日葵品系(B770、HA89、SuBL、SuRL、Rha426、B770imi和RW-B)对四个不同的AHAS-抑制性除草剂家族的反应。在品系平均平方(mean sum square)当中数据以MS表示，***P＜0.001，LSD最小显著差异值。同一字母的平均值表示，它们没有显著统计学差异(P＜0.01)。该损伤利用植物毒性(PI)测量。

S品系HA89和B770被施用的所有除草剂杀死。SU-抗性品系SuBL和SuRL对所用的三种SU有抗性，但被所有其他的除草剂杀死。IMI-抗性品系Rha426和B770imi对三种IMI有中度抗性，并对SU、POB和TP有高度敏感性。显著地，RW-B表现出对所有四个除草剂家族的高水平抗性。出乎意料地，该RW-B品系对SU的抗性水平与SU-抗性品系SuBL和SuRL相同，并且其对IMI的抗性水平比IMI-抗性品系Rha426和B770imi高。进一步地，在另一个出乎意料的结果中，RW-B表现出对POB和TP的高水平抗性。其他品系中没有一个表现出这种抗性类型。

等位性试验

使RW-B植物与RHA426杂交以便确定是否RW-B中的抗性基因是Imrl的等位基因，先前在咪唑啉酮抗性近交品系中描述的突变体。在这个杂交中，F₁杂交植物是自己授粉的并使其与RHA426回交从而分别获得F₂和BC₁F₁代。在V2-V4阶段，用160g a.i.ha^-1和320g a.i.ha^-1的灭草烟攻击来自亲本和来自F₁、F₂和BC₁F₁的植物。攻击之后，按如上所述地对植物进行评价。当以较低的除草剂施用率评价后代时，在由这个杂交产生的F₂和BC₁F₁群体中未观察到易感性植物，表明RW-B和RHA426中的抗性基因是相同基因座的等位基因。这些结果在图5的表3中给出。特别地，表3给出在由RW-B和携带咪唑啉酮抗性基因Imrl，RHA426的近交品系之间杂交产生的F₁、F₂和BC₁F₁中，向日葵植物对灭草烟的反应(即，为抗性(R)和易感性(S))，该灭草烟以80g a.i.ha^-1和320g a.i.ha^-1的施用率施用。

另一方面，在以较高施用率(320g a.i.ha^-1)施用除草剂之后给F₂和BC₁F₁群体评价时，可以观察到对易感性的分离。仅检测到两个表型类别，抗性类别是没有任何损伤迹象或仅轻微症状的植物，易感性表型是以与对照品系RHA426大致相同的方式和剂量杀死的。对于所筛选的508F2植物观察到的分离比率没有显著不同于3∶1分离比率(见表3)。为了证实这些结果，使F₁植物与RHA426回交，并以320g a.i.ha^-1的灭草烟筛选所得BC₁F₁植物。所观察到的分离比率(segregation ratio)良好地符合1∶1 R∶S比率，证实RW-B中的抗性基因表现出对RHA426中抗性基因的完全显性，并且该抗性基因中的两个都是相同基因座的等位基因，AHAS1。

与除草剂抗性的AHAS1单倍型共分离(Haplotype Cosegregation)

材料和方法：DNA是利用Dellaporta(1983)的方法从品系B770、RW-B和RHA426的嫩叶，以及从来自杂交RW-B/RHA426的单个F₁和F₂植物中分离的。AHAS1基因片段是利用引物p-AHAS 18和p-AHAS 19扩增的PCR(Kolkman等人，2004)。PCR产物在15μl反应液中进行扩增，该反应液含有1U Taq DNA聚合酶(Biotools)、70ng基因组向日葵DNA、25μg牛血清白蛋白(BSA)，最终浓度中每个dNTP为100μM，每个引物为0.25μM，Tris-HCl pH 8为90mM，(NH₄)₂SO₄为20mM和MgCl₂为2.5mM。该PCR程序由在94℃下持续2min的初始变性步骤，接着是在94℃下30s，在56℃下30s和在72℃下30s的40个循环，接着是在72℃下持续10min的延伸步骤构成。在60W的恒定功率下，在含有6％聚丙烯酰胺、8M尿素和1X TBE的标准测序凝胶上分离扩增产物(3μL/跑道)，持续2～3h，并通过硝酸银染色法检测(Silver Sequence^TM Promega Biotech，USA)。在凝胶相邻跑道中利用分子量标记和标准测序反应，评价每个SSR等位基因的尺寸。

