JP6092930B2 - アブラナ属の変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
本出願は,米国特許仮出願60/977,944(2007年10月5日出願)に基づ
く優先権を主張しており,この出願は,明細書,図面,表を含めその全体がすべての目的
のために参照として本明細書に組み込まれる。
本発明は,除草剤耐性植物および種子の分野に関し,特に,アセトヒドロキシ酸シンタ
ーゼ(AHAS)遺伝子および蛋白質における変異に関する。
以下の説明は,単に本発明の理解を助けるために提供され,本発明に対する従来技術を
記載するかまたは構成すると認めるものではない。
するための耕うんの必要性を低減させ,このことにより土壌の浸食を有効に低減すること
ができる。
米国特許4,545,060は,植物のゲノムに,酵素をその競合的阻害剤であるグリホ
セートに対してより耐性にする少なくとも1つの変異を有するEPSPS変種をコードす
る遺伝子を導入することにより,植物のグリホセートに対する耐性を増加することに関す
る。
94,606を参照。
この変異は,PM−1として知られる(シロイヌナズナのアセト乳酸シンターゼ(ALS
)アミノ酸配列に基づいて653として知られる同等の位置における変異,セリンからア
スパラギンへのアミノ酸の変化,それぞれ次のようにコードされる-AGTからAAT)
。高発現している遺伝子AHAS IIIに別の変異が見いだされ,これはPM−2とし
て知られる(574として知られる同等の位置における変異,トリプトファンからロイシ
ンへのアミノ酸の変化,それぞれ次のようにコードされる-TGGからTTG)。これら
の2つの変異,すなわちPM−1およびPM−2を組み合わせたものが,クリアフィール
ド(Clearfield)キャノーラとして知られるキャノーラの商業的亜種である(
Tan et al.,2005)。
本発明は,部分的には,変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)核酸,および
変異した核酸によりコードされる蛋白質に関する。本発明はまた,部分的には,これらの
変異した核酸および蛋白質を含むキャノーラ植物,細胞,および種子に関する。
びS653からなる群より選択される位置に対応する1またはそれ以上のアミノ酸位置に
おいて変異を有するアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ蛋白質をコードする単離さ
れた核酸が提供される。ある態様においては,単離された核酸は,配列番号1の205位
に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換,配列番号1の205位に対応する
位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換,配列番号1の376位に対応する位
置におけるアスパラギン酸からグルタミン酸への置換,配列番号1の574位に対応する
位置におけるトリプトファンからシステインへの置換,配列番号1の574位に対応する
位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換,配列番号1の574位に対応する位
置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換,配列番号1の574位に対応する位
置におけるトリプトファンからセリンへの置換,配列番号1の577位に対応する位置に
おけるアルギニンからトリプトファンへの置換,配列番号1の653位に対応する位置に
おけるセリンからアスパラギンへの置換および配列番号1の653位に対応する位置にお
けるセリンからトレオニンへの置換からなる群より選択される1またはそれ以上の変異を
有する蛋白質をコードする。ある態様においては,変異は配列番号1の653位に対応す
る位置におけるセリンからアスパラギンへの置換であり,ここで,変異はアブラナ属AH
AS I遺伝子のS653Nではない。ある態様においては,変異は配列番号1の653
位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換である。ある態様においては,
変異は配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置
換であり,ここで,変異はアブラナ属AHAS III遺伝子のW574Lではない。あ
る態様においては,変異は配列番号1の205位に対応する位置におけるアラニンからバ
リンへの置換である。別の態様においては,変異は,配列番号1の205位に対応する位
置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換である。別の態様においては,単離され
た核酸は,表2に示される変異から選択される変異を有する蛋白質をコードする。ある態
様においては,単離された核酸は2またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードする。
ある態様においては,2またはそれ以上の変異は表2から選択される。ある態様において
は,単離された核酸は,配列番号1のS653に対応する位置に変異を有し,配列番号1
のA205,D376,W574,およびR577からなる群より選択される位置に対応
する1またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードする。別の態
様においては,単離された核酸は,配列番号1のW574に対応する位置において変異を
有し,配列番号1のR577に対応する位置において変異を有する蛋白質をコードする。
ある態様においては,単離された核酸は,AHAS阻害性除草剤による阻害に耐性である
アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)蛋白質をコードする。ある態様においては,
AHAS阻害性除草剤は,イミダゾリノン,スルホニルウレア,トリアゾロピリミジン,
ピリミジニルチオベンゾエート,スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン,および
これらの混合物からなる群より選択される除草剤である。ある態様においては,除草剤は
イミダゾリノン除草剤である。ある態様においては,除草剤はスルホニルウレア除草剤で
ある。ある態様においては,単離された核酸は,図2のアミノ酸配列の1またはそれ以上
と70%またはそれ以上の同一性を含むAHAS蛋白質をコードする。ある態様において
は,単離された核酸はセイヨウアブラナAHAS蛋白質をコードする。別の態様において
は,単離された核酸はセイヨウアブラナAHAS I蛋白質をコードする。ある態様にお
いては,単離された核酸はセイヨウアブラナAHAS III蛋白質をコードする。
S653からなる群より選択される位置に対応する1またはそれ以上のアミノ酸位置にお
いて変異を有するアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ蛋白質をコードする単離され
た核酸を含む発現ベクターが提供される。ある態様においては,発現ベクターは,配列番
号1の205位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換,配列番号1の20
5位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換,配列番号1の376
位に対応する位置におけるアスパラギン酸からグルタミン酸への置換,配列番号1の57
4位に対応する位置におけるトリプトファンからシステインへの置換,配列番号1の57
4位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換,配列番号1の574
位に対応する位置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換,配列番号1の574
位に対応する位置におけるトリプトファンからセリンへの置換,配列番号1の577位に
対応する位置におけるアルギニンからトリプトファンへの置換,配列番号1の653位に
対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換および配列番号1の653位に対
応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換からなる群より選択される1またはそ
れ以上の変異を有する蛋白質をコードする単離された核酸を含む。ある態様においては,
変異は,配列番号1の653位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換
であり,ここで,変異はアブラナ属AHAS I遺伝子のS653Nではない。ある態様
においては,変異は配列番号1の653位に対応する位置におけるセリンからトレオニン
への置換である。ある態様においては,変異は配列番号1の574位に対応する位置にお
けるトリプトファンからロイシンへの置換であり,ここで,変異はアブラナ属AHAS
III遺伝子のW574Lではない。ある態様においては,変異は配列番号1の205位
に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換である。別の態様においては,変異
は配列番号1の205位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換で
ある。
有する植物が提供され,ここで,該遺伝子は,配列番号1のA205,D376,W57
4,R577,およびS653からなる群より選択される位置に対応する1またはそれ以
上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードする。別の観点においては,アブ
ラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)遺伝子を有する植物が提供され,ここ
で,該植物はAHAS阻害性除草剤に耐性であり,該遺伝子は,配列番号1のA205,
D376,W574,R577,およびS653からなる群より選択される位置に対応す
る1またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードする。上述の観
点のある態様においては,植物は,配列番号1の205位に対応する位置におけるアラニ
ンからバリンへの置換,配列番号1の205位に対応する位置におけるアラニンからアス
パラギン酸への置換,配列番号1の376位に対応する位置におけるアスパラギン酸から
グルタミン酸への置換,配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンか
らシステインへの置換,配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンか
らロイシンへの置換,配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンから
メチオニンへの置換,配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンから
セリンへの置換,配列番号1の577位に対応する位置におけるアルギニンからトリプト
ファンへの置換,配列番号1の653位に対応する位置におけるセリンからアスパラギン
への置換および配列番号1の653位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの
置換からなる群より選択される1またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードするAH
AS遺伝子を有する。ある態様においては,変異は配列番号1の653位に対応する位置
におけるセリンからアスパラギンへの置換であり,ここで,変異はアブラナ属AHAS
