HUT62333A - Process ofr producing herbicide-resistant mutants of acetohydroxy acid synthesis enzyme - Google Patents

Description

A találmány tárgyát olyan új DNS szekvenciák képezik, amelyek az acetohidroxi-sav szintetáz enzim (a továbbiakban AHAS) új variáns formáit kódolják. Az AHAS enzim egy kritikus enzim, amelyet rutinszerűen állítanak elő számos növény illetve mikroorganizmus segítségével. A normál AHAS funkciót számos különböző herbicid gátolja; a mutáns DNS szekvenciák által kódolt új AHAS enzimek azonban normálisan, katalitikusán működnek, még az ilyen herbicidek jelenlétében is, és ezért a növényt, illetve a mikroorganizmust, amelyik tartalmazza őket, rezisztenssé teszik az ilyen herbicidekkel szemben.

Az új DNS szekvenciák azon a váratlan megfigyelésen alapulnak, hogy a normál AHAS gén szekvencia bizonyos régióiban néhány (egy vagy több) aminosav deléciója egy teljesen funkcióképes enzimet eredményez, de az enzimet számos különböző herbiciddel szemben rezisztenssé teszi, beleértve az imidazolinonokat, triazolopirimidineket és a szulfonilkarbamidokat. Az ilyen variáns szekvenciák hozzáférhetősége eszközt biztosít különböző terménynövények transzformálására a herbicid rezisztencia alapján, valamint egy új szelektálható genetikai markert biztosít más típusú genetikai transzformációk esetében is.

A herbicideket manapság széleskörűen alkalmazzák a mezőgazdaságban. Jóllehet nagyszámú olyan vegyület hozzáférhető, amelyek hatékonyan irtják a gyomnövényeket, mégis, nem mindegyik herbicid képes szelektíven megcélozni a nemkívánt növényeket a terménynövény mellett, és emellett még az állatokra sem toxikus. Gyakran olyan vegyületeket szükséges választani, amelyek egyszerűen kevésbé toxikusak a terményekre mint a gyomnövényekre. Abból a célból, hogy ezt a problémát megoldjuk, a herbicid rezisztens terménynövények kifejlesztése a mezőgazdasági kutatás középpontjába került.

A herbicid rezisztencia kifejlesztésének egy fontos fázisa annak megértése, hogy a herbicidek miként gátolják a növények növekedését, majd a bioszintézis út manipulálása a terménynövényben, hogy a gátló hatást megszüntessük, de a növény megtartsa normális biológiai funkcióját. A herbicidek biokémiai mechanizmusával kapcsolatban az egyik első felfedezés egy sor, egymással szerkezetileg nem rokon herbicid vegyülethez kapcsolódik, az imidazolinokhoz, a szulfonil-karbamidokhoz és a triazolopirimidinekhez. Az már ismert [Shaner et al., Plánt Physiol., 76, 545-546 (1984); 4 761 373 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás], hogy ezek közül mindegyik herbicid úgy gátolja a növények növekedését, hogy egy integrális sejt-enzimmel lép kölcsönhtásba, az aceto-hidroxisav </íí· ' szintetázzal (AHAS; acetol-acetát szintetáznak is nevezik, vagy ALS-nek). Az AHAS-ra az izoleucin, leucin és valin szintézisénél van szükség.

Az AHAS enzimről ismert, hogy jelen van a magasabbrendu növényekben, valamint megtalálható számos mikroorganizmusban, például a Saccharomyces cerevisiaeben, valamint a bélbaktériumokban az Escherichia coliban és a Salmonella typhimuriumban. Ezekben a fajokban a normál AHAS termelésének genetikai alapjait is jól jellemezték. Például mind az Escherichia coliban, mind a Salmonella typhimuriumban az AHASnak három izoenzime létezik. Mind a három izoenzim egy kis és egy nagy alegységből áll; az IlvIH, IlvGM és IlvBN operonokra térképezhető. Az élesztőben az egyetlen AHAS izoenzimet az ILV2 lókuszba térképezték. Mindegyik esetben azonosítottak érzékeny és rezisztens formákat, és a különböző allélek szekvenciáit meghatározták [Friden et al., Nucleic Acids Research, 13., 39793993 (1985); Lawther et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 78, 922-928 (1982); Squires et al., Nucleic Acids Research, 811, 5299-5313 (1983); Wek et al., Nucleic Acids Research, 13., 4011-4207 (1985); Falco and Dumas, Genetics, 109, 21-35 (1985); Falco et al., Nucleic Acids Research, 13, 4011-4027 (1985)].

A dohányban az AHAS funkciót két, egymással kapcsolatban nem álló gén, a SurA és a SurB tartalmazza. Lényeges azonosság található a két gén között, mind nukleotid szinten, mind az érett fehérje aminosav szintjén, jóllehet az Normál terminális, feltételezhetően tranzit régió sokkal lényegesebb különbségeket mutat [Lee et al., EMBO J., 7, 1241-1248 (1988)]. Az Arabidopsisban azonban csak egyetlen AHAS gén található, amelynek szintén teljesen meghatározták a szekvenciáját. A magasabbrendű növények AHAS génjeinek szekvenciáinak összehasonlítása a szekvencia bizonyos régióinak erős konzerválódását mutatja; pontosabban, legalább 10 olyan régió található, amelynek a szekvenciája megőrződik. Korábban feltételezték, hogy ezek a konzervált régiók kritikusak az enzim működése szempontjából, és ezeknek a funkcióknak a megtartása a szekvencia konzerválódásától függ.

Korábban már közölték (EP 0257993), hogy a herbicid rezisztenciát mutató mutánsok legalább egy aminosavban mutációt hordoznak ezen konzervatív régiók közül egyben vagy többen.

Pontosabban, ha az AHAS szekvenciában ezeken a specifikus helyeken bizonyos aminosavakkal helyettesítik a vad típusú aminosavakat, akkor ez elviselhető, és valóban herbicid rezisztenciát eredményez az ezt a mutációt hordozó növényben, míg a katalitikus funkcióikat megtartják. Ezekről a mutációkról kimutatták, hogy a dohányban mind a SuRA mind a SuRB lókuszban előfordulnak; hasonló mutációkat izoláltak Arabidopsis-ban és élesztőben is.

Egy újabb, váratlan felfedezés szerint egy vagy több ilyen konzervált régióban egy vagy több aminosav deléciója nem csak funkcióképes AHAS enzimet eredményez, hanem herbicid rezisztenciát is. A szekvencia megőrződése általában azt jelenti, hogy ezekben a régiókban bármely változás elviselhetetlen, és ezért funkcióképtelen fehérjéket eredményez. Ebben az esetben azonban különösen meglepő, hogy az enzimatikus funkció megmarad, annak a ténynek a fényében, hogy a deléciók nemcsak eliminálnak egy aminosavat, amely az enzim szerkezeti komponense, hanem szükségszerűen eltolják a csoportokat is, és ezzel elrontják a mutációkat tartalmazó szekvencia látszólagos konzerválódását is. így új nukleinsav szekvenciákat állítunk elő, amelyek herbicid érzékeny növények herbicid rezisztensekké való transzformálására használhatók. Az így transzformált növények szolgáltatják az alapot új, herbicid rezisztens növény variánsok kifejlesztéséhez.

A találmány tárgyai új nukleinsav szekvenciák, amelyek különböző herbicidekre érzéketlen, működőképes AHAS enzimeket kódolnak. A kérdéses szekvenciákból egy vagy több kodon

- 6 hiányzik, amelyek egy specifikus aminosavat kódolnak a vad típusú AHAS molekula egy vagy több úgynevezett konzervált régiójában. Ezeknek a helyeknek az azonosítását és a kivágható kodonokat az alábbiakban részletesebben tárgyaljuk. A megváltoztatott DNS szekvenciák jól használható herbicid rezisztens növényi sejteket előállító módszerekben, az említett módszer abban áll, hogy egy kiválasztott növényi sejtet az alábbiakban megadott, egy vagy több megváltoztatott szekvenciával transzforrnáÍjuk. Egy másik módszer szerint mutagenezissel készítünk deléciós mutánsokat a növényi sejtekben vagy magvakban, amelyek egy herbicid érzékeny AHAS-t kódoló nukleinsav szekvenciát tartalmaznak. Az ilyen növényi sejteket azután szövettenyészetbe visszük, hogy olyan növényeket regeneráljunk, amelyek a herbicid rezisztencia vagy herbicid érzéketlenség tulajdonságot hordozzák. A találmány tárgyai ezért növényi sejtek, kifejlett növények valamint növényi magvak, amelyek a deléciós mutációt tartalmazó nukleinsav szekvenciát hordozzák, és amelyek működőképes, herbicid rezisztens AHAS enzimeket termelnek.

Ezeknek az új herbicid rezisztens növényeknek a hozzáférhetősége lehetővé teszi a termények új módszerekkel, herbicid jelenlétében való növesztését. A nem-rezisztens növények termesztése helyett a termőföldeket a találmány szerinti rezisztens növényekkel lehet bevetni, majd a termőföldet rutinszerűen lehet herbiciddel kezelni, anélkül, hogy a terményeknek ezzel kárt okoznánk. Az erre a célra előnyös herbicidek az imidazolinok, szulfonil-karbamidok és a triazolopirimidinek.

.: :···.......

.:. ’**·' ·’ ’.·* '··:

A találmány szerinti mutáns nukleinsavak a transzformációs kísérletekben új szelektálható markereket is jelentenek. Egy rezisztens AHAS-t kódoló nukleinsav szekvenciát egy második génhez kötjük, mielőtt egy gazdaszervezetbe vinnénk, majd az egész konstrukciót a gazdaszervezetbe transzformáljuk. A feltételezett transzformált sejteket azután szövettenyészetben növesztjük, gátló mennyiségű herbicid jelenlétében; a túlélő sejtek sikeresen megszerezték a második, számunkra érdekes gént.