结果：向日葵中的AHAS1基因呈现简单的序列重复(SSR)多态性，其允许辩别携带来自其他向日葵基因型的Imrl等位基因的品系(Kolkman等人，2004)。利用引物p-AHAS18和p-AHAS19，对含有这个SSR的AHAS1基因片段进行PCR扩增，对于RW-B获得321bp的产物，对于RHA426获得312bp的片段。利用在RW-B和RHA426中检测到的这个长度多态性变体，从而调查从使两个品系杂交得到的F₂和BC₁F₁群体中的分离。随机选择来自F₂群体的111个植物和来自BC₁F₁群体的126个植物，取样用于DNA分离，用以320g a.i.ha^-1施用率施用的灭草烟攻击，并利用这个标记进行基因分型。在该F₂群体中，30个植物被除草剂(S)杀死，并且81个未表现任何症状或表现出轻微损伤(R)。这些数据在表4中给出。特别地，表4给出在源自杂交RW-B/RHA426的F₂和BC₁F₁群体中，向日葵植物对以320g a.i.ha^-1施用率施用的灭草烟和AHAS1单倍型分离(A＝RW-B单倍型，B＝RHA426单倍型)的反应(即，为抗性(R)和易感性(S))。

对抗性所观察到的分离比率没有显著不同于对在F₂中分离的完全显性因子预期的分离比率(3R∶1S)。对AHAS1 SSR标记观察到的分离(26 A/A∶55 A/B∶30 B/B)符合对在F2中分离的共显性标记预期的分离比率(1∶2∶1)。所有对AHAS1 SSR基因分型的易感性植物对于RHA426单倍型(B/B)是纯合的，而R-植物对于RW-B单倍型(A/A)是杂合的(A/B)或纯合的(见表4)。对针对抗性分离的126 BC₁F₁后代进一步评估除草剂抗性表型和AHAS1单倍型的共分离。对抗性观察到的分离比率符合1∶1比率，如对BC₁F₁中的一个基因座的分离所预期的。AHAS1 SSR单倍型与除草剂反应的表型，64A/B∶62 B/B的表型完全共分离。易感性后代对于RHA426单倍型(B/B)是纯合的，而抗性后代对于RHA426和RW-B单倍型(A/B)是杂合的。这些结果证实了RW-B中的抗性基因不同于RHA426中的抗性基因，并且该基因的两个都是基因座AHAS1的等位基因变体。

PCR扩增和来自RW-B的向日葵AHAS1基因排序

利用Qiagen′s DNeasy 96 Plant试剂盒，从向日葵叶子中提取基因组DNA(catalog no.69181)。在三个片段中对AHAS1基因进行PCR扩增，并通过Macrogen USA直接测序。利用Qiagen′s Hotstart Taq DNA聚合酶和相关试剂(catalog no.203205)完成PCR扩增。该三个片段的PCR引物如下：AHAS1F1(向日葵公共序列AY541451的碱基对1-19处的正向引物)5′ATGGCGGCTCCTCCCAACC3′、AHAS1R1(向日葵公共序列AY541451的碱基对757-777处的反向引物)5′CGGTAACCTCATCGGTTCATC3′、AHAS1F2(向日葵公共序列AY541451的碱基对757-777处的正向引物)5′GATGAACCGATGAGGTTACCG3′、AHAS1R2(向日葵公共序列AY541451的碱基对1794-1814处的反向引物)5′TCCGCCTTTTGGGTCACTCGA3′、AHAS1F3(向日葵公共序列AY541451的碱基对1248-1269处的正向引物)5′GGTGACTAATCTTGATTTTTCG3′和AHAS1R3(向日葵公共序列AY541451的碱基对1949-1968处的反向引物)5′TCAATATTTCGTTCTGCCAT3′。

