CN104789682B

CN104789682B - 检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的引物与应用

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Publication number: CN104789682B
Application number: CN201510213846.8A
Authority: CN
Inventors: 胡茂龙; 浦惠明; 龙卫华; 高建芹; 张洁夫; 陈松; 陈锋; 付三雄; 周晓婴; 张维; 彭琦; 王晓东; 戚存扣
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN104789682A

Abstract

本发明公开了检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的引物与应用，属于分子育种领域。引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2用于检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的方法为:以甘蓝型油菜总DNA作为模板，加入引物进行PCR扩增；PCR产物进行限制性核酸内切酶BsrDI消化；酶切产物用来区分含抗性基因BnALS3R的纯合型油菜、含抗性基因BnALS3R的杂合型油菜和不含抗性基因BnALS3R的纯合型油菜。本发明能快速、准确地检测油菜植株是否含有抗性基因BnALS3R，更精确检测所含除草剂基因是纯合型还是杂合型，从而快速有效地实现培育抗除草剂油菜新品种的育种目标。

Description

检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的引物与应用

技术领域

本发明涉及分子育种领域，确切地说，涉及一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的引物与应用。

背景技术

近年来，随着我国工业化和城市化进程加快，农村劳动力大量向城镇转移，轻简化、机械化已成为油菜产业发展的主要方向。有效治理田间杂草是实现油菜轻简化、机械化的重要技术环节。化学除草是当前农田控制杂草的主要手段。然而，当前油菜生产上应用的除草剂仅能有效防治单子叶杂草，对大多数双子叶类的阔叶杂草缺少安全、高效的除草剂进行防除，油菜生产化学除草面积非常有限。而磺酰脲类除草剂能高效防除双子叶类阔叶杂草，具有低用量、对环境友好等特点，在我国水稻、小麦、玉米等单子叶作物中广泛应用。遗憾的是，油菜为双子叶作物，对磺酰脲类除草剂表现敏感，生产上还未开发出对油菜安全、高效的磺酰脲类除草剂，创制对磺酰脲类除草剂具有选择抗性的油菜新种质，拓宽现有磺酰脲类除草剂的应用范围，是解决油菜田杂草防除的一个经济有效途径。

磺酰脲类除草剂是一类高效、低毒的除草剂，属于乙酰乳酸合酶(acetolactatesynthase，ALS；EC4.1.3.18)抑制剂类除草剂，其作用靶标为植物体内的ALS。ALS也叫乙酰羟基酸合酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS；EC2.2.1.6)，是植物和微生物3种支链氨基酸生物合成过程中的关键酶(McCourt JA,Duggleby RG.AminoAcids,2006,31:173–210)。该酶负责催化两个平行反应，催化两分子丙酮酸缩合形成2-乙酰乳酸放出CO₂，最终生成缬氨酸和亮氨酸，催化一分子丙酮酸和一分子2-氧丁酸缩合形成乙酰羟基丁酸，最终生成异亮氨酸(Ronald G D,et al.,PlantPhysiolBioch,2008,46:309-324)。如果此酶的活力受到抑制或者丧失，会导致植物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成受阻，影响蛋白质合成，最终导致植物生长受阻、直至死亡。磺酰脲类除草剂作用机理是除草剂通过与ALS形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制ALS活性，导致支链氨基酸合成受阻，使植物组织失绿、黄化，最后逐渐死亡(McCourt JA,et al.,PNAS,2006,103:569-573)。

随着研究的不断深入，人们发现某些特定氨基酸残基突变能引起ALS对磺酰脲类除草剂产生抗性，其中常见易发生变异的氨基酸残基是Pro197、Ala205和Trp574(参照拟南芥ALS位置；Walter K L,et al.,Pest ManagSci,2014,70(12):1831-1839；Ghio C,etal.,TheorAppl Genet,2013,126(12):2957-2968；胡茂龙等，中国农业科学，2012,45(20):4326-4334)。例如，在中国甜菜的sur和莴苣的1个突变体中197位脯氨酸被组氨酸或丝氨酸所取代；向日葵的Two突变体中205位丙氨酸被缬氨酸所取代；玉米的XA17中574位色氨酸被亮氨酸所取代(Tan S,et al.,PestManagSci,2005,61:246-257)。通过进一步研究发现，当拟南芥ALS与磺酰脲类除草剂相互作用时，除草剂结合在拟南芥ALS催化位点的活性空腔里，当活性空腔内的氨基酸残基发生突变时，会引起除草剂与ALS结合方式的变化，导致植物产生对磺酰脲类除草剂的抗性(Lee H,et al.,PNAS,2011,108(21):8909-8913)。