Az - alábbi definíciókat alkalmazzuk a specifikációk és az igénypontok során is.

Funkcionális, vagy normális az az AHAS enzim, amely képes az izoleucin, leucin és valin esszenciális aminosavak bioszintézis útjának első lépését katalizálni. Az AHAS konzervált szekvenciája vagy régiója a nukleinsavak vagy aminosavak olyan sorozata az AHAS aminosav szekvenciájában vagy nukleinsav szekvenciájában, amely az AHAS enzimet tartalmazó fajok közül legalább kettőben azonos. A vad-típusú AHAS szekvencia egy adott faj herbicid érzékeny tagjában található szekvencia. Egy rezisztens növény egy normál AHAS enzimet termel, és. képes teljesen kifejlődni, akkor is, ha a herbicid normálisan gátló koncentrációjának jelenlétében növesztjük. A rezisztens szakkifejezés az alábbiakban toleráns növényeket is jelent, azaz olyan növényeket, amelyek fenotípusosan előnytelen, de nem letális reakciókat adnak a herbicidekre.

Az la és lb ábrák (1-es és 2-es szekvencia listák) az Arabidopsis vad típusú AHAS-ának aminosav és nukleotid

szekvenciáját mutatják. Az la ábrán a bekeretezett régiók olyan szubszekvenciákat jelölnek, amelyekben deléciókat hajthatunk végre herbicid rezisztencia kiváltása céljából. A bekarikázott csoportok azok a specifikus helyek, ahol ezek a deléciók elvégezhetők. Az lb ábrán egy nyíl jelzi a kódoló régió kezdetét.

A 2(a-c) ábrán az utódok (első generáció) három fényképét látjuk, amelyek egy olyan transzgenikus dohánynövényből származnak (10-1), amelyet az Arabidopsis AHAS Trp574 mutánsával transzformáltunk, majd megjelenés után Pursuit imidazolin herbiciddel permeteztünk le 0, 10, 20, 40, 60, 80 és 160 gramm/hektár (g/ha) mennyiségben. Mind a három fényképet a permetezés után három nappal készítettük. Mindegyik fényképen a kontroll növények, a vad-típusú herbicid érzékeny dohányfajta, a Wisconsin 38 [W38] vannak az első sorban.

(a) W38 kontroll és a 10-1 önmagával keresztezve - A W38 a kontrollt képviseli, míg a 10-1 az önmagával szaporított transzgenikus dohány utódokat. 0 g/ha Pursuit koncentrációnál mind a W38, mind a 10-1 hasonlóan néz ki. 10 g/ha koncentrációnál a W38 növény növekedése enyhén gátolt a 10-1-hez viszonyítva; 20 g/ha értéktől azonban a W38 növekedése majdnem teljesen gátolt. 80 g/ha koncentrációnál a 10-1 növény növekedése enyhén gátoltnak tűnik, majd 160 g/ha koncentrációnál a 10-1 növény növekedése teljesen gátolt.

(b) W38 kontroll és 0 x 10-1 - A W38 jelentését az előzőkben ismertettük. A 0 x 10-1 jelentése olyan keresztezés, amelyben W38 az anya (0) és 10-1 az apa. Az eredmények nagyon hasonlók ahhoz, amit az önmagával keresztezett 10-1 fényképén ···

- 9 láthatunk.

(c) W38 kontroll és 10-1 x 0 - A W38 jelentését az előzőkben ismertettük. A 10-1 x 0 jelentése olyan keresztezés, amelyben 10-1 az anya, és W38 az apa (0). Az eredmények nagyon hasonlóak ahhoz, mint amit az önmagával keresztezett 10-1 fényképén látunk, azzal a különbséggel, hogy ezen a fényképen a herbicid rezisztencia tulajdonság látható a 10-1 utódok között.

A 3. ábrán a Pursuit hatását látjuk dohány palántákra megjelenés után alkalmazva, a növény magasságának mérése alapján. C* jelentése a kontroll átlaga (érzékeny növényfajta), míg minden egyes további oszlop egy-egy transzgenikus utódot jelent.

A 4. ábrán a Pursuit imidazolinon herbicid hatását látjuk egy Trp574 deléciót [DÉL], egy Trp574 szubsztitúciót [SUB] tartalmazó génnel transzformált, valamint egy vad típusú [WT] AHAS szekvenciával transzformált Escherichia coliból izolált AHAS enzimre.

Az 5. ábrán a Glean szulfonil-karbamid herbicid hatását látjuk olyan AHAS enzimeken, amelyeket Escherichia coli transzformánsokból izoláltunk. A rövidítések ugyanazok mint a 4. ábrán.

A 6. ábrán a Pursuit imidazolinon herbicid hatását látjuk Escherichia coli transzformánsokból izolált AHAS enzimekre. Az enzimek egy Ser653 deléciót [DÉL] tartalmazó szekvenciával transzformált Escherichia coliból, egy Ser653 szubsztitúciót [SUB] tartalmazó szekvenciával transzformált Escherichia coliból és egy vad típusú [WT] AHAS szekvenciával transzformált Escherichia coliból származnak.

’· *· «· ·····, • · * ···

-ίο-,

A 7. ábrán a Glean szulfonilkarbamid herbicid hatását látjuk az Escherichia coli transzformánsokból izolált AHAS enzimekre. A rövidítések ugyanazok mint a 6. ábrán.

A 8. ábrán a Pursuit imidazolinon herbicid hatását látjuk egy olyan AHAS enzimre, amely a Trp574 delécióval rendelkező Arabidopsis AHAS alléit tartalmazó Agrobacterium törzset hordozó dohánynövényből származik.

Az AHAS gén teljes nukleotid szekvenciája számos szervezetben ismert, beleértve az élesztőt, Escherichia coli-t, Brassica-t, Arabidopsis-t, cukorrépát és a dohányt, és már korábban közölték [Mazur et al., i.m.; Lee et al., EMBO J.,7, 1241-1248 (1988)]. Emellett az is ismert, hogy a herbicid rezisztencia az AHAS szekvenciában levő egy vagy több mutációval áll kapcsolatban; specifikusan, a rezisztenciáról megjegyezték, hogy a szekvenciában levő bizonyos specifikus aminosav szubsztitúciókkal áll kapcsolatban [EP 259 793; Yadav et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83., 44184422 (1986); Sathasivan et al., Nucleic Acids Research, 18, 2188 (1990)]. Ezzel azonban vele jár [Hartnett et al., Managing Resistance To Agrichemicals, Ch. 31. 459-473, American Chemical Society (1990); EP 259 793] hogy ezeket a konzervatív régiókat, amelyekben a mutációk rezisztenciát okoznak, általában meg kell tartani az enzimatikus funkciók megőrzéséhez.

Újabban váratlanul felfedezték, hogy ezeknek a szekvenciáknak a megőrződése nem esszenciális a molekula katalitikus funkciója szempontjából. A jelen találmány során az Arabidopsis AHAS kódoló régió helyspecifikus mutagenezisét

• *4

- 11 használjuk arra, hogy olyan deléciós mutációkat hozzunk létre, amelyekben egy olyan csoportot, amelyről korábban igazolták, hogy helyettesíthető, kihagyunk a szekvenciából. Egy csoportnak a deléciója világosan elrontja azoknak a régióknak a konzervált természetét, amelyekben előfordul. Mindemellett, az így készített deléciós mutánsok mindegyike megtartja az AHAS funkcióját, és amellett herbicid rezisztensek is lesznek. Specifikusan, a Trp574, Prol97 és Ser653 csoportok egyenként való deléciója, illetve a Prol97 és Ser653 csoportok kettős deléciója révén teljesen működőképes, herbicid rezisztens növényeket kapunk. Az aminosavak számozása az alábbiakban az Arabidopsis AHAS szekvencián alapul. .Az azonban nyilvánvaló, hogy a specifikáció és az igénypontok során az Arabidopsis szekvenciában levő specifikus deléciós helyre való hivatkozás azt jelenti, hogy bármely fajban levő AHAS génben levő megfelelő szekvenciára is vonatkozik.

Ezeknek az adatoknak a fényében nyilvánvalóvá válik, hogy ezeknek az AHAS molekulában levő herbicid rezisztenciához kapcsolódó régióknak a megőrződése nem kritikus a katalitikus aktivitás szempontjából, és egy vagy több aminosav delécióját egy vagy több konzervált aminosav szekvenciában könnyen elviseli az enzim, sőt, a növényt herbicid rezisztenssé is teszi. A jelen találmány olyan AHAS DNS szekvenciákra vonatkozik, amelyekben a vad típushoz viszonyítva egy vagy több deléció található, ezek a deléciók nem változtatják meg a keletkező AHAS enzim katalitikus funkcióját. Az ilyen deléciós mutációk tartozik, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, egy vagy több kodon deléciója, amelyek az úgynevezett

• »*·

- 12 konzervált szubszekvenciákat tartalmazzák, az EP 257 793 definíciója szerint. Ezek a DNS szekvenciák a 119-122-es, a 194-197-es, a 201-208-as, a 255-257-és, a 348-353-as, a 373377-es és az 569-578-as Arabidopsis AHAS szekvenciákat kódolják. Van még egy további konzervált régió, amelyben szubsztitúciót írtak le, és amelyben a deléció hasznos a herbicid rezisztencia kialakításában, ez a 650-653-aminosav szekvencia. Egy kodon, több kodon’, egészen az összes kodon deléciója az előzőkben említett szubszekvenciák-ban, a találmány oltalmi körébe tartozik. Azok az előnyös kodon deléciók, amelyek olyan mutánsokat kódolnak, amelyekben az alábbi aminosav csoportból legalább egy aminosav ki van hagyva: 120, 121, 197, 205, 256, 351, 376, 571, 574, 578 és 653. Különösen azok a szekvenciák előnyösek, amelyekből a 197-es, 574-es vagy 653-as aminosav hiányzik.