该三个PCR片段覆盖了已知赋予对IMI除草剂的抗性的所有突变位点。进行核苷酸比对，并利用色谱仪检查易感性品系B770和抗性品系RW-B之间的多态性。

向日葵AHASL1基因测序的结果

对PCR产物进行测序从而产生RW-B和B770向日葵品系的AHASL1序列。这些核苷酸序列和苍耳属物种AHAS基因的核苷酸序列(GenAccession No U16280)的比对在图1中示出。

特别地，图1示出AHASL1基因编码区的部分DNA序列比对，该AHASL1基因来自HA89(GenBank acc.no.AY541451)(SEQ ID NO：3)、B770品系(SEQ ID NO：4)、抗性品系RW-B(SEQ ID NO：5)、苍耳属物种ALS基因(GenBank acc.no.U16280)(SEQ ID NO：6)和拟南芥AHAS基因(GenBank acc.no.AY124092)(SEQ ID NO：7)。星号指示在RW-B中发现的单突变，这个碱基变化是氨基酸位置574(基于拟南芥序列)上Trp到Leu置换的原因。核苷酸序列位置由箭头指示，并根据南芥序列编号。

该比对揭示，相对于B770的AHASL1，来自RW-B的AHASL1基因具有G到T的转变。

预期的RW-B，B770和苍耳属物种AHASL1核苷酸序列的氨基酸序列比对提供在图2中。

特别地，图2示出AHASL1蛋白的部分氨基酸序列比对，该AHASL1蛋白来自HA89(GenBank acc.no.AY541451)(SEQ ID NO：8)、B770品系(SEQ ID NO：9)、抗性品系RW-B(SEQ ID NO：10)、苍耳属物种ALS基因(GenBank acc.no.U16280)(SEQ ID NO：11)和拟南芥AHAS基因(GenBank acc.no.AY 124092)(SEQ ID NO：12)。星号指示密码子574中的氨基酸置换(基于拟南芥序列)。

相对于B770的AHASL1氨基酸序列，RW-B的AHASL1氨基酸序列在由拟南芥AHASL核苷酸序列编码的全长氨基酸序列中的氨基酸位置574处具有色氨酸到亮氨酸的置换。由于这个原因，这种新的AHASL基因座的等位基因在此称为W574L。

携带W574L等位基因的向日葵杂交体与传统(野生型)杂交体和携带A205V等位基因(IMISUN性状)的那些农业特性(颗粒产量和油含量)比较。

目的：进行这个实验从而量化和对比携带W574L等位基因的杂交体与传统(野生型)和imisun(等位基因A205V)杂交体的农业表现。

材料：将品系RW-B转化为雄性不育品系，其通过使其与细胞质的雄性不育品系(cms B770)重复回交进行。在4次回交之后，所获得的不育品系称为“cms RW-B”。

品系RW-B也用作除草剂抗性来源从而转化两个不同的传统(野生型)恢复品系：R20和R54。所获得的近等基因品系称为R20-574和R54-574。

在传统的，IMISUN和RW-B来源的品系当中，F1杂交体是在大田条件(field condition)下获得的。它们的谱系和突变事件在下表中给出。

表5.杂交体4(cms B770xR54)和杂交体6(cms B770xIR152)是两个注册的商品杂交体，其分别称为“Paraiso 33”和“Paraiso 103 CL”。

杂交体	谱系	突变体等位基因
			1	cms RW-B x R20-574	W574L
2	cms RW-B x R54-574	W574L
			3	cms B770x R20	野生型
4	cms B770x R54	野生型
			5	cms B770 imi x IR79	A205V
6	cms B770imixIR152	A205V

方法：以具有四次重复的完全随机化区组设计，在大田条件(VenadoTuerto，Santa Fe，Argentina)下播种种子。每个区包括六米长的三行，并间隔0.7m。在列中的种子相隔0.30m。