I遺伝子のS653Nではない。ある態様においては,変異は配列番号1の653位に対
応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換である。ある態様においては,変異は
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換であ
り,ここで,変異はアブラナ属AHAS III遺伝子のW574Lではない。ある態様
においては,変異は配列番号1の205位に対応する位置におけるアラニンからバリンへ
の置換である。別の態様においては,変は配列番号1の205位に対応する位置における
アラニンからアスパラギン酸への置換である。別の態様においては,変異は表2に示され
る変異から選択される。ある態様においては,植物は,2またはそれ以上の変異を有する
蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。ある態様においては,2またはそれ以上の
変異は表2から選択される。ある態様においては,植物は,配列番号1のS653に対応
する位置において変異を有し,配列番号1のA205,D376,W574,およびR5
77からなる群より選択される位置に対応する1またはそれ以上のアミノ酸位置において
変異を有する蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。別の態様においては,植物は
,配列番号1のW574に対応する位置において変異を有し,かつ配列番号1のR577
に対応する位置において変異を有する蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。ある
態様においては,植物は,AHAS阻害性除草剤による阻害に耐性である蛋白質をコード
するAHAS遺伝子を有する。ある態様においては,植物は,図2のアミノ酸配列の1ま
たはそれ以上と70%またはそれ以上の同一性を含む蛋白質をコードするAHAS遺伝子
を有する。ある態様においては,植物は,少なくとも1つのAHAS阻害性除草剤の適用
に対して耐性である。ある態様においては,AHAS阻害性除草剤は,イミダゾリノン,
スルホニルウレア,トリアゾロピリミジン,ピリミジニルチオベンゾエート,スルホニル
アミノ−カルボニルトリアゾリノン,およびこれらの混合物からなる群より選択される除
草剤である。ある態様においては,除草剤はイミダゾリノン除草剤である。ある態様にお
いては,除草剤はスルホニルウレア除草剤である。ある態様においては,植物は,表2に
挙げられる系統から選択される系統の種子を生長させることにより製造されるアブラナ属
植物である。ある態様においては,植物はアブラナ属の種である。別の態様においては,
植物はセイヨウアブラナである。ある態様においては,植物は,春菜種(Spring
Oilseed Rape)および冬菜種(Winter Oilseed Rape)
から選択される。ある態様においては,植物はセイヨウアブラナAHAS蛋白質をコード
するAHAS遺伝子を有する。別の態様においては,植物はセイヨウアブラナAHAS
I蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。ある態様においては,植物はセイヨウア
ブラナAHAS III蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。ある態様において
は,植物は非トランスジェニックである。
びS653からなる群より選択される位置に対応する1またはそれ以上のアミノ酸位置に
おいて変異を有する蛋白質をコードするアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AH
AS)遺伝子を有する種子提供される。ある態様においては,種子は,配列番号1の20
5位に対応する位置におけるアラニンからバリンへの置換,配列番号1の205位に対応
する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換,配列番号1の376位に対応す
る位置におけるアスパラギン酸からグルタミン酸への置換,配列番号1の574位に対応
する位置におけるトリプトファンからシステインへの置換,配列番号1の574位に対応
する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換,配列番号1の574位に対応す
る位置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換,配列番号1の574位に対応す
る位置におけるトリプトファンからセリンへの置換,配列番号1の577位に対応する位
置におけるアルギニンからトリプトファンへの置換,配列番号1の653位に対応する位
置におけるセリンからアスパラギンへの置換,および配列番号1の653位に対応する位
置におけるセリンからトレオニンへの置換からなる群より選択される1またはそれ以上の
変異を有する蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。ある態様においては,変異は
配列番号1の653位に対応する位置におけるセリンからアスパラギンへの置換であり,
ここで,変異はアブラナ属AHAS I遺伝子のS653Nではない。ある態様において
は,変異は配列番号1の653位に対応する位置におけるセリンからトレオニンへの置換
である。ある態様においては,変異は配列番号1の574位に対応する位置におけるトリ
プトファンからロイシンへの置換であり,ここで,変異はアブラナ属AHAS III遺
伝子のW574Lではない。ある態様においては,変異は配列番号1の205位に対応す
る位置におけるアラニンからバリンへの置換である。別の態様においては,変異は配列番
号1の205位に対応する位置におけるアラニンからアスパラギン酸への置換である。別
の態様においては,変異は表2に示される変異から選択される。ある態様においては,種
子は2またはそれ以上の変異を有する蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。ある
態様においては,2またはそれ以上の変異は表2から選択される。ある態様においては,
配列番号1のS653に対応する位置において変異を有し,かつ配列番号1のA205,
D376,W574,およびR577からなる群より選択される位置に対応する1または
それ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有す
る。別の態様においては,種子は,配列番号1のW574に対応する位置において変異を
有し,配列番号1のR577に対応する位置において変異を有する蛋白質をコードするA
HAS遺伝子を有する。ある態様においては,種子は,AHAS阻害性除草剤による阻害
に耐性である蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。ある態様においては,種子は
,図2のアミノ酸配列の1またはそれ以上と70%またはそれ以上の同一性を含む蛋白質
をコードするAHAS遺伝子を有する。ある態様においては,種子は,少なくとも1つの
AHAS阻害性除草剤の適用に耐性である。ある態様においては,AHAS阻害性除草剤
は,イミダゾリノン,スルホニルウレア,トリアゾロピリミジン,ピリミジニルチオベン
ゾエート,スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン,およびこれらの混合物からな
る群より選択される除草剤である。ある態様においては,除草剤はイミダゾリノン除草剤
である。ある態様においては,除草剤はスルホニルウレア除草剤である。ある態様におい
ては,種子はアブラナ属種子である。ある態様においては,種子はセイヨウアブラナAH
AS蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。別の態様においては,種子はセイヨウ
アブラナAHAS I蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する。ある態様においては
,種子はセイヨウアブラナAHAS III蛋白質をコードするAHAS遺伝子を有する
。ある態様においては,種子はアブラナ属植物系統の種子であり,この系統は,表2に挙
げられる系統から選択される。ある態様においては,種子は非トランスジェニックである
。ある態様においては,本明細書に記載される方法により得られる植物から生成される種
子を提供する。別の態様においては,種子はキャノーラ種子である。
胞にアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)遺伝子に標的とする変異を有する遺伝子
修復オリゴ核酸塩基(GRON)を導入して,配列番号1のA205,D376,W57
4,およびS653からなる群より選択される位置に対応する1またはそれ以上のアミノ
酸位置において変異を有するAHAS蛋白質を発現するAHAS遺伝子を有する植物細胞
を生成し;AHAS阻害性除草剤の存在下で対応する野生型植物細胞と比較して実質的に
正常な生長および触媒活性を有する植物細胞を同定し;そして,前記植物細胞から変異し
たAHAS遺伝子を有する非トランスジェニック除草剤耐性植物を再生する,の各工程を
含む。別の観点においては,植物の除草剤耐性を増加させる方法が提供され,この方法は
,(a)第1のアブラナ属植物と第2のアブラナ属植物を交配させ,ここで,第1の植物
はアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)遺伝子を含み,ここで,遺伝子
は,配列番号1のA205,D376,W574,R577,およびS653からなる群
より選択される位置に対応する1またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋
白質をコードしており;(b)交配から得られた集団を,増加したAHAS除草剤耐性に
ついてスクリーニングし;(c)交配の結果生じた,AHAS除草剤耐性が増加したメン
バーを選択し;そして(d)交配から得られた種子を生成する,の各工程を含む。ある態
様においては,ハイブリッド種子は上述のいずれかの方法により製造される。ある態様に
おいては,植物は上述のいずれかの方法により製造された種子から生長させる。別の観点
においては,植物を含む畑において雑草を防除する方法が提供され,この方法は,有効量
の少なくとも1つのAHAS阻害性除草剤を前記雑草および植物を含む畑に適用し,植物
はアブラナ属アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)遺伝子を有しており,遺伝子は
配列番号1のA205,D376,W574,R577,およびS653からなる群より
選択される位置に対応する1またはそれ以上のアミノ酸位置において変異を有する蛋白質
をコードする。ある態様においては,AHAS阻害性除草剤は,イミダゾリノン,スルホ
ニルウレア,トリアゾロピリミジン,ピリミジニルチオベンゾエート,スルホニルアミノ
−カルボニルトリアゾリノン,およびこれらの混合物からなる群より選択される除草剤で
ある。別の態様においては,AHAS阻害性除草剤はイミダゾリノン除草剤である。別の
態様においては,AHAS阻害性除草剤はスルホニルウレア除草剤である。
クレオチド,およびこれらのフラグメントまたは一部を表し,これは一本鎖であっても二
本鎖であってもよく,センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。核酸はDNA
であってもRNAであってもよく,天然起源のものであっても合成のものであってもよい
。例えば,核酸には,mRNAまたはcDNAが含まれる。核酸には,増幅された(例え
ば,ポリメラーゼ連鎖反応を用いて)核酸が含まれる。"NTwt###NTmut"との
慣用表記法は,核酸中の位置###において野生型ヌクレオチドNTwtが変異型NTm