Jóllehet az előzőkben említett deléciók olyan régiókat képviselnek, amelyekről ismert, hogy elviselik a variációt, az valószínű, a molekula lényeges flexibilitása fényében, hogy más deléciók is valószínűek lehetnek. Például az AHAS enzim más konzervált régiói is léteznek a leírtak mellett. Bár nem akarunk egyetlen elmélethez sem kötődni, az most már valószínűnek tűnik, hogy ahelyett, hogy olyan helyek lennének, amelyek a molekula katalitikus aktivitásához kötődnek, és ezért lényeges szerkezeti konzerválódást igényelnek, a legtöbb ilyen konzervált régió a herbicid kötődési régiója. Ezeken a helyeken egy vagy több aminosav deléciója ezért logikusan megakadályozza a herbicid kötődését, és ennek következtében megakadályozza azt, hogy a herbicid kölcsönhatásba lépjen az AHAS aktivitással.

Ennek az elképzelésnek az alapján a hozzáférhető konzervált AHAS szekvenciák [lásd például Mazur et al., Plánt Physiol., 85, 1110-1117 (1987)] és az ismert technikák, például a helyspecifikus mutagenézis alkalmazásával rutin dolga lesz további olyan deléciós mutánsok tervezése, amelyek herbicid rezisztensek. A feltételezett mutánsokat azután úgy lehet megvizsgálni, hogy a kiválasztott herbicid gátló koncentrációjának jelenlétében növesztjük, hogy meghatározzuk, van-e vajon herbicid rezisztens növény.

Csakúgy, mint más fehérjék esetében, a funkcionális AHAS enzimnek térbeli szerkezete van, ami az enzimet alkotó aminosavak lineáris elrendeződésének következménye. Az aminosavak oldalláncainak kölcsönhatása kialakítja a fehérjék szekunder szerkezetét, majd a elrendeződés a fehérjék tercier szerkezetét hozza létre. Egy adott fehérje specifikus architektúrája, ami végülis az aminosav szekvencia alapján alakul ki, kritikus lehet a fehérje funkciója szempontjából. Azaz, egy aminosav kicserélése megtartja a fehérje szerkezeti egységét, míg egy aminosav deléciója erősen elrontja ezt a szerkezeti egységet, várható hogy jelentősen megváltoztatja a fehérje térbeli szerkezetét, és eközben megváltoztatja a molekula funkcióját. Ezért, a deléció által okozható potenciális károsodást figyelembe véve, az különösen meglepő, hogy a keletkező molekula a térbeli szerkezetének elegendő részét tartja meg nemcsak a katalitikus funkcióhoz, hanem a herbicid rezisztenciához is.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló , hogy a jelen találmány szerinti deléciós mutánsok nem korlátozódnak a DNS vagy az enzim forrására. Jóllehet a találmánynál alkalmazott kísérleti elrendezés elsődlegesen az Arabidopsis AHAS gén szekvenciáját használja, hasonló mutációk rutinszerűen állíthatók elő az ilyen gént hordozó organizmusok AHAS szekvenciáiban, azaz például más magasabbrendű növények, élesztő, Escherichia coli, és más mikroorganizmusok szekvenciájában. Az összes ismert vad típusú AHAS gén szekvenciájában megfigyelt hasonlóság olyan nagy, hogy rutinszerű kísérletezés tárgyává teszi az Arabidopsistól eltérő AHAS szekvenciákban azonos mutációk előállítását. Egy másik módszer szerint kiméra gének készíthetők, amelyek az Arabidopsis AHAS gén deléciós mutációt tartalmazó részéből és más forrásból származó, változatlan AHAS génrészből állnak.

Az alábbiakban leírt újtipusú gén egyfajta, illetve több mint egyfajta típusú herbicid elleni rezisztenciát képes biztosítani. Amint azt már alaposan meghatározták, az AHAS számos különböző osztályba tartozó herbicid, nevezetesen imidazolinonok, szulfonil-karbamid, triazolopirimidinek, szulfamoil-karbamidok és szulfonil-karboxamidok hatásának támadáspontja. Ami az aminosav szubsztitúcióval előállított herbicid rezisztenciákat illeti, az ilyen mutációkkal előállítót herbicid rezisztencia lehet szelektív egy bizonyos herbicidre, illetve lehet kereszt-rezisztencia egynél több herbicidre. A Trp574 és a Ser653 deléciók keresztrezisztenciát okoznak az imidazolinonokra és a szulfonil-karbamidokra. Egy szakterületen jártas szakember számára könnyen meghatározható egy adott mutáns specifitása, olymódon hogy külön-külön vizsgálja az adott mutánst például csak imidazolinonok, csak szulfonil-karbamidok • ··

jelenlétében, majd a túlélő növényeket izolálja. Azokat a herbicid típusokat, amelyekre a jelen találmány használható, az alábbi Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban közük például:4 188 487, 4 201 565, 4 221 586, 4 297 128,

4	554	013,	4	608	079,	4	638	068,	4	647	301,	4 650 514,
4	698	092,	4	701	208,	4	709	036,	4	752	323,	4	772	311 és
4	798	619;	valamint	a	4 127 405		4 435 206		4 424 703,
4	417	917,	4	398	939,	4	394	506,	4	391	627,	4	383	113,
4	378	911,	4	372	778,	4	371	391,	4	370	480,	4	370	479, 4 369 320

sorszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (szulfonil-karbamidokra vonatkoznak).

Az AHAS-ról jelenleg kimutatták, hogy nemcsak sok különböző fajta növényben van jelen, hanem igazolták azt is, hogy a herbicid érzékenység kritikus meghatározó helye nagyszámú, lényegében egymással rokonságban nem álló növényeknél is, például a kukoricánál, Brassica-nál, dohánynál, lennél, Arabidopsis-nál és a cukorrépánál [Stougaard et al., Molecular and Generál Genetics, 219, 413-420 (1989); Jordán and McHughen, J. Plánt Physiol., 131, 333-338 (1987); McHughen, Plánt Cell Reports, 8, 445-449 (1989)]. Amint azt az előzőkben megjegyeztük, ezek után a megfelelő mutáció közvetlenül a kiválasztott növényben állítható elő, ismert mutációs technikákkal [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982), valamint a II. számú példa a jelen találmányból].

Gyakran azonban sokkal kényelmesebb olyan transzformált növények előállítása, amelyek a megkövetelt deléciókat tartalmazó, ismert, izolált DNS-t tartalmaznak, például a jelen esetben

• · • * · · leírt Arabidopsis deléciós mutánsuk előállítása. Az 574-es és 653-as pozíciókban deléciókat tartalmazó plazmidokat 1990. december 6-án letétbe helyeztük az American Type Culture Collection-nál, ATCC 68488 és ATCC 68489 letéti számok alatt.

A jelen találmány szerinti izolált DNS szekvenciák hasznosak kiválasztott haszonnövények transzformálásában, herbicid rezisztenssé teszik őket, anélkül, hogy mutagén kezelésre lenne szükség. Jelenleg sok különböző technika létezik, amelyekkel magasabbrendü növényeket közvetve vagy közvetlenül transzformálni lehet idegen DNS-sel, és bármely módszer, amellyel az új szekvencia bejuttatható a gazdaszervezet genomjába, és stabilan átörökíthető az utódokra, a jelen találmány oltalmi körébe tartozik.

A növényi sejtek közvetett transzformációját vektorok alkalmazásával érhetjük el. Egy általános módszer a transzformáció elérésére az Agrobacterium tumefaciens használata egy idegen génnek a kiválasztott növényi sejtbe való bejuttatására. Ebben az esetben például a mutáns AHAS szekvenciát beépítjük egy plazmid vektorba, amely a Ti plazmid T-DNS-ének határoló szekvenciáit tartalmazza. A plazmidot ezután Escherichia coli-ba transzformáljuk. Ezután egy háromszülős keresztezést végzünk, ezen törzs, egy olyan Agrobacterium törzs, amely egy hatástalanított, de az AHAS szekvenciát tartalmazó TDNS szekvenciának a kiválasztott növény kromoszómájába való juttatáshoz szükséges virulencia funkciókat tartalmazza, valamint egy második Escherichia coli törzs között, amely azokat a szekvenciákat tartalmazó plazmidot hordoz, amelyek ahhoz szükségesek, hogy az AHAS konstrukciót az Escherichia • ·

- 17 coli-ból az Agrobacterium-ba vigyük át. Egy rekombináns Agrobacterium törzset, amely a növény transzformálásához szükséges szekvenciákat tartalmazza, használunk levélkorongok megfertőzésére. A korongokat szelekciós táptalajra tesszük,, majd a sikeresen transzformált regenerált növényeket azonosítjuk. Az izolált növények rezisztensek a herbicid hatásaira, ha annak jelenlétében növesztjük. Más növényi vektorok, például növényi vírusok szintén megfelelő eszközök idegen DNS bejuttatására.

A növényi sejtek közvetlen transzformálása is használható a vektorok alkalmazása helyett. A kiválasztott növény protoplasztjait általában egy közegbe helyezzük a beviendő DNS-sel, valamint egy olyan reagenssel, amely elősegíti a protoplasztok felszínére tapadt DNS molekulák felvételét. Ebből a szempontból jól használható reagens a polietilén-glikol valamint a kalcium-foszfát.

Egy másik módszer szerint a DNS felvételét elektroporációval serkenthetjük. Ebben a módszerben egy elektromos impulzust használunk arra, hogy ideiglenesen pórusokat nyissunk a protoplaszt sejtmembránján, majd ezután a környező oldatban levő DNS a pórusokon keresztül bejut. Hasonlóképpen, mikroinjekció is alkalmazható a DNS molekuláknak közvetlenül a sejtekbe juttatására, előnyösen közvetlenül a sejtmagba.