在每个区中记录下面变量：开花天数、开花时的高度、产量(kg/ha)和颗粒中的油含率(％)。对这些变量进行anova检测，并利用Tuckey检测比较不同事件和杂交体的平均值。

结果：4个所记录的变量用的每个事件的平均值在表6中给出。如可以看出的，该三个事件具有类似的平均产率。该分析检测到事件间种子中油含量差异，因为带有A205V等位基因的杂交体比其他两个类型的杂交体的油含量少。事件间开花天数和植物高度也不相同，因为携带W574L等位基因的杂交体略小和早于两个其他类型的杂交体。总之，相比传统(野生型)和包括商业杂交体品种的IMISUN杂交体，携带等位基因W574L的两个杂交体的种子中表现出相同的产量和相当的油含量。

所记录变量的每个杂交体的平均值，和变量分析结果在表7中给出。

表6.AHASL1基因座的3种不同基因型(突变事件)的高度、开花天数(DIF)、产率和油含量的平均值。每个基因型或突变事件的平均值是两个不同杂交体的平均值。

等位基因	高度(m)	DTF(天)	产量(kg/ha)	油含量(％)
					W574L	2,14^a1	63,3^a	3062^a	45,8^a
WT	2,22^b	66,4^b	3523^a	46,3^a
					A205V	2,17^ab	65,8^b	3119^a	44,5^b
平均值	2,18	65,1	3145	45,6
					¹CV(％)	2,4	0,75	5,39	0,92
²MS	0,015	21,9	76845	6,58
					F-值	5,61	90,5	267	37,3
³P	＜0,015	＜0,0001	＜0,101	＜0,0001
					⁴MSD	0,068	0,64	220,2	0,55

¹相似字母指示事件之间在统计学上没有显著差异。

²CV：变异系数

³MS：事件之间的均方

⁴p：F-值的概率值

⁵MSD：Tuckey最低显著差异

表7.携带AHASL1基因座的三种不同基因型(突变事件)的6个向日葵杂交体的高度，开花天数(DIF)、产率和油含量平均值。

基因型	突变体	高度(m)	DTF(天)	产量(kg/ha)	油含量
							等位基因	±SD¹	±SD	±SD	(％)±SD
Hibl	W574L	2.13±0.05^b	63.8±0.5^c	3053±198^a	45.48±0.7^bc
						Hib2	W574L	2.15±0.06^b	62.8±0.5^c	3071±80^a	46.18±0.3^ab
Hib3	WT	2.28±0.05^a	66.3±0.5^ab	3370±311^a	47.13±0.2^a
						Hib4	WT	2.18±0.05^ab	66.5±0.6^a	3135±249^a	45.45±0.4^bc
Hib5	A205V	2.20±0^ab	65.3±0.5^b	3059±145^a	44.80±0.2^cd
						Hib6	A205V	2.15±0.06^b	66.3±0.5^ab	3179±164^a	44.28±0.3^d
平均值		2.18	65.13	3144	45.6
						²CV(％)		2.4	6.75	5.4	0.92
³MS		0.00042	9.58	58798.7	4.06
						F-值		0.15	39.6	2.05	23.04
⁴P		0.014	0.0001	0.13	0.0001
						⁵MSD		0.12	1.13	389.6	0.96

¹SD：标准偏差，后面是表示在杂交体间是否存在差异的字母：相似字母指示事件之间在统计学上没有显著差异。

²CV：变异系数

³MS：杂交体间的均方

⁴p：F-值的概率值

⁵MSD：Tuckey最低显著差异。

品系RW-B对两种AHAS-抑制性除草剂的4种不同混合物的抗性

目的：比较携带W574L等位基因的品系(RW-B)，和携带P197L(SURES)、A205V(IMISUN)，野生型(传统)等位基因的品系的表现(以药害指数评价)。

