TW208716B

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Publication number: TW208716B
Application number: TW080101136A
Authority: TW
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1990-12-27
Filing date: 1991-02-12
Publication date: 1993-07-01
Also published as: FI916117A; NO915094L; ZA9110136B; EP0492113A2; EP0492113A3; NO915094D0; BG95677A; CA2058349A1; JPH04311392A; PL292942A1; FI916117A0; BR9105628A; IL100089A0; AU9005591A; HU914122D0; YU200091A; CS395891A3; HUT62333A; MX9102804A; IE914542A1

Description

£08?1〇 Α6 Β6 五、發明説明（經濟部中央搮準局印^ 农發明係關於编碑tU斑裡'酸令巧酵-酵素（.下文稱之為炎込g )之新潁·變寻玆形式的新頴DNA序列•此aHAS酵素是在各種不同植物及寬範園微生物經常產生之一關键酵素•正常 AHAS功能受若千不同類型救单劑的抑制；可是，由突變種 DNA序列编碼之新AHAS酵素，卽使在此種毅单劑的存在下，仍然可正常地催化起作用，所以，植物或微生物包含它們時，可使產生救单剤抗性· ' 此新績D^·序列係基於意外的氍察，將正常处认s基因序列之某些區域内一或多個#殊胺基酸删除，將會屋生—克全功能之酵素，但是使得該酵素對種種不同拥型救草剩包括咪唑咻酮，三唑駢嘧啶及磺醯脲毂草劑引起的抑制作用具抗性· 這些變異菝序列的可利用性提種不同作物植株之轉也成救革劑抗性的工具，以及提.供供用於其他類型之遺傳轉化賁驗的新頴可選擇標記· 發明背景 -救单刺在哀絷上的使用目前是普及的*雖敌有許多可利用的化合物其有效地破壞雜单，但是並不是所有救单劑都能夠選择性地標定作物植株上不合宜之植物，以及對办物無毒性•通常，必須設定化合物單純地對作物植株比對雜草較少毒性為了克服此問题，抗救单剤作物植株的發展，已經變成農業上斫究之一主要焦點· 抗毅草劑之發展的一重要方面是了解救单劑如何直生抑制植物生長，煞後操縱在作物植株受影響的生化路徑，使甲 4 (210X297公发） {請先閱請背面之注意事吼再瑱寫本頁> •装* .打· 線· A6 B6 五、發明-说明得當植物保有正常生物功能時，避免受到抑制作用，首先必須發現闞於一系列構造上無關之殺草劑化合物，咪唑啉醑，磺醢腺及三唑駢嘧啶類殺草劑的生化機制，現在已知 (Shaner等，Plant Physiol， 76: 545-546， 1984 ，美國專利案第4,761,373號）這些殺草劑中的每一個是藉由干擾整合细胞酵素，乙醢羥酸合成酶（AHAS;也稱之為丙酮酵乙酸酯合成酶，或ALS)而抑制植物生長，AHAS是胺基酸異白胺酸^白.胺酸及纈胺酸之合成所必要者。 — · 蛆 4 X W U 局 ip 請先閱讀背 S} I 事項再填 % 本頁 AH AS酵素已知存在整個高等植物中，並且.被發現存在種種微生物，例如：酵母菌，醸酒酵苺（Saccharomyces cerevisiae)，及腸道畑菌，大腸桿菌（Escherichia coli) 及鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)，在若干這些菌種中正常AHAS的產生之遺傳基礎也已經有很好的特性描述。例如：在大腸桿菌及鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimuriiiffl)。在若干這些菌種中正常AHAS的產生之遺傳基礎也已經有很好的特性描述。例如：在大腸桿菌及鼠傷寒沙門R'菌中存在有三種AHAS同功酶（isozymes);其中2 種對殺草/劑敏感而第三種則不敏感。這些同功酶中的每一' 種均具有一個大的及一個小的蛋白霣亞單位；並且經測定位置於IlvIH，IlvGM及IlvBN操縱子（operons)中。在酵母菌中，單一AHAS同功梅已纆測定位置於ILV2位置上。每一例子中，敏感型及抗型已經被確認，並且各種不同等位基因之序列已經測定（Friden等，Nucl, Acid Res. 13: 3979-3993, 1985; Lawther等，PNAS USA 78:922-928, 1982; Sqires等，Nucl. Acid Res. 811:5299-5313, 1983; Wek等，Nucl. Acid Res. 13:401H027, 1 985 F a 1 c o 及 D u η a s , G e n e t i c s 1 0 9 , 2 1 - 3 5 , 9 8 5 ; F a 1 c o 等，甲 4(210X 297乂发) 4 208710 ^ ΐν - 36 ·£、發明説明（3 ) Nucl. Acid Res. 13; 401H027, 1985 卜在煙草，AHAS功能是由2種未聯结基因，SuRAS S (J R B編碼。（雖然N-端，推定轉換區更實質上不同）但是2種基因在成熟蛋白質中，於核脊酸濃度及胺基酸濃度上有實質同一性（Lee等，F-MRΠ .1 . 2_: 1 241 - 1 248 , 1 988 )。在另一方面，芥（Arabidopsis)具有單一 AHAS基因，其也已烴完全被定序。比較高等植物之AHAS基因之序列中，顯示此序列之某些區域的高ί保留·•特別是有至少序列的1〇區保留。先前已經假定這些保留區對酵素功能是闞鍵，而該功.*能的保留是依實質序列保存而定。最近已經報導（歐洲專利0257993),具殺草劑抗性之突 | ! 變種在一或多個該等保留區中，有至少一胺基酸突變。特丨定言之，在AHAS序列中之這些特殊位置上，野生型胺基酸之某些胺基酸被置換，已證明為可忍受的，並且確實產生持有此突變，且具殺草劑抗性之植物，而仍然保有催化功 | 能。這些突變已經證明發生在煙草之SuRA及SuRB位上；類 | 似突變已經在芥及酵母菌中被單離出來。 — 現已經'意外地發現在這些”保留”區中之一個或多個區内刪除一或·多個胺基酸，不僅產生功能性AHAS酵素’而且造成殺草劑抗性。序列保留通常意味著在這些區中任何改 I 變均無法被容忍，並且會因此造成非功能性蛋白質。可是，在本案中，特別令人驚訝的是保有酵素功能，此乃由於下列事實，即此刪除不僅除去羼酵素结構姐份的胺基酸殘基，而且必定導(致殘基移位（shifting)’因而破壞含此突變之序列的表相保留。因此，提供之新穎核酸序列’在轉化殺草劑敏感植物成殺 ......................................................5t..............................ir..............................*4L 請先«讀背面之注意事項存滇«本\00 甲 4 (210X297 公潘） 5 經濟部中央採準局印製 208ϊ1〇 Α6 Β6 一 - -- _ 五、發明説明（4 :. - 箪剞啤性技物上有用•所γ .經轉化植袅提供供發展新穎抗毂草剞植物變種上有用* . _ ·· — .__發明摘要本發明提供新讓核發序列，其编碼對各種不同致单劑不敘戚之功能AHAS酵素•討論中之序列包括將在野生型AHAS 分子中編碼所謂保留蛋之一或多個指定區內的特殊按基酸之一或多個密碼子删除·這些位點的同^一性，及可删除密碼子將於下面更詳細地加以討論•此經改變DNA序列在製造毅草剞抗性技物細胞上有用，前述方法包括用一或多個本文提供之經改變序列，轉化梯的桩物細胞•或變更為，利用誘變，在含編碼较草劑敏戚AHAS之核醆序列的植物細总或種‘子中，產生缺支突變種•此種植物細跑再通遏組織培養，以便使持有般草剞抗性或不敏戚性持&之植物杀生 •因此本發明也包含植物細胞，植物組織培養，成長植物 ’及植物種子其持有缺失突變種核酸序列及其表現功钝，抗救草劑AHAS酵素者· -這些新穎抗般萆劑植物之可利用性，使作物植株在狡草劑存在下能絢生長之新方法•取代补抗性植物的生長，田聞可用本發明之抗性植物種植並且此田間循例可用救革劑處理’對作物植株沒有度生傷害•就此目的之較佳毅莩剞是咪唉咻酮，碭醯脲及三唑駢嘧啶· 本發明之突變種核駿也提供用於轉化實驗之新頴可選揮梯記•將编碼抗AHAS之核酸序列，於轉移至寄主細胞之前，接至第二種基因，並且將整個構造轉化至寄主中•然後甲 4(210X297 公发） (請先聞磺背面之注意事項再填寫本頁) .装. .打· .緣· COb/xo A6 B6 五、發明說明（經濟部中央搮準局印令推定之轉化細胞在亨抑制量救草剞_的存在下，在培養基中生長：殘存細胞斿成功地> 挺有趣之第£種基因· 應了解下列定義應用至整個專利説明書及申請專利範圍中· 1功能.，或“正常” AHAS酵素是一能夠傕化必要胺基致異白按酸·，白胺酸及纈胺酸之合成路徑的第一步·处路之保留序列或區域是在AHAS核酸或胺基酸序列中一系列核醆或胺基酸，此核酸或按基酸序列其至少有2種具有 AHAS酵素相同者•“野生型” ahas序列是存在一纥定物種之救萆劑敏成組份中的序列•“抗性”植物是—產生正常 AHAS_素，並且當在正常抑制濃度之年草剞的存在下生長時’能夠達到成熟度*如本文所使用之“抗性”—詞也意圖包含“耐受性·’植物，扣那些表型上證明不利，但不是致死之植物對毅草剞的反應· 附圓之簡明描述 (圖la及lb C序列1及2 )分别展示芥c Arabidopsis )野生型AHAS<胺基醆及核苷醆序列•圖13中，加柩區域表示螂示序列，其中被删除產生救萆剞抗性者·畫图硃基確認可造行此種)删除之特殊位點•在囷lb中，箭頭表示編瑪區之起始·) (ϋ 2 Ca-c")展示3個子代C第一代）之照）f，此子代係由用Pursui t，味丨峻| S3投草劑，於〇，，20，40 , 60 , 肋及160克/孜草剞（克/公頃〕胡後喷霧處理後，用含茶AHAS之Trp 574 缺失突種之結搆轉化的基因突變蛭草植物C 10 - 1 )直生的•所有3照序是於嘖霧之後25天所照一請先閱讀背面之注意事壻卉琪宵本頁) .裝· •打· •蛛·· 甲 4(210X297 公尨) r 〇8:加 A6 B6 五、發明說明f 經濟部中央搮準印的t在所有照序中，兮照裨物Γ野生型救草敏戚性煃萆栽培品種，Wiseonsin 38〔 w、j是在前排、 ⑻网8錡照組及10_1自交種，代表對照/及自交基因突變煙草子代•於0克/公頃Pursuit，WQ8及].Q-1兩者看起來_似•於1〇克/公頃，网g植物當與.j比較時略微抑制其生長；可是，於2〇克/公頃開始，切明生長幾乎无全受抑制•於8〇克/公頃，1〇_丨植-:物生長顯示略微受抑制而於16〇克/公頃時，10—1植物生長明顯地受抑制· (b) 艰8對照组及oxl(卜如先前所描述者· 〇χ1〇_ι代表^8作爲母系親代（(》而作爲華枣親代•結果很栽似在10—1自交照净所看到者· (c) W38對照組及i〇-lx〇~V\^8如先前描述者· 1〇_1χ〇代表 10-1作爲母系親代而TO作為雄系親代(〇) · “果很顛似在 10-1自交照净中所看到者，惟在此般单剞抗性特色之光隔難中可在10-1子代看出·· 圖3詳細説明PurSuit ,萌後施用對埵箪幼苗生長之作用，.由杈物高度测量之· C*代表對照纽（教戚親代栽培品種 )植物之平均值，而每—隨後割線代表個別基因突變子代· \ Λ \ 〔圓4孑細説明咪嗤琳^同救草劑pur8.ui t對由用τ印574缺失〔DEL〕轉化大腸桿萄，Trp EM取代〔SUB〕及用野生型〔WT〕 AHAS序列轉化之大腸捍菌衍生酵素的作用·〉围5詳細説明磺醢脲救草劑GUan對由大腸徉菌轉化突變型之作用•縮寫如圓4· 請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁 .裝· •打· •線.