Mindegyik előzőkben említett technikában a növényi sejt transzformációja tenyészetben történik meg. A transzformációt követően a protoplasztokat teljes növényekké kell regenerálni. Az érett növényeknek kalluszból vagy protoplaszt tenyészetből • *

-18való regenerálására ismert számos technika, nagyszámú különböző faj esetében [lásd például Handbook of Plánt Cell Culture, 1-5, (1983-1989) McMillan, NY). így, ha egyszer a transzformációt sikerült kivitelezni, akkor a szakmai ismeretek alapján már egyszerűen lehet az érett növényeket regenerálni a transzformált növényi sejtekből.

Más módszerek is ismertek, amelyekhez nincs feltétlenül szükség az izolált sejtek alkalmazására, ennek következtében regenerációs technikákra sem, ahhoz, hogy transzformációt kapjunk. Ezeket általában ballisztikus, vagy részecske gyorsítós módszereknek ismerik, amelyekben a DNS-sel borított fémrészecskéket belövik a növényi sejtekbe, vagy egy belövő szerkezettel [Kiéin et al, Natúré, 327. 70-73 (1987)], vagy elektromos töltéssel [EPO 270 356]. Ilymódon a tenyészetben levő növényi sejteket, illetve a növényi szaporító szerveket vagy sejteket, például a virágport, stabilan transzformálni lehet a kiválasztott DNS szekvenciával.

A jelen találmány bármilyen típusú növény, legyen egyszikű vagy kétszikű, transzformálására alkalmazható. Azok között a haszonnövények között, amelyeket herbicid rezisztenssé transzformáltak, megtalálható a kukorica, rizs, köles, zab, árpa, paradicsom, bors, szójabab, dohány, sárgadinnye, lucerna, cukorrépa, Brassica fajok, tök, burgonya, mogyoró, borsó, gyapot vagy kakaó. Az új szekvenciák használhatók még dísznövények transzformálására is, ilyenek például a rózsa, és a díszfák, például a fenyő.

A találmány szerinti új szekvenciák szelekciós bélyegekként is alkalmazhatók a növényi genetikai « · <·«♦·· · «·· • · * ♦ · 4 ·«· · · » ·««« ··

- 19 vizsgálatokban. A növényi transzformációban például a herbicid rezisztenciát kódoló szekvenciák hozzáköthetők egy számunkra érdekes génhez, és ezzel transzforrnáÍjuk a kiválasztott herbicid érzékeny növényi sejteket.

A mind a kiválasztott gént, mind a herbicid rezisztenciát kódoló szekvenciát tartalmazó konstrukciókat bejuttatjuk a növényi sejtekbe, majd a növényi sejteket a herbicid gátló koncentrációjának jelenlétében növesztjük. Az ezt a kezelést túlélő növényi sejtek feltehetően megkapták mind a rezisztencia gént, mind a kiválasztott gént, ennélfogva a feltételezett transzformánsok könnyen azonosíthatók.

A találmányt a továbbiakban az alábbi, nem korlátozó jellegű példákkal illusztráljuk.

I. Példa

Az Arabidopsis AHAS-t kódoló genomiális klón izolálása Egy 2,1 kb méretű EcoRI fragmentet, amely az érett

Arabidopsis AHAS promoterét, tranzit-peptidjét, és a struktúrgén egy részét tartalmazza, nick transzlációval ³²P-vel jelölünk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)], majd hibridizációs próbaként használjuk arra, hogy az Arabidopsis thaliana genomiális DNS-éből készített genomiális könyvtárat (Clontech, Palo Alto, CA) átvizsgáljunk vele. A membránokat 24 óra hosszat 42°C-normál hibridizáljuk 6xSSC, SxDenhardt oldat, 50 mmól nátrium-foszfát pH=7,2, 0,1% SDS és 100 Mg/ml denaturált heringsperma DNS összetételű oldatban. A membránokat többször mossuk 60°C-on lxSSC és 0,1% SDS összetételű oldatban. Hat • ···· ► · ·>« • · · 4 r * » ·« • ··· · * · «*.

• « * 4 *· ·** ·«« «0 0**4«<

- 20 rekombináns bakteriofágot (A22, A31, A42, A52, A72, A83) soroltunk a feltételesen pozitívok közé. Ezeket a bakteriofágokat tarfolt tisztításnak vetjük alá, majd alacsony multiplicitással Escherichia coli K802-t fertőzünk vele folyékony NZY táptalajban (az NZCYM összetétele: 10 g NZ amin, 5g NaCl, 5g élesztőkivonat, lg kazaminosav, 2g MgSO₄x7H2O és 1 mól TRIS-HC1 pH=7,2) Maniatis és munkatársai leírása szerint [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. A · folyadék tenyészeteket éjszakán át 300 per perc fordulatszámmal rázatva 37°C-on inkubáljuk. Az 50 ml térfogatú szuszpenzióban 1 mól NaCl és 8% PEG koncentrációt állítunk be, szilárd NaCl és szilárd PEG hozzáadásával. A szuszpenziót éjszakán át inkubáljuk 4°C-on, hogy a bakteriofágokat kicsapjuk. A bakteriofágokat centrifugálással ülepítjük (18 OOOxg, 20 perc). Az üledéket 2 ml Találmány pufferben szuszpendáljuk (10 mmól TRIS-HC1 pH=7,5; 10 mmól MgCl₂), CsCl lépcsős gradiensre rétegezzük (4,8 mól CsCl, 4,0 mól CsCl és 3,2 mól CsCl), majd 50 OOOxg-vel centrifugáljuk 1 óra hosszat egy SW60 kilendülőfejes rotorban. A fág-csíkot eltávolítjuk a 4,0/3,2 mól CsCl határfelületéről, egy 1,5 ml^-es Eppendorf csőbe tesszük, majd a bakteriofágokat 1 térfogat formamid hozzáadásával lizáljuk, és szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. A DNS-t kinyerjük, olymódon hogy az oldatban 10 mmól TRIS-HC1 pH=8,0 és 1 mmól Na2^_EDTA koncentrációt állítunk be, majd a DNS-t 2 térfogat 100%-os etanol hozzáadásával kicsapjuk. A bakteriofág DNS-t centrifugálással kinyerjük, 70%-os etanollal mossuk, majd TE pufferben oldjuk (a TE puffer összetétele: 10 mmól TRIS-HC1 pH=7,5; 1 mmól Na₂21

EDTA). A tisztított DNS-t egyszer extraháljuk fenol:kloroform: izoamilalkohol 24:24:1 arányú elegyével, etanollal kicsapjuk, majd 50-10Ö gliter TE pufferben oldjuk, mielőtt különböző restrikciós enzimekkel emésztenénk.

A hat rekombináns fágból származó DNS készítményeket különböző restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agaróz gélelektroforézissel vizsgáljuk (1%-os agaróz gél). A DNS-t nitrocellulóz membránra visszük át (Southern transzfer), majd hibridizáljuk (24 óra, 60°C, 2xSSC, SxDenhardt oldat, 50 mmól nátrium-foszfát, pH=7,2, 0,1% SDS és 100 Mg/ml denaturált heringsperma DNS) egy 900 bp méretű NcoI/EcoRI fragmenttel, ami a 2,1 kb méretű EcoRI fragment 3’ régióját képviseli (a tranzit peptide, valamint az érett kódoló régió 5’ részét).

A‘ szűrőt kétszer mossuk 65°C-on 0,5xSSC és 0,1% SDS összetételű oldattal. A 900 bp méretű Ncol/EcoRI fragment mind az A42, mind az A52 fragmenten egy 5,5 kb méretű Xbal és egy 2,1 kb méretű EcoRI fragmenthez hibridizál. Ezek az adatok összhangban vannak az Arabidopsis AHAS genomiális szekvenciájának klónozására és jellemzésére vonatkozó, publikált adatokkal [Mazur et al., Plánt Physiol., 85, 1110-1117 (1987)].

A további vizsgálatok céljára az A52 bakteriofágot választottuk ki. Az A52 5,5 kb méretű Xbal fragmentjét 1%-os agaróz gélből izoláljuk, majd IBI elektroelúciós berendezéssel tisztítjuk, a gyártó előírásai szerint. Az 5,5 kb méretű Xbal fragmentet. etanollal kicsapjuk, majd bi-desztillált vízben szuszpendáljuk. Ezeket a fragmenteket ligáijuk Xbal restrikciós enzimmel emésztett pSK(-) plazmid DNS-sel (gyártó: Stratagene, LA Jolla, CA). A fragmenteket 16-24 óra hosszat ligáljuk 14°C-on • ·

- 22 20 gliter térfogatban [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. Az inkubálást követően a 20 gliteres reakcióelegyet 100 gliterre hígítjuk 100 mmól TRIS-HC1 pH=7,2 pufferrel. Ebből a mintából 20 glitert tovább hígítunk 100 gliterre 100 mmól TRIS-HC1 pH=7,2 pufferrel, és 100 gliter kompetens Escherichia coli HB101 sejttel inkubáljuk a Morrison által leírt módszert alkalmazva [Methods in Enzymology, 68. 326-331 (1979)]. A plazmid/Escherichia coli transzformációs elegyet jégen inkubáljuk 20 percig, majd 2 percre 42°C-ra tesszük, utána 20 percre szobahőmérsékletre, ezt követően azonnal 1 ml LB táptalajt adunk hozzá (az LB táptalaj összetétele: 10 g Bacto-trypton, 5 g élesztőkivonat, 5 g NaCl és 10 ml 1 M TRIS-HC1 pH=7,2 literenként), majd tovább inkubáljuk 37°C-on 30 percig. Az ebben a munkában használt DNS plazmid klónozó vektor vagy kanamicin, vagy ampicillin rezisztencia gént tartalmaz. Ezért az egyes transzformációs elegyekből 200 glitert közvetlenül vagy LB+kanamicin vagy LB+ampicillin lemezekre szélesztünk (mindegyik antibiotikum koncentrációja 100 gg/ml), majd 12-20 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk, a telep méretétől függően.