材料：使用下面的向日葵近交品系：两个咪唑啉酮易感性品系(“B770”和“HA89”)、对源自SURES群体的SU除草剂有抗性的两个品系(“SuBL”和“SuRL”)、对源自IMISUN的IMI除草剂有抗性的两个品系(“RHA426”和“B770imi”)，以及携带等位基因W574L的品系“RW-B”。HA89和RHA426是由USDA发布的公共近交品系。B770和B770imi是来自Nidera S.A.的专有品系，而B770imi具有携带用于抗咪唑啉酮的抗性基因Imrl(＝A205V等位基因)的B770遗传背景。按照上面描述的获得RW-B。

方法：在20×20×30cm盆中播种来自七个品系中每个品系的八颗种子。在出苗之后，手动使植株变稀，使得每个盆中有4个植株。每个品系的五个盆用不同除草剂的混合物处理。每个实验均包括每个品系的未处理对照盆。植物于温室下在自然光条件下生长，用400W卤化灯补充该自然光条件从而提供14h的日长。日/夜温度分别为25和20℃。在发育的V4阶段(Schneiter和Miller 1981)，用四种不同的混合物处理植物，该混合物包含两种不同的AHAS-抑制性除草剂、磺酰脲(甲磺隆)和咪唑啉酮(灭草烟)。四种除草剂混合物中每种的除草剂浓度如下：混合物A为20ga.i./ha灭草烟和1.25g a.i./ha甲磺隆，混合物B为40g a.i./ha灭草烟和2.5g a.i./ha甲磺隆，混合物C为80g a.i./ha灭草烟和5g a.i./ha甲磺隆，并且混合物D为160g a.i./ha灭草烟和10g a.i./ha甲磺隆。

在该处理后14天，利用植物毒性(PI)按表型打分。PI是0至9的表型级别(phenotypic scale)，其是通过目视检查每个盆评估的。没有任何症状的植物记录为“0”，发育迟缓和萎黄相对于未处理对照组的水平升高记录为“1”至“4”，叶畸形和叶坏死的水平升高记录为“5”至“8”，并且具有顶端完全坏死的死亡植物记录为“9”。每个实验的PI数据通过ANOVA检测分析，平均值通过Tuckey检测比较。

该结果在表8中给出。品系HA89和B770被施用的所有除草剂混合物杀死。SU-抗性品系SuBL和SuRL对混合物A和混合物B表现出相同水平的耐受性，但由于除草剂的剂量增加，例如在混合物C的情况下，达到高水平的叶坏死和发育迟缓。利用混合物D杀灭了所有植物，该混合物D具有最高的活性成分剂量。IMI-抗性品系RHA426和B770imi对混合物A、混合物B和混合物C有中度抗性，但是随着除草剂剂量的增加它们表现出损害增加。当将混合物D施用给这些品系时，所有植物都被杀死。显著地，RW-B对所试验的所有混合物都表现出耐受性，即使对于具有最高活性成分浓度的混合物。

结论：RW-B不仅对单独试验的AHAS抑制性除草剂表现出较高水平的耐受性，而且对在混合物中同时试验的除草剂组合表现出最高的耐受水平。

表8.当受到两个AHAS抑制性除草剂的4个混合物攻击时，在基因座AHASL1处携带不同突变事件的7个向日葵品系的平均植物毒性。

¹MS：均方

²p：概率

³MSD：最低显著差异

与A205V和P197L等位基因纯合子的品系相比较，W574L等位基因纯合子的向日葵品系，和易感性单倍型在整株水平下对灭草烟的反应

目的：进行这个实验，从而量化和对比携带纯合W574L等位基因的向日葵品系的灭草烟灵敏度，与整株水平下的P197L和A205V等位基因的纯合品系相比较。

材料：

表9给出不同向日葵品系的种子，其在大田条件下获得。

编码	等位基因
		B770	野生型(易感性)
B770IMI	A205V
		SuBL	P197L
RW-B	W574L

在培养皿中播种种子，并在出苗之后，将植株移植到直径为10cm的盆中，盆栽介质由等份的蛭石(vermiculite)、土壤和沙子组成。植物于温室下在自然光条件下生长，用400W卤化钠灯补充该自然光条件从而提供16h的日长。日/夜温度分别为25和20℃。在V2-V4阶段(Schneiter&Miller，1981)，将每个基因型中的10个植物随机归类为各由八个灭草烟剂量(0、40、80、160、320、480、640和800g ai/ha，分别为未处理、0.5x、1x、2x、4x、6x、8x和10x)组成的处理，和零时间生物量测定。将实验设计为随机化区组设计，其具有处理的完全析因设计(向日葵品系x处理)，和10次的重复。

