CN108342376A - 芸苔属中突变的乙酰羟酸合酶基因 - Google Patents

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Abstract

本发明的发明名称是芸苔属中突变的乙酰羟酸合酶基因。本申请提供了突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)核酸和该突变核酸编码的蛋白。还提供了包含该突变基因的油菜植物、细胞和种子。

Description

芸苔属中突变的乙酰羟酸合酶基因
本申请是分案申请，原申请的申请日为2008年10月3日、申请号为200880119084.3(PCT/US2008/078798)、发明名称为“芸苔属中突变的乙酰羟酸合酶基因”。
相关专利申请的交叉参考
本申请要求2007年10月5日提交的美国临时申请第60/977,944号的权益，其通过引用包括说明书、图和表的全部内容并入本文，用于所有目的。
技术领域
本发明涉及抗除草剂植物和种子领域，以及更具体而言，涉及乙酰羟酸合酶(AHAS)基因和蛋白的突变。
背景技术
下列描述只是提供来帮助理解本发明，而不是承认其描述或构成本发明的现有技术。
耐受除草剂的植物的益处是已知的。例如，耐受除草剂的植物可以减少对控制杂草的耕作的需要，从而有效地减少土壤侵蚀。
外源突变基因向植物中的导入被充分评述。例如，美国专利第4,545,060号涉及通过将编码EPSPS变体的基因导入植物的基因组中来增强植物对草甘膦的抗性，所述EPSPS变体具有至少一种突变，该突变使得酶更加抵抗其竞争性抑制剂，即草甘膦。
AHAS基因中的一些突变的实例是已知的。参见例如，美国专利第7,094,606号。
通过化学诱变，在较低表达的AHAS I基因中发现了突变。该突变被称为PM-1(基于拟南芥(Arabidopsis)的乙酰乳酸合酶(ALS)氨基酸序列在已知为653的等同位置处的突变，丝氨酸改变为天冬酰胺的氨基酸改变，分别如下进行编码-AGT改变为AAT)。另一种突变在较高表达的基因AHAS III中被发现，称为PM-2(在已知为574的等同位置处的突变，色氨酸改变为亮氨酸的氨基酸改变，分别如下进行编码-TGG改变为TTG)。在称为Clearfield油菜的油菜商业品种中组合了这两个突变PM-1和PM-2(Tan等,2005)。
发明内容
本发明部分涉及突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)核酸和这些突变的核酸编码的蛋白。本发明还部分涉及包含这些突变核酸和蛋白的油菜(canola)植物、细胞和种子。
在一方面，提供编码芸苔属(Brassica)乙酰羟酸合酶蛋白的分离核酸，所述蛋白在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574、R577和S653。在一些实施方式中，所述分离核酸编码具有选自如下的一个或更多个突变的蛋白：在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代(置换)为缬氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置376的位置处天冬氨酸取代为谷氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为甲硫氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置577的位置处精氨酸取代为色氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺和在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺，其中突变不是芸苔属AHAS I基因中的S653N。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸，其中突变不是芸苔属AHAS III基因中的W574L。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为缬氨酸。在其它实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸。在其它实施方式中，分离核酸编码具有选自表2中示出的突变的突变的蛋白。在某些实施方式中，分离核酸编码具有两个或更多个突变的蛋白。在一些实施方式中，所述两个或更多个突变选自表2。在一些实施方式中，分离核酸编码的蛋白在对应于SEQ ID NO:1的S653的位置处具有突变和在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574和R577。在其它实施方式中，分离核酸编码的蛋白具有在对应于SEQ ID NO:1的W574的位置处的突变和在对应于SEQ ID NO:1的R577的位置处的突变。在一些实施方式中，分离核酸编码乙酰羟酸合酶(AHAS)蛋白，该蛋白抵抗抑制AHAS的除草剂的抑制。在一些实施方式中，抑制AHAS的除草剂选自下列除草剂：咪唑啉酮、磺脲、三唑并嘧啶、嘧啶硫代苯甲酸(pyrimidinylthiobenzoate)、磺酰氨基-羰基三唑啉酮及它们的混合物。在一些实施方式中，除草剂是咪唑啉酮除草剂。在一些实施方式中，除草剂是磺脲除草剂。在一些实施方式中，分离核酸编码AHAS蛋白，该蛋白包含与图2中一种或更多种氨基酸序列70％或更高的同一性。在一些实施方式中，分离核酸编码甘蓝型油菜(Brassica napus)AHAS蛋白。在其它实施方式中，分离核酸编码甘蓝型油菜AHAS I蛋白。在某些实施方式中，分离核酸编码甘蓝型油菜AHAS III蛋白。
在另一方面，提供含有编码芸苔属乙酰羟酸合酶蛋白的分离核酸的表达载体，所述蛋白在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574、R577和S653。在一些实施方式中，表达载体包含编码蛋白的分离核酸，所述蛋白具有选自如下的一个或更多个突变：在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为缬氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置376的位置处天冬氨酸取代为谷氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为甲硫氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置577的位置处精氨酸取代为色氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺和在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺，其中突变不是芸苔属AHAS I基因中的S653N。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸，其中突变不是芸苔属AHAS III基因中的W574L。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为缬氨酸。在其它实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸。
在另一方面，提供具有芸苔属乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的植物，其中所述基因编码这样的蛋白，所述蛋白在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574、R577和S653。在另一方面，提供具有芸苔属乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的植物，其中所述植物抵抗抑制AHAS的除草剂，其中所述基因编码这样的蛋白，所述蛋白在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574、R577和S653。在上述方面的一些实施方式中，植物具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白具有选自如下的一个或更多个突变：在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为缬氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置376的位置处天冬氨酸取代为谷氨酸、在对应于SEQ IDNO:1的位置574的位置处色氨酸取代为半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为甲硫氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置577的位置处精氨酸取代为色氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺和在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺，其中突变不是芸苔属AHAS I基因中的S653N。