utで置き換えられることにより生ずる変異を示すために用いられる。ヌクレオチドの1
文字コードは"the U.S.Patent Office Manual of P
atent Examining Procedure",第2422章,表1に示され
るとおりである。この点に関して,ヌクレオチドの表記では,"R"はプリン,例えばグア
ニンまたはアデニンを意味し,"Y"はピリミジン,例えばシトシンまたはチミン(RNA
の場合にはウラシル)を意味し,"M"はアデニンまたはシトシンを意味し,"K"はグアニ
ンまたはチミンを意味し,"W"はアデニンまたはチミンを意味する。
NA配列を表し,これは,非コーディング機能(例えば,リボソームまたはトランスファ
ーRNA)を有していてもよく,またはポリペプチドまたはポリペプチド前駆体を含んで
いてもよい。RNAまたはポリペプチドは,全長コーディング配列によりコードされてい
てもよく,または,所望の活性または機能が維持される限り,コーディング配列の任意の
一部によりコードされていてもよい。本明細書において用いる場合,"AHAS遺伝子"と
の用語は,アブラナ属AHAS遺伝子に対して相同性を有する遺伝子を表す。ある態様に
おいては,AHAS遺伝子は,特定のアブラナ属AHAS遺伝子,例えば,セイヨウアブ
ラナAHAS遺伝子IまたはセイヨウアブラナAHAS遺伝子IIIに対して,70%;
75%;80%;85%;90%;95%;96%;97%;98%;99%;または1
00%の同一性を有する。ある態様においては,AHAS遺伝子は,図3の配列から選択
される配列に対して,60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;96
%;97%;98%;99%;または100%の同一性を有する。ある態様においては,
AHAS遺伝子は少なくとも1つの変異により改変されている。別の態様においては,A
HAS遺伝子は,少なくとも2つの変異により改変されている。ある態様においては,A
HAS遺伝子は,表2に示される変異から選択される少なくとも1つの変異により改変さ
れている。ある態様においては,AHAS遺伝子は,表2に示される少なくとも2つの変
異により改変されている。ある態様においては,変異は保存的変異である。
/またはポリペプチドまたはそのフラグメントを生成する核酸またはその相補体,または
その一部の配列を意味する。コーディング配列はゲノムDNAまたは未成熟一次RNA転
写産物中にエクソンを含み,これは細胞の生化学的機構により一緒に連結されて,成熟m
RNAを与える。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり,コードされる配列は
ここから推定することができる。
の配列またはその一部,または,tRNAがアミノ酸を配置するよう相互作用しないかま
たは配置しようとしない配列を意味する。非コーディング配列には,ゲノムDNAまたは
未成熟一次RNA転写産物中のイントロン配列,および遺伝子付随配列,例えばプロモー
ター,エンハンサー,サイレンサー等の両方が含まれる。
れらの誘導体または類似体である。ヌクレオシドは,ペントースフラノシル成分を含む核
酸塩基,例えば,任意に置換されていてもよいリボシドまたは2’−デオキシリボシドで
ある。ヌクレオシドは,リンを含んでいても含んでいなくてもよいいくつかの連結成分の
1つにより連結することができる。未置換ホスホジエステル結合により連結されているヌ
クレオシドは,ヌクレオチドと称される。本明細書において用いる場合,"核酸塩基"との
用語には,ペプチド核酸塩基,ペプチド核酸のサブユニット,およびモルホリン核酸塩基
,ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドが含まれる。
,相補的配列を有するDNAに,ワトソンクリック塩基対形成によりハイブリダイズする
ことができる。オリゴ核酸塩基鎖は,単一の5’および3’末端を有することができ,こ
れはポリマー中の最終の核酸塩基である。特定のオリゴ核酸塩基鎖は,すべてのタイプの
核酸塩基を含むことができる。オリゴ核酸塩基化合物は,相補的であってワトソンクリッ
ク塩基対形成によりハイブリダイズすることができる1またはそれ以上のオリゴ核酸塩基
鎖を含む化合物である。リボ型の核酸塩基には,2’炭素がヒドロキシル,アルキルオキ
シまたはハロゲンで置換されているメチレンであるペントースフラノシル含有核酸塩基が
含まれる。デオキシリボ型の核酸塩基は,リボ型の核酸塩基以外の核酸塩基であり,これ
には,ペントースフラノシル成分を含まないすべての核酸塩基が含まれる。
鎖のセグメントまたは領域の両方が含まれる。オリゴ核酸塩基鎖は3’末端および5’末
端を有することができ,オリゴ核酸塩基鎖が鎖と同一の広がりを持つ場合,鎖の3’およ
び5’末端は鎖の3’および5’末端でもある。
レックスオリゴヌクレオチド,非ヌクレオチド含有分子,一本鎖オリゴデオキシヌクレオ
チドおよび他の遺伝子修復分子を含むオリゴ核酸塩基を表す。
て"単離された"とは,これが天然に生ずるゲノムの実質的な部分から分離されているか,
および/または,そのような核酸に天然に付随する他の細胞成分から実質的に分離されて
いる核酸を意味する。例えば,合成により製造された(例えば,連続的な塩基縮合により
)核酸は,単離されたものと考えられる。同様に,組換え的に発現された,クローニング
された,プライマー伸張反応(例えばPCR)により生成した,または他の方法によりゲ
ノムから切り出された核酸もまた,単離されたものと考えられる。
mut"との慣用表記法は,ポリペプチド中の位置###において野生型アミノ酸AAw
tが変異体AAmutで置き換えられることにより生ずる変異を示すために用いられる。
配列を意味する。相補的配列はまた,DNA配列に相補的なRNAの配列またはその相補
的配列であってもよく,cDNAであってもよい。
配列がハイブリダイズすることを意味する。当業者は実質的に相補的な配列はその全長に
わたってハイブリダイズする必要はないことを理解するであろう。
中への特定のアミノ酸の挿入を決定する遺伝的コードまたは蛋白質合成の停止のシグナル
を構成する,3つの隣接するヌクレオチド(RNAまたはDNAのいずれか)の配列を表
す。"コドン"との用語はまた,元のDNAが転写されたメッセンジャーRNA中の3つの
ヌクレオチドの対応する(そして相補的な)配列を表すためにも用いられる。
質に相同性を有する蛋白質を表す。ある態様においては,AHAS蛋白質は,特定のアブ
ラナ属AHAS蛋白質,例えば,セイヨウアブラナAHAS蛋白質Iまたはセイヨウアブ
ラナAHAS蛋白質IIIと,70%;75%;80%;85%;90%;95%;96
%;97%;98%;99%;または100%の同一性を有する。ある態様においては,
AHAS蛋白質は,図2の配列から選択される配列と,70%;75%;80%;85%
;90%;95%;96%;97%;98%;99%;または100%の同一性を有する
。ある態様においては,AHAS蛋白質は少なくとも1つの変異により改変されている。
別の態様においては,AHAS蛋白質は少なくとも2つの変異により改変されている。あ
る態様においては,AHAS蛋白質は,表2に示される変異から選択される少なくとも1
つの変異により改変されている。ある態様においては,AHAS蛋白質は表2に示される
少なくとも2つの変異により改変されている。ある態様においては,変異は保存的変異で
ある。
ときの特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を表す。野生型遺伝子とは,集団中で最も高
い頻度で観察され,したがって,任意に遺伝子の"正常型"または"野生型"と呼ばれる遺伝
子である。"野生型"とはまた,特定のヌクレオチド位置(単数または複数)における配列
,または特定のコドン位置(単数または複数)における配列,または特定のアミノ酸位置
(単数または複数)における配列を表してもよい。
は遺伝子産物と比較したときに,配列および/または機能上の特性(すなわち,変更され
た特徴)に改変を示す核酸または蛋白質を表す。また,"変異体"または"改変された"とは
,野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較したときに,配列および/または機能上の特性
(すなわち,変更された特徴)に改変を示す,特定のヌクレオチド位置(単数または複数
)における配列,または特定のコドン位置(単数または複数)における配列,または特定
のアミノ酸位置(単数または複数)における配列を表す。
のヌクレオチドの変動(variation)またはポリペプチドにおける単一のアミノ
酸の変動を包含することを意味する。変異には,置換,欠失,反転または挿入が含まれる
。
類似性を表す。"相同性"または"相同な"との用語は,同一性の程度を表す。部分的な相同
性であっても完全な相同性であってもよい。部分的に相同な配列とは,別の配列と比較し
たときに100%より低い配列同一性を有するものである。
て異なるアレルを有することを表す。本明細書において用いる場合,"ヘテロ接合性"はま
た,1またはそれ以上の遺伝子座において異なるアレルが検出されるサンプル,細胞,細
胞集団または生物も表す。ヘテロ接合性のサンプルは,当該技術分野において知られる方
法,例えば,核酸配列決定によって判定してもよい。例えば,配列決定の電気泳動像が単
一の位置に2つのピークを示し,両方のピークがおおよそ同じサイズであれば,サンプル
はヘテロ接合性であると特徴づけることができる。あるいは,一方のピークが他方のピー
クより小さいが,大きいほうのピークのサイズの少なくとも約25%のサイズであれば,
サンプルはヘテロ接合性であると特徴づけることができる。ある態様においては,小さい
ほうのピークは大きいほうのピークの少なくとも約15%である。別の態様においては,
小さいほうのピークは,大きいほうのピークの少なくとも約10%である。別の態様にお
いては,小さいほうのピークは,大きいほうのピークの少なくとも約5%である。別の態
様においては,小さいほうのピークは最少量で検出される。
はそれ以上の遺伝子座において同一のアレルを有することを表す。"ホモ接合性"はまた,
1またはそれ以上の遺伝子座において同じアレルが欠失していてもよいサンプル,細胞,
細胞集団または生物も表す。ホモ接合性のサンプルは,当該技術分野において知られる方
法,例えば,核酸配列決定により判定することができる。例えば,配列決定電気泳動像が
特定の位置において単一のピークを示す場合,サンプルはその位置に関して"ホモ接合性"
であると称される。
イプにおいて1回のみ存在する遺伝子または遺伝子セグメントを表す。本明細書において
用いる場合,"半接合性"はまた,ジェノタイプにおいて1またはそれ以上の遺伝子座にお
けるアレルが1回のみ検出されるサンプル,細胞,細胞集団または生物も表す。
,本明細書に記載される方法により試験することにより判定して,ヘテロ接合性,ホモ接
合性,または半接合性と思われるサンプル,細胞集団,または生物を表す。"核酸の接合
性状態"との用語は,核酸の起源が,ヘテロ接合性,ホモ接合性,または半接合性と思わ
れるか否かを判定することを意味する。"接合性状態"は,配列中の単一のヌクレオチドの
相違を表してもよい。ある方法においては,単一の変異に関するサンプルの接合性状態は
,野生型のホモ接合性,ヘテロ接合性(すなわち,1つの野生型アレルおよび1つの変異
型アレル),変異型のホモ接合性,または半接合性(すなわち,野生型または変位型のア
レルのいずれかの単一コピー)として分類することができる。
り開発されたザ・ラピッド・トレイト・デベロップメント・システム(The Rapi
d Trait Development System(商標))(RTDS)を表す
。RTDSは,外来遺伝子または制御配列を取り込ませることなく遺伝子配列を精密に変
更するのに有効な部位特異的遺伝子改変システムである。
を意味する。例えば,"約3%"は2.7−3.3%を包含し,"約10%"は9−11%を
包含する。
本発明は,部分的には,例えば,サイバス社により開発された"the Rapid