A6 B6

2〇B 五 '發明説明（ /圖6説明味唑咻酮毅萆劑Pursuit舞由大腸桿菌轉化突變 I ' * _ 、-. - 1型羊取之AHAS酵素的作用· > ‘素是由大勝'桿菌用Ser 653 缺失〔DEL〕#化之大腸桿菌，用Ser 653取代〔SUB〕轉化之大腸捍茵，及用野生型CWT〕AHAS 序列轉化之大腸样茵衍生的· P … 〔圖7/^明磺醯脲救草剤Gle如，對由大腸捍茵轉化突變型羊取之AHAS酵素的作用•縮寫如囷7〔者 (圖8説明味唑咻酮致草劑Pursuit對由用会具有Trp 574缺失之突變種界AHAS等位基因之土壤桿_屬C Agrobacterium ) 菌株，由煙草植物衍生之AHAS酵索蚱作用本發明之詳細描述苦干有機菝包括酵去茵，大腸桿菌，芥藍CBrassica 1，芥CArabidopsiO，钳策及煃草之AHAS基因的免整核萼蟑序列先前已被揭示C Mazur等，前文· Lee等，EMBO J · 7 :1241，1988〕·而且，已經注意到殺萆劑抗性與AHAS序列中之一或〆個突變有關：特別是抗性已經被注意到與此序列之4某些特殊胺基醆的取代有關* C歐洲專利259四3 ;

Yadav 等 PNAS USA 83 : 4418 - 22，1986 : 3玨1；1|3317811等，1^11(：1

Acids res. 18.'2188, 1990 〕* 可是，巳經意味著 C Hartnett 等，在 Managing Resistan.ee To Agrichemicals ,第 31 幸，PP. 459-473，美國化學學會，1"0年版：欧洲專利2M 793 )其中授予抗性發生之突變的這些保留區，一般必須維抟，以保存酵素功能· 目前意外地發現這些序列之保留明顯地益不是對此分子甲 4 (210X297 公发） {請先聞讀背面之注意事項再瑱寫本頁 .装· •打· 經濟部中央橾準局印奴 (δ；·. A6 B6 五、發明說明f 8, 之傕化功能必要者·在本發.明的發展溯間，利用芥AHAS密 - -. - 碼區之位點引導誘變，以產、缺失突變，其中一殘基先前經證明爲可取代者，再自此序列删除•一殘基删除明顯地破壞此區其中它們發生之保存特性•但是，此產生之缺失突變所有都保留AHAS功能，也顯出般草剞抗性*特别是進行Trp 574 ，Prol9设Ser 653殘基之單一删除，Pro 197及 Ser 653之笔重删除，以產生完全功能，：抗段草劑植物•本文所有胺ί酸之計數是以齐序列爲基碑-可是，要了 — 解在整個專利説明書及申請專利範圍之中，參照在芥序列- 中缺失之特殊位點，其意思包含在具有AHAS基因之任何其他物種的AHAS序列中之對應位點· 就這些數據來看，顯而易見的、是這些AHAS分子之抗段草剞有關區域的保留益不是催化活性的關鍵，而且在一或多個“保留”胺·基酸序列中，一或多個胺基酸缺失可容易地破此酵素接受而且贈與該植物役草劑抗性•本發明包含 DNA序列其'中對野生型序列而言，已經進行一或多個删除 - *- ，.此删除ί不改變所得之AHAS酵素的催化功能，但其授予二毅草剞抗性•此種缺失突變包括一或多個密碑子’其编碼如歐洲專利257 793中所定義之所謂“保留亞序列”之密碼子的删除，惟並不受限於此•這些是在芥MS中編瑪按基酸 119-122 ， 194-197 ， 20卜208 , 255-257 , 348 -353 » 373-377 » (請先聞請背面之注意事ifi再填寫本頁> .装. ，打· .綠. 經濟部中央揉準局印甲 4(210X 297公沒） —10 — A 6 B6 五、發明説明（9 及569-578之DNA序列。此外，另一"保留序列”是650-653 ，其中之取代已經被描述，且其中之刪除可用於導致殺草劑抗性。一個密碼子、多於一個密碼子，及最高達上述 ”亞序列”中之所有密碼子的缺失被認為是在本發明之範圍内。較佳是編碼突變棰之密碼子缺失，此密變體具有至少 —選自包括胺基酸 120, 121，197，205, 256, 35 1， 376, 57 1，574，578及653之殘基位置之缺失。最佳是編碼19 7 , 去7 4或6 5 3缺失之序列。