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ IDNO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ IDNO:1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸，其中突变不是芸苔属AHAS III基因中的W574L。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为缬氨酸。在其它实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸。在其它实施方式中，突变选自表2中示出的突变。在某些实施方式中，所述植物具有AHAS基因，该基因编码具有两个或更多个突变的蛋白。在一些实施方式中，所述两个或更多个突变选自表2。在一些实施方式中，所述植物具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白在对应于SEQ ID NO:1的S653的位置处具有突变和在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574和R577。在其它实施方式中，所述植物具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白在对应于SEQ ID NO:1的W574的位置处具有突变和在对应于SEQ ID NO:1的R577的位置处具有突变。在一些实施方式中，所述植物具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白抵抗抑制AHAS的除草剂的抑制。在一些实施方式中，所述植物具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白包含与图2中一种或更多种氨基酸序列70％或更高的同一性。在一些实施方式中，所述植物抵抗至少一种抑制AHAS的除草剂的施用。在一些实施方式中，抑制AHAS的除草剂选自：咪唑啉酮、磺脲、三唑并嘧啶、嘧啶硫代苯甲酸、磺酰氨基-羰基三唑啉酮和它们的混合物。在一些实施方式中，除草剂是咪唑啉酮除草剂。在一些实施方式中，除草剂是磺脲除草剂。在一些实施方式中，所述植物是通过培育选自表2中列出的株系的株系的种子所产生的芸苔属植物。在一些实施方式中，所述植物是芸苔属各种。在其它实施方式中，所述植物是甘蓝型油菜。在一些实施方式中，所述植物选自春油菜(SpringOilseed Rape)和冬油菜(Winter Oilseed Rape)。在一些实施方式中，所述植物具有AHAS基因，该基因编码甘蓝型油菜AHAS蛋白。在其它实施方式中，所述植物具有AHAS基因，该基因编码甘蓝型油菜AHAS I蛋白。在某些实施方式中，所述植物具有AHAS基因，该基因编码甘蓝型油菜AHAS III蛋白。在一些实施方式中，所述植物是非转基因的。
在一方面，提供具有编码蛋白的芸苔属乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的种子，所述蛋白在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574、R577和S653。在一些实施方式中，所述种子具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白具有选自如下的一个或更多个突变：在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为缬氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸、在对应于SEQID NO:1的位置376的位置处天冬氨酸取代为谷氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为甲硫氨酸、在对应于SEQ IDNO:1的位置574的位置处色氨酸取代为丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置577的位置处精氨酸取代为色氨酸、在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺和在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺，其中突变不是芸苔属AHAS I基因中的S653N。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸，其中突变不是芸苔属AHAS III基因中的W574L。在一些实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为缬氨酸。在其它实施方式中，突变是在对应于SEQ ID NO:1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸。在其它实施方式中，突变选自表2中示出的突变。在某些实施方式中，所述种子具有AHAS基因，该基因编码具有两个或更多个突变的蛋白。在一些实施方式中，所述两个或更多个突变选自表2。在一些实施方式中，所述种子具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白在对应于SEQ ID NO:1的S653的位置处具有突变和在和在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574和R577。在其它实施方式中，所述种子具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白在对应于SEQ ID NO:1的W574的位置处具有突变和在对应于SEQ IDNO:1的R577的位置处具有突变。在一些实施方式中，所述种子具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白抵抗抑制AHAS的除草剂的抑制。在一些实施方式中，所述种子具有编码蛋白的AHAS基因，所述蛋白包含与图2中一种或更多种氨基酸序列70％或更高的同一性。在一些实施方式中，所述种子抵抗至少一种抑制AHAS的除草剂的施用。在一些实施方式中，抑制AHAS的除草剂选自：咪唑啉酮、磺脲、三唑并嘧啶、嘧啶硫代苯甲酸、磺酰氨基-羰基三唑啉酮和它们的混合物。在一些实施方式中，除草剂是咪唑啉酮除草剂。在一些实施方式中，除草剂是磺脲除草剂。在一些实施方式中，所述种子是芸苔属种子。在一些实施方式中，所述种子具有AHAS基因，该基因编码甘蓝型油菜AHAS蛋白。在其它实施方式中，所述种子具有AHAS基因，该基因编码甘蓝型油菜AHAS I蛋白。在某些实施方式中，所述种子具有AHAS基因，该基因编码甘蓝型油菜AHAS III蛋白。在一些实施方式中，所述种子是芸苔属植物株系的种子，其中所述株系选自表2中列出的株系。在一些实施方式中，所述种子是非转基因的。在一些实施方式中，提供本文公开的方法的植物所产生的种子。在其它实施方式中，所述种子是油菜种子。
在另一方面，提供产生抗除草剂植物的方法，其这样进行：向植物细胞中引入具有乙酰羟酸合酶(AHAS)基因中靶突变的基因修复寡核苷碱基(GRON)，以产生具有AHAS基因的植物细胞，所述AHAS基因表达AHAS蛋白，该AHAS蛋白在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574和S653；以及鉴定植物细胞，所述植物细胞在抑制AHAS的除草剂存在的情况下与对应的野生型植物细胞相比具有基本上正常的生长和催化活性；以及再生非转基因抗除草剂植物，其具有来自所述植物细胞的突变AHAS基因。在另一方面，提供增加植物除草剂抗性的方法，其这样进行：(a)使第一芸苔属植物与第二芸苔属植物杂交，其中所述第一植物包含芸苔属乙酰羟酸合酶(AHAS)基因，其中所述基因编码这样的蛋白，该蛋白在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变：SEQ ID NO:1的A205、D376、W574、R577和S653；(b)筛选得自所述杂交的群体中增加的AHAS除草剂抗性；(c)选择得自所述杂交的具有增加的AHAS除草剂抗性的成员；以及(d)产生得自所述杂交的种子。在一些实施方式中，杂种种子通过任意上述方法而产生。在一些实施方式中，植物生长自任意上述方法所产生的种子。在另一方面，提供在含有植物的田地中控制杂草的方法，其如下进行：施用有效量的至少一种抑制AHAS的除草剂至含有所述杂草和植物的田地，所述植物具有芸苔属乙酰羟酸合酶(AHAS)基因，其中该基因编码这样的蛋白，所述蛋白在对应于选自SEQ ID NO:1的A205、D376、W574、R577和S653的位置的一个或更多个氨基酸位置处具有突变。在一些实施方式中，抑制AHAS的除草剂选自如下的除草剂：咪唑啉酮、磺脲、三唑并嘧啶、嘧啶硫代苯甲酸、磺酰氨基-羰基三唑啉酮和它们的混合物。在其它实施方式中，抑制AHAS的除草剂是咪唑啉酮除草剂。在其它实施方式中，抑制AHAS的除草剂是磺脲除草剂。
术语"核酸"或"核酸序列"指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及它们的片段或部分，其可以是单链或双链，以及呈现有义链或反义链。核酸可以包括DNA或RNA，以及可以具有天然或合成来源。例如，核酸可以包括mRNA或cDNA。核酸可以包括已经被扩增(例如，应用聚合酶链反应)的核酸。协约"NTwt###NTmut"用来表示导致在核酸中位置###处的野生型核苷酸NTwt被突变体NTmut替换的突变。核苷酸的单字母代码如美国专利局专利审查程序手册第2422节表1中所述。因此，核苷酸名称"R"含义是嘌呤，如鸟嘌呤或腺嘌呤，"Y"含义是嘧啶，如胞嘧啶或胸腺嘧啶(如果是RNA则为尿嘧啶)；"M"含义是腺嘌呤或胞嘧啶；"K"含义是鸟嘌呤或胸腺嘧啶；以及"W"含义是腺嘌呤或胸腺嘧啶。