在施用除草剂的那天，在每个基因型的10个植物的子叶节点处进行切割，并在60℃下干燥48小时以在零点测定干燥重量。

在灭草烟处理(DAT)后14天，维持剩余的植物，并确定其高度、植物毒性(PI)和地上干生物量。高度确定为每个植物的子叶节点和顶端之间的距离。在施用之后通过从每个样品中扣除适当的平均零时间生物量，将来自每个品系的地上生物量数据转化为生物量积累。将干生物量数据转化为每个品系中未处理的对照植物的百分比，从而允许直接在组之间进行比较。PI是0至9的表型级别，其是通过目视检查每个植物评估的。没有任何症状的植物记录为“0”，发育迟缓和萎黄相对于未处理对照组的水平升高记录为“1”至“4”，叶畸形和叶坏死的水平升高记录为“5”至“8”，并且具有顶端完全坏死的死亡植物记录为“9”。

结果：

高度.在施用咪唑啉酮之后，在易感性(B770)和SU耐受性(SuBL)品系中植物高度明显降低。实际上，甚至在较低的除草剂喷洒施用率(0.5x)下，高度从未处理的对照植物中的100％分别减少到易感性和SU耐受性品系中的35.0％和42.7％。仅在2x的除草剂施用率施用之后，该IMI耐受性品系(B7701IMI)表现出高度的显著降低，然后，随着除草剂施用率的增加，高度降低更多，接近在10x下易感性品系的同一水平(32.8％)。

相比，当受到增加剂量的咪唑啉酮攻击时，向日葵品系RW-B展现出较小的高度降低。从4x到10x的除草剂施用率，这种高度的降低仅达到未处理的对照植物的75％(表10和图9)。

表10.当受到增加的灭草烟施用率攻击时，携带向日葵的AHASL1基因座上的不同突变体等位基因的4个品系的高度降低(以未处理对照植物的百分比表示)。

¹MS：均方

²p：概率

³MSD：最低显著差异

植物毒性

在以增加的灭草烟施用率施用之后，所试验的四个突变体在其症状中表现出很大的差异。随着除草剂施用率的增加，向日葵品系RW-B仅表现出叶子尺寸的轻微减小和比对照植物浅的绿色(表11)。相比，尽管在0.5x施用率下携带A205V等位基因(B770IMI)的植物没有表现出任何损伤，但随着灭草烟剂量从1x增加到10x，它们展现出增加的损伤水平(萎黄、叶畸形和叶坏死)。从0.5x到10x的除草剂施用率，Su-耐受性和易感性品系表现出几乎相同的性质：总易感性。

表11.当用增加的灭草烟施用率攻击时，在向日葵的AHASL1基因座处携带不同突变体等位基因的4种向日葵品系的植物毒性。

¹MS：均方

²p：概率

³MSD：最低显著差异

地上干重生物量

突变体W574L、P197L和205V干重的剂量反应曲线在图11中示出。仅在以6x、8x和10x的除草剂施用率施用时，纯合条件下W574L的生物干重量相对于未处理的对照植物减少。在10x施用率下的RW-B植物的干重是未处理的对照组的78％。同时，在所试验的剂量的每个剂量下，所有其他突变体和野生型品系的干重显著不同于那些品系RW-B(表12)。