Trait Development System(RTDS(登録商標)"技術を用
いて,アブラナ属のアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)遺伝子を首尾良く標的化
することに関連する組成物および方法を提供する。本明細書に開示されるいすれかの変異
を含む植物は,組み合わせでまたは単独で,新規な除草剤耐性製品の基礎を形成すること
ができる。また,AHAS遺伝子の変異についてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれ
かである変異した植物から生成される種子も提供される。本明細書に開示される変異は,
他の既知の任意の変異との,または将来発見される変異との組み合わせであってもよい。
特異的に改変し,外来DNAおよび遺伝子発現制御配列を挿入しないで,標的とする遺伝
子を変化させることに基づく。この方法は,ゲノムの残部を変更せずに,遺伝的配列を精
密に変化させることができる。慣用的なトランスジェニック遺伝子組換え生物(GMO)
とは異なり,外来性の遺伝的物質のインテグレーションはなく,外来性の遺伝的物質は植
物中に残らない。RTDSにより導入される遺伝的配列の変化は,ランダムに挿入される
ものではない。影響を受ける遺伝子はその天然の位置に維持されるため,ランダムな,制
御されない,または有害な発現パターンは生じない。
マッチした塩基対(単数または複数)を生成するよう設計された,DNAおよび修飾RN
A塩基の両方,ならびに他の化学成分から構成されることができる,化学的に合成したオ
リゴヌクレオチドである。このミスマッチした塩基対は,細胞それ自身の天然の遺伝子修
復系をその部位に引きつけるシグナルとして作用し,遺伝子中の指定されたヌクレオチド
(単数または複数)を修正(置き換え,挿入または欠失)する。修正プロセスが完了する
と,RTDS分子は分解され,今回改変されたまたは修復された遺伝子は,その遺伝子の
通常の内因性制御メカニズムの下で発現される。
子および蛋白質(配列番号2,3および4を参照)を用いて記述される。本発明の組成物
および方法は,他の種の変異したAHAS遺伝子(パラログ)も包含する。しかし,異な
る種のAHAS遺伝子における変動のため,1つの種において変更すべきアミノ酸残基の
番号は別の種におけるものと異なるかもしれない。いずれにしても,当業者は配列相同性
により類似の位置を容易に同定することができる。例えば,図1は,シロイナズナAHA
S(配列番号1)およびセイヨウアブラナAHAS I(配列番号2)およびAHAS
III(配列番号3および配列番号4)パラログのアライメントしたアミノ酸配列を示す
。すなわち,これらのパラログおよび他のパラログにおける類似の位置を同定し,変異を
導入することができる。
除草剤ファミリーの除草剤に対して耐性または寛容性にする,AHAS遺伝子中の変異に
関連する。本発明の組成物および方法はまた,植物の染色体またはエピゾーム配列中のA
HAS蛋白質をコードする遺伝子において所望の変異を作製するために,遺伝子修復オリ
ゴ核酸塩基を使用することに関連する。野生型蛋白質の触媒活性を実質的に維持している
変異蛋白質は,AHAS阻害性ファミリーの除草剤に対する植物の耐性または寛容性を増
大させることができ,除草剤の存在または非存在にかかわらず,野生型植物と比較して,
植物,その器官,組織,または細胞を実質的に正常な生長または発生させることができる
。本発明の組成物および方法はまた,AHAS遺伝子が変異している非トランスジェニッ
ク植物細胞,これから再生された非トランスジェニック植物,ならびに再生された非トラ
ンスジェニック植物を用いて,異なるAHAS遺伝子に変異を有する植物または例えば変
異したEPSPS遺伝子を有する植物と交配させることにより得られる植物に関する。
りの4つのファミリーは,スルホニルウレア類,トリアゾロピリミジン類,ピリミジニル
チオベンゾエート類およびスルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン類である(Ta
n et al.,2005)。
非トランスジェニックの植物または植物細胞,例えば本明細書に開示されるものが提供さ
れる。ある態様においては,AHAS遺伝子中に1またはそれ以上の変異を有する植物ま
たは植物細胞は,AHAS阻害剤のメンバーに対して増加した耐性または寛容性を有する
。ある態様においては,AHAS遺伝子中に1またはそれ以上の変異を有する植物または
植物細胞は,対応する野生型の植物または細胞と比較して,植物,その器官,組織または
細胞の実質的に正常な生長または発生を示すことができる。提供される特定の観点および
態様は,AHAS遺伝子に変異を有する非トランスジェニック植物,例えば本明細書に開
示されるものである。これは,ある態様においては,AHAS阻害性除草剤ファミリーの
メンバーに対して増加した耐性または寛容性を有し,対応する野生型の植物または細胞と
比較して,植物,その器官,組織または細胞の実質的に正常な生長または発生を示すこと
ができる。すなわち,1またはそれ以上の除草剤,例えば,イミダゾリノンおよび/また
はスルホニルウレアの存在下で,変異したAHAS蛋白質は野生型AHAS蛋白質と比較
して実質的に同じ触媒活性を有する。
れ以上の変異を有する植物を製造する方法も提供される。好ましくは,植物は,関連する
除草剤の存在または非存在にかかわらず,野生型蛋白質の触媒活性を実質的に維持してい
る。ある態様においては,本発明の方法は,AHAS遺伝子中に1またはそれ以上の標的
とする変異(例えば,本明細書に開示されるもの)を有する遺伝子修復オリゴ核酸塩基を
植物細胞に導入し,そして変異したAHAS遺伝子を有する細胞,種子,または植物を同
定することを含む。
葉植物または裸子植物であってもよく,例えば,木または潅木として生長する任意の木性
植物種,任意の草本植物,または食用果実,種子または野菜を生成する任意の種,または
色とりどりのまたは香りの良い花を生成する任意の種であることができる。例えば,植物
は,上で特定的に記載されたもののほか,キャノーラ,ヒマワリ,タバコ,テンサイ,綿
花,トウモロコシ,コムギ,オオムギ,イネ,ソルガム,トマト,マンゴー,モモ,リン
ゴ,洋ナシ,イチゴ,バナナ,メロン,ジャガイモ,ニンジン,レタス,タマネギ,大豆
種,サトウキビ,エンドウ,ソラマメ,ポプラ,ブドウ,柑橘類,アルファルファ,ライ
麦,オートムギ,芝草および飼料草,亜麻,菜種,キュウリ,アサガオ,ニガウリ(ba
lsam),ピーマン,ナス,マリーゴールド,ハス,キャベツ,デイジー,カーネーシ
ョン,チューリップ,アヤメ,ユリ,および木の実を生成する植物からなる群の植物の種
から選択することができる。
,例えば,限定されないが,マイクロキャリア(遺伝子銃(biolistic)デリバ
リー),マイクロファイバー,ポリエチレングリコール(PEG)媒介性取り込み,エレ
クトロポレーション,およびマイクロインジェクションを用いて,植物細胞中に導入する
ことができる。
以下,"繁殖力のある植物"と称する)を得るために培養し,そのような繁殖力のある植物
から種子およびさらなる植物を製造することに関連する方法および組成物が提供される。
HAS遺伝子が変更した植物および雑草を含み,この方法は,植物が耐性になっている畑
に除草剤を適用することを含む。
は変異したAHAS遺伝子が野生型AHASと比較して実質的に同じ酵素活性を有するよ
うな,AHAS遺伝子中の変異も提供される。
本明細書に開示される方法および組成物は,下記に詳細に説明されるコンフォメーショ
ンおよび化学を有する"遺伝子修復オリゴ核酸塩基"を用いて実施または製造することがで
きる。本明細書において企図される"遺伝子修復オリゴ核酸塩基"とは,公開された化学文
献および特許文献において,例えば,"組換え誘導性(recombinagenic)
オリゴ核酸塩基";"RNA/DNAキメラオリゴヌクレオチド";"キメラオリゴヌクレオ
チド";"混合デュープレックスオリゴヌクレオチド"(MDONs);"RNADNAオリ
ゴヌクレオチド(RDOs)";"遺伝子標的化オリゴヌクレオチド;""ジェノプラスト"
;"一本鎖修飾オリゴヌクレオチド";"一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド変異用ベクタ
ー"(SSOMVs);"デュープレックス変異用ベクター";および"ヘテロデュープレッ
クス変異用ベクター"等の他の名称を用いて記載されている。
特許5,731,181(Kmiec II)(参照として本明細書に組み込まれる)に
記載されるコンフォメーションおよび化学を有するオリゴ核酸塩基は,本発明の"遺伝子
修復オリゴ核酸塩基"として用いるのに適している。Kmiec Iおよび/またはKm
iec IIの遺伝子修復オリゴ核酸塩基は,2つの相補的鎖を含み,その一方は少なく
とも1つのRNA型のヌクレオチドのセグメント("RNAセグメント")を含み,これは
他方の鎖のDNA型のヌクレオチドと塩基対形成する。
オチドを用いてもよいことを開示する。本発明において用いることができる別の遺伝子修
復分子は,米国特許5,756,325;5,871,984;5,760,012;5
,888,983;5,795,972;5,780,296;5,945,339;6
,004,804;および6,010,907,および国際出願PCT/US00/23
457;および国際公開WO98/49350;WO99/07865;WO99/58
723;WO99/58702;およびWO99/40789(それぞれその全体が参照
として本明細書に組み込まれる)に記載されている。
レオチド(MDON)であり,ここで,混合デュープレックスオリゴヌクレオチドのRN
A型のヌクレオチドは,2’−ヒドロキシルをフルオロ,クロロまたはブロモ官能基で置
き換えることにより,または2’−O上に置換基を配置することにより,RNaseに耐
性とされている。適当な置換基としては,Kmiec IIにより教示される置換基が挙
げられる。別の置換基としては,米国特許5,334,711(Sproat)により教
示される置換基および特許公開EP629387およびEP679657(併せてMar
tin出願と称し,これらは参照として本明細書に組み込まれる)により教示される置換
基が挙げられる。本明細書において用いる場合,リボヌクレオチドの2’−フルオロ,ク
ロロまたはブロモ誘導体,またはMartin出願またはSproatに記載される置換
基で置換された2’−OHを有するリボヌクレオチドは,"2’−置換リボヌクレオチド"
と称される。本明細書において用いる場合,"RNA型のヌクレオチド"との用語は,混合
デュープレックスオリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドと,未置換ホスホジエステル結
合またはKmiec IまたはKmiec IIに教示されるいずれかの非天然型結合に
より連結している,2’−ヒドロキシルまたは2’−置換ヌクレオチドを意味する。本明
細書において用いる場合,"デオキシリボ型のヌクレオチド"との用語は,2’−Hを有す
るヌクレオチドを意味し,これは,未置換ホスホジエステル結合またはKmiec Iま
たはKmiec IIに教示されるいずれかの非天然型結合により,遺伝子修復オリゴ核
酸塩基の他のヌクレオチドと連結されることができる。
ジエステル結合により連結されている混合デュープレックスオリゴヌクレオチド(MDO
N)である。別の態様においては,結合は,置換されたホスホジエステル,ホスホジエス
テル誘導体およびKmiec IIに教示されるような非リン系結合によるものである。
さらに別の態様においては,混合デュープレックスオリゴヌクレオチド中のそれぞれのR
NA型のヌクレオチドは2’−置換ヌクレオチドである。2’−置換リボヌクレオチドの
特に好ましい態様は,2’−フルオロ,2’−メトキシ,2’−プロピルオキシ,2’−
アリルオキシ,2’−ヒドロキシルエチルオキシ,2’−メトキシエチルオキシ,2’−