I 雖然上述缺失所代表之區域'其中之變異、已知是能被容忍的，可能就分子之實質”番活性（flexibility)”來看，其他刪除也是可行的。例如，除了那些上面略述者之外，其他AH AS酵素之明顯”保留”區也存在。並不希望受限於任何特定之理論，現在似乎大部份這些保留區代表殺草劑之结合位置*而非與該分子催化活性有關且需有必要结構保留之位置。於這些位置上有一或多個胺基酸缺失*在理輯上應可防止其與殺草劑結合，因此，可防止殺草劑干擾 AH AS活性'。使用此理論，現有闞於”保留” AH AS序列之知識 (參閱里如：Mazur 等，Plant Physiol..85:1110-111 7.， 1987)及已知技術，例如：位點特異性突费，設計具有額外缺失之突爱體且可能具有殺箪劑抗性，將成為例行事務。推定之突爱種可再藉由在抑制有效董之主題殺草劑存在下生長而篩選，Μ測定是否得到殺草劑抗性。 ns. 濟部中央橾準局印誠如所有蛋白質，此功能AH AS酵素有三次元結構，其為該姐份胺基酸之線性排列的最後结果。胺基酸之側基的相互作用，產生蛋白質之次级结構，而且再叠，専致產生蛋白質之三级結構。一既定蛋白質之特異”播築（architecture)” 其最終是由此胺基酸序列產生者，可為此蛋白 -11 — 一請先M讀背面之注意事項再瑱艿本11 甲 4(210Χ 297'αΆ 五、發明說明（l〇 A 6 B6 雉濟部中央揉準局印 Hi 質之功飩的關鍵•因此，聆基醆之罝换保留此蛋白質之全部結構的完整性，而胳基酸今删除有效地破壞此結搆之々整性ϋ且可期望顯著地改變蛋白質之三次元结構益且，二此將會改變分子之功能•所以，從濟在傷害來看，其可由删除引起，尤其令人W的是所得之分子保有其三次元結構之足約部分，不僅保留值化功能，而且引起毅草刹抗性 β ，那些熟▲於此技藝者將認知i發明之缺未突變種不受限於DNA或酵素之來源•㈣、本實驗設計主要利用茶應基. 因序列，類似突變可循例在任何持有蜱一種基因之有機迓例如：其他高等植物，酵母菌，大腸桿菌及其他微生物獲得-在所有此已知序列之中，在野生型雜s基因之相似性大至使其以例行實驗之物質，在芥以外之^^序列中屢相同突變種V或變更爲可建立含與得自其他來源之_基因的未改變部分重組合之芥AHAS基·因的缺失突變種部分之崁合基因· _ •本文所镌述之新穎基因麵型可使對一或多種類型毅草劑_ 具抗性•.如巳經建立好者，綱是幾種不同類救草劑之作用點，^ 咪唑啉酮，磺醏脲，三唑駢嘧啶，胺磺醏脲及磺醯羧醯胺至於由胺基醆置換而授予之救草剞抗性，由此種突變產生之玟草劑抗性可對特定般草剞具選揮性，或可對多於一種以上的救单劑具交又抗性•例如·： Trp订4及 653之删除，產生對咪唑咻酮及磺瞇脲兩者之交叉抗性· 可疋，一熟練於此技藝者，藉由在例如·· ~有咪唑啉辆，甲 4 (210X297 公发） ί請先¾¾背面<注意事項再填.¾本页」 k. *r. -sf· -12 - 20BVi〇 A6B6 五、發明說明（11 > 經濟部中央搮準局印裝或^’有磺醏脲之存在下分開辉選並且黹殘存之植物單.離， • · . < · _ 就可容易地決定任祷特定突變鮞4特異性•、交叉抗性可藉 »· — ·二. - 由在多於一種救草剤的存在下生長測定之*本發明有用之救草劑類螌祓描述在例如：美國專利案4· 1肋· 487 : 4,201，565 :4,221,586 ； 4,297,128 ： 4,555,013 ： 4,608,079 ； 4,638,068 ：4,647,301 ； 4,650,514 ; 4,698,092 ； 4,701,208 ： 4,709,036 :4,75 2,323 ； 4,772,311 :及 4,798,619 :’美國專利案 4，1?7,4〇5 ；4,435,206 : 4,424,703： 4,417,917 ； 4,398,939 ： 4,394,506 :4,391,627 ； 4,383,113 ； 4,378,991 ： 4,372,778 ； 4,371,391 ;4,370,480 ； 4,370,479 : 4· 369,320 C # 酸腺）· 於此時，AHAS經證明不僅存乒各種不同植物，而且經謹· 明在寬‘範圍之基本上不相關植物，例如：玉米，芥藍，煃草，亞麻，芥，及甜莱上是決定投单剞敏戚，i之一關啐位點 c Stougaard 等，Mbl· Gen. Genet. 219 : 413-420，1989 : Jordan & McHughen, J. Plant Physiol. 131： 333-338, 1987； McHughen, Plant Cell Report 8： 445-449, 1989 ) ·然後如上面所註明者，可铯i接在有趣之植物中，藉由已知诱變枝街，使產生逋切之突變· C 參閲，例如：Maniatis 等，Molecular Cloning，一實驗手册，Cold Spr丨ng Harbor實驗室，1982 ;及下文if 施例I ) ·可是，通常.用一已知及單雜DNA序列，將更宜於友生轉化植物，此一 DNA序列包括必要之缺失》例如在本案例中描述之芥缺失突變種·'含於574及6M位之缺失突變種之質粒，已經於1990年12月6日，分別以接受登記號碼 ATCC 68488 及 68489寄存在 American Type Culture Collection {請先KI讀背面之注意事吼再填寫本頁 •装. •打. •綠·