2013年，利用EMS诱变和定向选育技术，我们获得了甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变体M342(公知公用，浦惠明等，专利申请号201310054645.9)。在苯磺隆除草剂杂草防治的推荐使用浓度下，抗性突变体M342喷药后无任何药害症状，仍能正常生长。进一步通过分子生物学技术克隆获得了抗性突变体M342抗性基因BnALS3R(胡茂龙等，一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用；中国专利ZL201310111739.5)。抗性基因的发现为我国抗磺酰脲类除草剂油菜品种的培育提供了自主知识产权的种质资源。利用该抗性种质资源，常规育种方法是将含BnALS3R基因的M342与生产上推广的主栽品种进行杂交和回交，然后在每个分离后代中喷施除草剂进行鉴定，最终选择含抗磺酰脲基因BnALS3R的抗性单株。在每个分离后代除草剂鉴定过程中，如果除草剂剂量使用不当或喷施不均匀极易导致误选。另外，有时在抗除草剂基因研究过程中需要保存不抗的材料，用作比较研究。为此，若能根据该基因BnALS3R的突变位点特性，开发出检测抗性基因的功能性标记，从而进行标记辅助选择，区分出育种材料中抗性基因的不同基因型，则可指导田间选育，加快育种进程，为标记辅助选择进行油菜抗除草剂新品种选育提供选择方法和技术支撑。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的分子标记引物。

本发明的另一个目的在于提供所述检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R分子标记引物的应用方法。

技术方案

本发明的目的是通过如下技术方案实现：

一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的分子标记引物，其核甘酸序列为：

SEQ ID NO.1：5'-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3'

SEQ ID NO.2：5'-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3'

所述的分子标记引物用于检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待测甘蓝型油菜总DNA为模板，用权利要求1所述引物的核甘酸序列SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2进行PCR扩增；将PCR扩增的产物用限制性核酸内切酶BsrDI消化；将消化的酶切产物经凝胶电泳检测:

如果电泳检测表明的酶切产物含有分子量为766bp一种条带时，则为含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的纯合型抗性油菜；

如果电泳检测表明的酶切产物含有分子量为766bp、570bp和196bp三种条带时，则为含抗性基因BnALS3R杂合型抗性油菜；

如果电泳检测表明的酶切产物含有分子量为570bp、196bp两种条带时，则为不含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的纯合型敏感性油菜。

所述的分子标记引物在辅助选择选育抗除草剂甘蓝型油菜品种中的应用。

所述的应用，其特征在于，用所述引物的核甘酸序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对以恢复系为母本、以含甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的品种为父本进行杂交的F1单株自交获得的F2群体中的植株进行抗性基因PCR扩增检测，将含有分子量为766bp条带的可育单株套袋自交，自交后代即为获得的含有抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R纯合型的含甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的F3种子；在含有分子量为766bp条带的可育单株套袋自交后代中选择可育的单株套袋自交，自交后代即育出抗磺酰脲类除草剂的MI CMS恢复系。

所述的应用，还可以以抗磺酰脲类除草剂油菜为父本，普通油菜为母本杂交获得F1，然后以普通油菜为轮回亲本，在每次回交世代前，采用本发明的分子标记BsrDI-ALS3R进行基因型检测，将含分子量为766bp、570bp和196bp三种条带的抗性基因杂合型单株与轮回亲本回交，通过多次回交，在最后一代自交的群体中用权利要求1所述引物的核甘酸序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R进行分子标记辅助基因型检测，选择含分子量为766bp条带的抗性基因纯合型单株即培育出抗除草剂油菜。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有下列优点和效果：

1、本发明找到一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的CAPS分子标记方法，克服了甘蓝型油菜基因组复杂、在四倍体油菜中应用分子标记难度很大的问题。

本发明开展了大量的检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的AS-PCR分子标记、ARMS-PCR分子标记、CAPS分子标记的开发研究，摸索试验中发现敏感性油菜的乙酰乳酸合酶III基因正义链起始密码子第一个核甘酸下游的+1662至+1667位点，该位点的6个核甘酸序列为“GCAATG”，能够被限制性核酸内切酶BsrDI酶识别并剪切，而抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R在+1662至+1667的对应序列为“GCAATT”，不能被限制性核酸内切酶BsrD I酶识别并剪切，从而克服了甘蓝型油菜为白菜型油菜(A基因组)和甘蓝(C基因组)天然杂交自然加倍而来的异源四倍体(2n＝38)，基因组相对复杂，二倍体研发的分子标记在四倍体油菜的应用难度很大的问题，找到一种检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的CAPS分子标记方法，