フルオロプロピルオキシおよび2’−トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチド
である。2’−置換リボヌクレオチドのより好ましい態様は,2’−フルオロ,2’−メ
トキシ,2’−メトキシエチルオキシ,および2’−アリルオキシ置換ヌクレオチドであ
る。別の態様においては,混合デュープレックスオリゴヌクレオチドは,未置換ホスホジ
エステル結合により連結されている。
ゴヌクレオチド(MDON)はより便利に合成することができるが,本発明の方法は,2
またはそれ以上の型のRNA型のヌクレオチドを有する混合デュープレックスオリゴヌク
レオチドを用いても実施することができる。RNAセグメントの機能は,2つのRNA型
のトリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオチドが導入されることにより引き起こされる
中断によっては影響を受けない。したがって,RNAセグメントとの用語は,"中断され
たRNAセグメント"等の用語を包含する。中断されていないRNAセグメントは,連続
的RNAセグメントと称される。別の態様においては,RNAセグメントは,RNase
耐性および未置換2’−OHヌクレオチドを交互に含むことができる。混合デュープレッ
クスオリゴヌクレオチドは,好ましくは100ヌクレオチド未満,より好ましくは85ヌ
クレオチド未満であり,50より多いヌクレオチドを有する。第1および第2の鎖はワト
ソンクリック塩基対形成する。1つの態様においては,混合デュープレックスオリゴヌク
レオチドの鎖は,リンカー,例えば,一本鎖ヘキサ,ペンタまたはテトラヌクレオチドに
より共有結合されており,このため第1の鎖および第2の鎖は,単一の3’末端および単
一の5’末端を有する単一のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントである。3’および5’
末端は,"ヘアピンキャップ"を付加することにより保護することができ,このことにより
3’および5’末端ヌクレオチドは隣接するヌクレオチドとワトソンクリック対を形成す
る。さらに,第2のヘアピンキャップを,3’および5’末端から離れた位置の第1の鎖
と第2の鎖との間の接合部に配置することができ,これにより第1の鎖と第2の鎖との間
のワトソンクリック対が安定化される。
み,すなわち,標的遺伝子と同じ配列を有する。相同領域は,RNAセグメントのヌクレ
オチドを含み,連結DNAセグメントの1またはそれ以上のDNA型のヌクレオチドを含
んでいてもよく,また,介在DNAセグメント中にはないDNA型のヌクレオチドを含ん
でいてもよい。相同性の2つの領域は,"非相同領域"と称される,標的遺伝子の配列とは
異なる配列を有する領域により分離されており,かつそれぞれ隣接している。非相同領域
は,1個,2個または3個のミスマッチしたヌクレオチドを含むことができる。ミスマッ
チしたヌクレオチドは,連続的であってもよく,あるいは標的遺伝子と相同な1または2
個のヌクレオチドにより分離されていてもよい。あるいは,非相同領域はまた,1,2,
3,または5またはそれ以下のヌクレオチドの挿入を含むことができる。あるいは,混合
デュープレックスオリゴヌクレオチドの配列は,混合デュープレックスオリゴヌクレオチ
ドからの1,2,3または5またはそれ以下のヌクレオチドの欠失によってのみ,標的遺
伝子の配列と異なっていてもよい。この場合,非相同領域の長さおよび位置は,混合デュ
ープレックスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドが非相同領域中にない場合であっても,
欠失の長さであるとみなされる。置換(単数または複数)が意図される場合,2つの領域
に相補的な標的遺伝子のフラグメント間の距離は,非相同領域の長さと同一である。非相
同領域が挿入を含む場合,このことにより相同領域は,混合デュープレックスオリゴヌク
レオチド中で,その相補的相同フラグメントが遺伝子中で離れているよりさらに遠くに離
れており,非相同領域が欠失をコードする場合にはその逆があてはまる。
すなわち,標的遺伝子のフラグメントと配列が同一である領域の一部である。これらのセ
グメントは,一緒になって,好ましくは,少なくとも13個のRNA型のヌクレオチドを
含み,好ましくは16から25個のRNA型のヌクレオチドを含み,またはさらにより好
ましくは18から22のRNA型のヌクレオチドを含み,または最も好ましくは20ヌク
レオチドを含む。1つの態様においては,相同性領域のRNAセグメントは,介在DNA
セグメントにより分離されかつ隣接しており,すなわち"接続"されている。1つの態様に
おいては,非相同領域の各ヌクレオチドは介在DNAセグメントのヌクレオチドである。
混合デュープレックスオリゴヌクレオチドの非相同領域を含む介在DNAセグメントは"
変異誘発セグメント"と称される。
オキシヌクレオチド変異誘発ベクター(SSOMV)であり,国際出願PCT/US00
/23457,米国特許6,271,360,6,479,292,および7,060,
500(その全体が参照として本明細書に組み込まれる)に開示されている。SSOMV
の配列は,米国特許5,756,325;5,871,984;5,760,012;5
,888,983;5,795,972;5,780,296;5,945,339;6
,004,804;および6,010,907および国際公開WO98/49350;W
O99/07865;WO99/58723;WO99/58702;およびWO99/
40789に記載される変異誘発ベクターと同じ原理に基づく。SSOMVの配列は,所
望の遺伝的変更を含む領域(変異誘発領域と称される)により隔てられている,標的配列
と相同な2つの領域を含む。変異誘発領域は,標的配列中で相同領域を隔てている配列と
同じ長さであるが配列が異なる配列を有することができる。そのような変異誘発領域は,
置換を引き起こす。あるいは,SSOMV中の相同領域は,互いに連続していてもよいが
,標的遺伝子中の同じ配列を有する領域は,1,2またはそれ以上のヌクレオチドにより
隔てられている。そのようなSSOMVは,SSOMVに存在しないヌクレオチドの標的
遺伝子からの欠失を引き起こす。最後に,標的遺伝子の相同領域と同一の配列は,標的遺
伝子中で隣接していてもよいが,SSOMVの配列中では1,2またはそれ以上のヌクレ
オチドにより隔てられている。そのようなSSOMVは,標的遺伝子の配列中に挿入を引
き起こす。
除き未修飾ホスホジエステル結合により連結されているデオキシリボヌクレオチドである
か,あるいは,2つの3’末端および/または5’末端ヌクレオチド間結合はホスホロチ
オエートまたはホスホルアミダイトであってもよい。本明細書において用いる場合,ヌク
レオチド間結合はSSOMVのヌクレオチドの間の連結であり,3’末端ヌクレオチドま
たは5’末端ヌクレオチドとブロッキング置換基との間の連結を含まない。特定の態様に
おいては,SSOMVの長さは21から55デオキシヌクレオチドであり,したがって相
同性領域の長さは合計して少なくとも20デオキシヌクレオチドであり,少なくとも2つ
の相同性領域はそれぞれ少なくとも8デオキシヌクレオチドの長さを有するべきである。
的であるように設計することができる。所望の変異が単一塩基の置換である場合,変異誘
発ヌクレオチドおよび標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。所望
の機能上の結果を達成することと矛盾しないかぎり,相補鎖中の変異誘発ヌクレオチドお
よび標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。特に好ましいものは,
トランスバージョン変異をコードする,すなわち,CまたはT変異誘発ヌクレオチドがそ
れぞれ相補鎖中のCまたはTヌクレオチドとミスマッチするSSOMVである。
結合した5’ブロッキング置換基を含むことができる。リンカーの化学は長さを除き重要
ではなく,長さは,好ましくは少なくとも6原子の長さであるべきであり,リンカーは柔
軟性を有するものであるべきである。種々の非毒性置換基,例えば,ビオチン,コレステ
ロールまたは他のステロイドまたは非インターカレート性のカチオン性蛍光染料を用いる
ことができる。SSOMVを製造するのに特に好ましい試薬は,Glen Resear
ch社,Sterling Va.(現在はGE Healthcare)からCy3(
商標)およびCy5(商標)として市販されている試薬であり,オリゴヌクレオチド中に
取り込まれると,それぞれ3,3,3’,3’−テトラメチルN,N’−イソプロピル置
換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン染料を生ずる,ブロックされ
たホスホルアミダイトである。Cy3が特に好ましい。インドカルボシアニンがN−オキ
シアルキル置換されている場合,これはオリゴデオキシヌクレオチド5’の末端に5’末
端リン酸を有するホスホジエステルとして便利に連結することができる。染料とオリゴデ
オキシヌクレオチドとの間の染料リンカーの化学は重要ではなく,合成の便宜により選択
される。市販のCy3ホスホルアミダイトを指示どおりに用いる場合,得られる5’修飾
は,ブロッキング置換基およびリンカーが一緒になって,N−ヒドロキシプロピル,N’
−ホスファチジルプロピル3,3,3’,3’−テトラメチルインドモノカルボシアニン
から構成される。
においてテトラ置換されている。理論に限定されるものではないが,これらの置換のため
,染料はインターカレート染料ではない。これらの位置における置換基の種類は重要では
ない。SSOMVはさらに3’ブロッキング置換基を有することができる。この場合にも
,3’ブロッキング置換基の化学は重要ではない。
または部位特異的),または他のDNA編集または組換え手法,例えば,限定されないが
,ジンクフィンガーヌクレアーゼによる部位特異的相同組換えを用いる遺伝子標的化によ
っても得ることができる。
植物細胞をトランスフォームするのに用いられる任意の既知の方法を用いて,遺伝子修
復オリゴ核酸塩基をデリバリーすることができる。例示的な方法について以下に説明する
。
セルロース細胞壁を有する植物細胞中に大きなフラグメントのDNAを発射貫入により
導入するための金属マイクロキャリア(微小球)の使用は,当業者によく知られている(
以下,バイオリスティックデリバリーと称する)。米国特許4,945,050;5,1
00,792および5,204,253は,マイクロキャリアおよびこれらを発射させる
ためのデバイスを選択する一般的手法を記載する。
7865に記載されている。例示的手法においては,氷冷したマイクロキャリア(60m
g/mL),混合デュープレックスオリゴヌクレオチド(60mg/mL),2.5Mの
CaCl2および0.1Mのスペルミジンをこの順番で加え,混合物を例えば10分間ボ
ルテックスすることにより穏やかに撹拌し,次に室温で10分間放置し,次いで,マイク
ロキャリアを5倍容量のエタノールで希釈し,遠心分離し,100%エタノールに再懸濁
する。良好な結果は,接着溶液中の濃度が,8−10μg/μLのマイクロキャリア,1
4−17μg/mLの混合デュープレックスオリゴヌクレオチド,1.1−1.4MのC
aCl2および18−22mMスペルミジンの場合に得ることができる。最適な結果は,
8μg/μLのマイクロキャリア,16.5μg/mLの混合デュープレックスオリゴヌ
クレオチド,1.3MのCaCl2および21mMのスペルミジンの場合に認められた。
するためにマイクロファイバーを用いて植物細胞中に導入することができる。Coffe
eらの米国特許5,302,523は,30x0.5μmおよび10x0.3μmのシリ
コンカーバイド繊維を用いて,トウモロコシ(Black Mexican Sweet
)の懸濁培養物のトランスフォーメーションを容易にすることを記載する。マイクロファ
イバーを用いる植物細胞のトランスフォーメーション用にDNAを導入するために用いる
ことができる任意の機械的手法を用いて,トランス変異用に遺伝子修復オリゴ核酸塩基を