五、發明説明ί 12 * _R〇ckvi 1 Ie, MD · . . . 本發明之單離AHAS DNA序-列V .九神^， -τ夕」1用於轉化榡的作物植株，藉以提供救萆剞抗性，而未必要餚瘳β Η ^ ± ★ π琦變*目前存在有寬範圍技街，可用於達到用賴職以錢接轉化高等植物，而藉此任-方法，可將此㈣序卵人寄主基因組，並且由其于代穗定地遣傳，此涵蓋在本發明之内·—此種方法之詳細描述，將提供在下列實旄例中< 藉由使用載體可達到植物細胞之間接轉化•達到轉化之 —普通於法是使用根癌土壞以f細如㈣脑tumefacien )，辨外來基因導入梯的植物細胞·咧如：在本案例中，將突變種AHAS序列插入在τ卜質粒_中含側翼序列的質粒載《中·熬後將贫粒轉化進入大腸桿菌•在此菌株中三親株雜交，一含消除T卜質粒之土壤样茵菌株其含，性功飩者，必須將含T-DNA序列之AHAS .轉移進入檁的植物之杀色ft，並且將含一質粒之第二大腸样菌菌株其含一質粒具有必須咸與得自大腸样菌之g結搆轉移至土壤样菌之序列携帶出去·一重组合土壤桿菌菌株，含此必要序列，供用於植物轉化，以侵染葉序·葉片在選定培養基上生長並且經確認成功地轉化再生種•田收之植物當在般革刹存在下生長時，對敌单軋之作用具抗性•其他植物載菝例如 .植物病毒，也提供—種供外源DNA轉移之—可能工具„ 也可使用植物細跑之菹接轉化，取代載菝的使用•典型，將梯的植物之原生質髖放在被轉移DNA存在之培養基中，促進原生質K吸收DNA之剞，被吸附在其表面上•關於甲 4 (210X297 公发） OBVio Α6 Β6 經濟部中央抹準為印焚· 五、發叼說明（13 這點有用之翻是聚？二薄，或，鱗酸約.. - · ·· 或變更爲藉疋lectroparation—可鈿激DNA吸收•在此方法中 ’電腺衝是Θ於打開原生質體細胞膜内之暫時孔珐，在圍繞溶液中之DNA再經孔味引入細跑·同樣地，可使用微注射將DNA S接遞送至細胞，較佳 < 接進入細胞核，每一前述技衡中，在培養基內之枝物細胞發生轉化•轉化事件倂發後，植物细胞必須再生成整個植物*由愈侮組織或原生質《培養之成熟植物的再生技衡，現在爲許多不同物種所熟知者（參閲例如；· Hanbook of P丨ant Ce丨1 Culture ,vols 1-5 , 1983-1989 McMillan，Ν·Υ·》·因此，—旦達成轉化’在此技藝之知識以內，由經轉化植物细胞再生成熟植物-' 變更方法也是目前可利用者，其未必需要板用單難知孢所以》使甩再生技街，以達到轉化.·這些一般稱之為“ 彈道”或粒子加速”方法，其中DNA塗及之金屬粒子藉火禁充電 Klei II 等，Nature 327 : 70^73，1987 )或故電 C 歐· 洲專利公告270 356 ：)推入植物細胞•以此方式，培養中之植物細絶或植物絮殖器官或細胞，例如：花耠，可用有趣之DNA序列穩定地轉化* 本發明可應用至賁質上任何麺型之植物，單子葉及雙子葉植物之轉化•作物植株中供此轉化成狡草劑抗性被涵蓋的是玉米，小麥，水稻，级，戾麥，大麥，高梁，紫苜蓿，柑策，芥藍屬，蕃茄，胡椒，大豆，蛭萆，甜瓜，南瓜，馬鈐薯，花生，豌豆，棉花，或可可•此新頴序列也可甲 4(210X297 公发） • - - • •·*··φ··*··φ*········*···*··*·····^. *········*· ·········♦·*····♦············*·······Α >···**···«·*·*·· 線：…：ν {請先閱讀背面之注意事巩再填寫本贾> 20SU6 A6 B6 M.濟部中表梂準局印¾ 五、發明説明（14) 用於蛘化裝飾物種例:沬.塊，及喬冰種额例如·•松樹β 本發明之，顆序列也可使1妙爲在植物邊傳研究上之可選择之操記*例如··在植物轉化上，編瑪救草剩抗姓之序列可·接至用於轉化梯的毅草劑教戚植物細胞之有趣基因上 •此结構包括將有趣之基因及抗軚草剞序列兩者導入植物細胞’此植物細跑再於抑制量之狡草刺的存在下生長•此種處理存活之植物細胞可推测巳取得抗性基因以及有趣之基因•所以，推定之轉化突變型是容易確認的„本發明將藉由下列胙限制性實施例進一步加以説明》货施例I編碼芥AHAS之基因祖無性系的單離一包含芥AHAS之啓動區，遏渡肽及一部份成熟密碼區之 2.1 kb EcoRI 片段籍銬口轉譯 C nick translation )標定吟 C Maniatis 等，jVio丨eculer Cloning ：—.赏驗手册，Cold Spring Harbor 賁驗宣，Cold Spring Harbor, Ν. Υ· 1982 )並且利用作為雜交探針，以辉選由擬南界〔Arabidopsis . thaliana )深色 ft ‘組 DNA 製得之基因庫（Clontech，Palo Alto, CA ) * 滅紙於 42 °C，在 β X SSC，5 X Denhardt 氏溶液，50mA 磷酸鈾，pH7.2 ，0.1%SDS及100後克/毫升變性鮭魚精蟲DNA 中雜交24小時·濾紙於.60 °C，在1 X SSC及0.1 % SDS中洗幾次•六個重組合噬筠If C A 22，A 31，A 42，A 52， A72，A83 )被分無作爲推定陽性•這些噬肩技經噬純化並且於低多重性下，用大腸桿菌菌株k8〇2，在液《ΝΖΥ 肉汁（NZCYM是10克NZ胺，5克氣化钠C NaCI〕，5克酵 {請先聞讀背面之注意事吼再填寫本頁 •装. .打. •線· 中 4(210X297 公发） —16 — Α6 Β6 蛆濟部中央捸準局印五、發明說明（15

母本取物，1克酪蛋白胺基,酸，2.克_破駿鎂七水合物及1〇毫升 1Μ Tris 'HC1，ρΗ7·2-' 中，依 Maniat'is 等，前文所描述方法侵篇*液嫌培養基於37 °C，用固定振燙（300 rpm )培-養遏夜*取50毫升懸浮液藉由添加固體氟化纳及固體聚L二醉CPEG)配成1M NaCl及8 % PEG ·此懸泮液於4 °0培養遏夜，使噬菌蹬沉激·*此噬菌雅經由於18,000 X|麴心2〇分鐘使成九•將此丸再懸浮在20毫;升ΊΜ缓衝液（10 nM