"基因"指DNA序列，该序列包含RNA产生所必需的控制和编码序列，其可以具有非编码功能(例如，核糖体RNA或转运RNA)或其可以包括多肽或多肽前体。RNA或多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任意部分编码——只要保留期望的活性或功能。如本文所用，术语"AHAS基因"指与芸苔属AHAS基因具有同源性的基因。在某些实施方式中，AHAS基因与特定的芸苔属AHAS基因如甘蓝型油菜AHAS基因I或甘蓝型油菜AHAS基因III具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方式中，AHAS基因与选自表3中序列的序列具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方式中，AHAS基因用至少一种突变进行修饰。在其它实施方式中，AHAS基因用至少两种突变进行修饰。在一些实施方式中，AHAS基因用至少一种选自表2中示出的突变进行修饰。在某些实施方式中，AHAS基因用至少两种表2中示出的突变进行修饰。在某些实施方式中，突变是保守突变。
"编码序列"含义是核酸或其互补体或其部分的序列，该序列可以被转录和/或翻译以产生mRNA和/或其多肽或片段。编码序列包括基因组DNA或未成熟的初级RNA转录物中的外显子，它们通过细胞的生物化学机制连接在一起以提供成熟的mRNA。反义链是这种核酸的互补体，以及编码序列可以有由其进行推导。
"非编码序列"含义是核酸或其互补体或其部分的序列，其在体内不被转录成氨基酸，或其中tRNA不相互作用以放置或试图放置氨基酸。非编码序列包括基因组DNA中或未成熟的初级RNA转录物中的内含子，以及基因相关序列如启动子、增强子、沉默基因等。
核苷碱基(nucleobase)是碱基，所述碱基在某些优选的实施方式中是嘌呤、嘧啶或其衍生物或类似物。核苷是含有戊糖呋喃糖基部分，例如任选取代的核苷或2'-脱氧核苷的核苷碱基。核苷可以通过几个连接部分之一进行连接，所述连接部分可以含有磷或可以不含有磷。通过未取代的磷酸二酯键连接的核苷被称为核苷酸。如本文所用，术语"核苷碱基"包括肽核苷碱基、肽核酸的亚单位和吗啉核苷碱基以及核苷和核苷酸。
寡核苷碱基是包含核苷碱基的聚合物；优选地该寡核苷碱基的至少一部分可以通过Watson-Crick碱基配对与具有互补序列的DNA杂交。寡核苷碱基链可以具有一个5'端和3'端，它们是聚合物的最终的核苷碱基。特定的寡核苷碱基链可以包含所有类型的核苷碱基。寡核苷碱基化合物是包含一个或更多个寡核苷碱基链的化合物，所述寡核苷碱基链可以是互补的和通过Watson-Crick碱基配对杂交。核糖型核苷碱基包括含有核苷碱基的戊糖呋喃糖基，其中2'碳是用羟基、烷氧基或卤素取代的亚甲基。脱氧核糖型核苷碱基是除核糖型核苷碱基之外的核苷碱基并且包括不含有戊糖呋喃糖基部分的所有核苷碱基。
在某些实施方式中，寡核苷碱基链可以包括寡核苷碱基链和寡核苷碱基链的区段或区域。寡核苷碱基链可以具有3'末端和5'末端，以及当寡核苷碱基链(strand)与链(chain)共同延伸时，该链(strand)的3'和5'末端也是该链(chain)的3'和5'端。
如本文所用，术语"基因修复寡核苷碱基"表示寡核苷碱基，其包括混合双链体寡核苷酸、不含核苷酸的分子、单链寡脱氧核苷酸和其它基因修复分子。
"分离"当指核酸(例如，寡核苷酸如RNA、DNA或混合聚合物)时，其含义是这样的核酸，所述核酸与其天然存在于其中的基因组的实质部分分开和/或与天然伴随该核酸的其它细胞组分基本上分离。例如，已经通过合成(如通过连续碱基缩合)而产生的任意核酸被认为是分离的。同样地，重组表达的核酸、克隆的核酸、通过引物延伸反应(例如PCR)产生的核酸或另外切离基因组的核酸也被认为是分离的。
"氨基酸序列"指多肽序列或蛋白序列。协约"AAwt###AAmut"用来表示导致在多肽中位置###处的野生型氨基酸AAwt被突变体AAmut替换的突变。
"互补体"含义是，根据标准Watson/Crick配对规则的核酸的互补序列。互补体序列也可以是与DNA序列或其互补体序列互补的RNA序列，以及也可以是cDNA。
"实质上互补/基本上互补"含义是，两个序列在严格杂交条件下杂交。技术人员将了解，基本上互补的序列不需要沿着它们的整个长度进行杂交。
如本文所用，术语"密码子"指组成遗传密码的三个邻近的核苷酸(RNA或DNA)的序列，所述遗传密码决定了在蛋白合成期间多肽链中特定氨基酸的插入或终止蛋白合成的信号。术语"密码子"还用来指在原始DNA转录成的信使RNA中三个核苷酸的对应的(以及互补的)序列。
如本文所用，术语"AHAS蛋白"指与芸苔属AHAS蛋白具有同源性的蛋白。在某些实施方式中，AHAS蛋白与特定的芸苔属AHAS蛋白如甘蓝型油菜AHAS蛋白I或甘蓝型油菜AHAS蛋白III具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方式中，AHAS蛋白与选自表2中序列的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施方式中，AHAS蛋白用至少一种突变进行修饰。在其它实施方式中，AHAS蛋白用至少两种突变进行修饰。在一些实施方式中，AHAS蛋白用至少一种选自表2中示出的突变进行修饰。在某些实施方式中，AHAS蛋白用至少两种表2中示出的突变进行修饰。在某些实施方式中，突变是保守突变。
术语"野生型"指至这样的基因或基因产物，其具有从天然存在的来源分离时该基因或基因产物的特征。野生型基因在群体中经常被观察到的基因，以及因此被随意地称为基因的"正常"或"野生型"形式。"野生型"还可以指在特定核苷酸位置或多个位置处的序列，或在特定密码子位置或多个位置处的序列，或在特定氨基酸位置或多个位置处的序列。
如本文所用，"突变体"或"修饰的(modified)"指当与野生型基因或基因产物相比时显示序列和或功能性质修饰(即，改变的特征)的核酸或蛋白。"突变体"或"修饰的"还指在特定核苷酸位置或多个位置处的序列，或在特定密码子位置或多个位置处的序列，或在特定氨基酸位置或多个位置处的序列，所述序列当与野生型基因或基因产物相比时显示序列和或功能性质的修饰(即，改变的特征)。
"突变"含义是，相对于正常序列或野生型序列，包括核酸序列的至少一个核苷酸变异或多肽的至少一个氨基酸变异。突变可以包括取代、缺失、倒置或插入。
如本文所用，术语"同源性"指蛋白和DNA之间的序列相似性。术语"同源性"或"同源的"指相同的程度。可以存在部分同源性或完全同源性。部分同源的序列是与另一序列相比时具有小于100％序列同一性的序列。
"杂合的"指在同源染色体片段中在一个或更多个遗传基因座处具有不同的等位基因。如本文所用，"杂合的"还可以指可检测到一个或更多个遗传基因座处的不同等位基因的样品、细胞、细胞群或生物体。杂合的样品还可以通过本领域已知的方法如例如核酸测序进行测定。例如，如果测序电泳图在一个基因座处显示两个峰并且这两个峰大小大致相同，则该样品可以被表征为杂合的。或者，如果一个峰比另一个峰小但却是较大峰大小的至少约25％，则该样品可以被表征为杂合的。在一些实施方式中，较小的峰是较大的峰的至少约15％。在其它实施方式中，较小的峰是较大的峰的至少约10％。在其它实施方式中，较小的峰是较大的峰的至少约5％。在其它实施方式中，较小的峰最小量被检测。
如本文所用，"纯合的"指在同源染色体区段中在一个或更多个遗传基因座处具有相同的等位基因。如本文所用，"纯合的"还可以指可检测到一个或更多个遗传基因座处的相同等位基因的样品、细胞、细胞群或生物体。纯合的样品还可以通过本领域已知的方法如例如核酸测序进行测定。例如，如果测序电泳图在具体基因座处显示一个峰，则该样品相对于该基因座可以被称为"纯合的"。
术语"半合子"指因第二等位基因被删除而在细胞或生物体的基因型中仅出现一次的基因或基因区段。如本文所用，"半合子"还可以指一个或更多个遗传基因座处的等位基因可在基因型中仅检测到一次的样品、细胞、细胞群或生物体。
如本文所用，术语"接合状态"指如本领域已知的和本文描述的测定方法所测定显示杂合、纯合或半合的样品、细胞群或生物体。术语"核酸的接合状态"含义是测定核酸的来源是否显示杂合、纯合或半合。"接合状态"可以指序列中一个核苷酸的不同。在一些方法中，针对一个突变的样品的接合状态可以分为纯合野生型、杂合(即，一个野生型等位基因和一个突变体等位基因)、纯合突变体或半合子(即，野生型或突变体等位基因的单个拷贝)。
如本文所用，术语"RTDS"指由Cibus开发的性状快速开发系统(The Rapid TraitDevelopment SystemTM)(RTDS)。RTDS是位点特异性基因修饰系统，其有效地进行基因序列的精确改变而不掺入外源基因或控制序列。
如本文所用，术语"约"含义是定量术语中加或减10％。例如，"约3％"将包括2.7-3.3％以及"约10％"将包括9-11％。
附图说明