2、本发明提供的分子标记检测方法操作简便、结果准确可靠、容易判断。

本发明的分子标记位于敏感性油菜的乙酰乳酸合酶III基因正义链起始密码子第一个核甘酸下游的+1662至+1667位点，该位点的6个核甘酸序列为“GCAATG”，能够被限制性核酸内切酶BsrDI酶识别并剪切，而抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R在+1662至+1667的对应序列为“GCAATT”，不能被限制性核酸内切酶BsrD I酶识别并剪切。由此，可以开发一个能够检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的CAPS分子标记BsrDI-ALS3R。

该分子标记是一个共显性标记，操作者仅需要通过简单的分子生物学实验手段(PCR扩增和酶切反应)就能对不同抗性基因型进行鉴定，快速、准确的区分出抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的纯合型、杂合型和不抗除草剂的敏感型油菜植株。

3、本发明提供的分子标记检测方法能有效用于抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R引起的油菜对磺酰脲类除草剂抗性的标记辅助选择育种。

常规育种方法是利用含BnALS3R基因的抗性油菜M342与生产上推广的主栽品种进行杂交和回交，然后在每个分离后代中喷施除草剂进行鉴定，最终选择含抗磺酰脲类除草剂BnALS3R的抗性单株。在每个分离后代除草剂鉴定过程中，如果除草剂剂量使用不当或喷施不均匀极易可能导致误选或所需要的材料死亡。另外，有时在抗除草剂基因研究过程中需要保存不抗的材料，用作比较研究。因此，利用与BnALS3R基因直接相关的PCR分子标记对植株DNA进行检测，可以在油菜任何时期鉴定出抗性基因纯合基因型单株以及优良性状的不抗单株，淘汰其它单株，这样不仅可以节约田间育种成本，而且可以大大提高抗除草剂油菜品种的选择进程。

4、本发明首次为我国抗磺酰脲类除草剂油菜选育提供了PCR分子标记，并成功获得应用。

本发明首次为我国抗磺酰脲类除草剂油菜选育提供了PCR分子标记，该分子标记不是与抗磺酰脲类除草剂BnALS3R连锁的分子标记，而是根据基因的核苷酸突变特性设计的功能性基因标记，能直接反映植株的抗性，不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定。

附图说明

图1—实施例1中M342和5个敏感性油菜及它们各自杂交的F1代植株抗性基因分子标记鉴定图

其中泳道1-5：抗磺酰脲类除草剂油菜M342的5个单株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp的条带；泳道6-10：分别为5个敏感性油菜N131、N221、N340、N341和宁油16号的PCR扩增后的酶切产物，含分子量为570bp、196bp的条带；泳道11-15：M342分别与5个敏感性油菜N131、N221、N340、N341和宁油16号杂交的F1植株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp、570bp、196bp的条带；M：DNA分子量标准，片段从小到大依次为250bp、500bp、750bp、1000bp。

图2—实施例1中引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2扩增的油菜乙酰乳酸合酶III基因的PCR产物序列比对图

其中Z11524为Genbank登录的油菜乙酰乳酸合酶I基因的部分核酸序列(Genbank登录号：Z11524)；Z11526为Genbank登录的油菜乙酰乳酸合酶IIII基因的部分核酸序列(Genbank登录号：Z11526)；N131为野生型N131的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；N221为敏感性油菜N221的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；N340为敏感性油菜N340的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；N341为敏感性油菜N341的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；Ningyou20为敏感性油菜宁油20号的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；M342×N131为抗性油菜M342与野生型N131杂交F1的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；M342×N221为抗性油菜M342与敏感性油菜N221杂交F1的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；M342×N340为抗性油菜M342与敏感性油菜N340杂交F1的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；M342×N341为抗性油菜M342与敏感性油菜N341杂交F1的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；M342×Ningyou20为抗性油菜M342与敏感性油菜Ningyou20杂交F1的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列；M342为抗性油菜M342的乙酰乳酸合酶III基因核酸部分序列。“*”表示野生型乙酰乳酸合酶III基因与抗性突变基因BnALS3R的单核苷酸差异(G/T)，N表示杂交F1的乙酰乳酸合酶III基因的G/T杂合型。