デリバリーすることができる。
とおりである:滅菌したマイクロファイバー(2μg)を約10μgの混合デュープレッ
クスオリゴヌクレオチドを含む150μLの植物培養液に懸濁させる。懸濁した培養物を
沈殿させ,集めた細胞と滅菌ファイバー/ヌクレオチド懸濁液とを等量で10分間ボルテ
ックスし,プレートに播種する。選択培地は,特定の特性に適するように,ただちに適用
するか,または約120時間まで遅らせて適用する。
別の態様においては,遺伝子修復オリゴ核酸塩基は,植物の一部に由来するプロトプラ
ストのエレクトロポレーションにより植物細胞にデリバリーすることができる。プロトプ
ラストは,当業者によく知られる手法にしたがって,植物の一部,特に葉を酵素で処理す
ることにより形成される。例えば,Gallois et al.,1996,Meth
ods in Molecular Biology 55:89−107,Human
a Press,Totowa,N.J.;Kipp et al.,1999,Met
hods in Molecular Biology 133:213−221,Hu
mana Press,Totowa,N.Jを参照。プロトプラストは,エレクトロポ
レーション前に成長培地で培養する必要はない。エレクトロポレーションの条件の一例は
,総容量0.3mL中に3x105個のプロトプラストであり,遺伝子修復オリゴ核酸塩
基の濃度は0.6−4μg/mLである。
別の態様においては,当業者によく知られる手法にしたがって膜改変剤であるポリエチ
レングリコールの存在下で,核酸を植物プロトプラストに取り込ませる(例えば,Gha
rti−Chhetri et al.,1992;Datta et al.,199
2を参照)。
別の態様においては,遺伝子修復オリゴ核酸塩基は,マイクロキャピラリーを用いて植
物細胞またはプロトプラストに注入することによりデリバリーすることができる(例えば
,Miki et al.,1989;Schnorf et al.,1991を参照
)。
植物および植物細胞は,当該技術分野において一般に知られる方法を用いて,例えば,
植物または植物細胞を除草剤の存在下で生長させ,除草剤の非存在下における生長速度と
比較した生長の速度を測定することにより,除草剤に対する耐性または寛容性について試
験することができる。
常な生長とは,植物,植物器官,植物組織,または植物細胞の成長速度または細胞分裂の
速度が,野生型AHAS蛋白質を発現する対応する植物,植物器官,植物組織または植物
細胞における成長速度または細胞分裂の速度の少なくとも35%,少なくとも50%,少
なくとも60%,または少なくとも75%であるものとして定義される。
常な発生とは,植物,植物器官,植物組織または植物細胞において,野生型AHAS蛋白
質を発現する対応する植物,植物器官,植物組織または植物細胞において生ずるものと実
質的に同じ1またはそれ以上の発生事象が生ずることとして定義される。
茎,根,枝芽,花芽,分裂組織,胚,子葉,内胚乳,萼片,花弁,雌しべ,心皮,雄蘂,
葯,小胞子,花粉,花粉管,胚珠,子房および果実,またはこれらから取りだした切片,
スライスまたはディスクが挙げられる。植物組織としては,限定されないが,カルス組織
,基本組織,維管束組織,貯蔵組織,分裂組織,葉組織,芽組織,根組織,こぶ組織,植
物腫瘍組織,および生殖組織が挙げられる。植物細胞としては,限定されないが,細胞壁
を有する単離された細胞,その種々のサイズの凝集物およびプロトプラストが挙げられる
。
寛容性の同様の植物から得られるものと比較して右にシフトしている場合,関連する除草
剤に対して実質的に"寛容性"である。そのような用量応答曲線は,"用量"をX軸にプロッ
トし,"殺生パーセント","除草効果"等をy軸にプロットしたものである。寛容性の植物
は,所定の除草効果を得るために,非寛容性の同様の植物より多くの除草剤を必要とする
。除草剤に対して実質的に"耐性"である植物は,畑の雑草を防除するために除草剤を農薬
社会で典型的に用いられる濃度および速度で適用したときに,壊死,溶解,退緑またはそ
の他の病変がほとんどない。除草剤に対して耐性の植物は,除草剤に対して寛容性でもあ
る。
あると解釈してはならない。特に記載しないかぎり,すべてのパーセンテージは重量に基
づき,すべての溶媒混合比は容量に基づく。
本明細書において用いる場合,特に記載しないかぎり,遺伝子の番号付けは,シロイナ
ズナのアセト乳酸シンターゼ(ALS)またはアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS
)At3g48560(配列番号1)のアミノ酸配列に基づく。2005年10月より前
の実験ノートでは,S653位(シロイナズナアミノ酸配列に基づく)は,トウモロコシ
のアミノ酸配列ZmAHAS108およびZmAHAS109(Fang et al.
,1992)に基づいてS621として示されている。
ilseed Rape−BN−2と称する)および冬菜種(WinterOilsee
dRape;WOSR,セイヨウアブラナ−BN−11と称する)のBnAHAS Iお
よびIIIのいずれかまたは両方にイマゼタピル(Imi)耐性のアミノ酸置換S653
Nを作製することであった。
−2)のBnAHAS IおよびIIIの標的領域を増幅するために,オリゴの対,すな
わちBnALS1およびBnALS2を設計した(配列番号9および10)。BnAHA
S IおよびIIIはイントロンを含まないため,BnALS1およびBnALS2は,
S653部位を挟むゲノムDNAおよびcDNAの両方から284bpの標的領域を増幅
する。また,このプライマー対は,シロイナズナからのALS標的領域の増幅を可能とす
るよう設計した。プライマーを受領し,滅菌水に再懸濁した。
IおよびIIIのC末端標的領域をPCR増幅した。その後,追加のBN−2サンプル
からALS標的領域を増幅し,pGEM−T easyにクローニングした。それぞれ3
つのゲノムDNAおよびcDNAサンプルからの12個のコロニーを一晩培養してプラス
ミドを調製し,クローニングされた挿入物を配列決定して,標的配列を確認した。BnA
HAS Iの284bp標的領域についての代表例としてBN−2ALS2c−21,B
nAHAS IIIの代表例としてBN−2ALSYB10−2g−14について,グリ
セロールストックを調製した。
エラーを記録した。BN−2のBnAHAS IおよびIIIの配列に基づいて,単一の
GRON(遺伝子修復オリゴヌクレオチド)BnALS1621/C/41/5’Cy3
/3’idC(配列番号5)を設計して,位置653においてセリンからアスパラギンへ
のアミノ酸置換(AGT−>AAT)を作製した(表1を参照)。最初の合成物を再懸濁
し,その濃度を決定した。再懸濁したオリゴを-70℃で凍結保存した。このGRONの
非コーディング版はBnALS1621/NC/41/5’Cy3/3’idCと称され
る(配列番号6)。後日,BnALS1621/NCをすべてのGenbank配列と比
較し,16を越えるヌクレオチドを有しハイブリダイズする41個のうち唯一の配列はB
nAHAS IおよびIIIであり,オリゴはS653Nアミノ酸置換を導入するよう設
計された単一のミスマッチG−>Aを有していた。
N−11からのBnALS標的領域を,系統BN−11を表すことが知られている単一の
植物のゲノムDNAおよびcDNAから増幅した。BN−11BnALS配列を分析し,
PCRエラーを記録した。
域を市販の亜種であるクリアフィールドキャノーラ(BN−15)においても特性決定し
た。クリアフィールドのBnAHAS配列を分析し,PCRエラーを記録したところ,B
nAHAS I中にS653N(AGT−>AAT),およびBnAHAS III中に
W574L(TGG−>TTG)の予測されたアミノ酸の変更が認められた。最後に,系
統BN−2,BN−11およびBN−15からのBnAHAS IおよびIIIの全コー
ディング配列を,それぞれBnALS3/BnALSOR2(配列番号11および12)
およびBnALS3/BnALSOR3(配列番号11および13)を用いて増幅し,ク
ローニングし,配列決定して,比較目的のための参照配列として用いた。
ALS1621N−44〜53を,Edwardsら(1991)の方法を用いて抽出し
た。この材料からのゲノムDNAを,BnAHAS IまたはIIIのいずれかにおいて
,アレル特異的PCR(AS−PCR)ミックス(MM#23,オリゴBnALSOF1
,BnALSOR2,BnALSOR3およびBnALSIR1Aから構成される)(そ
れぞれ配列番号14,12,13,および15)を用いてスクリーニングして,S653
Nの変化を特異的に検出し,アレル特異的PCRミックス(MM#29,オリゴBnAL
SOF2,BnALSOR4およびBnALSIF1Tから構成される)(それぞれ配列
番号16,17,および18)を用いて,W574Lの変化を特異的に検出した。これら
の最初のAS−PCRの結果は決定的ではなかったため,サンプルBnALS1621N
−44〜53の大部分について,追加のサンプルであるBnALS1621N−54〜5
8を受領し,Edwardsら(1991)方法を用いて抽出し,さらなる精製工程を用
いてより純度の高いゲノムDNAを得た。
LSOR2およびBnALSOR3のプライマーの組み合わせを用いて増幅し,少量の増
幅産物を得た。これらの産物をpGEM−T easyにクローニングし,1系統あたり
12個の白色コロニーを一晩培養し,プラスミドを調製し(Qiagenプラスミドミニ
プレップキットを用いた),BigDye3.1シークエンシング化学を用いて配列決定
した。
にS653N変異(AGT−>AAT)を有し,この系統からの別の2つのクローンであ
るBnALS1621N−55−15および19はBnAHAS IIIについて野生型
であることがわかった。全配列分析を記録した。この1個の陽性がPCRエラーから生じ
たものではないことを確認するために,この系統からの追加の38コロニーをAS−PC
Rによりスクリーニングした。このAS−PCRスクリーニングで最も強い8個の陽性B
nALS1621N−55−1〜8の一晩培養物を調製し,プラスミドDNAを単離して
配列決定した。8個の陽性コロニーのうちの7個,すなわち,AS−PCRによるBnA
LS1621N−55−2〜8はBnAHAS III中のS653N変異についての配
列決定により陽性であり,残りのBnALS1621N−55−1は野生型BnAHAS
I配列であった。これらの結果を合わせると,系統BnALS1621N−55は,B
nAHAS III中のS653N変異についてヘテロ接合性であることが示された。
mi耐性カルスからの平行して得たカルスサンプルである。これらのサンプルからのゲノ
ムDNAをBnALSOF2,BnALSOR2およびBnALSOR3のプライマーの
組み合わせで増幅し,フラグメントをpGEM−T easyにクローニングし,トラン
スフォーメーションした。MM#23を用いて38個の白コロニーをS653N変異につ
いてスクリーニングしたところ,4個の陽性コロニーが同定された(BnALS1621
N−49−9〜12)。これらのコロニーを配列決定した。4つのうち3つのコロニー(
BnALS1621N−49−9,10および12)が,BnAHAS III中にS6
53N変異を有していた。
て,S653N多型を有する他の系統を同定した。これらの中に系統BnALS−97が
あった。BnALS−97は再生して植物となり,種子を形成させた。この系統はプロト
タイプ(植物として)であるため,BnAHAS IおよびIIIの両方の全コーディン
グ配列をクローニングし,配列決定した。この系統においては,BN−2野生型配列と比
較して唯一の多型はAGT−>AATのコドン変化であり,これはBnAHAS III
中のS653Nアミノ酸置換を生ずる。
nALSOR2およびBnALSOF2/BnALSOR3アンプリコンの予備的配列分
析により,BnALS1621N−57−43および46の両方のクローンがBnAHA
S I中にW574L変異(TGG−>TTG)を有していることが示された。全配列分