图1显示了拟南芥乙酰羟酸合酶AHAS(SEQ ID NO:1)、甘蓝型油菜AHAS I(SEQ IDNO:2)和甘蓝型油菜AHAS III(SEQ ID NO:3和4)的氨基酸比对。SEQ ID NO:1是拟南芥AHASAt3g48560的氨基酸序列，其基于注释的基因组DNA序列Genbank登录号NC003074。SEQ IDNO:2是来自Cibus优良株系BN-2和BN-11的甘蓝型油菜AHAS I的氨基酸序列。该序列与Genbank登录Z11524的翻译产物相同。SEQ ID NO:3是来自Cibus优良株系BN-2的甘蓝型油菜AHAS III的氨基酸序列。该序列除了在氨基酸325处的D325E取代之外与Genbank登录Z11526的翻译产物相同。SEQ ID NO:4是来自Cibus优良株系BN-11的甘蓝型油菜AHAS III的氨基酸序列。该序列除了在SEQ ID NO:1中氨基酸343处的E343之外与SEQ ID NO:3的翻译产物相同。
图2显示表2中列出的翻译基因的氨基酸序列。粗体显示的氨基酸表示突变。
图3显示表2中列出的核苷酸序列。粗体显示的核苷酸表示突变。
图4显示实施例4中描述的喷洒试验的结果。
具体实施方式
提供了组合物和方法，其部分涉及应用例如Cibus开发的性状快速开发系统(RTDSTM)技术对芸苔属中乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的成功靶向。含有本文公开的任意突变的植物可以组合或单独形成新的抗除草剂产品的基础。还提供了由突变植物产生的种子，在所述突变植物中，AHAS基因对于突变或是纯合的或是杂合的。本文公开的突变可以组合已知的任意其它突变或未来发现的突变。
RTDS基于：通过利用细胞自身的基因修复系统来改变靶基因，以在原位特异性修饰基因序列，而不插入外源DNA和基因表达控制序列。该方法实现了遗传序列的精确改变，同时基因组的其余序列保持不变。与传统的转基因GMO相比，没有整合外源遗传物质，也没有任何外源遗传物质留在植物中。RTDS引入的遗传序列中的改变不被随意插入。因为影响的基因保持在其原来的位置，所以不存在随意、不受控制或不利的表达形式。
实现这种改变的RTDS是可以由DNA和修饰的RNA碱基以及其它化学部分组成的化学合成的寡核苷酸，并且被设计成在靶基因位置处进行杂交以产生错配的碱基对(多个碱基对)。错配的碱基配对起信号的作用，以将细胞自身的天然基因修复系统吸引到该位点并且纠正(取代、插入或缺失)基因中指定的核苷酸(多个核苷酸)。一旦纠正过程完成，RTDS分子便降解并且在该基因的正常内源控制机制下表达现已修饰的或修复的基因。
AHAS I和III基因中的目标突变应用甘蓝型油菜AHAS基因和蛋白进行描述(参见SEQ ID NO:2、3和4)。所述组合物和方法还包括其它种的突变体AHAS基因(种内同源基因)。然而，由于不同种AHAS基因的变异，在一个种中待改变的氨基酸残基数可以与另一种不同。然而，本领域的技术人员通过序列同源性容易对类似位置进行鉴定。例如，图1显示，拟南芥AHAS(SEQ ID NO:1)和甘蓝型油菜AHAS I(SEQ ID NO:2)和AHAS III(SEQ ID NO:3和SEQID NO:4)种内同源基因的氨基酸序列比对。因此，这些和其它种内同源基因中的类似位置可以被鉴定和突变。
所述组合物和方法部分涉及AHAS基因的突变，该突变使得植物对抑制AHAS或抑制ALS的除草剂家族的除草剂抵抗或耐受。所述组合物和方法还涉及在编码AHAS蛋白的基因中应用基因修复寡核苷碱基进行植物染色体序列或游离基因序列中的期望的突变。突变的蛋白——其基本上保持野生型蛋白的催化活性——可以增加植物对抑制AHAS家族除草剂的抗性或耐受性，并且与野生型植物相比不论存在或不存在除草剂均允许植物、其器官、组织或细胞基本上正常的生长或发育。所述组合物和方法还涉及：AHAS基因已经突变的非转基因植物细胞；由其再生的非转基因植物；以及应用再生的非转基因植物与例如具有不同AHAS基因的突变的植物或具有突变的EPSPS基因的植物杂交而产生的植物。
咪唑啉酮是抑制AHAS的除草剂的五种化学家族的其中一种。其它四种家族是磺脲、三唑并嘧啶、嘧啶硫代苯甲酸和磺酰氨基-羰基三唑啉酮(Tan等,2005)。
还提供转基因或非转基因植物或植物细胞，其具有例如如本文所公开的AHAS基因中的一种或更多种突变。在某些实施方式中，具有AHAS基因中一种或更多种突变的植物或植物细胞对抑制AHAS的成员的抗性或耐受性增加。在某些实施方式中，具有AHAS基因一种或更多种突变的植物或植物细胞与相应的野生型植物或细胞相比可以显示植物、其器官、组织或细胞基本上正常的生长或发育。在特定的方面和实施方式中，提供具有例如如本文中公开的AHAS基因突变的非转基因植物，其在某些实施方式中对抑制AHAS的除草剂家族成员有增加的抗性或耐受性，并且与相应的野生型植物或细胞相比可显示植物、其器官、组织或细胞基本上正常的生长或发育，即在一种或更多种除草剂如例如咪唑啉酮和/或磺脲存在的情况下，突变的AHAS蛋白与野生型AHAS蛋白相比具有基本上相同的催化活性。
进一步提供产生植物的方法，所述植物具有突变的AHAS基因，例如具有本文描述的一种或更多种突变；优选不论存在或不存在相关的除草剂，该植物均基本上保持野生型蛋白的催化活性。在某些实施方式中，所述方法包括：将具有一种或更多种AHAS基因靶突变(例如，如本文公开的)的基因修复寡核苷碱基导入植物细胞中，以及鉴定具有突变的AHAS基因的细胞、种子或植物。
在各种实施方式中，本文所公开的植物可以是双子叶植物、单子叶植物或裸子植物中的任意种，包括作为树或灌木而生长的任意木本植物种类，任意草本种类，或产生可食用的果实、种子或蔬菜的任意种类，或产生彩色的或芬芳的花的任意种类。例如，所述植物可以选自下列植物种类：油菜、向日葵、烟草、甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、番茄、芒果、桃子、苹果、梨、草莓、香蕉、瓜、马铃薯、胡萝卜、生菜、洋葱、大豆各种、甘蔗、豌豆、蚕豆、白杨、葡萄、柑橘、苜蓿、黑麦、燕麦、草坪草和牧草、亚麻、油菜、黄瓜、牵牛花、香脂植物、胡椒、茄子、金盏花、莲花、卷心菜、雏菊、康乃馨、郁金香、鸢尾花、百合花和产生坚果的植物——就此而言它们还没有被具体提到。
可以应用本领域中常用的任意方法将基因修复寡核苷碱基导入植物细胞中，所述方法包括但不限于微载体(生物射弹输送)、微纤维、聚乙二醇(PEG)介导的摄取、电穿孔和微注射。
还提供方法和组合物，其涉及为获得产生种子的植物——下文称为"可育植物(fertile plant)"——而培养依照本文公开的方法突变的细胞，以及从该可育植物产生种子和其它植物。
还提供在田地中选择性控制杂草的方法，所述田地包含具有所公开的AHAS基因改变的植物和杂草，所述方法包含向所述田地施用除草剂，所述植物已经对所述除草剂具有抗性。
还提供AHAS基因的突变，该突变赋予植物对相关除草剂成员的抗性或耐受性，或其中突变的AHAS基因与野生型AHAS相比具有基本上相同的酶活性。
基因修复寡核苷碱基
本文公开的方法和组合物可以应用具有下面详细描述的构象和化学性质的"基因修复寡核苷碱基"实施或制备。本文所考虑的"基因修复寡核苷碱基"也已经使用其它名称描述在发表的科技文献和专利文献中，包括"引起重组的(recombinagenic)寡核苷碱基"；"RNA/DNA嵌合寡核苷酸"；"嵌合寡核苷酸"；"混合双链体寡核苷酸"(MDONs)；"RNA DNA寡核苷酸(RDOs)"；"靶向基因的寡核苷酸"；"genoplast"；"单链修饰的寡核苷酸"；"单链寡脱氧核苷酸突变载体"(SSOMV)；"双链体突变载体"和"异源双链体突变载体"。
寡核苷碱基——其具有通过引用而并入本文的Kmiec(Kmiec I)的美国专利第5,565,350号和Kmiec(Kmiec II)的美国专利第5,731,181号中描述的构象和化学性质——适于用作本发明的"基因修复寡核苷碱基"。Kmiec I和/或Kmiec II中的基因修复寡核苷碱基含有两个互补链，其中一个含有RNA型核苷酸的至少一个片段("RNA片段")，所述RNA型核苷酸被碱基配对于另一链的DNA型核苷酸。
Kmiec II公开，含有嘌呤和嘧啶碱基的非核苷酸可以代替核苷酸。可以用于本发明的其它基因修复分子描述在美国专利第5,756,325；5,871,984；5,760,012；5,888,983；5,795,972；5,780,296；5,945,339；6,004,804；6,010,907号中和国际专利号PCT/USOO/23457中；以及国际专利公开号WO 98/49350；WO 99/07865；WO 99/58723；WO 99/58702和WO99/40789中，其各自全部并入本文。
在一个实施方式中，基因修复寡核苷碱基是混合的双链体寡核苷酸(MDON)，其中混合双链体寡核苷酸的RNA型核苷酸通过用氟、氯、溴官能团替换2'-羟基或通过在2'-O上放置取代基而制成抗RNA酶。适合的取代基包括Kmiec II教导的取代基。可选的取代基包括美国专利第5,334,711号(Sproat)教导的取代基以及专利公开EP 629 387和EP 679 657(均为Martin申请)教导的取代基，其通过引用而并入本文。如本文所用，核糖核苷酸的2'-氟、氯或溴衍生物或具有取代有Martin申请或Sproa中描述的取代基的2'-OH的核糖核苷酸被称为"2'-取代核糖核苷酸"。如本文所用，术语"RNA-型核苷酸"含义是2'-羟基或2'-取代核苷酸，其通过未取代的磷酸二酯键或Kmiec I或Kmiec II教导的任意非天然键与混合双链体寡核苷酸的其它核苷酸连接。如本文所用，术语"脱氧核糖型核苷酸"含义是具有2'-H的核苷酸，其可以通过未取代的磷酸二酯键或Kmiec I或Kmiec II教导的任意非天然键与基因修复寡核苷碱基的其它核苷酸连接。