表12.当用增加的灭草烟施用率攻击时，在向日葵的AHASL1基因座上携带不同突变体等位基因的4个向日葵品系的地上干重生物量(以未处理植物％表示)。

¹MS：均方

²p：概率

³MSD：最低显著差异

结论：在纯合条件下在向日葵的AHASL1基因座上携带突变W574L的品系RW-B，比Su-耐受性和已知的IMI耐受性品系呈现出对所有受试验的灭草烟剂量的更高水平的耐受性。

与A205V和P197L突变体相比较，W574L突变体等位基因，和易感性单倍型对整株水平的甲磺隆的反应

目的：进行这个实验，从而量化和对比在纯合条件下携带W574L等位基因的向日葵品系，与携带P197L和A205V等位基因的纯合品系在整株水平下对甲磺隆的灵敏度。

材料

表13示出不同向日葵品系的种子，其在大田条件下获得。

编码	等位基因
		B770	WT-易感性
B770IMI	A205V
		SuBL	P197L
RW-B	W574L

在培养皿中播种种子，并在出苗之后，将植株移植到直径为10cm的盆中，盆栽介质由等份的蛭石、土壤和沙子组成。植物于温室下在自然光条件下生长，用400W卤化钠灯补充该自然光条件从而提供16h的日长。日/夜温度分别为25和20℃。在V2-V4阶段(Schneiter&Miller，1981)，将每个基因型中的10个植物随机归类为各个由八个灭草烟剂量(分别为0、2.5、5、10、15、20g ai/ha，未处理、0.5x、1x、2x、3x，和4x)组成的处理，和零时间生物量测定。将实验设计为为随机化区组设计，其具有处理的完全析因设计(向日葵品系x处理)，和10次的重复。

在施用除草剂的那天，在每个基因型的10个植物的子叶节点处进行切割，并在60℃下干燥48小时后在零点测定干燥重量。

在灭草烟处理(DAT)后14天，维持剩余的植物，并确定其植物毒性(PI)和地上干生物量。在施用之后通过从每个样品中扣除适当的平均零时间生物量，将来自每个品系的地上生物量数据转化为生物量积累。将干生物量数据转化为每个品系中未处理的对照植物的百分比，从而允许直接在组之间进行比较。PI是0至9的表型级别，其是通过目视检查每个植物评估的。没有任何症状的植物记录为“0”，发育迟缓和萎黄相对于未处理对照组的水平升高记录为“1”至“4”，叶畸形和叶坏死的水平升高记录为“5”至“8”，并且具有顶端完全坏死的死亡植物记录为“9”。

结果

植物毒性：在对增加的甲磺隆施用率的反应中，突变体表现出很大的差异(表13和图12)。传统基因型(B770)甚至在较低的甲磺隆剂量下也被杀死。随着除草剂施用率从0.5增加至3x，在纯合条件下携带W574L突变体的向日葵品系仅表现出植物尺寸的轻微减小和比对照植物浅的绿色(表13)。事实上，当施用4x施用率的甲磺隆时，它仅表现出萎黄和畸形。相比，从0.5x至4x施用率，携带A205V等位基因的品系(B770IMI)表现出损伤水平的升高。事实上，在2x的甲磺隆施用率下，这个谱系的几乎所有植物都被该除草剂杀死。

携带向日葵中磺酰脲耐受性的已知突变体等位基因的SU-抗性品系(SuBL)，在0.5x和1x的甲磺隆施用剂量下未表现出症状或表现出轻微的萎黄，但是然后在4x的甲磺隆施用率下其损伤水平升高，达到9分(所有植物都被该除草剂杀死)。

表13.当受到增加的甲磺隆施用率攻击时，在向日葵的AHASL1基因座上携带不同突变体等位基因的4个向日葵品系的植物毒性。

¹MS：均方

²p：概率

³MSD：最低显著差异

结果：

地上干重生物量：突变体W574L、P197L和205V干重的剂量反应曲线示出在图5和表14中。在施用除草剂之后，IMI耐受性和易感性品系表现出干重的立即降低。随着甲磺隆施用率从0.5增加到4x，SU-耐受性品系的生物量从未处理的对照植物的83.3％降低到30.3％。