A telepeket 3 ml LB+ampicillin vagy LB+kanamicin táptalajra visszük át, majd éjszakán át 37°C-on inkubáljuk állandó rázás közben. Kismennyiségű plazmid preparátumot készítünk a Maniatis és munkatársai által közölt alkalikus lízis módszer minimális módosításával [Maniatis et al., Molecular Cloning: A·Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. Rutinszerűen a 3 ml-es éjszakán át növesztett tenyészetből 400 pliter-t 1,5 ml-es Eppendorf csőben ülepítünk, majd 150 Mliter GTE oldatban szuszpendáljuk (a GTE oldat összetétele: 50 mmól glükóz, 25 mmól TRIS-HC1 pH=8,0 és 10 mmól Na₂-EDTA), utána 20 percig jégen inkubáljuk, majd 300 pliter lúgos SDS oldatot és 200 pliter 5 mólos K⁺/3 mólos OAc oldatot adunk hozzá az előírt időpontokban. A végső DNS üledéket 40 Mliter 50 ^g/ml koncentrációjú RN-áz A TE pufferben oldjuk. A plazmid DNS-ből 15 Mlitert kiveszünk restrikciós enzimmel emésztés céljára. Két plazmid, a pAC301 (5'--->3') és a pAC302 (3'--->5') olyan konstrukció, amely az 5,5 kb méretű Xbal fragmentet a pSK(-) plazmid Xbal helyére ligáivá tartalmazza. A pAC301 és pAC302 plazmidok további restrikciós elemzése megerősíti a promoter régió jelenlétét, a pSK(-) Xbal hasítási helyére klónozva. A pAC301 és pAC302 plazmidok további restrikciós elemzése megerősíti promoter régió, a tranzit peptid, az érett kódoló régió és a 3' nem-transzlálódó régió jelenlétét az Arabidopsis AHAS genomiális szekvenciájában [Mazur et ál., Plánt Physiol., 85, 1110-1117 (1987)].

II. Példa

Az Arabidopsis AHAS kódoló régió oligonukleotiddal végzett helvspecifikus mutagenezise (a) A pAC301 egyszálú templát előállítása

A pAC301 plazmidot az XL-1 Escherichia coli törzsbe transzformáljuk (Stratagene). A pAC301 egyszálú templát molekulát ebből a pSK(-) phagemid alapú konstrukcióból állítjuk elő, a gyártó előírásai szerint. Rutinszerűen 3 ml SB+ampicillin táptalajon növesztett tenyészetet adunk 50 ml

SB+ampicillin táptalajt tartalmazó steril lombikokhoz (az SB összetétele: 35 g Bacto-tryptone, 20 g élesztőkivonat, 5 g NaCl, 10 ml 1 mólos TRIS-HC1 pH=7.5 per liter), majd 37°C-on inkubáljuk rázatás közben (300/perc), amíg a tenyészet eléri az Ο°600⁼°'³ értéket. Ennél a pontnál a tenyészetet az R408 segítő fággal oltjuk be, majd éjszakán át erősen rázatjuk (300/perc) 37°C-on. A baktériumokat centrifugálással ülepítjük (10 OOOxg, 10 perc). A baktérium üledéket elöntjük, és a felülúszót (körülbelül 45 ml), amely az egyszálú pAC301 templátot tartalmazza, a felhasználásig 4°C-on tároljuk. A felülúszót rutinszerűen használhatjuk egy hónapig az egyszálú phagemid preparátumokhoz. Kismennyiségű plazmid preparátumot készítünk (1,2 ml) az egyszálú pAC301 phagemid DNS-ből, lényegében a gyártó (Stratagene) előírásai szerint. A fágot kicsapjuk 300 Mliter 3,5 mól NH4AC pH=7,5; 20% PEG összetételű oldat hozzáadásával. Az oldatot jól összekeverjük egy 1,5 ml-es Eppendorf csőben, majd 20 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az egyszálú fágokat centrifugálással ülepítjük (20 perc Eppendorf mikrocentrifugában). A felülúszót elöntjük, az üledéket mégszárítjuk, és végül 300 gliter TE pufferben oldjuk. A fágokat 200 /xliter fenol:kloroform: izoamilalkohol 24:24:1 arányú elegyével lizáljuk, majd 1 percig vortexeljük. Ezt a lépést még egyszer megismételjük, majd még kétszer extraháljuk kloroform:izoamilalkohol 24:1 arányú elegyével. A végső vizes fázist etanollal kicsapjuk (egytized térfogat 5 Μ K⁺/3 M OAc és két térfogat etanol), kétszer mossuk 70%-os etanollal, 20 pliter TE pufferben oldjuk és egy friss 1,5 ml-es Eppendorf csőbe visszük át.

(c) Ac oligonukleotid előállítása

Az összes oligonukleotidot a New England Biolabs-től vásároljuk. Oligonukleotidokat használunk arra, hogy (1) aminosav szubsztitúciókat vigyünk be az

Arabidopsis AHAs kódoló régió Trp574 csoportja helyére (Trp--->Leu), és (2) egy aminosav deléciót hozzunk létre a Trp574 aminosav csoport helyén.

Trp574----> Leu szubsztitúció

V	M	Q	W	E	D	R
vad típus 5'-GTT	ATG	CAA	TGG	GAA	GAT	CGG-3

mutáns

V	M	Q	L	E	D	R
5'-GTT	ATG	CAA	TTG	GAA	GAT	CGG-3' (21 tagú)

Trp574 deléció

V	M	Q	W	E	D	R
vad típus 5’-GTT	ATG	CAA	TGG	GAA	GAT	CGG-3

V M Q E D R mutáns 5'-G GTT ATG CAA --- GAA GAT CGC-3'(21 tagú)

Az egyes oligonukleotidokból 200 nanogrammot kináz kicserélő rekcióba viszünk, mielőtt a pAC301 egyszálú templáthoz hibridizálnánk. Egy 40 ^literes reakcióelegy összetétele 50 mmól TRIS-HC1 pH=7,5; 10 mmól MgC12, 50 mmól DTT, 0,1 mmól spermidin és 0,1 mmól Na2~EDTA. A reakciót 10 egység T4 polinukleotid kináz (Pharmacia) hozzáadásával indítjuk, majd 30 percig 37°C-on inkubáljuk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy a reakcióelegy hőmérsékletét 3 percre 37°C~ra emeljük. A kináz reakció felét a teljes 20 Mliter pAC301 egyszálú preparátumhoz adjuk, majd 10 percig 65°C-on inkubáljuk, hogy elősegítsük a hibridizációt. Ehhez a 40 /iliteres kináz/oligonukleotid elegyhez 6 /xliter 1 mmólos dNTP-ket, 6 Mliter lOx ligáz puffért (500 mmól TRIS-HC1 pH=7,5; 70 mmól MgC12, 10 mmól DTT), 2 gliter 10 mmólos rATP-t, 5 egység Klenow DNS polimerázt (Pharmacia), 8 egység DNS ligázt (Stratagene) és 4 Mliter bi-desztillált vizet adunk. A polimeráz/ligáz reakciót 3 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. A reakcióelegy egyharmadát használjuk kompetens Escherichia coli XL-1 sejtek transzformálására. A transzformációs elegyet LB+ampicillin tartalmú lemezekre szélesztjük, majd éjszakán át 37°C-on inkubáljuk. A transzformánsokat friss LB+ampicillin lemezekre oltjuk át hálós elrendezésben. A telepek hibridizálással való átvizsgálását pontosan ugyanúgy végezzük, ahogy a Stratagene Technical Service (June 1988/pBSII Exo/Mung Beán DNA Sequencing System) előírja. Mindkét oligonukleotidot kináz kicserélési reakcióban ³²P-ATPvel jelezzük (300 ng oligonukleotid 40 gCi szigma³²P-ATP jelenlétében, az előzőkben leírt kináz körülmények alkalmazásával). A beépületlen ³²P-ATP-t eltávolítjuk, olymódon hogy a kináz reakcióelegyet 20%-os akrilamid/7 mól karbamid gélen elektroforetizáljuk. A 21-tagú oligonukleotidnak megfelelő radioaktív csíkot egy borotvapengével kivágjuk a gélből, majd eluáljuk vagy (1) az összetörés és áztatás módszerével [Maxam and • ···· ·· Μ ·· • ··· · · « ··· • · · · · · ··· ··· · · ···· · ·

- 27 Gilbert, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 560-566 (1977)], vagy (2) elektroelúcióval, egy IBI elektroelúciós berendezés alkalmazásával. A tisztított, radioaktív izotóppal jelzett oligonukleotidokat a nitrocellulóz membránra tapadt telepekhez hibridizáljuk nem-szigorú körülmények között (37°C 24 óra hosszat 6xSSC, SxDenhardt féle oldat, 50 mmól Na-P pH=7,2 és 500 Mg/ml borjútimusz DNS összetételű oldatban). A membránokat egyszer mossuk szobahőmérsékleten 6xSSC és 50 mmól Na-P pH=7,2 összetételű oldatban, majd ismét mossuk 37°C-on 6xSSC és 50 mmól Na-P pH=7,2 összetételű oldatban. A membránokat végül kétszer mossuk 60°C-on 15 percig 3 mól tetrametil-ammónium-klorid, 50 mmól TRIS-HCl pH=7,5, 2 mmól Na₂-EDTA, és 1 mg/ml SDS összetételű oldatban. Egy 21 tagú oligonukleotid, amely tökéletesen hibridizálódik (azaz a mutáns oligonukleotid a mutáns phagemidhez) nem mosódik le a phagemid DNS-ről 60°C-on, míg a minimális eltérést tartalmazó oligonukleotid (azaz a mutáns oligonukleotid a vad típusú phagemidhez) lemosódik. A feltételezett pozitív telepeket az eredeti LB+ampicillin lemezekről friss LB+ampicillin lemezekre szélesztjük. Minden egyes újra szélesztett feltételezett pozitív telepből tíz transzformánst hálós formában átoltunk, majd a telephibridizálást megismételjük. A szekunder pozitív telepeket a Trp574 kódoló régió DNS szekvencia elemzésével megerősítjük [Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463-5467 (1977)]. A további elemzések céljára két pozitív mutánst, a pAC324-et (Trp574 ---> Leu szubsztitúció) és a pAC325-öt (Trp574 deléció) választunk ki.