在本发明特定的实施方式中，基因修复寡核苷碱基是只通过未取代的磷酸二酯键进行连接的混合双链体寡核苷酸(MDON)。在可选的实施方式中，连接通过取代磷酸二酯、磷酸二酯衍生物和Kmiec II所教导的基于非磷的键进行。在又一实施方式中，混合双链体寡核苷酸中的每一RNA-型核苷酸均是2'-取代核苷酸。2'-取代核糖核苷酸特别优选的实施方式是2'-氟、2'-甲氧基、2'-丙氧基、2'-烯丙氧基、2'-羟基乙氧基、2'-甲氧基乙氧基、2'-氟丙氧基和2'-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。2'-取代核糖核苷酸更优选的实施方式是2'-氟、2'-甲氧基、2'-甲氧基乙氧基和2'-烯丙氧基取代的核苷酸。在另一实施方式中，混合双链体寡核苷酸通过未取代的磷酸二酯键进行连接。
尽管仅具有单一类型的2'-取代RNA-型核苷酸的混合双链体寡核苷酸(MDON)合成更加方便，但本发明的方法可以用具有两种或更多种类型的RNA-型核苷酸的混合双链体寡核苷酸进行实施。RNA区段的功能可以不受通过在两个RNA-型三核苷酸之间引入脱氧核苷酸而引起的间断的影响，因此，术语RNA片段包括诸如"间断RNA片段"的术语。未间断RNA片段被称为连续RNA片段。在可选的实施方式中，RNA片段可以含有相间的抗RNA酶核苷酸和未取代的2'-OH核苷酸。混合双链体寡核苷酸优选具有少于100个核苷酸以及更优选少于85个核苷酸，但多于50个核苷酸。第一和第二链进行Watson-Crick碱基配对。在一个实施方式中，混合双链体寡核苷酸的链通过诸如单链六核苷酸、五核苷酸或四核苷酸的连接体而共价键合，这样第一链和第二链是具有单一3'末端和单一5'末端的单寡核苷酸链的片段。3'和5'末端可以通过添加"发夹帽"来保护，从而将3'和5'端的核苷酸与邻近的核苷酸进行Watson-Crick配对。另外，第二发夹帽可以放置在远离3'和5'末端的第一和第二链之间的连接处，以便稳定第一和第二链之间的Watson-Crick配对。
第一和第二链含有两个区，这两个区与靶基因的两个片段同源，即具有与靶基因相同的序列。同源区含有RNA区段的核苷酸以及可以含有连接DNA区段的一种或更多种DNA-型核苷酸以及还可以含有不在间插DNA区段内的DNA-型核苷酸。同源的两个区被具有不同于靶基因序列的序列的区——称为"异源区"——所分隔，并且每一区与所述"异源区"毗邻。异源区可以含有一个、两个或三个错配的核苷酸。错配的核苷酸可以是连续的或可选地可以被与靶基因同源的一个或两个核苷酸所分隔。可选地，异源区还可以含有插入或一个、两个、三个或五个或更少的核苷酸。可选地，混合双链体寡核苷酸的序列可以仅因为从混合双链寡核苷酸中缺失一个、两个、三个或五个或更少的核苷酸而不同于靶基因序列。在这种情况下，异源区的长度和位置被认为是缺失的长度——即使混合双链体寡核苷酸的核苷酸不在异源区内。与两个异源区互补的靶基因片段之间的距离与意图进行一个取代或更多个取代的异源区长度相同。当异源区含有插入时，同源区因此被分隔在比基因中它们的互补同源片段远的混合双链体寡核苷酸中，以及当异源区对缺失进行编码时适用相反的情况。
混合双链体寡核苷酸的RNA区段各自是同源区——即序列上与靶基因片段相同的区——的一部分，这些区段一起优选含有至少13个RNA-型核苷酸以及优选16至25个RNA-型核苷酸或更优选18-22个RNA-型核苷酸或最优选20个核苷酸。在一个实施方式中，同源区的RNA区段被间插DNA区段所分隔并且与间插DNA区段毗邻，即通过间插DNA区段"连接"。在一个实施方式中，异源区的每一核苷酸均是间插DNA区段的核苷酸。含有混合双链体寡核苷酸的异源区的间插DNA区段被称为"增变区段"。
在本发明的另一实施方式中，基因修复寡核苷碱基(GRON)是单链寡脱氧核苷酸突变载体(SSOMV)，其被公开在国际专利申请PCT/USOO/23457、美国专利号6,271,360、6,479,292和7,060,500中，其通过引用全部并入。SSOMV的序列基于与下列专利中描述的突变载体相同的原理：美国专利第5,756,325；5,871,984；5,760,012；5,888,983；5,795,972；5,780,296；5,945,339；6,004,804；和6,010,907号以及国际公开第WO 98/49350；WO 99/07865；WO99/58723；WO 99/58702；和WO 99/40789号。SSOMV的序列含有两个区，这两个区与靶序列同源，被称为增变区的含有期望遗传改变的区所分隔。增变区可以具有这样的序列，所述序列与在靶序列中分隔同源区的序列长度相同，但具有不同的序列。这种增变区可以引起取代。可选地，SSOMV中的同源区可以彼此连续，而具有相同序列的靶基因区被一个、两个或更多个核苷酸分隔。这种SSOMV引起SSOMV中缺少的核苷酸从靶基因中缺失。最后，与同源区相同的靶基因的序列在靶基因中可以是邻近的，但在SSOMV的序列中被一个、两个或更多个核苷酸分隔。这种SSOMV引起靶基因序列的插入。
SSOMV的核苷酸是脱氧核糖核苷酸，所述脱氧核糖核苷酸通过未修饰的磷酸二酯键进行连接，只是3'端和/或5'端核苷酸间键合或可选地两个3'端和/或5'端核苷酸间键合可以是硫代磷酸酯或氨基磷酸酯(phosphoamidate)。如本文所用，核苷酸间键合是SSOMV的核苷酸之间的连接以及不包括3'端核苷酸或5'端核苷酸和封端取代基之间的连接。在特定的实施方式中，SSOMV的长度是21至55个脱氧核苷酸之间，以及因此同源区的长度是至少20个脱氧核苷酸的总长度，以及至少两个同源区应当各自具有至少8个脱氧核苷酸的长度。
SSOMV可以被设计成与靶基因的编码链或非编码链互补。当期望的突变是单碱基取代时，优选增变核苷酸和靶核苷酸均是嘧啶。就与实现期望的功能结果一致而言，优选突变核苷酸和互补链中的靶核苷酸均是嘧啶。特别优选的是这样的SSOMV，其编码颠换突变，即C或T增变核苷酸与互补链中的C或T核苷酸分别进行错配。
除寡脱氧核苷酸外，SSOMV也可以含有5'封端取代基，该封端取代基通过连接体与5'端的碳相连。连接体的化学性质不是关键的，这不同于其长度，连接体长度应当优选至少6个原子长并且连接体应当是挠性的。可以使用各种无毒的取代基如生物素、胆固醇或其它类固醇，或非嵌入性阳离子荧光染料。用以制备SSOMV的特别优选的试剂是Glen Research,Sterling Va.(现为GE Healthcare)作为Cy3TM和Cy5TM销售的试剂，它们是封端的氨基亚磷酸酯(phosphoamidite)，在掺入寡核苷酸中后分别得到3,3,3',3'-四甲基N,N'-异丙基取代的吲哚单羰花青(indomonocarbocyanine)和吲哚二羰花青(indodicarbocyanine)染料。Cy3是特别优选的。当吲哚羰花青被N-氧烷基取代时，其可以以带有5'端磷酸酯的磷酸二酯与寡脱氧核苷酸的5'端方便地连接。染料和寡脱氧核苷酸之间的染料连接体的化学性质不是关键的，以及为了合成方便而进行选择。当直接使用商业可得的Cy3氨基亚磷酸酯时，所得的5'修饰由封端取代基和连接体一起组成，它们是N-羟基丙基、N'-磷脂酰基丙基3,3,3',3'-四甲基吲哚单羰花青。
在优选的实施方式中，吲哚羰花青染料在吲哚环的3和3'位被四取代。没有受理论的限制，这些取代基防止染料成为嵌入性染料。在这些位置处的取代基的身份不是关键的。SSOMV可以另外具有3'封端取代基。3'封端取代基的化学性质也不是关键的。
本文描述的突变也可以通过诱变(随机诱变、体细胞诱变或定向诱变)和其它DNA编辑或重组技术来获得，所述技术包括但不限于利用锌指核酸酶采用位点特异性同源重组的基因打靶。
将基因修复寡核苷碱基输送到植物细胞中
用于转化植物细胞的任意通常已知的方法可以用来输送基因修复寡核苷碱基。下面列出了说明性方法。
微运载体和微纤维
用于通过射弹穿透(projectile penetration)将DNA大片段导入具有纤维素细胞壁的植物细胞的金属微运载体(微球)的应用对相关领域的技术人员而言是周知的(下文称为生物射弹输送)。美国专利号4,945,050；5,100,792和5,204,253描述了选择微运载体的一般技术和投射它们的装置。
在本发明的方法中使用微运载体的具体条件描述在国际公开WO 99/07865中。在说明性技术中，依次添加冰冷的微运载体(60mg/mL)、混合双链体寡核苷酸(60mg/mL)、2.5MCaCl2和0.1M亚精胺；将混合物例如通过旋涡轻轻地搅动10分钟，然后放置在室温下10分钟，而后将微运载体稀释在5体积的乙醇中、离心并且再悬浮在100％乙醇中。8-10μg/μL微运载体、14-17μg/mL混合双链体寡核苷酸、1.1-1.4M CaCl2和18-22mM亚精胺的粘附溶液浓度可以获得良好的结果。在8μg/μL微运载体、16.5μg/mL混合双链体寡核苷酸、1.3M CaCl2和21mM亚精胺的条件下观察到最佳结果。
对于本发明的实践，也可以应用微纤维将基因修复寡核苷碱基导入植物细胞中，以穿过细胞壁和细胞膜。Coffee等的美国专利号5,302,523描述了，应用30×0.5μm和10×0.3μm碳化硅纤维促进Black Mexican Sweet玉米悬浮培养液的转化。可以应用微纤维用来导入DNA以进行植物细胞转化的任何机械技术可以用来输送基因修复寡核苷碱基以进行蜕变(transmutation)。
基因修复寡核苷碱基微纤维输送的说明性技术如下：将无菌微纤维(2μg)悬浮在150μL含约10μg混合双链体寡核苷酸的植物培养基中。静置悬浮培养液并且将等体积的叠集细胞和无菌纤维/核苷酸悬浮液旋涡10分钟并且铺板。如具体性状所适合，立即或延迟多达约120h施用选择性培养基。
原生质体电穿孔