tris - HCI，pH 7·5 ; 1〇πΜ MgCl 2 )，放在 CsCl分段梯度 C 4.8 M CsCl，4.0 M CsCl 及夺·2Μ CsCl )上並且於 50,000 X g，在SV\€0摄動斗式轉子內雜心1小時•自4.0 / 3.2M CsCl 界面取出道菌技蒂，放_入I·5毫升Eppendorf管中，此噬菌ΊΚ藉添加1趙僉甲醯胺使溶解並且於室溫培養3〇分鐘•籍由將此溶液配成lOnM Tri s七C1 ，pH 8.0及lnM Na 0- EDTA间收DNA並經由添加2誼積耽涔已珥使DNA沉澉· 噬菌《 DNA經離心坷收之，用移洗後，再懸浮在xe 緩衝液 C Τέ緩衝液是 ι〇πΜ Tris-HCI，pH 7·5 ; InM Na2-EDTA ).·經此化PNA循例用笨酚：氣仿：異戊咩c 24 : 24 : 1 )萃取一至幾次，加G醇使沉澱，並且於用各種不同限制酵素消化之前，再懸浮在5〇 -咖微升XE緩衝液中· 得自六個重組合噬菌之DNA製品用各種不同的限制酵素消化並且藉由經i %瓊雎糖凝膠電年使溶解·此DNA轉移至硝基殲維素（Southern )且對代表21此Eco RI序段之 3*S C成熟密瑪之過渡肽及5*部分）的故射性梯定之9〇〇 bp Ncol/EcoRl 峥段雜交（於 gjyc ，在 2X SSC , 5X Denhardt 甲 4(210X297 公廣） ....................................一 ............k.................…一 ............：#*. (請先閲讀背面之注意事项再填寫本頁) —17 — 經濟部中央抹準局印裝 20咖 A6 _B6_ 五、發明説明（161氏篸液，50fflM磷醆鈾，pH7.2，0.1 % SDS及2)0微克/毫升 , · · * _ 變性鮭魚精蟲DNA中，.雜交与Ψ時）·此濾紙於65 °c，在 0·5 X SSC及 0.1 % SDS 洗 2 次· 900 bp Ncol /EcoRr 净段雜交至A 42及A 52兩者之5.5 kb X l?a丨及2.1 EcoR丨；f段》這些數據與有關編碼芥AHAS之基因組序列的無性系及特性描述之已發表資料一致 C Mazur 等，Plant Physiol, 85 : 1110-1117 ，1987 )- ' 經選擇之噬_ K A 52供進一步分析β A 52之5.5 kb X bal 片段自1 %瓊脂糖凝孩單難出來並且經依製迨商建議之IB[ 電溶雒設計纯化之•此5.S kb X bal片咚經G醇沉殿並且再懸浮在dd H2〇中•將這些片段連接至X ba丨經消化-PSK㈠質粒 DNA C 購自 Stratagene，La Jolla，CA) * 此净段在 14 〇C ，以20微升體積，藉剪面Mani ati s等所描述之方法連绎l6 - 24小時，接著培養後，取2〇微升反應體積，用肌脱Tris _HCI，pH 7.2稀释至》0微升*此樣品的25微升再用伽虛 Tris- HCI / pH 7.2稀釋成B0微升並且用BO微升適任HB 101 細抱〔正確地依 Morrison ( Meth Enzymol· 68 : 32卜331，1979) 所描述之方·法製備之〕培養*此質、粒/大腸桿茵轉化淡合物在冰上培養20分嫂；轉移至42 &，培養2分鐘；室温培養10分鐘；隨後立刻添·.加1毫升(LB'肉汁是每升10克bact0_ t ryptone ; 5克酵母羊取物ί 5克氣化纳及1〇毫升Tri s -HCI，pH7.2 )並且於37°C再培養20分鐘*在此工作中使用之DNA質粒無性載趙携帶授予胺苄青微素CampiclUin ) 或卡那微素（kanamycin )抗杜之基因β所以，將200微升 {請先閱讀背面之注意事填再填寫本頁) .装· .打. •緣· 甲 4 (210X297 公发） —18 — ΟΒ^Ιύ A 6 Β6 經濟部中央揉準局印裝五、發明説明（17 ) 每^•，化現合物if接接種真.LBamp/或—LB.kari.片上（DO微克 /微升個別抗生素）if:且依||4大小，於37' °C培姜12 - 20 小時· 將茵落轉移至毫升LBamp或LBkan益且於37 °C，用固定振盪培養過夜•小規棋質粒DNA製品是藉前面Maniatis 等描述之鹼性溶胞方法之小量修改被備之-·循例，取此3 毫升過夜培養液的400微升，在I.5务升Eppendorf 管中難心使成丸狀並且再懸浮在150微升GTE溶液中（GTE溶液是 5〇πΜ -策萄糖：25nM Tris- HCJ，pH 8.0 及 ItoM Na 2_EDTA ) 並且在冰上培養20分鐘，隨後於規定Bf間間隔添加3〇〇微升鹼性-SDS溶液及200微升_5MK+/3M OAc **最後之0似丸再懸‘浮在40微升在TE緩衝液中之50微克/微升RNAs e A 中"取出15微升質粒DNA供限制消化β 2個ΐ粒，PAC3〇l C 5* 73·〕及 PAC302 (3*--75* )，代表含 5.5 kb X bal 沣段之結構，速接至PSK㈠之X bal位點** PAC301及PAC302之進一步限制分析，確認存在编碼芥^HAS之基因組序列的啓動區，_過渡肽，成熟密碼區及3·朴辦譯區C前面Mazur等）* f施例I · 芥AHAS密碼區之寡核萼駿位點引導誘變 ⑻pAC301之單股模板的製備一將此質粒PAC 301轉化至大腸桿菌菌株，XL- 1 C Stragene ) ·由此pSK㈠“嗤菌趙質粒（Phagemid )”基礎結構，依製迨者原報告產生單股PAC 301模板•循例，將3毫升SBamP過夜培養液洛加至含50 毫升SBamp之無菌三角瓶中C SB是每升含35克細菌的口1〇加請先閱讀背面之注意事得再填寫本頁) -裝· ，打· •線· 甲 4 (210X297 公;«) —19 — y-N ** * ·'Obv A 6 B6 經滴部中决秣準局印繁五、發明説明（18丨、 - · ，容克酵母萃取物，5克Naqi及10毫升谓Tn· s _HC丨，pjj 7·5 )益且於37 »C，—甩固定—振—去(3〇〇 rpm )培養度至此培養液達到0Deoo是〇·3為止•此時培養液用輔助噬_體 ,R 408 c i X #噬菌菝）培養並且於3〇〇 rpm，37γ ，激烈10。振盪速續培養過夜•細茵於1〇,〇〇〇 x g離心10 分鐘，使成丸狀•將此細菌九.丢素並將此含單股pAC 301 棋板之上層液（大約45毫升）於4。〇貯^存菹至使用•上層竦循例至多使用一個月，供單股噬茵嬗質粒（phagemid )槳備用•單股PAC 301噬菌體哭粒DNA之小规模製品r i.2 毫升）》基本上依製迨者C Stratagene )描述之方法製備之 •此噬菌菝藉添加300微升3·5 Μ醏酸接，PH 7.5 ; 20 % PEG霉液，使沉澱下來》此溶液在I』毫升Eppend〇rf管中混合好it且於至温培養20分鐘•單股唆菌技洛由在Eppendorf 微離心管中離心20分鐘使成丸狀•將本層液傾析出來，此丸乾燥後，最终再懸浮在300微升TE緩衝液中•噬菌技藉添加2〇0微升笨阶：氣仿：異戍醇C 24 : 24 : . 1 )並渦動 1分鐘使其溶解•此步驟重復1次，隨後用氯仿••異戊移 C 24 : 1 )萃取2次以上•最终水相i辱沉澉c 1/10 K積 5M K+/3M oAC及2K積酵），用7〇%匕醇洗後，再懸浮在20微升TE緩衝液並且轉移至新鲜i.5毫升Eppend〇rf 管中· (c)寡核菩酸之製備一所有塞核替駿都構自New England Biolabs ·寡核替酸被利用於導入⑴於芥密碼區（Trp— > Leu )之Trp 574殘基之胺基酸置換及⑵於Trp 574胺甲 4(210X 297公沒）請先聞讀背面之注意事項再填穹本頁) .^· •打· •線， 20871ο Α6 Β6 五、”㈣19: 基竣垮基之胺基酸缺失· ，」 » · 請先聞讀背面之注意事項再填寫本页)

Trp 574 —> Leu .置換… ' _ ，

V M Q W E D R 野主型 5，-GTT ATG CAA TGG GAA GAT CGG_ 3 *

V M Q L E D R 突變種 5.-GTT ATG CAA TTG GAA GAT CGG-3· C2卜mer)

Trp 574 缺失，—

V M Q W E DR 野生型 _ 5*-GTT ATG CM TGG GAA GAT CGG-3*

V M Q E D R 突變種 5 · -G GTT ATG CAA——GAA GAT CGC-3* / C2Hmer) 20〇奈克之每一寡核苷酸於雜交至PAC 301單股模樨之前，進行激酶反應· 40微升反應《積包括50 nM Tris-HCl， PH 7.5； 1〇πΜ MgCIg» 5〇nM DTT » O.lnM 精脒 C spermidine ) 蛆濟部中央橾準局印裝及0.1 πΜ Νά 2-EDTA ·此反應經由添加10箪位T4多核萼醆連.接螓（Pharmacia：)起始並於37 °C培養30分鐘•此反應藉由將反應混合物熱至90 °C維持3分鐘使反應终止•此激酶反應物的一半添加至整S 20微升pAC 301單股製品並且於65 °C培養10分鐘，以促進雒交*於此40微升激酶/寡核萼醆混合物添加6微升InM dNTP*s ，6微升10 X連接酶緩衝液 C 500 mM Tris-HCl，pH 7.5 ; 7〇noM MgCl 2 及 10°°^ DTT ) » 2 微升 IOieM rATP，5 單位 Klenov DNA 聚合酶 C Pharmacia ) ，8單位DNA連接薛（Stratagene )及4微ft* d dH^O ·此软甲 4(210X297 公沒） -21 - A6 _B6 五、發明說明（20) 合蜂/連接反應於室温培養3小時•此瀑合物的一半用於 , . 轉化適任大腸桿菌XL-J 細—胞^將此轉化混合物铺在LBamp 、- —-- 净上並於37 ΐ培養過夜*轉化突變種以梅格方式·再劃線接種至新鮮LBamp片上•菌落篩選藉雜交正確地依Stratagene Technical Service 所描述之方法 C 1988 年 6 月 / pBSI Exo/ Mung Bean DNA Sequencing System )進行之 * 兩種寡核夺酸藉激酶交換反應標定32P C 300奈免寡核替酸在40 WCi S32p_ATp之存在下，利用先前描述之激酶調整）·未參入之32p_ATp 雇由此激酶反應物經_2〇%丙烯醯胺/?M脲凝釋·電泳去除之•此放射活.性帶相當於21 -mer 寡核苷酸，用剃刀；f自凝應·切開並且藉⑴Maxam及Gi lbert4l打碎及漫清方海使溶離C PNAS USA 74: 560 - 566，1977 )或⑵經IB[ 經濟部中央搮準局印裝 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 電溶離設計電溶離•經純化放射性標定之寡钕替酸於朴嚴緊雜交條件C 37 °C雜交24小時，在6 乂 SSC，5 X Denhardfs ，Na-P，pH 7.2及—500微克/微升小牛胸腺DNA中雜交）雜交至硝基織維素_落層•濾紙於室孟，在6xSSC 及 5ftriVI Na-P ，ρΗ7·2 洗一次，再於 37 °C，在 6XSSC 及 50 πλί Na-P，· pH7.2洗一次《最後，濾紙再於60°C在3M氣化四甲接，5〇nM Tris七C1，ρΗ7·5 ’ 2nM Nag- EDTA 及 / 毫克/毫升SDS中，以15分鐘間隔洗2次· 一具完全驗基對鹼基雜交配對C郎突變種寡聚物對突變種噬菌捜質粒）之 21- mer寡核萼酸於60 °C未洗去，無噬菌ft質粒，而一略微錯誤82·段C卽突變種寡聚物對野生型噬菌椬質粒〕被洗掉•推定陽性由黑始LBamp片割線至一新鲜LBamp沣。自每一再割線推定陽性之轉化突變型，再以一桃格模式再割甲 4 (210X297 公发） -22 — A6 B6 £08你五、發明說明（21 > {請先聞讀背面之注意事吼再填寫本頁) 線ϋ且重複Λ菌落雜交•多二次陽性者透過Trp574密碼區經DNA序列分析再確認之乂 Sanger等，PNAS USA 74: 5463- ，-··.:· 一-