• · • · • · • · · ·

III. Példa

A dohány transzformálása Agrobacterium segítségével (a) A vektorok előállítása

Mind a vektorokat, mind az Agrobacterium törzseket a Clontech-től vásároltuk. A pBIN19 egy Escherichia coli/ Agrobacterium bináris ingázó vektor, amely a Ti plazmidnak mind a baloldali, mind a jobboldali határoló szekvenciáját tartalmazza, emellett egy polilinkert, egy Escherichia coli-ban és Agrobacterium-ban működő replikációs origót, és egy kanamicin rezisztencia gént [Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8721 (1984)]. A pAC324 és pAC325 plazmidokat Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, majd egy 1%-os agaróz gélen elektroforetizáljuk. A pAC324 és pAC325 megfelelő mutációit tartalmazó 5,5 kb méretű Xbal fragmentet az előzőkben leírtak alapján izoláljuk. A pBIN19 plazmidot Xbal restrikciós enzimmel emésztjük, majd külön-külön reakcióelegyben inkubáljuk a pAC324ből és a pAC325-ből származó 5,5 kb méretű fragmenttel. A teljes ligáló elegyet Escherichia coli XL-1 sejtekbe transzforrnáÍjuk, majd a pozitív transzformánsokat a kék/fehér szelekció alapján választjuk ki LB_aj_x lemezeken (LB táptalaj 100 gg/ml ampicillinnel, 80 Mg/ml X-Gal-lal, és 20 mmól IPTG-vel kiegészítve). A pozitív transzformánsok megerősítésére a kismennyiségű plazmid preparátumokat, a restrikciós enzimes elemzést és az agaróz gélelektroforézist az előzőkben leírt módon hajtjuk végre. A négy pBIN19 alapú plazmid konstrukció közül, a pAC348-pAC349 (a Trp574 ---> Leu szubsztitúciót hordozó

5,5 kb méretű Xbal fragmentet mindkét orientációban tartalmazó pBIN19 vektor) és a pAC350-pAC351 (a Trp574 deléciót hordozó • ·

5,5 kb méretű Xbal fragmentet mindkét orientációban tartalmazó pBIN19 vektor) közül egyet választunk ki a dohány transzformálására.

(b) A pAC348-pAC351 mobilizálása Agrobacteriumba'

A pRK2013 egy konjugatív plazmid, amely azokat a transzható szekvenciákat tartalmazza, amelyek ahhoz kellenek, hogy a pBIN19 alapú konstrukciókat Escherichia coli-ból a legyengített Agrobacterium LBA4404 (pAL4404) törzsbe juttassuk. Ez az Agrobacterium törzs streptomicin rezisztens, és a legyengített pAL4404 Ti plazmid-t tartalmazza [Ooms et al., Plasmid, 7, 15-29 (1982). Ez a Ti plazmid szolgáltatja azokat a transz-ható virulencia funkciókat, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a pBIN19 alapú T-DNS régió könnyen bejusson a dohány kromoszómájába. A pBIN19 alapú vektorok, a pRK2013 konjugatív plazmid és az Agrobacterium LBA4404 törzsek közötti háromszülős keresztezést lényegében Bevan leírása szerint végezzük [Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8721 (1984)]. A pAC348-351 (kanamicin rezisztens) és a pRK2013 (kanamicin rezisztens) plazmidokat kompetens Escherichia coli HB101 vagy XL-1 törzsekbe transzformáljuk, az előzőkben leírt módon. Az egyes plazmidokat tartalmazó transzformánsokat 3 ml térfogatú LB+kanamicin összetételű táptalajba oltjuk, majd 37°C-on rázatjuk. Az LB4404 Agrobacterium törzset AB_st_rp táptalajba oltjuk (A 20x AB összetétele: 20 g Nh₄Cl, 6 g MgSO₄x7H2O, 3 g KC1, 60 g K₂HPO₄, 20 g NaH₂PO₄, 3 g CaCl₂, és 50 mg FeSO₄x7H₂O. A glükózt lx oldat formájában adjuk hozzá, végkoncentrációja 0,5x), majd 28°C-on rázatjuk 36-48 óra hosszat. A háromszülős keresztezést úgy • · ··· ··· · - «« · ·«««· · · · · · • · · · » · Λ»· ··· ·♦ ···· ··

- 30 indítjuk, hogy mindhárom tenyészetből (a pBIN19 alapú konstrukcióból, a pRK2013-ból és az LBA4404-ből) 1-1 ml-t elegyítünk egy steril csőbe, majd az inkubálást további 1 óra hosszat folytatjuk. A tenyészetet egy 0,45 μτη-es szűrőre vákuumszűrjük, majd éjszakán át 28°C-on tartjuk egy NB lemezen (az NB összetétele: 4 g Difco Nutrient Broth por és 10 ml TRISHC1 pH=7,2). A membránt 2 ml friss AB táptalajba tesszük, majd egy óra hosszat lassan forgatjuk. Egy higítási sorozatot szélesztünk AB_st_rp/k_an lemezekre, majd 28°C-on inkubáljuk 3-4 napig. Csak a pBIN19 alapú konstrukciókat (kanamicin rezisztens) hordozó Agrobacterium (streptomicin rezisztens) képes az ^ABstrp/kan táptalajon kinőni. Az ΑΒ₃·(-_Γρ/]ζ_3η lemezekről különálló telepeket izolálunk és AB_sf_rp/k_an táptalajra oltjuk, majd 28°Con rázatjuk 36-48 óra hosszat. Ezeket a tenyészeteket AB_st_rp/kan lemezekre szélesztjük, 3-4 napig 28°C-on inkubáljuk, és felhasználásig 4°C-on tároljuk.

(c) Dohány transzformálása Agrobacterium segítségével

A pAC348 és pAC351 plazmidokat 50 ml ABk_an táptalajba oltjuk, majd 28°C-on rázatjuk 36-48 óra hosszat. A baktériumokat centrifugálással ülepítjük (2500 per perc, 10 perc, Damon/IEC asztali centrifuga). A kiülepedett baktériumokat 5 ml BAT táptalajban szuszpendáljuk (a BAT táptalaj összetétele lx MS sók [Murashige and Skoog, Plánt Physiol., 15, 473-497 (1962)], lx B5 vitamin (ΙΟΟχ B5 összetétele 10 mg mio-inozit, 100 mg nikotinsav, 100 mg piridoxin-HCl és 1000 mg tiamin-HCl egy literben), 3% szacharóz, 5 Mmól 6-benzilamino-purin, pH=5,7).

- 31 Fiatal, üvegházban nőtt Wisconsin 38 dohányleveleket 2 hosszirányú vágással felszabdalunk, majd Ivory kézmosószappant tartalmazó melegvízbe merítjük. A levéldarabokat steril desztillált vízzel mossuk, majd 10 %-os Clorox + Tween 20 oldatba merítjük 10 percre, és háromszor öblítjük bi-desztillált vízzel. A levéldarabokból korongokat vágunk ki, vagy egy dugófúrót, vagy egy lukasztót használva erre a célra. Ezeket a korongokat 50 ml-es csőbe tesszük, amely a felszuszpendált Agrobacterium tenyészetet tartalmazza. A szuszpenziót óvatosan kevertetjük 5 percig, majd steril papírtörülközőre tesszük, és ezt BAT táptalaj-lemezekre rakjuk (100 x 20 mm-es lemezek, körülbelül 10 korong per lemez). A lemezeket azután 48 óra hosszat 25°C-on inkubáljuk fluoreszcens lámpa alatt. A korongokat azután szelekciós táptalajra tesszük (BATCK: BAT táptalaj plusz karbenicillin és kanamicin), majd a kiindulási inkubálási körülmények közé tesszük, amíg a hajtások kialakulnak. A kanamicin rezisztens hajtásokat azután OTCK (gyökereztető) szelekciós táptalajra tesszük (az OTCK táptalaj összetétele ugyanaz mint a BATCK táptalajé, csak nincs benne 6benzilamino-purin) (GA7) Magenta dobozokban, és az előzőkben leírt módon folytatjuk az inkubálást. Mihelyt a kanamicin rezisztens hajtások megfelelő gyökérrendszert hoznak létre (legalább 3, 1 cm-nél hosszabb gyökér), a növényeket talajra tesszük. Röviden, az agar alapú hajtásokat eltávolítjuk a GA7 dobozokból, az agart óvatosan lemossuk meleg csapvízzel, majd a hajtásokat metromix-be tesszük, GA7 tartókban levő borsóedényekben. A növényeket üvegházba tesszük, majd hagyjuk megerősödni. Összesen 5 kanamicin rezisztens, a pAC348 plazmidot ·* ν *4*9·· * ··· * · · ·*· • ♦ · · · * * 4 · »»» · 9 ··F · ··