在可选的实施方式中，基因修复寡核苷碱基可以通过源自植物部分的原生质体电穿孔而输送到植物细胞。根据本领域技术人员周知的技术，原生质体通过植物部分，特别是叶的酶促处理而形成。参见例如，Gallois等,1996,Methods in Molecular Biology 55:89-107,Humana Press,Totowa,N.J.；Kipp等,1999,Methods in Molecular Biology 133:213-221,Humana Press,Totowa,NJ。在电穿孔之前原生质体不需要在生长培养基中培养。电穿孔的说明性条件是，在0.3mL的总体积中的3×105个原生质体以及0.6-4μg/mL的基因修复寡核苷碱基浓度。
原生质体PEG-介导的DNA摄取
在可选的实施方式中，根据本领域技术人员周知的技术(参见例如，Gharti-Chhetri等,1992；Datta等,1992)，核酸在膜改性剂聚乙二醇存在的情况下被植物原生质体摄取。
微注射
在可选的实施方式中，基因修复寡核苷碱基可以通过将其用微毛细管注射到植物细胞或原生质体中来进行输送(参见例如Miki等,1989；Schnorf等,1991)。
抗除草剂植物的选择和除草剂的施用
应用本领域中普遍已知的方法，例如通过在除草剂存在的情况下使植物或植物细胞生长并且测量与除草剂不存在的情况下生长速度相比的生长速度，可以测试植物和植物细胞对除草剂的抗性或耐受性。
如本文所用，植物、植物器官、植物组织或植物细胞基本上正常的生长被定义为植物、植物器官、植物组织或植物细胞的生长速度或细胞分裂速度，其是表达野生型AHAS蛋白的相应植物、植物器官、植物组织或植物细胞中生长速度或细胞分裂速度的至少35％、至少50％、至少60％或至少75％。
如本文所用，植物、植物器官、植物组织或植物细胞基本上正常的发育被定义为，植物、植物器官、植物组织或植物细胞中一个或更多个发育事件的发生与表达野生型AHAS蛋白的相应植物、植物器官、植物组织或植物细胞中发生的那些基本相同。
在某些实施方式中，本文提供的植物器官包括但不限于叶、茎、根、叶芽、花芽、分生组织、胚胎、子叶、胚乳、萼片、花瓣、雌蕊、心皮、雄蕊、花粉囊、小孢子、花粉、花粉管、胚珠、子房和果实，或取自它们的部分、切片或圆片。植物组织包括但不限于愈伤组织、基本组织、维管组织、贮藏组织、分生组织、叶组织、茎干组织、根组织、菌瘿组织、植物瘤组织和再生组织。植物细胞包括但不限于具有细胞壁的分离细胞、其各种大小的聚集物以及原生质体。
植物对相关除草剂基本上"耐受"——当它们接受除草剂并且与类似接受的非耐受类植物提供的剂量/响应曲线比较时提供右移的剂量/响应曲线时。这些剂量/响应曲线具有绘制在X轴上的"剂量"以及绘制在y轴上的"杀死百分比"、"除草效果"等。为产生给定的除草效果，耐受的植物需要的除草剂将比非耐受类植物需要的多。当在农用化学品界为杀死田地中的杂草而通常采用和的浓度和比率下接受除草剂时，基本上"抵抗"除草剂的植物显示很少的损伤，如果有损伤，则是坏死、裂解、萎黄病或其它损伤。抗除草剂的植物也对除草剂耐受。
实施例
下面是说明本发明实践方法的实施例。这些实施例不应当被理解为是限制性的。除非另有指明，所有百分比均是按重量计以及所有溶剂混合比例均是按体积计。
实施例1：抗除草剂芸苔属样品的制备
除非另有说明，如本文所用，基因(或更多基因)的编号基于拟南芥乙酰乳酸合酶(ALS)或乙酰羟酸合酶(AHAS)At3g48560(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列进行。在2005年10月之前的实验室笔记参考中，S653位置(基于拟南芥氨基酸序列)基于玉米氨基酸序列ZmAHAS108和ZmAHAS 109(Fang等,1992)而被称为S621。
一个目的是在春油菜(甘蓝型油菜，春油菜–称为BN-2)和冬油菜(WOSR，也为甘蓝型油菜-称为BN-1 1)的BnAHAS I和III之一或两者中制作抗咪草烟(Imi)的氨基酸取代S653N。
为了扩增甘蓝型油菜(最初是优良油菜株系BN-2)的BnAHAS I和III的靶区域，设计寡核苷酸对(oligo pair)BnALS1和BnALS2(SEQ ID NO：9和10)。由于BnAHAS I和III不含有内含子，因此BnALSl和BnALS2扩增S653位点两侧的基因组DNA和cDNA的284bp靶区域。该引物对还被设计来使得能够扩增拟南芥的ALS靶区域。收集引物对并将其再悬浮在无菌水中。
最初，BnALS l/BnALS2引物对被用来PCR扩增BN-2的BnAHAS I和III C-端靶区域。而后，从其它BN-2样品扩增ALS靶区域并且克隆到pGEM-T easy中。过夜培养生长的3个基因组DNA和cDNA样品中每一个的12个集落的克隆插入物被制备质粒并且测序，以确认靶序列。制备BN-2ALS 2c-21的甘油贮存液，为BnAHAS I，代表这些284bp靶区域；以及制备BN-2ALSYB10-2g-14的甘油贮存液，为BnAHAS III，代表这些284bp靶区域。
分析株系BN-2的基因组和cDNA靶区域BnALS序列并且记录PCR错误。基于BN-2的BnAHAS I和III的序列，单个GRON(基因修复寡核苷酸)BnALS1621/C/41/5'Cy3/3'idC(SEQID NO:5)被设计来在位置653处进行丝氨酸至天冬酰胺的氨基酸取代(AGT->AAT)(参见表1)。将最初的合成物再悬浮并且测定它们的浓度。将再悬浮的寡聚物冷冻储存在-70℃下。该GRON的非编码形式被称为BnALSl621/NC/41/5'Cy3/3'idC(SEQ ID NO:6)。在随后的日子，将BnALS1621/NC与所有Genbank序列比较，其中只有具有杂交的41个中>16个核苷酸的序列是BnAHAS I和III，以及其中寡聚物具有被设计来引入S653N氨基酸取代的单个错配G->A。
表l.GRON序列
转换的碱基被加粗显示。V＝CY3；H＝3'DMT dC CPG
Cibus优良冬油菜(WOSR)株系BN-11的BnALS靶区域从已知代表株系BN-11的一个植物的基因组DNA和cDNA进行扩增。分析BN-11BnALS序列并且记录PCR错误。
除表征BN-2和BN-11的BnALS靶区域外，在商业品种Clearfield Canola(BN-15)中也表征相同的靶区域。分析Clearfield BnAHAS序列并且记录PCR错误，以显示期望的氨基酸改变，BnAHAS I中的S653N(AGT->AAT)和BnAHAS III中的W574L(TGG->TTG)。最后，从株系BN-2、BN-11和BN-15应用BnALS3/BnALSOR2(SEQ ID NO:11和12)和BnALS3/BnALSOR3(SEQID NO:11和13)分别扩增BnAHAS I和III的全编码序列，克隆并且测序，作为参考序列用于比较目的。
抗Imi的BN-2(油菜)愈伤组织样品BnALS1621N-44至53——由各种处理所引起——应用Edwards等(1991)的方法提取。应用等位基因特异性PCR(AS-PCR)混合物(MM#23，由寡核苷酸BnALSOF1、BnALSOR2、BnALSOR3和BnALSIR1A组成)(分别为SEQ ID NO:14、12、13和15)，筛选来自该材料的基因组DNA，以特异性检测S653N改变，以及应用等位基因特异性PCR混合物(MM#29，由寡核苷酸BnALSOF2、BnALSOR4和BnALSIF1T组成)(分别为SEQ IDNO:16、17和18)进行筛选以特异性检测BnAHAS I或III中的W574L改变。这些最初的AS-PCR结果是非结论性的，因此，收集大部分样品BnALS1621N-44至53的额外样品BnALSl621N-54至58，以及应用Edwards等(1991)的方法提取，并进行其它纯化步骤获得更纯的基因组DNA。
此时，用BnALSOF2、BnALSOR2和BnALSOR3引物组合，扩增样品BnALS1621N-54至58，并且得到少量扩增产物。将这些产物克隆到pGEM-T easy中并且将每株系12个白色集落设置为过夜培养，制备质粒(应用Qiagen质粒微量制备试剂盒)，以及应用BigDye 3.1测序化学法测序。
初步序列分析明确了，BnALS1621N-55-13具有BnAHAS III的S653N突变(AGT->AAT)，该株系的两个其它克隆BnALS1621N-55-15和19是BnAHAS III的野生型。记录了全序列分析。为证实该单一阳性结果不是PCR错误所引起，通过AS-PCR筛选了该株系的另外38个集落。利用该AS-PCR筛选的最强的8个阳性结果BnALSl621N-55-1至8被设置成过夜培养，并且分离和测序质粒DNA。AS-PCR的8个阳性集落中有7个，BnALSl 621N-55-2至8，是阳性结果，通过测序为BnAHAS III的S653N突变；另一BnALS1621N-55-l是野生型BnAHAS I序列。这些结果共同表明，对于BnAHAS III的S653N突变，株系BnALS1621N-55是杂合的。
样品BnALS1621N-55是平行愈伤组织样品，其来自与BnALS1621N-49相同的原始抗Imi愈伤组织。用BnALSOF2、BnALSOR2和BnALSOR3引物组合，扩增这些样品的基因组DNA，以及将这些片段克隆到pGEM-T easy中并且进行转化。MM#23用来筛选38个白色集落的S653N突变，4个阳性集落被鉴定(BnALSl621N-49-9至12)。测序这些集落。4个集落中有3个集落(BnALS1621N-49-9、10和12)具有BnAHAS III的S653N突变。