有趣地，在0.5和1x的甲磺隆施用率下，RW-B品系没有表现出干重的显著降低。随着剂量的增加，观察到干重的显著降低。但是，在所试验剂量中的任何一个剂量下，这个品系表现出比其它品系中的任何一个都显著更高的干重。

表14.当受到增加的甲磺隆施用率攻击时，在向日葵的AHASL1基因座上携带不同突变体等位基因的4种向日葵品系的地上干重生物量(以未处理的对照植物的百分比表示)。

¹MS：均方

²p：概率

³MSD：最低显著差异

结论：在纯合条件下，在向日葵的AHASL1基因座上携带突变W574L的品系RW-B，比IMI-耐受性和已知的SU-耐受性品系呈现出对所有试验剂量的甲磺隆的更高水平的耐受性。

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Claims

1.一种向日葵乙酰羟酸合酶大亚单位(AHASL)多核苷酸，其中所述AHASL多核苷酸编码耐受除草剂的AHASL蛋白质，所述耐受除草剂的AHASL蛋白质包含在574位置处的亮氨酸，并且所述AHASL多核苷酸由SEQ ID NO:1示出的核苷酸序列组成；其中具有所述AHASL多核苷酸的至少一个拷贝的向日葵植物或其后代，与野生型向日葵植物相比，具有对咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧苯甲酸酯除草剂、和/或其混合物增强的抗性。

2.根据权利要求1所述的向日葵多核苷酸，其中所述耐受除草剂的AHASL1蛋白质由SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列组成；其中具有所述AHASL蛋白的向日葵植物或其后代，与野生型向日葵植物相比，具有对咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧苯甲酸酯除草剂、和/或其混合物增强的抗性。

3.一种分离的多核苷酸分子，由选自以下的核苷酸序列组成：

(a)SEQ ID NO:1示出的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列的核苷酸序列；

(c)与选自(a)-(b)中列出的核苷酸序列组成的组中的至少一个核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。

4.一种包含启动子的表达盒，所述启动子在向日葵植物中是活性的，可操作地连接到分离的核酸上，所述分离的核酸编码由SEQ ID NO:1编码的序列组成的蛋白质。

5.一种在向日葵植物附近控制杂草的方法，包括将除草剂施用到所述杂草和所述向日葵植物上，其中所述除草剂选自由咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧苯甲酸酯除草剂、及其混合物组成的组，其中所述向日葵植物具有由SEQ ID NO:1示出的核苷酸序列组成的多核苷酸或表达由SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列组成的蛋白质。

6.一种增强向日葵植物对除草剂的耐受性的方法，包括：

用包含编码由SEQ ID NO:1编码的蛋白质的核酸序列的构建体转化向日葵细胞，

使所述向日葵细胞再生为向日葵植物，和

选择对有效剂量的除草剂有植物生长和繁殖抗性的可育花卉植物，其中所述除草剂选自由磺酰脲、咪唑啉酮、嘧啶基氧苯甲酸酯、三唑并嘧啶及其混合物组成的组。

7.一种产生抗除草剂的向日葵植物的方法，包括：

使具有抗除草剂的AHAS活性的第一向日葵植物与不具有抗除草剂的AHAS活性的第二向日葵植物杂交，其中所述第一向日葵植物包含编码由SEQ ID NO:1编码的蛋白质的核酸。

8.根据权利要求7所述的方法，进一步包含选择具有抗除草剂的AHAS活性的后代植物。

9.一种产生向日葵种子的方法，包括

使第一亲本向日葵植物与第二亲本向日葵植物杂交，和

收获所产生的第一代向日葵种子，其中所述第一或第二亲本向日葵植物是包含编码由SEQ ID NO:1编码的蛋白质的核酸的向日葵植物。

10.一种生产RW-B来源的向日葵植物的方法，包括：

使向日葵品系RW-B，已经以ATCC登录号PTA-9176保藏的向日葵栽培种RW-B的代表种子，与第二向日葵植物杂交从而产生向日葵种子后代；和

种植所述后代从而产生所述RW-B来源的向日葵植物。