- 32 tartalmazó, és 9 kanamicin rezisztens, a pAC350 plazmidot tartalmazó hajtást teszünk át talajra. Körülbelül 10-14 nappal később, a borsó-edényeket nagyobb edényekbe tesszük át.

pAC348 pAC351

Transzformáns száma_____________Transzformáns száma

1)	19-1	1)	10-1
2)	33-1	2)	20-1
3)	33-2	3)	20-2
4)	46-1	4)	20-3
5)	46-2	5)	27-1
		6)	27-2
		7)	27-3
		8)	30-1
		9)	42-4

IV. Példa

A herbicid rezisztenciát biztosító mutánsok meghatározása és jellemzése

AHAS enzim vizsgálat (levélszövet):

Röviddel azután, hogy az üvegházba átvittük, a kanamicin rezisztens transzformánsok leveleiből kivonatot készítünk, és vizsgáljuk, hogy érzéketlenek-e a Pursuit imidazolinon herbicidre. Az acetohidroxi-sav szintetázt extraháljuk, majd az előző részben leírt módon vizsgáljuk. Két kanamicin rezisztens transzformáns (33-1 és 46-2), amelyek az Arabidopsis AHAS alléljének a Trp--->Leu mutáns alléljét tartalmazzák, a Pursuit herbicid jelenlétében AHAS aktivitást mutatnak. Emellett, az egyik kanamicin rezisztens deléciós transzformáns (10-1) érzéketlen a hozzáadott Pursuit herbicidre (7. ábra). Ezt a Trp574 deléciós transzformánst önmagával keresztezzük, majd visszakeresztezzük a Wisconsin 38-cal. A 10-1 utódai a kontroll dohánynövényekre letálisnál 4-8-szor nagyobb koncentrációban elviselik ha megjelenés után Pursuit herbicidet adnak hozzájuk.

A 2(a)-(c) ábrákon a fentiekben említett keresztezések és kontrollok fenotípusainak fényképes összehasonlítását láthatjuk. Ezek a megfigyelések azt mutatják, a transzformált növényi szövetből kivont kiindulási AHAS vizsgálatban megfigyelt rezisztencia öröklődik, és ez a tulajdonság az egész növényben expresszálódik.

Egy mennyiségi vizsgálatban az Arabidopsis AHAS Trp574 deléciós mutációját tartalmazó transzgenikus dohánynövény (10-1) önmagával keresztezett utódai, valamint az érzékeny kiindulási Wisconsin 38 variáns magvait ültetjük Metró Mix 350 talajba,

12,5 cm-es Azalea edényekbe. A palántákat 2 nap elteltével egyetlen, legerősebb palánta meghagyásával kiegyeljük. Tizenegy nappal később, ezeket a növényeket megjelenés után permetezzük Pursuit-tal 0, 10, 20, 40, 80 és 160 g/ha mennyiségben. Az egyes dohánytípusokból (transzgenikus és kontroll) öt-öt növényt permetezünk le az egyes herbicid dózisokkal. Tween 20-at adunk a herbicid oldatokhoz 0,25 térf% mennyiségben a permetezés előtt. A herbicidet laboratóriumi permetezővel visszük ki 400 liter/ha mennyiségben, a növények felett 45 cm magasan, 8,2 mp/ford sebességgel, #65015E számú permetezőfúvókával. A növények magasságát a kezelés után 1, 2, 3, és 4 héttel mérjük, a növények friss súlyára vonatkozó adatokat négy és fél hét elteltével kapjuk.

Ezeknek a permetezéseknek az eredményei láthatók a 4. ábrán. A grafikonban az utódok adatait a legtoleránsabb első, és a legérzékenyebb utolsó egyeddel adjuk meg az egyes herbicid dózisoknál. Amint az a grafikonról látható, és amint az várható volt az eredeti transzgenikus növény önmagával való keresztezéséből származó utódoknál, az utódokban a herbicid tolerancia szegregál. Mind érzékeny utódok, mind különböző mértékben herbicid-tűrő utódok megfigyelhetők.

A növények friss súlyát (g) és az egyes herbicid dózisok átlagát a 2. táblázatban adjuk meg, az átlagos friss súlyokat (g) foglalva össze az alábbiakban (1. táblázat):

1. Táblázat

A dohány átlagos súlya kontroll Transzgenikus utód (5 ismétlés)

Herbicid dózis:

0 g/ha	52,1	53,7
10 g/ha	8,1	36,4
20 g/ha	2,0	28,8
40 g/ha	0,8	20,9
80 g/ha	0,6	26,5
160 g/ha	0,2	21,4

Amint az ebből a táblázatból látható, a transzgenikus • ·

- 35 dohánynövény (10-1) nagymértékben toleráns a megjelenés után alkalmazott Pursuit herbicidre. Az érzékeny szülői variáns semmilyen herbicid toleranciát nem mutat, egyik vizsgált dózisban sem.

A transzgenikus 10-1 növényből származó magvakat is megvizsgáltuk, a Pursuit imidazolinonnal szembeni rezisztencia szempontjából. A magvakat 0, 1,25, 2,5, 3,75 és 5,0 μπιόΐ Pursuitot tartalmazó táptalajra tesszük. Lemezenként húsz magot teszünk ki, és kezelésenként két lemezt használunk. A hajtások herbicid toleranciáját három hét elteltével értékeljük. Az 5,0 mmólos kezelés eredményei a 2. táblázatban láthatók. Még a legkisebb koncentrációban is (1,25 gmólos kezelés), a kontroll növények herbicid érzékenységet mutattak. Ezek az eredmények a herbicid rezisztencia tulajdonság öröklődését mutatják a 10-1 növény és az utódai között.

2. Táblázat

A dohánvmag vizsgálat eredményei

A Pursuit

konc, (/xmól) : 5	S*	D	R
Utód: W38 (vad típus)	20	0	0
	20	0	0
10-1	7	6	6
önkeresztezés	3	11	6
10-1 x 0	11	9	0

	11	9	0
0 x 10-1	10	9	0
	8	8	0

*: S=érzékeny D=károsodott R=rezisztens

V. példa

Az AHAS enzim vizsgálata Escherichia coli-ban

AHAS enzim vizsgálat (expresszié Escherichia coli-ban

A helyspecifikus mutagenezisnek alávetett plazmidokat, a pAC224-et és pAC225-öt használjuk templátként egy Escherichia coli alapú expressziós rendszer kidolgozására. A herbicid érzéketlenséget vizsgáljuk, amikor a kiválasztott magasabbrendű növény génjét egy baktérium törzsben expresszáljuk, amely nem tartalmaz AHAS aktivitást. Ebből a célból a vad típusú Arabidopsis AHAS (pCA301) NcoI/PstI fragmentjét, a Trp574-Leu szubsztitúciót tartalmazót (pAC224) és a Trp574 deléciót tartalmazót a pKK233-2 Escherichia coli expressziós vektor (Pharmacia) NcoI/PstI hasítási helyére klónozzuk. Ez az expressziós plazmid tartalmaz egy IPTG-vel indukálható promotert, valamint egy transzkripciós terminációs szekvenciát. A két régió egy Ncol, Hindin és PstI hasítási helyeket tartalmazó linker szekvenciát vesz közre, amely lehetővé teszi, hogy a kiválasztott gént a baktérium promoterhez viszonyítva a megfelelő orientációban építsük be. A megfelelő NcoI/PstI fragmentek szubklónozása az NcoI/PstI restrikciós enzimmel emésztett pKK233-2 DNS-be (ampicillin rezisztencia) az előzőkben leírt módon megy végbe. A ligáló reakcióelegyet az MF2000 Escherichia coli törzsbe (ilvB800:mutagén kezelés-1, Bgl32, ilvI15, thi-1, argE3, RPSL31, (ara-leu, ilvH) 863, mtl-1, xyl-5 galK2, lacYI, recAI) transzforrnáÍjuk. Ebből a baktériumból hiányzik az AHAS aktivitás. Ennélfogva, ha egy olyan táptalajon növesztjük az MF2000 törzset, amelyből az izoleucin és a valin hiányzik (ezek az aminosavak annak a bioszintézis útnak a végtermékei, amelyben az AHAS enzim résztvesz), akkor ez csak akkor lehetséges, ha a törzset vagy a pAC224 (Trp564-Leu) vagy a pAC224 (Trp dél) plazmiddal transzformáltuk, mert a növekedéshez az Arabidopsis gén Escherichia coli-ban való működésére és expressziójára van szükség. Mind a három konstrukció komplementálja az MF2000 törzset agar táptalajon, valamint folyadék tenyészetben.

A pAC210, pAC224 vagy pAC225 plazmid konstrukciókat tartalmazó MF2000 telepeket 3 ml M63 folyadék minimál táptalajba (ampicillin) oltjuk, amely arginint, leucint, izoleucint és valint tartalmaz. [Az M63 összetétele: 30 g KH2PO_4/ 70 g K2HPO₄, 20 g (NH₄)2SO₄, 5 mg FeS0₄, 100 μΐ 1 mólos MgSO₄, 200 μΐ tiamin. A glükóz koncentrációt 1,2%-ra emeltük. A tenyészeteket éjszakán át 37°C-on inkubáljuk. A baktérium sejteket ülepítjük, néhány ml M63 (ampicillin) táptalajban szuszpendáljuk, amelyet argininnel és leucinnal egészítettünk ki, de amelyekből az izoleucin és a valin hiányzik (mínusz ilv táptalaj). A sejteket 10-50 ml mínusz ilv táptalajba tesszük, majd éjszakán át 37°C-on rázatjuk. A sejteket ülepítjük, majd vagy közvetlenül használjuk az AHAS enzimvizsgálatokban, vagy a felhasználásig -20°C-on tároljuk.

Az Arabidopsis AHAS baktériumsejtekből való kinyerését • · · · · • · · · · • · ···· · ·

-38-.