靶区域克隆，然后AS-PCR以及序列确证的类似方法被用来鉴定具有S653N多态性的其它株系。其中之一是株系BnALS-97。将BnALS-97再生成植物并且使其结出种子。尽管该株系是原型(作为植物)，仍克隆并且测序BnAHAS I和III的全编码序列。在该株系中，与BN-2野生型序列相比仅有的多态性是AGT->AAT密码子改变，其导致BnAHAS III的S653N氨基酸取代。
株系BnALSl 621N-57的随机克隆的BnALSOF2/BnALSOR2和BnALSOF2/BnALSOR3扩增子的初步序列分析表明，克隆BnALS1621N-57-43和46均具有BnAHAS I的W574L突变(TGG->TTG)。全序列分析被记录，并且表明株系57是杂合的，因为克隆38和41是W574。因此，BnALSOF2、BnALSOR2和BnALSOR3引物组合被用来从BnALS1621N-57和BnALS1621N-45——来自与BnALS1621N-57相同的原始抗Imi愈伤组织的平行愈伤组织样品——扩增该片段，连接到pGEM-T easy中，转化并且以蓝/白选择铺板。
MM#29被用来从BnALS1621N-57和BnALS 1621N-45的每个板筛选19个白色集落中的W574L，以及每一个的4个阳性集落(BnALS1621N-45-1、2、9和18，以及BnALS1621N-57-1、7、13和16)被制备质粒并且测序。序列分析显示，所有8个集落均具有BnAHAS I的W574L突变。优化MM#29的退火温度，另外19个集落应用这些新条件筛选。三个阳性集落(BnALS1621N-57-17、18和19)被制备质粒和测序。
收集另外的抗Imi油菜样品BnALS-68至91，并且应用Edwards等(1991)的方法提取基因组DNA。对于每个样品，BnALSOF2、BnALSOR2和BnALSOR3引物组合被用来扩增BnAHAS I和III的片段，并且将它们克隆到pGEM-T easy中。
在AS-PCR反应中应用MM#23检测S653N突变，筛选每株系12个集落，以及通过测序，结果显示株系BnALS-81的2个阳性结果(BnALS-81-203和208)和BnALS-76的4个阳性结果(BnALS-76-153、154、156和162)含有BnAHAS III的S653N突变。记录全序列分析。通过采用MM#23来AS-PCR筛选PCR-扩增的靶区域或具有单个克隆插入物的细菌菌落，株系BnALS-159(分子生物学样品102；集落655)被鉴定为具有BnAHAS I的S653N突变，这是Cibus在该基因中的最初S653N事件。
最后，在株系BnALS-83(分子生物学样品91)中，野生型(集落408)和突变体(集落403、405和406)被鉴定，以表明该株系对于BnAHAS I的S653T突变(AGT->ACT)是杂合的。作为植物，株系BnALS-83被证实在BnAHAS I中对S653T突变是杂合的。进一步，完成了用MM#23(S653N)和MM#29(W574L)对新的抗Imi BN-2油菜株系BnALS-76和BnALS-123的筛选。由于在这些样品中没有发现上述期望的突变，所以12个BnALSOF2/OR2/3被克隆和测序。BnALS-123的BnAHAS III的所有7个克隆(集落5、17-19、21、22、26和28)是S653T突变阳性。然而，R1植物的种子的基因型为杂合的。
此外，分别应用BnALS3/BnALS8(分别为SEQ ID NO:11和19)和BnALS3/BnALS9(分别为SEQ ID NO:11和20)寡核苷酸组合，克隆和测序BnALS-58、68和69的BnAHAS I和III中每一个的N-端PCR片段。获得BnALS-96的新组织样品，并且克隆和测序BnAHAS I和III的N-端PCR片段，以显示株系BnALS-96具有BnAHAS I的A205V突变(GCC->GTC)。全长编码序列BnALS3/OR2扩增子的所有4个克隆——来自源自愈伤组织株系BnALS-68的植物材料——均具有BnAHAS III的A205V改变(GCG->GTG)，该改变与BnALS-69的改变相同。
确定具有突变的株系、得到它们的实验以及提供的处理总结在表2中。株系BnALS-159作为愈伤组织株系而死亡并且不再生茎干。表3显示用于本文公开的实验的示例性寡核苷酸。
表2.BN油菜的抗IMI组织样品的突变
表3：示例性寡核苷酸
随着茎干变得可利用，以所有变换和组合中进行杂交(cross)。株系BnALS-97是参考的BnAHAS III中的S653N。株系BnALS-57是参考的BnAHAS I中的W574L。BnALS-68和69均被用作BnAHAS III中A205V的参考株系。株系BnALS-83是第一株系，所述第一株系作为愈伤组织对于BnAHAS I的S653T是杂合的，以便作为植物也是杂合的。
实施例2：材料和方法
细胞培养工作描述。将源自种子和小孢子来源的胚胎的茎干在无菌条件下体外繁殖。每隔2-4周对插条进行继代培养并且在培养皿(25mm×90mm)中在体积为40-45mL的RS培养基(Dovzhenko,2001)中培养。用微孔胶带(3M Company)将培养皿密封。嫩叶被用于原生质体分离。
原生质体分离和纯化。在培养皿中用手术刀将约600mg 2-3周大的离体茎干的叶组织切成小条，所述培养皿具有5mL培养基B(Pelletier等,1983)，pH调节为5.8。在大约1h后，用酶溶液取代培养基B，所述酶溶液由培养基B组成，其中溶解了0.5％(w/v)纤维素酶YC和0.75％(w/v)离析酶R10(两者均来自Karlan Research Products,Cottonwood,Arizona)、1g/L牛血清白蛋白和1g/L 2-吗啉乙磺酸。将酶溶液真空渗入到叶组织中，并且将具有酶溶液中的叶片的皿在25℃下在暗处温育。应用碘克沙醇密度梯度(改进自Optiprep Application Sheet C18；Purification of Intact Plant Proplasts；Axis-Shield USA,10Commerce Way,Norton,MA 02776)进行原生质体纯化。在密度梯度离心后，将具有纯化原生质体的条带连同约5mL W5培养基(Frigerio等.,1998)一起移除。用血细胞计数器测定原生质体收率，并且将原生质体在4℃下储存2h。
基因修复寡核苷酸GRON导入。将原生质体悬浮液与等体积的W5培养基混合，转移到50mL离心管，并且在临床离心机(约50×g)的最低设置下离心5min。移除上清液，并用TM培养基(Klaus,2001)替代，将原生质体密度调节到5×106/mL。将每份含5×106个原生质体的100μL的整分试样分配到12mL圆底离心管中。然后，应用PEG处理将靶向一个或两个AHAS基因突变的GRON导入原生质体中。为将GRON导入原生质体中，添加溶解在25μL纯化水中的12.5μg GRON和125μL聚乙二醇溶液(5g PEG MW 1500、638mg甘露醇、207mg CaNO3x 4H2O和8.75mL纯化水；pH调节为约9.0)。在冰上30min温育后，将原生质体-PEG悬浮液用W5培养基洗涤并且再悬浮于培养基B中。在约4℃下于冰箱中保持悬浮液过夜。
原生质体在藻酸钙中的包埋。在GRON导入后一天，将原生质包埋在藻酸钙中。原生质体在凝胶基质(例如琼脂糖、藻酸盐)中的包埋已经显示提高原生质体存活并且增加原生质体来源细胞的分裂频率。施用的方法是基于Dovzhenko(2001)中所描述的方法。
原生质体培养和抗咪草烟愈伤组织的选择。根据Pelletier等(1983)在培养基中应用连续继代培养藻酸盐来实施抗咪草烟愈伤组织的选择。在0.5μM咪草烟的浓度下于PEG/GRON处理后一周开始选择。除草剂不具有即时效应。最初，在没有咪草烟的早期培养阶段已经形成的所有小集落均继续生长，但慢于没有添加除草剂的对照。在选择开始后1至2周，集落的生长减慢或停止生长。
在液体培养基中的选择阶段结束之前，通过用含50mM柠檬酸钠的培养基处理它们30-45min来从藻酸盐释放细胞和集落。在将释放的集落从液体培养基转移到固体培养基时，大部分集落或死亡或由浅绿色中心组成，所述浅绿色中心覆盖有外层的死亡细胞。在固化的选择培养基E上，大部分仍含有活细胞的小愈伤组织停止生长并且呈现浅褐色。个体愈伤组织的有限生长偶尔继续，但所有非抗性愈伤组织最终均变为褐色并且死亡。在转移到固化的选择培养基后2至3周(偶尔会更早)，在浅褐色细胞和小愈伤组织的背景中出现活跃地生长的愈伤组织。
来自原生质体来源的、耐受除草剂的愈伤组织的植物的再生，所述愈伤组织具有证实的AHAS基因突变。将耐受Imi的愈伤组织——其已经在固化的选择培养基上发育并且在分析后其DNA已经显示突变的存在——转移至不含除草剂的培养基E(Pelletier等,1983)，以加快发育。个体愈伤组织株系的生长速度和形态学不同。一般而言，向茎干再生的发育遵循这些步骤：
未分化的绿色愈伤组织->具有深绿色区域的愈伤组织->根的发育->茎干最初的发育->具有超度含水(玻璃化的)叶子的矮化茎干的发育。
个体愈伤组织株系的发育是可变的，但通过在培养基E上连续继代培养和增殖或用较低浓度的α-萘乙酸(NAA)改进培养基E，最终许多愈伤组织株系产生了茎干。
一旦具有3至4个叶的茎干在培养基E上形成，便将它们转移至RS培养基(Dovzhenko,2001)。在该培养基上，随着时间的过去茎干和叶组织发育得形态学上'正常'(即，非超度含水)。在离体小植物已经产生根后，应用标准方案以适应温室条件。
实施例4：除草剂喷洒数据