5467, 1977) * 2 個陽性突變種，PAC 324 ( Trp574 —>Leu 取代）及pAC 325 C Trp 574缺失）經選揮供進一步分析-實施例I 煃草之土壤桿萄嫖介轉化 — ⑻載fit之建立一自ClontecI^得載《及"L土壤样_菌株•質粒pB丨N19是一大腸桿茵/ 土壤样菌二往復性载髖，其持有 T卜質粒T-DNA，一種多連結子之左及右邊緣序列，在大腸样_及土壤桿菌兩者之複製功诜之R_K2細_起始，及一增與卡那敬索抗性之基因C Beyan，NuCl，Acids Res, 12 : 8711 -8721,,1984 ) * 質粒 pAC 324 芨 pAC 325 用 Xbal 消化並且 •打· 線· 經1 %瓊脂糖凝縢電_·含PAC324及PAC325 之個别寒變之5·5 kb Xbal序段依先前描述之方法單離•質粒pB【N19用 Xba丨消化並且以一分開連接反應，用得自PAC324及pAC325 之5.5 kb Xial序段培養•此連接混合物轉化至大勝桿_ XL-1.細胞中並且經一藍/白色選揮，在LBaix序（LB序上有耽微克/微> 胺卡青徵素，80微克/毫升X-Gal及 [PTG )上遘擇陽性轉化突變種*小规楔質粒製迻，限制消'化分析及瓊雎糖凝捧電泳，依先前描述之方法進行，以確定陽性轉化突變種•其中四個PB【N19基礎質粒構造，pAC 348 - PAC349 (在 pB 丨N19 中含 Trp574--Leu 缸代之 5.5 kb Xbal片段兩取向〕及pAC35hpAC 351 C在PBIN19中含Trp 574缺失之5.5 kb Xbal片段的兩種取向），由每一個別突 —23 — 甲 4(210X297 公沒） A6 B6 五、發明·%明（22; 變之一構造選择作為煃草之.轉化·/」 (b) pAC348 - pAC 351 帶入ϋ 桿菌中質粒 pRK2〇l3 是一轉移性質粒 C conjugative plasmid )，其含將得自大腸桿菌之pB【N19基礎鲒構帶入經裁減土壤桿菌菌株，LBA4404 CpAL 4404 )中泠要之反作用序列β此土壤桿_菌株對鍵徽素具抗性並且含此經裁滅Ti質粒pAL44〇4 C Ooms 等，Plasmid 7: 15-29，1982 )〆此 Ti 質粒帑助此反作用毒性功能必须促進pB丨N19基礎T-DNA區轉移進入蛭草之杀色》· pB[Nl9基破載K，_轉移性質粒CPRK2013 )，及土壤桿菌菌株CLBA4404 )之三親代锥交，本質上依Bevan C NuCI. Acids Res. 12 : 8711-8721，_ 1984 )所描述之方法造行。質粒pAC348 - 351 CKanr)及pRK2013 (Καηθ 依先前描述之方法轉化進入適任大腸枰菌ΗΒ101或XL-1 細胞•將含每一質粒之轉化突變型接種至3毫升LBkaiJ肉汁培養液中並且於37 °C，以固定振盪培養之•此土壤桿_菌株，LBA4404 ，接種至ABst 培養基C 20 X AB是20克氣化鉄CNH4CI) 雉濟部中央橾準局印裝 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，.6克硫酸鎂七水合物CMgS〇4- 7M2〇〕，3克氣化鉀CKC1〕，60 克硃酸 A 二鉀 CK2HP〇4) ，20 克磷酸二 & 钠 CNaH2P〇4) ，3克氟化鈣CCaCI 2)及50毫克硫酸绒七水合物（FeS〇f 7H2〇)〕·將葡萄搪添.加至1 X原種培養液中至終濃度0·5χ 1並且用固定振盪，於28 °C培養36 - 48小時•此三親代維交籍由將1毫升三種培養液中的每一鏔（ΡβΙΝ19基破搆迨，PRK2013及LBA4404 )混合至一無_管中使起始益且於 28 °C連續培養1小時β此培養液經抽真空至一 0.45UM濾紙甲 4(210X 297公发）一 24 —

五、發明説研（23) 上濃，之並直於28ec，在τ.ΝΒ縿上培|過夜（NB是4克Di fco 營養肉汁耠及10毫升1M Trfs - HCI, pH 7.2)— ·將此濾紙放 , ··.-.* ~ *- 在2毫升新鲜AB培養基肀並且慢慢旋轉1小時•將一稀释系列補至ABstrpAaii净上並且於28 °C培養3 - 4天《只有携蒂PBIN19基礎構迻c kary〕之土壤桿菌c strp/：)生長在 ABstrp/kan培養基上•由ABstrp/kan毕之單一菌落接種至 ABstrB/kan肉汁培養基中並且於28°C，1用固定振盪36 - 48 小時培養之•這些培養再割線接種至AB8trp/kan片，於28 °C培養3 - 4天並且於4。<：竚存®至使用· ⑹缉草之土壤桿菌嫖介轉化將PAC348及PAC351接種至50 $升ABka〇益且用固定振盪 ’於28" °C培養36 - 48 d、時細菌藉由於2500 r pm，在Damon /【EC 秦上型離心機雔心1〇分鐘使晏丸狀· i細菌丸每懸浮在5毫升BAT培養基C BAT培養基是1 X MS 鹽（Mura-shige 及 Skoog，Plant Physiol. 15： 473-497, 1962 ) 1 X 85維生素〔KX) >〇B5是每1升有10毫克myo -肌醇，mo毫克菸醆，.耽毫克吡啰醇C維生素B6 )，及1000毫克鹽酸硫胺素（維生素& ) ·〕，3 %戾楗，5收pH5.7之6-苄胺基嘌岭〕·將年幼温室生長Wisconsin 38煙革葉切成2縱切序益且漫在含Ivory洗手肥皂之水中•此在無_蒸你水中洗後，在10 % Clorox + Tween 20溶液中扰抨浸泡10分鐘並且用ddH2〇溧洗3次•由此葉切净使用軟木穿轧器或鑽孔器切成圓片•將這些圓片放在含再懸浮土壤桿菌培養液之50 毫升管中*此懸浮液慢慢混合5分鐘並且吸墨至無_紙巾 -25 - {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 甲 4(210X297 公沒） r^0BVi〇 A6 _____B6_ 五、發明説明（24, 上旅且培養至BAT培莘基片C BO X 2〇麾米；f，每）f大約有 10個圓葉坪）_·此序於25 鮝光下培養48—小時•然後將 ». 一· 此圓葉厗轉蔟至選揮培養基C BATCK ; BAT培養基加羧苄青徵素C carbenicillin )及卡那微素（kanamyic ))並且可復至最初培養條件i|[至形成嫩枝'•將卡那徵素抗性嫩枝轉移至在CGA7) Magenta箱內之OTCK C生根：）選擇培養基（ OTCK培養基是batck培養基減6 -宇^胺基嘌蛉）並且連續先前描述之培養條件《當卡那黴索抗性嫩枝形成一可評價根系時（i少有3個根之長度比1公分長·），.將此枝物轉移至土壤中•簡略地自GA7箱取ΛΛ洋菜支撑幼苗，用溢自來水小心地將洋茉洗掉並具將此幼苗轉移至GA7容器內之泥炭盆中的母沒备物（_ metfomix )中*將此植物放在 a室中並且讓其變得壯大•總共5顆卡那徽条抗性幼苗含 PAC348及9顆含PAC 350之卡那徵索抗性幼苗轉移至土壤 •大約10- 14天後，將此泥炭盆移植至較大盒· pAC348 pAC351 轉化突變種__# ：轉化突變種# : 請先《讀背面之注意事項再瑱寫本頁) .打· ⑴ 19、1 ⑴10 ⑵ 33 - 1 ⑵20 (3) 33 - 2 ⑶20 ⑷ 46 — 1 ⑷20 •線· m iS 中林k 坏a 2 46 ⑸ 2727273042 ⑸⑻⑺⑻⑼ 1 2 4