析を記録し,クローン38および41はW574であったため,系統57はヘテロ接合性
であることが示された。したがって,BnALSOF2,BnALSOR2およびBnA
LSOR3のプライマーの組み合わせを用いて,BnALS1621N−57およびBn
ALS1621N−45(BnALS1621N−57と同じ最初のImi耐性カルスか
ら平行して得たカルスサンプル)からこのフラグメントを増幅し,pGEM−T eas
y中にライゲーションし,トランスフォーメーションし,プレートに播種して青/白選択
を行った。
N−45のプレートからの19個の白色コロニーをW574Lについてスクリーニングし
,それぞれ4つの陽性コロニー(BnALS1621N−45−1,2,9および18,
およびBnALS1621N−57−1,7,13および16)について,プラスミドを
調製し,配列決定した。配列分析により,8コロニーすべてがBnAHAS IにW57
4L変異を有することが示された。MM#29についてアニーリング温度を最適化して,
この新たな条件でさらに19コロニーをスクリーニングした。3つの陽性コロニー(Bn
ALS1621N−57−17,18および19)について,プラスミドを調製し,配列
決定した。
dwardsら(1991)の方法を用いてゲノムDNAを抽出した。各サンプルから,
BnALSOF2,BnALSOR2およびBnALSOR3プライマーの組み合わせを
用いて,BnAHAS IおよびIIIのフラグメントを増幅し,これをpGEM−T
easy中にクローニングした。
12コロニーをスクリーニングしたところ,系統BnALS−81から2つ(BnALS
−81−203および208),BnALS−76から4つ(BnALS−76−153
,154,156および162)の,BnAHAS III中にS653N変異を含む陽
性コロニーが得られた。全配列分析を記録した。PCR増幅した標的領域または単一のク
ローニングされた挿入物を有する細菌コロニーの両方を,MM#23を用いてAS−PC
Rスクリーニングしたところ,系統BnALS−159(モレキュラー・バイオロジー(
molecular biology)のサンプル102;コロニー655)が,BnA
HAS I中にS653N変異を有するものとして同定された。これはこの遺伝子中のサ
イバス社の最初のS653N事象である。
て,野生型(コロニー408)および変異体(コロニー403,405および406)を
同定したところ,この系統はBnAHAS I中のS653T変異(AGT−>ACT)
についてヘテロ接合性であった。系統BnALS−83は,植物として,BnAHAS
I中のS653T変異についてヘテロ接合性であることが確認された。新たなImi耐性
BN−2キャノーラ系統BnALS−76およびBnALS−123について,MM#2
3(S653N)およびMM#29(W574L)を用いてさらなるスクリーニングを行
った。これらのサンプルでは上述した予測された変異が見いだされなかったため,12個
のBnALSOF2/OR2/3をクローニングし配列決定した。BnALS−123に
ついてのBnAHAS IIIの7個すべてのクローン(コロニー5,17−19,21
,22,26および28)はS653T変異について陽性であった。しかし,R1植物か
らの種子のジェノタイプはヘテロ接合性であった。
ーニングし,それぞれBnALS3/BnALS8(それぞれ配列番号11および19)
およびBnALS3/BnALS9(それぞれ配列番号11および20)のオリゴの組み
合わせを用いて,BnALS−58,68および69について配列決定した。BnALS
−96の新たな組織サンプルを取得し,BnAHAS IおよびIIIのN末端PCRフ
ラグメントをクローニングし,配列決定したところ,系統BnALS−96はBnAHA
S I中にA205V変異(GCC−>GTC)を有することが示された。カルス系統B
nALS−68に由来する植物材料からの全長コーディング配列BnALS3/OR2ア
ンプリコンの4つのクローンはすべて,BnAHAS III中にA205Vの変化(G
CG−>GTG)を有しており,これはBnALS−69における変化と同一であった。
にまとめる。系統BnALS−159は,カルス系統として死滅し,新芽を再生しなかっ
た。表3は,本明細書に開示される実験において用いた例示的オリゴを示す。
ALS−97はBnAHAS III中の参照S653Nである。系統BnALS−57
はBnAHAS I中の参照W574Lである。BnALS−68および69は両方とも
BnAHAS III中のA205Vの参照系統として進歩したものである。系統BnA
LS−83は,BnAHAS I中のS653Tについて,カルスとしてヘテロ接合性で
あり,植物としてもヘテロ接合性である最初の系統である。
細胞培養の説明
種子から,および小胞子から誘導された胚からの両方の新芽をインビトロで無菌条件下
で増殖させた。2−4週間ごとに切片を継代し,ペトリ皿(25mmx90mm)で40
−45mLの容量のRS培地(Dovzhenko,2001)で培養した。皿をミクロ
ポアテープ(Microporetape,3M Company)で密封した。若葉を
プロトプラスト単離に用いた。
インビトロで発芽した2−3週齢の葉組織約600mgを,5mLの培地B(Pell
etier et al.,1983,pHを5.8に調節)を入れたペトリ皿中で,外
科用メスを用いて小さいストリップに切断した。約1時間後,培地Bを,0.5%(w/
v)のセルラーゼ(Cellulase)YCおよび0.75%(w/v)のマセロザイ
ム(Macerozyme)R10(いずれもKarlan Research Pro
ducts,Cottonwood,Arizonaより),1g/Lのウシ血清アルブ
ミン,および1g/Lの2−モルホリノエタンスルホン酸を溶解した培地Bからなる酵素
溶液で置き換えた。酵素溶液を葉組織中に減圧浸潤させ,酵素溶液中の葉切片を入れた皿
を暗所で25℃でインキュベーションした。プロトプラスト精製は,イオジキサノール密
度勾配(Optiprep Application Sheet C18;Purif
ication of Intact Plant Protoplasts;Axis
−Shield USA,10 Commerce Way,Norton,MA027
76を適用)を用いて行った。密度勾配遠心分離の後,精製されたプロトプラストを含む
バンドを約5mLのW5培地とともに取り出した(Frigerio et al.,1
998)。プロトプラストの収率は血球計で測定し,プロトプラストは4℃で2時間保存
した。
プロトプラスト懸濁液を等量のW5培地と混合し,50mLの遠心管に移し,臨床用遠
心分離器で最低の設定(約50xg)で5分間遠心分離した。上清を除去し,TM培地(
Klaus,2001)で置き換えて,プロトプラスト密度を5x106/mLに調節し
た。それぞれ5x106個のプロトプラストを含む100μLのアリコートを12mLの
丸底遠心管に入れた。次に,AHAS遺伝子中の一方または両方の変異を標的とするGR
ONを,PEG処理を用いてプロトプラストに導入した。GRONをプロトプラストに導
入するためには,12.5μgのGRONを25μLの純粋に溶解し,125μLのポリ
エチレングリコール溶液(5gPEG,MW1500,638mgマンニトール,207
mgCaNO3x4H2Oおよび8.75mL純水;pHを約9.0に調節)を加えた。
氷上で30分間インキュベーションした後,プロトプラスト−PEG懸濁液をW5培地で
洗浄し,培地Bに再懸濁した。懸濁液を冷蔵庫で約4℃で一晩保持した。
GRONを導入した1日後,プロトプラストをアルギン酸カルシウムに包埋した。プロ
トプラストをゲル基質(例えば,アガロース,アルギン酸)中に包埋すると,プロトプラ
ストの生存が高まり,プロトプラストに由来する細胞の分裂頻度が増加することが示され
ている。適用した方法は,Dovzhenko(2001)に記載されている方法に基づ
くものである。
イマゼタピル耐性カルスの選択は,Pelletier et al.(1983)に
したがって,培地中のアルギン酸の一連の継代培養により行った。0.5μMイマゼタピ
ルの濃度でPEG/GRON処理した1週間後に選択を開始した。除草剤は即時効果は有
していなかった。イマゼタピルなしで培養初期段階に形成されたすべてのマイクロコロニ
ーは,最初は生長し続けたが,除草剤を加えていない対照より遅かった。選択開始の1か
ら2週間後,コロニーの生長は鈍化するかまたは停止した。
ウムを含む培地で30−45分間処理することによりアルギン酸から放出させた。放出さ
れたコロニーを液体培地から固体培地に移したとき,大部分のコロニーは死滅しているか
,または,死亡した細胞の外層に覆われた緑色がかった中心から構成された。固化した選
択培地E上では,生きた細胞をなお含んでいたマイクロカルスの大部分は生長を停止し,
褐色がかった色に変化した。時々,個々のカルスの限定された成長が続いたが,すべての
非耐性カルスは最終的に褐色に変化し,死亡した。固化した選択培地に移した2〜3週間
後(場合によってはより早期に),褐色ががった細胞およびマイクロカルスの背景の中で
,活発に生長するカルスが出現した。
スからの植物の再生。
固化選択培地上に発生し,そのDNAを分析すると変異の存在を示すImi寛容性カル
スを,除草剤を含まない培地E(Pelletier et al.,1983)に移し
て,発生を加速させた。個々のカルス系統は,その生長速度および形態学は様々であった
。一般に,新芽生成に向けた発生は以下の段階を経た:
未分化,緑色カルス−>暗緑色の領域をもつカルス−>発根−>始原細胞発芽−>過水状
態の(ガラス化した)葉をもつ発育不良の発芽
ン酢酸(NAA)で改変した培地Eでの連続的な継代および増殖により,最終的に多くの
カルス系統が発芽した。
001)に移した。この培地上では,時間がたつと,形態学的に正常な(すなわち過水状
態ではない)新芽および葉組織が発生した。インビトロで植物体が根を生成した後,標準
的なプロトコルを用いて温室条件に適合させた。
5−6葉期のセイヨウアブラナ植物に種々のAHAS阻害除草剤を散布した。散布した
B.napus植物には,親系統BN02(または必要な場合にはBN11),BN15
(クリアフィールド(Clearfield),市販の2遺伝子チェック)および下記に
示す変異体が含まれる。除草剤は,0.25%のAU391界面活性剤の存在下で下記の
割合で散布した。
イマザモックス (Beyond(登録商標)) 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 32 および 48 オンスの
活性成分/エーカー(ai/A)
チフェンスルフロン 0.028, 0.056, 0.112, 0.168 ポンドの ai/A
トリベヌロン 0.015, 0.03, 0.06, 0.12, 0.18 ポンドのai/A
ニコスルフロン 0.06, 0.120, 0.24, 0.36 ポンドのai/A
リムスルフロン 0.015, 0.03, 0.06, 0.12, 0.18 ポンドのai/A
2:1 重量:重量チフェンスルフロン/トリベヌロン 0.056, 0.112, 0.224, 0.336 ポンドの
ai/A
2.22:1 チフェンスルフロン/ニコスルフロン 0.058, 0.116, 0.232 ポンドのai/A
プリミスルフロン 0.035, 0.070, 0.140 ポンドのai/A
フルメツラム0.040, 0.080, 0.16 ポンドのai/A
クロランスラム0.039, 0.078, 0.156 ポンドのai/A
,すべてのAHAS阻害除草剤の試験は,散布の14日後に,枯死を1,未散布対照の損
傷なしを10とする1−10の損傷評点を用いて評価した。個々の植物系統は,各散布率
で,その特定の速度における対照の性能と比較して評点した。散布試験の結果を図4に示
す。
チフェンスルフロン: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18)