用各种抑制AHAS的除草剂喷洒5-6个叶阶段的甘蓝型油菜植物。喷洒的甘蓝型油菜植物包括平行株系BN 02(或按需要BN 11)、BN 15(Clearfield，商业的两个基因对照)和下面详述的突变体。以下列比率在0.25％AU391表面活性剂存在的情况下喷洒除草剂：
甲氧咪草烟(BeyondTM)0、2、4、6、8、12、16、32和48oz活性成分/Acre(ai/A)
噻吩磺隆0.028、0.056、0.112、0.168lb ai/A
苯磺隆0.015、0.03、0.06、0.12、0.18lb ai/A
烟嘧磺隆lb 0.06、0.120、0.24、0.36ai/A
砜嘧磺隆0.015、0.03、0.06、0.12、0.18lb ai/A
2:1重量:重量噻吩磺隆/苯磺隆0.056、0.112、0.224、0.336lb ai/A
2.22:1噻吩磺隆/烟嘧磺隆0.058、0.116、0.232lb ai/A
氟嘧磺隆0.035、0.070、0.140lb ai/A
唑咪磺草胺0.040、0.080、0.16lb ai/A
氯酯磺草胺0.039、0.078、0.156lb ai/A
通过叶面喷洒来施用除草剂，并且对照植物保持不喷洒。除甲氧咪草烟外，所有抑制AHAS的除草剂试验应用1-10的损害等级——1为死亡以及10为未损害的未喷洒的对照——在喷洒后14天进行评价。与在该具体比率下对照的性能比较，在每一喷洒比率下对个体植物株系打分。喷洒试验的结果显示在图4中。
化学测试：基因型(所有比率的幼苗的#)
噻吩磺隆:BN2(6),BNl 5(6),BN15xBnALS-57(18)
苯磺隆:BN2(6),BN 15(6),BN15xBnALS-57(18),63(9)
烟嘧磺隆:BN2(6),BN 15(6),BN15xBnALS-57(18)
THI/TRI:BN2(6),BN 15(6),BN15xBnALS-57(18)
砜嘧磺隆:BN2(6),BN 15(6),BN15xBnALS-57(18),63(9)
THI/Nic:BN2(18),63(9),BN15xBnALS-57(36),BNl 5(18)
氟嘧磺隆:BN2(9),63(9),BNl 5(9),BN15xBnALS-57(18)
唑咪磺草胺:BN2(9),63(9),BN 15(9),BN15xBnALS-57(18)
氯酯磺草胺:BN2(9),63(9),BN15(9),BN15xBnALS-57(18)
用甲氧咪草烟的试验评价如下：
10d分数:8、16、32和48oz/A的BnALS-83xBnALS-123、BnALS-96xBnALS-123、BnALS-97xBnALS-57、BN15xBnALS-57、BN2、BN15、BnALS-97xBN15
17d分数:4和12oz/A的BnALS-97xBnALS-57、BN15xBnALS-97、BN2
28d分数:2、4、6、8oz/A的所有单个因子突变。
甲氧咪草烟：
2oz/A:BN2(18)、BnALS-123(9)、BnALS-96(9)、BnALS-97(18)、BnALS-83(6)、BnALS-76(18)、BnALS-58(9)、BnALS-57(12)
4oz/A:BN2(18)、BnALS-123(9)、BnALS-96(9)、BnALS-97(18)、BnALS-83(9)、BnALS-76(18)、BnALS-58(9)、BnALS-57(12)、BnALS-97xBN15(15)、BnALS-97xBnALS-57(14)
6oz/A:BN2(9)、BnALS-123(9)、BnALS-96(12)、BnALS-97(9)、BnALS-83(12)、BnALS-76(9)、BnALS-57(12)
8oz/A:BnALS-123(9)、BnALS-96(12)、BnALS-83(12)、BnALS-83xBnALS-123(18)、BnALS-96xBnALS-123(18)、BN2(18)、BNl 5(18)、BN15xBnALS-57(15)、BnALS-97xBnALS-57(18)、BN15xBnALS-97(18)
12oz/A:BnALS-97xBN15(15)、BnALS-97xBnALS-57(14)、BN2(12)
16oz/A:BnALS-83xBnALS-123(18)、BnALS-96xBnALS-123(18)、BN2(15)、BN15(18)、BN15xBnALS-57(18)、BnALS-97xBnALS-57(18)、BN15xBnALS-97(18)
32oz/A:BnALS-83xBnALS-123(18)、BnALS-96xBnALS-123(18)、BN2(13)、BN15(18)、BN15xBnALS-57(18)、BnALS-97xBnALS-57(18)、BN15xBnALS-97(18)
48oz/A:BnALS-83xBnALS-123(18)、BnALS-96xBnALS-123(18)、BN2(6)、BN15(18)、BN15xBnALS-57(18)、BnALS-97xBnALS-57(18)、BN15xBnALS-97(18)
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除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同的含义。
本文说明性描述的发明可以在本文没有具体公开的任意要素或多个要素、限制或多个限制不存在的情况下适当地被实践。因此，例如，术语"包含"、"包括"、"含有"等应当被广义地和无限制地理解。另外，本文采用的术语和表达已经被用作描述的术语，而不是限制，并且没有意图使用这些术语和表达来排除显示和描述的特征或其部分的任意等价物。应当意识到，各种修改在要求保护的发明范围内都是可能的。
因此，应当理解为，尽管本发明已经通过优选的实施方式和任选的特征进行了具体公开，但所公开的发明的修改、改进和变化可以由本领域技术人员采取，并且这些修改、改进和变化被认为是在本发明的范围内。此处提供的材料、方法和实施例代表了优选的实施方式，是示例性的，没有意图限制本发明的范围。
在本文中已经对本发明进行了广泛和一般性的描述。落入一般公开的较窄种类和亚组也组成本发明的一部分。这包括用从种类中去除任意主题的限制性条件或否定限制进行的本发明的一般描述——不论该去除材料是否在本文中被具体陈述。
此外，在针对马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域的技术人员将意识到，本发明还因此针对马库什组的任意单独成员或成员亚组进行描述。
本文中提到的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献通过引用其全部明确并入，达到好像每一个通过引用而单独并入的程度。在冲突的情况下，以包括限定在内的本说明书为准。
其它实施方式阐述在所附权利要求书中。

Claims (10)

1.分离核酸，其编码芸苔属(Brassica)乙酰羟酸合酶(AHAS)蛋白，所述蛋白在对应于选自如下位置的一个或更多个氨基酸位置处包含突变：SEQ ID NO：1的A205、D376、W574、R577和S653。
2.权利要求1所述的分离核酸，其中所述核酸编码的所述AHAS蛋白包含选自如下的一个或更多个突变：
在对应于SEQ ID NO：1的位置205的位置处丙氨酸取代为缬氨酸、
在对应于SEQ ID NO：1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸、
在对应于SEQ ID NO：1的位置376的位置处天冬氨酸取代为谷氨酸、
在对应于SEQ ID NO：1的位置574的位置处色氨酸取代为半胱氨酸、
在对应于SEQ ID NO：1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸、
在对应于SEQ ID NO：1的位置574的位置处色氨酸取代为甲硫氨酸、
在对应于SEQ ID NO：1的位置574的位置处色氨酸取代为丝氨酸、
在对应于SEQ ID NO：1的位置577的位置处精氨酸取代为色氨酸、
在对应于SEQ ID NO：1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺、和
在对应于SEQ ID NO：1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。
3.权利要求1所述的分离核酸，其中所述突变包含在对应于SEQID NO：1的位置653的位置处丝氨酸取代为天冬酰胺，其中所述突变不是芸苔属AHAS I基因中的S653N。
4.权利要求1所述的分离核酸，其中所述突变包含在对应于SEQID NO：1的位置653的位置处丝氨酸取代为苏氨酸。
5.权利要求1所述的分离核酸，其中所述突变包含在对应于SEQID NO：1的位置574的位置处色氨酸取代为亮氨酸，其中所述突变不是芸苔属AHAS III基因中的W574L。
6.权利要求1所述的分离核酸，其中所述突变包含在对应于SEQID NO：1的位置205的位置处丙氨酸取代为缬氨酸。
7.权利要求1所述的分离核酸，其中所述突变包含在对应于SEQID NO：1的位置205的位置处丙氨酸取代为天冬氨酸。
8.权利要求1所述的分离核酸，其中所述核酸编码的所述AHAS蛋白包含选自表2中示出的突变的突变。
9.权利要求1或2所述的分离核酸，其中所述核酸编码的所述AHAS蛋白包含两个或更多个突变。
10.权利要求9所述的分离核酸，其中所述两个或更多个突变选自表2中示出的突变。
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