és vizsgálatát lényegében a Singh és munkatársai által leírt’ módszerrel végezzük [Journal of Chromatograpy, 444. 251-261 (1988)]. A baktérium üledéket cseppfolyós nitrogénben elporítjuk, majd 100 mmólos kálium-foszfát pufferben (pH=7,5), amely 10 mmól piruvátot, 5 mmól magnézium-kloridőt, 5 mmól Na₂EDTA-t, 100 mmól flavin-adenin dinukleotidot (FAD), 1 mmól valint, 1 mmól leucint, 10 súly/tf% glicerint és 10 mmól ciszteint tartalmaz, homogenizáljuk. A homogenizátumot nylon hálón szűrjük át (53 Mm mesh), majd 25 000 x g-vel centrifugáljuk 20 percig. A felülúszó frakcióban ammóniumszulfát 50%-os telítettségét állítjuk be, majd 20-30 percig hagyjuk jégen állni. Az üledéket centrifugálással ülepítjük (25 000 x g, 20 perc). A felülúszót elöntjük, majd az ammóniumszulfát csapadékot azonnal felhasználjuk, illetve cseppfolyós nitrogénben lefagyasztjuk, és felhasználásig -20°C-on tároljuk.

Az AHAS aktivitást a herbicid jelenlétében illetve távollétében a termék, az acetolaktát becslésével mérjük, miután savas dekarboxilezéssel acetoinná alakítottuk. A standard reakcióelegy tartalmazza az enzimet (és a herbicidet) 50 mmólos foszfát pufferben pH=7,0, amely 100 mmól nátrium-piruvátot, 10 mmól magnézium-kloridot, 1 mmól tiamin-pirofoszfátot (TPP) és 10 Mmól FAD-ot tartalmaz. Ezt az elegyet 1 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk. A reakciót 0,85 % végkoncentrációjú kénsav hozzáadásával állítjuk le.. A reakcióelegyet hagyjuk dekarboxileződni 60°C-on 15 percig. A keletkező acetoint úgy határozzuk meg, hogy 0,17% keratinnal és 1,7% 1-naftollal inkubáljuk Westerfeld módszere szerint [Journal of Biological Chemistry, 161, 495-502 (1945)]. Az enzimvizsgálat során * *··· ·· »· ·· ··· · · » · · · • ··· · · · ··· • · · · · · ··· ··· ·· ···· ··

- 39 közvetlenül keletkező acetoint megfelelően ellenőrizzük.

A vad típusú Arabidopsis AHAS (pAC201) érzékeny a Pursuit imidazolinon herbicidre és a Glean szulfonil-karbamid herbicidre, míg mind a Trp574-Leu helyettesítést tartalmazó (pAC224) mind a Trp574 deléciót tartalmazó (pAC225) érzéketlen a Pursuit herbicid (4. ábra) ás a Glean herbicid (5. ábra) növekvő koncentrációjára. Meglepő módon a deléció nagyobb rezisztenciát biztosít ezekre a herbicidekre, mint a megfelelő szubsztitúció. Ennélfogva az Arabidopsis thaliana AHAS kódoló régiójában a Trp574 csoport deléciója az enzimnek egy olyan funkcionális alakját eredményezi, amely érzéketlen a két, egymással szerkezeti rokonságban nem álló herbicid hozzáadására, amelyek képesek az említett enzim vad formájának a gátlására.

A fentiekben említett eljárások használhatók emellett arra is, hogy egy aszparagin csoportot szerinre cseréljünk le a 653-as pozícióban, illetve a deléciót vigyünk be ebbe a pozícióba. A szubsztitúciót (pAC229) vagy a deléciót tartalmazó (pAC230) plazmidokat Escherichia coli MF2000-be transzformáljuk, majd a deléciós és szubsztitúciós mutánsok AHAS aktivitását megmérjük a Pursuit illetve Glean herbicidek jelenlétében az említett transzformánsokra. Az aszparagin helyett szerint tartalmazó AHAS érzéketlen a Pursuit általi gátlásra (6. ábra), amint azt korábban közölték [Sathasivan et al., Nucleic Acids Research, 18, 2188 (1990)], de a Glean elleni érzéketlenség csak enyhén csökkent (körülbelül 10%), a vad típusú enzimhez viszonyítva (7. ábra). Ezzel szemben, a Ser653 deléciót tartalmazó AHAS nagyon rezisztens mind a Pursuit, mind a Glean által okozott gátlással szemben (6. és 7. ábra).

- 40 A biológiai anyagok letétbe helyezése

Az alábbi mikroorganizmusokat helyeztük letétbe 1990 december 6-án az American Type Culture Collection-nél, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20857, az alábbi letéti sorszámok alatt.

Mikroorganizmus_________________Letéti szám

Agrobacterium LBA4404 68488 törzs, amely a pAC351 plazmidot tartalmazza (Agro/351) Trp574 deléció)

Agrobacterium LBA4404 68489 törzs, amely a pAC324 plazmidot tartalmazza [Ser653 deléció]

Claims (20)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy funkcionális AHAS enzimet kódoló nukleinsav szekvencia, azzal jellemezve, hogy az enzim aminosav szekvenciája eltér a vad típusú AHAS szekvenciájától, és ez a legalább egy aminosavat érintő deléció az enzim herbicid rezisztenciáját biztosítja.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti szekvencia, azzal jellemezve, hogy a deléció az AHAS szekvencia konzervált régiójában található.
3. 3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti szekvencia, azzal jellemezve, hogy a deléció a vad típusú Arabidopsis AHAS szekvenciának abban a régiójában fordul elő, amely a 119-122-es, a 194-197-es, 201-208-as, a 255-257-es, a 348-353-as, a 373377-es, az 569-578-as és a 650-653-aminosavakat kódolja, illetve egy eltérő fajban a homológ régióban.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti szekvencia, azzal jellemezve, hogy a deléció az alábbi aminosav pozíciók közül legalább egyben fordul elő: 121, 122, 197, 205, 256, 351, 376, 571, 574, 578 és 653.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti szekvencia, azzal jellemezve, hogy a rezisztencia az imidazolinon, szulfonil-karbamid és triazolo-pirimidin csoportokba tartozó herbicidek közül legalább eggyel szemben megmutatkozik.
6. 6. Működőképes AHAS enzim, azzal jellemezve, hogy aminosav szekvenciája eltér a vad típusú AHAS szekvenciájától, és ez a legalább egy aminosavat érintő deléció az enzim herbicid rezisztenciáját biztosítja.

   β« · «f « « • 4
7. 7. A 6. igénypont szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy a deléció az AHAS szekvencia egyik konzervált régiójában van.
8. 8. A 6-7. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy a deléció a vad típusú Arabidopsis AHAS szekvenciának abban a régiójában fordul elő, amely a 119-122-es, a 194-197-es, 201-208-as, a 255-257-es, a 348-353-as, a 373377-es, az 569-578-as és a 650-653-aminosavakat kódolja, illetve egy eltérő fajban a homológ régióban.
9. 9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy a deléció az alábbi aminosav pozíciók közül legalább egyben fordul elő: 121, 122, 197, 205, 256, 351, 376, 571, 574, 578 és 653.
10. 10. Egy funkcionális AHAS enzimet kódoló nukleinsav szekvenciát tartalmazó vektor, azzal jellemezve, hogy az aminosav szekvenciája eltér a vad típusú AHAS szekvenciájától, és ez a legalább egy aminosavat érintő deléció az enzim herbicid rezisztenciáját biztosítja.
11. 11. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav szekvenciát tartalmazza.
12. 12. A 10. igénypont szerinti vektort tartalmazó gazdasejt.
13. 13. Egy működőképes AHAS enzimet kódoló nukleinsav szekvenciát tartalmazó növényi sejt, azzal jellemezve, hogy az enzim aminosav szekvenciája eltér a vad típusú AHAS szekvenciájától, és ez a legalább egy aminosavat érintő deléció az enzim herbicid rezisztenciáját biztosítja.
14. 14. Egy működőképes AHAS enzimet kódoló nukleinsav szekvenciát tartalmazó herbicid rezisztens növényi sejt, azzal jellemezve, hogy az enzim aminosav szekvenciája eltér a vad típusú AHAS szekvenciájától, és ez a legalább egy aminosavat érintő deléció az enzim herbicid rezisztenciáját biztosítja.
15. 15. A 14. igénypont szerinti növény magja.
16. 16. A 14. igénypont szerinti növény virágpora.
17. 17. Eljárás egy növényi sejt herbicid rezisztenssé tételére, azzal jellemezve, hogy a növénybe olyan nukleinsavat juttatunk, amely működőképes AHAS enzimet kódol, és az enzim' aminosav szekvenciája eltér a vad típusú AHAS szekvenciájától, és egy legalább egy aminosavat érintő deléció az enzim herbicid rezisztenciáját biztosítja.
18. 18. Eljárás herbicid rezisztens növények termesztésére, azzal jellemezve, hogy egy olyan funkcióképes AHAS enzimet termelő növényt, amelyben az AHAS enzim aminosav szekvenciája eltér a vad típusú AHAS szekvenciájától, és egy legalább egy aminosavat érintő deléció az enzim herbicid rezisztenciáját biztosítja, a herbicid gátló mennyiségének jelenlétében növesztjük.
19. 19. Eljárás a kiválasztott génnel sikeresen transzformált gazdasejtek szelektálására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtekbe a kiválasztott gént az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav szekvenciával látjuk el és így juttatjuk be, majd a sejteket a herbicid gátló mennyiségének jelenlétében növesztjük, és a túlélő sejteket a kiválasztott

    - 44 gént tartalmazó sejteknek tekintjük.
20. 20. Nukleinsav konstrukció, azzal jellemezve, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti szekvenciát egy agronómiailag hasznos tulajdonságot kódoló génhez kötjük.