トリベヌロン: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18), 63 (9)
ニコスルフロン: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18)
THI / TRI: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18)
リムスルフロン: BN2 (6), BN15 (6), BN15xBnALS-57 (18), 63 (9)
THI / Nic: BN2 (18), 63 (9), BN15xBnALS-57 (36), BN15 (18)
プリミスルフロン: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18)
フルメツラム: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18)
クロランスラム: BN2 (9), 63 (9), BN15 (9), BN15xBnALS-57 (18)
10回目の評点: 8, 16, 32, および 48 オンス/エーカー(oz/A)の BnALS-83xBnALS-123
, BnALS-96xBnALS-123, BnALS-97xBnALS-57, BN15xBnALS-57, BN2, BN15, BnALS-97xBN15
17回目の評点: 4 および 12 oz/A の BnALS-97xBnALS-57, BN15xBnALS-97, BN2
28回目の評点: すべての単一因子変異について2, 4, 6, 8 oz/A
イマザモックス:
2 oz/A: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (6), BnA
LS-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS-57 (12)
4 oz/A: BN2 (18), BnALS-123 (9), BnALS-96 (9), BnALS-97 (18), BnALS-83 (9), BnAL
S-76 (18), BnALS-58 (9), BnALS-57 (12), BnALS-97xBN15 (15), BnALS-97xBnALS-57 (1
4)
6 oz/A: BN2 (9), BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-97 (9), BnALS-83 (12), BnAL
S-76 (9), BnALS-57 (12)
8 oz/A: BnALS-123 (9), BnALS-96 (12), BnALS-83 (12), BnALS-83xBnALS-123 (18), Bn
ALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (18), BN15 (18), BN15xBnALS-57 (15), BnALS-97xBnALS-5
7 (18), BN15xBnALS-97 (18)
12 oz/A: BnALS-97xBN15 (15), BnALS-97xBnALS-57 (14), BN2 (12)
16 oz/A: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (15), BN15 (18),
BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)
32 oz/A: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (13), BN15 (18),
BN15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)
48 oz/A: BnALS-83xBnALS-123 (18), BnALS-96xBnALS-123 (18), BN2 (6), BN15 (18), B
N15xBnALS-57 (18), BnALS-97xBnALS-57 (18), BN15xBnALS-97 (18)
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は,本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
任意の要素および限定がない場合にも適切に実施することができる。すなわち,例えば,
"含む(comprising)","含む(including)","含む(conta
ining)"等の用語は,拡張的に限定なしに読むべきである。さらに,本明細書にお
いて用いられる用語および表現は,説明の用語として用いられており,限定ではない。そ
のような用語および表現の使用においては,示されるかまたは説明される特徴またはその
一部の均等物を排除することを意図するものではない。特許請求の範囲に記載される本発
明の範囲内で種々の改変が可能であることが理解される。
示される本発明の改変,改良および変更をなしうること,およびそのような改変,改良お
よび変更は本発明の範囲内であると考えられることが理解される。本明細書に提供される
物質,方法,および例は,好ましい態様の代表的なものであり,例示であって,本発明の
範囲を限定することを意図するものではない。
のそれぞれも本願発明の一部を形成する。これには,属から任意の主題を除く,排除また
は負の限定を含む本発明の一般的説明が含まれ,除かれる物が本明細書に特定的記載され
ているか否かは問わない。
は,当業者は,本発明はマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはサブグルー
プについても記載されていることを理解するであろう。
れが個々に参照として本明細書に組み込まれる場合と同じ程度に,その全体が明示的に参
照として本明細書に組み込まれる。不一致がある場合には,定義を含む本明細書の記載が
優先する。
Claims (11)
- 配列番号1の574位に対応する位置がトリプトファンであるアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)I遺伝子を有する親系統に由来する非トランスジェニック除草剤耐性植物であって、
アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)I遺伝子に人工的に導入された標的変異をゲノムに含み、人工的に導入された標的変異を含むAHASI蛋白質を発現し、
人工的に導入された標的変異が、
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからシステインへの置換;
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換;
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換;および
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからセリンへの置換;
からなる群より選択される、非トランスジェニック除草剤耐性植物。 - 人工的に導入された標的変異が、配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換である、請求項1記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
- AHAS阻害性除草剤による阻害に対して耐性である、請求項1記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
- 前記AHAS阻害性除草剤は、イミダゾリノン、スルホニルウレア、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルチオベンゾエート、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン、およびこれらの混合物からなる群より選択される除草剤である、請求項3記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
- 前記AHAS阻害性除草剤はイミダゾリノン除草剤である、請求項4に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
- 前記AHAS阻害性除草剤はスルホニルウレア除草剤である、請求項4に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
- 前記AHASI蛋白質は、配列番号21〜62のアミノ酸配列の1またはそれ以上と90%またはそれ以上の同一性を有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
- キャノーラ、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、綿花、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガム、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、洋ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、大豆種、サトウキビ、エンドウ、ソラマメ、ポプラ、ブドウ、柑橘類、アルファルファ、ライ麦、オートムギ、芝草および飼料草、亜麻、菜種、キュウリ、アサガオ、ニガウリ、ピーマン、ナス、マリーゴールド、ハス、キャベツ、デイジー、カーネーション、チューリップ、アヤメ、およびユリからなる群の植物の種から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
- アブラナ属である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物の種子であって、
人工的に導入された標的変異を含むアセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)I蛋白質をコードする、人工的に標的変異が導入されたAHASI遺伝子をゲノムに含み、
人工的に導入された標的変異が、
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからシステインへの置換;
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換;
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換;および
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからセリンへの置換;
からなる群より選択される、種子。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載の非トランスジェニック除草剤耐性植物の細胞であって、
アセトヒドロキシ酸シンターゼ(AHAS)I遺伝子に人工的に導入された標的変異をゲノムに含み、人工的に導入された標的変異を含むAHASI蛋白質を発現し、
人工的に導入された標的変異が、
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからシステインへの置換;
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからロイシンへの置換;
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからメチオニンへの置換;および
配列番号1の574位に対応する位置におけるトリプトファンからセリンへの置換;
からなる群より選択される、細胞。
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