1—___ _ _ A6 B6 五、發明說明（25 ) jr施例f .： -—- jt予救萆刹抗性之突變種的-測走及特性描适 AHAS 酵»析（葉組織）一轉移至溫室後立刻製備每 —卡那微素抗性轉化突變種萃取物差且對咪唑咻酮Pursuit 毅萆剤分析不敏戚性*依先前部分'描述之方法萃取L*醯羥醆合成酶並加以分析* 2個卡那徽素抗性轉化突變種c 33 -1及46 - 2 )其含Trp574 —>Leu取代二之芥AHAS等位基因之突變種等位基因，在Pursuit数萆劑之存在下顯出AHAS活性*此外，一卡那徵素抗性缺失轉化突變種（1〇 _ - 1 )之 AHAS 活性顆示對添加pUrSUi t救草劑不敏成（圖7 ) *此 Trp574缺失轉化突變種同一材秆是自交及间交至Wisconsin 38 **由‘10- 1之子代癖Pursui t救草奇丨，於比對對照煃草植株致死之濃度大4 - 8倍下，萌後施用顯出4受性· -團2⑻-(C)展示上述討論之雜交及對照組之表現型的比較照相•這些觀察顯示在由轉化葉組織之最初分析中觀察抗性之遺傳，及於整個植物程度下，此特性之表現· -在一更定量分析中，基因突變煃单植株C 10- 1 )之自交子代的種子含芥AHAS之Trp574缺失突變並且將教戚梘代栽培種“ Wisconsin 38 **之種子種在5吋Azalea盆內之Metr〇 Mix 35〇*中*此幼苗於2天後使稀疏至單一最铥健幼苗· 11天後，這些植物用Pursuit ,以〇 , 1〇 , 2〇 ,奶，8〇及16〇經濟部中央樣準局印裝

{請先KJ讀背面之注意事項再填駕本頁J .打. •tf. 克/公頃葫後喷霧•每一種婕草麺型〔基因突變及對照組；)之5顆植物，以每個救草劑比例喷霧，喷霧之前，丁呢抑 20*以0·25體積比添加至救草劑溶液中•此段草劑用實驗甲 4 (210X297 公发） —27 〇8ηό Α6 Β6 雉濟部中央揉準局印裝：)之自交子代顳出對Pvrsuit萌後施用具高度耐受性•敏或总代栽培種於你何試驗比例下都未顯現救草剞耐受性β 五、發明説明（26 室帶式噴霧溶，以4〇0升;/公頃之比刺，於植法上方18叶距離下，用帶速度8·2'秒/>叙嘖嘴#es〇lg E施用之•處理後1，2，3及4星期測量植物高度，於4及％星期時，記嫁植物鮮重教據· 這些吋霧的結果描述在圖4 ·在'圓中子代數據用每—救单劑比例之最对受性個趙第—及最教戚個菝最後表示之· 由此圓可看出，當原始基因突變植物之〔自交子代預期，分離毅萆刹耐受性子代•可觀察到教戚子代及具各種不同程度救草劑讨受性之個菝· 每一救草剤比例之植物鮮重（克平均值示於表2 , 以平均鲜重C克）摘鎵如下（：表1 ): / 表1 -..................................{、............災........·......................打…：: - ^ ·*······»·*···· ·····«» ............................·.·:. 一一 .- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁> 蛭萆平均鲜重對照組基因突 C每一組5重後）救草劑比例： · 〇克_ /公頃 52.1 53.7 10克/公頃 8.1 36.4 20克/公頃 2.0 28.8 40克/公頃 0.8 20.9 80克/公頃 0.6 26.5 160克/公頃 0.2 21.4 由此表可看出，基因突變煃单植株c 10 -

A6 B6 五、發明說明（£7 舍基因突變植物10 - !矣皋的粳子也分析其對咪唑咻辆 Pursuit之抗性•將種.子接蟑主含。，、·25，2 5，Vs 及5.0 mM Pursui t之培巷基上《•每個培養瓜接種2〇個種子，每個處理用2個培養皿·3星期後評估幼苗之毅草劑对受性* 5·0 mM處理的结果示於表< ·甚至於最低濃度（I25 mM處理組）下’對照植物仍顯出段草剞敏戚性•這些結果説明由親代植物10 - 1至其子代之抗*殺草劑特性的遺傳· 表2 多草種子分麻的结果

Pursuit 濃度CnM) : 5 S* D R ^ V W38 C野生型） 20 0. 0 20 0 0 10-1 - 7 6 6 - 自交 3 11 6 10-1X0 11 9 0 11 9 0 0X10-1 10 9 0 8 8 0 *S =敏戚性：D =損害；R =抗性經濟部央橾準局 ip 裂

實施例V 以大腸桿_分析AHAS酵素位點引導突變校， {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 素分析C表現在大腸桿菌甲 4 (210X297公发） —29 — A6 B6 五、發明説明（28 #024及pAC225，利用作爲大腸桿菌爲基爽之表現系统的世代模板•當有趣之高·等植因在任一内源活性之细_茵株缺之表現時，試驗對救草剞之不敏戚性-爲了此目的 ’將野生型界AHAS ( pAC301)之Nc η I/P stl片段，Trp 574-I*eu取代C .pAC224 )及Tr p 574缺失亞無性繁技造入大勝桿菌表現载體，PKK233-2 C 購自Pharmacia )之Nc〇I / Pstl 位點·此表現質粒含[PTG誘導啓動區μ々及轉鎵終止序列，兩區圍繞一Ncol，Hind |[及PstI聯鲒子序列，其容許有趣之基因對細菌啓動區之適當取向*個别Ncol / Pst 1片段亞無性繁技益連接至如先前描述之經Ncol /PstI消化pKK233 * ^ -2 DNA C胺卡青徽素抗性〕•此速接反應轉化至大腸桿茵菌株，MF2000〔 ilv 0 800: mu-l，Bg 132 , ilvl 15，thi-Ι ’ arg E 3 » RPSL 31 » Cara-leu, i Iv HI ) 863· mtKjj, xy卜5· galk2 ，lacYI，recAl 〕·此細菌菌株缺乏內源AHAS活性•所以生長在缺乏異白胺酸及纈胺酸C其包含在AHAS酵素之胺基醆生合成路^之終產物中）之基本培養基（血·111·11131邮山3) ，在 M pAC224 C Trp574 - Leu )或 pAC225 C Trp 缺失）轉化之MF2000 _株需要芥基因在大腸样茵之表現及功能· 3低構造輔技MF2000中的每一個在洋菜培養基上以及肉汁培養液中· 經濟部中央抹準局印 {請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁> 含質粒構造PAC2l〇，PAC224或？八仁225之MF2000的單一茵株接種至含胺基酸精胺酸，白胺酸，異白胺酸及總接酸之 MB3基本培養基CamP)之3毫升肉汁培養液中** 〔M田是 30克璘酸二氩鉀（，70克蹲酸氫二鉀（冗2册〇4)，2〇甲4(210X297公发) —30 — Α6 Β6 五、發明説明ί 29 克硫啤銨CCfttl4)2S〇4)，5毫克硫酸亞鐵CFeSOp , ]〇〇微升1 Μ硫酸鎂<MgS〇4> ’ 200-微升硫胺素cthi咖·μ )，葡萄接濃度提升至I·2 %〕·此培養液於37〇c，用固定抵逢培養遏夜*成丸狀之細菌細皰，再懸浮在附加有精瞭酸及白胺酸’但缺乏異白胺酸及纈胺蟑之幾毫升M63 Camp) c 負ilv培養基）此細胞轉移至10 — 5Q毫升員jlv培養基益且於37 C固定振盪持續遇夜•細胞使成-九狀益且这接用於 AHAS 酵素分析或於-2tfC冷凍it至使用· 細茵·细胞中芥AHAS之萃取及分析基太上如Singi^ ( j.

Chromatography 444 : 251 - 261，1988 )所_婆者•此細菌丸在液態氮中磨成檢並且在含10nM丙辆酸鹽Na2 - EDTA ’ ΪΧΧιΜ 腺嗓吟二核苷駿CFAD)，imM潮胺酸，1 nM白胺酸，10 % C ν/ν)廿淖及1〇πΜ半貌按酸之]〇〇ϊΜ磷酸钟緣衝液C ρΗ7·5 ：)中均化•此均質液經—尼龍布（曰微米篩眼 • · )過濾並且於25,000 X g離心20分鐘•上層液部分配成對硫酸按而言是50%飽和度並且在冰上靜置2〇 - 30分鐘•此沉澱物於25,000 X g難心20分鐘使成丸狀•上層液去棄，此硫酸按丸立刻使用或用液態氟冷凍並於-2UC貯存S至使經濟部中央橾準局印 $1 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 在有或無救萆剤存在.下AHAS活性是藉由評估產物，丙酮游酸醏，於藉酸聪羧成1偶姻Cacetoin)轉化之後測定之 •標準反應混合物，在含MO nM丙酮酸鈉，10 mM氯化鎂，1 mM硫按素焦磷酸鹽（TPP)及1〇 FAD 之50 mM磷酸鉀緩衝液C PH7.0)中含此酵素（及殺草劑〕*此混合物甲 4(210X297 公沒） —31 — 五、發明說明（30 A 6 B6 經濟部中央橾準局印於37 °C培養1小時*此反庳用洛加硫酸達終濃度0.85%，使其停止*令此反應產、物於%。C税羧基15分'鐘·形成之G 偶姻藉由用肌醆〔creatine ) C0.17% )及1 -落酚C 1.7 % )培養，藉 Westerfeld 之方法 C J. Biol · Chem. 161:495 -502 ，1糾5 )測定之•於酵素分析期闓進行菹接G偶姻形成之適當核對· - 野生型芥AHAS C pAC2〇l )對咪唑咻ST:毅草劑Pursuit，及磺醯脲救草劑Glean教戚，而Trp-574 - Leu取代（pAC224〕及Trp 574 缺失CPAC225 ) 則對增加濃度之Pursuit救草剞 C圖4〕及Glean救草剞C圖5 )不欹戚•令人鷲訝地是缺失授予對這些毅草剞不敏戚的程度等於或大於對應取代之不敏‘戚程度•所以，芥AHAS密碼區之Trp574殘基缺失將導致酵素對洛加飩夠抑制酵素之野生型的2種無關毅草劑中任一種不敏或之功飩形成· 上述方法也用於產生門冬醢胺取代昍3位上之絲胺酸，以及於此位之缺失•含此取代C PAC229 )或缺失CPAC230) 之質叙轉化至大腸桿菌MF2〇〇〇並且在毅草劑Pursujt，及Glean 之存在下，裱上述方法，測定缺失及取代突變種之AHAS活性•由門冬醯胺取代絲胺酸產生之AHAS對Pursui t之抑制不敏戚C圖6 ) β如先前所報導者（Sathas丨·van 等，前文），但是對Glean之敏戚性，當與野生型酵素比較時，只略微減饫C約10 % ) C圖7 ) *相反地，由Ser 653缺失所產生之AHAS，對於由Pursuit及Glean兩者引起之抑制作用，則具高度抗性C圓6及7 ) · {請先M讀背面之注意事項再瑱寫本页> •装· •打· •線· 甲 4(210X 297t'沒）一 32 _ A6 B6 OB'Vio 五、發明説明（31) - --· . 生物材料之寄存 :二下列微生物於1990年12月6日寄存在美S類型培養收集中心 C American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20857)，接受登記號碼如下：微生物_ 取得號碼土壤桿 _ _ 株 LBA4404 68488 隱藏 pAC351 CAgr〇/351 ) 1 〔Trp574 缺失〕土壤桿 _ 菌株 LBA4404 68489 隱藏質粒PAC324 .- 〔Ser 653 缺失〕 ..............................:……< .............it-.......:................……打.：·.：.(.......................*!. (請先閱讀背面之注意事項再瑱寫本頁> 經濟部中央揉準局印裂 —33 — 甲 4(210X 297 公发）

Claims

ifjL· 號隼刹f請業ν ,)古決史中請專到範21修正本似年4：月)1_J K， A7 B7 C7 D7 六、申請專利範面 2 a 4. 5. 6. a 娩濟部中央標準局印製 —種編碼功能性AHAS酵素之核酸序列，此酵素之胺基酸序列不同於野生型胺基酸序列，有至少一個授予此酵素殺草劑抗性之胺基酸刪除’其中一刪除發生在芥 (ArahiHnDsis)AHAS序列中之胺基酸574或653上*或在不同物種之同源位置上。根據申請專利範圍第1項之序列，其中抗性是對一種或更多種選自包括眯唑啉嗣*磺醢腺及三唑駢嘧啶之殺草劑具抗性。一種'^能AHAS酵素，其胺基酸序列不同於野生型胺基酸序列*有至少一個授予此酵素殺草_抗性之胺基酸刪除·，. · ，其中一刪除發生在芥(Arabidops is) AHAS序列中之胺基酸57 4或6 53上，或在不同物種之同源位置上。一種製備可使宿主细胞具殺草劑抗性的載體之方法*其包括將申請專利範圍第1項之核酸序列，K此序列可表現之方向，插入適當之載體中。一種製備具殺草劑抗性的宿主细胞之方法，其包括以申請專利範圍·第1項之核酸序列，轉形一適當宿主细胞。一種製備具殺草.劑抗性的宿主细胞之方法，其包括以申請專利範圍第4項之方法所製得之載體轉形一適當宿主细胞。一種製備具殺草劑抗性的植物细胞之方法，其包括以申 _專利範圍第1項之核酸序列轉形二植物细胞。 —琴製備具殺草劑抗也的成熟植物之方法，其包括由以申請專利範圍第1項之序列轉形一植物细胞養成成热植物，或由所培植出之植物培養其後代。 (請先閲讀背面之注素事項再填寫本頁) 甲 4(210X297 公尨) 3 7· 8' ο 2 A B c D 六、申請專利範面 9· 一種製備具殺草劑抗性的種子之方法，其包括K根據申請專利範圍第8項之方法培植一植物，使植物進行有性生殖，並收集其種子。 10·—種製備具殺草劑抗性的花粉之方法，其包括K根據申請專利範圍第δ項之方法培植一植物，並收集其花粉。 11· 一種授予一植物细胞殺草劑抗性之方法，其包括提供該植物细胞編碼功能性AH AS酵素之核酸序列，此酵素之胺基酸序列不同於野生型胺基酸序列，有至少一個授予此酵素1草劑抗性之胺基酸刪除，其中一刪除發生·在斧 (A r a h i do p s i s ) A H A S序列中之胺某酚7 4或6 5 3上，或在不同物種之同源位置上。 12 一種供抗殺草劑植物生長之方法，其包括於抑制量殺草劑之存在下培養，產生功能性AH AS酵素之植物，胺基酸序列不同於野生型胺基酸序列，有至少一個授予此酵素殺草劑抗性之胺基酸刪除，其中一刪除發生在芥 (InaJLLdiLE^LsJ AH AS序列中之胺基酸574或653上，或在不同物種之.同源位置上。， la. —種JS目標基因成功轉形的宿主细胞之篩選方法，其包 … 括將連接有根據申請專利範圍第1項之核酸序列之目標基因，提供給預期宿主细胞*使此细胞在抑制量殺草劑的存在下生長*及確認存活细胞為含目標基因者。 14. 一種核酸構建體，其包括將申請專利範圍第1項之序列接至一種編碼雇藝上^用特性之基因。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· •打· •線_ 經濟邡中央搮準扃印装甲 4 (210X297公廣）