图3—实施例2中分子标记BsrDI-ALS3R对F2(M342×N221)群体中抗性基因BnALS3R的基因型检测图

其中泳道1：抗磺酰脲类除草剂油菜M342的PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp的条带；泳道2：敏感性油菜N221的PCR扩增后的酶切产物，含分子量为570bp、196bp的条带；泳道3：M342与敏感性油菜N221杂交的F1植株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp、570bp、196bp的条带；泳道4-8：F2群体中含有抗性基因BnALS3R的纯合型单株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp的条带；泳道9-18：F2群体中含有抗性基因BnALS3R的杂合型单株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp、570bp、196bp的条带；泳道9-18：F2群体中不含有抗性基因BnALS3R的纯合型单株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为570bp、196bp的条带；M：DNA分子量标准，片段从小到大依次为250bp、500bp、750bp、1000bp。

图4—实施例2中分子标记BsrDI-ALS3R对BC1[(M342×N221)×M342]群体中抗性基因BnALS3R的基因型检测图

其中泳道1：抗磺酰脲类除草剂油菜M342的PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp的条带；泳道2：敏感性油菜N221的PCR扩增后的酶切产物，含分子量为570bp、196bp的条带；泳道3：M342与敏感性油菜N221杂交的F1植株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp、570bp、196bp的条带；泳道4-13：BC1群体中含有抗性基因BnALS3R的纯合型单株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp的条带；泳道14-23：BC1群体中含有抗性基因BnALS3R的杂合型单株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp、570bp、196bp的条带；M：DNA分子量标准，片段从小到大依次为250bp、500bp、750bp、1000bp。

图5—实施例2中分子标记BsrDI-ALS3R对BC2[(M342×N221)×N221]群体中抗性基因BnALS3R的基因型检测图

其中泳道1：抗磺酰脲类除草剂油菜M342的PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp的条带；泳道2：敏感性油菜N221的PCR扩增后的酶切产物，含分子量为570bp、196bp的条带；泳道3：M342与敏感性油菜N221杂交的F1植株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp、570bp、196bp的条带；泳道4-13：BC2群体中含有抗性基因BnALS3R的杂合型单株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为766bp、570bp、196bp的条带；泳道14-23：BC2群体中不含有抗性基因BnALS3R的纯合型单株PCR扩增后的酶切产物，含分子量为570bp、196bp的条带；M：DNA分子量标准，片段从小到大依次为250bp、500bp、750bp、1000bp。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例中的所有实验方法如无特别说明，均为常规方法，具体实施步骤如下：

实施例1 检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R分子标记的开发过程

(1)检测油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的AS-PCR分子标记的开发

甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R是从EMS诱变的突变体M342(见浦惠明等，专利申请号201310054645.9)中克隆获得。与野生型N131的乙酰乳酸合酶III基因相比，突变体BnALS3基因发生1处单碱基突变，即起始密码子第一个核苷酸下游的+1667处鸟嘌呤核苷酸(G)突变成了胸腺嘧啶核苷酸(T)(胡茂龙等，ZL201310111739.5，一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用)，可以基于该位点的单碱基变异开发相关分子标记检测抗性基因BnALS3R。

首先，我们根据前期开发检测抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R的经验(胡茂龙等，ZL201210291068.0，一种检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因的分子标记方法)，拟根据突变体BnALS3基因发生的SNP差异，开发抗性基因位点的等位基因特异PCR标记(allele-specific PCR,AS-PCR)，以期快速、准确检测抗性基因BnALS3R。

表1 设计用于检测抗性基因的AP-PCR标记引物序列(加粗表示突变碱基，斜体加粗表示错配碱基)

根据序列差异,设计41条分子标记引物(表1)。其中每条等位基因特异PCR引物的3’末端分别与SNP位点对应的等位碱基完全匹配，同时在特异引物3’末端的倒数第3或第4位置引入1个错配碱基，每个位置引入3种错配碱基，以期获得多个多态性标记。公用引物SU1F和SU2F分别与等位基因特异PCR引物SU3R～SU14R配对；公用引物SU15F和SU16F分别与等位基因特异PCR引物SU17R～SU28R配对；公用引物SU29R分别与等位基因特异PCR引物SU30F～SU41F配对。以提取的油菜基因组DNA为模板，PCR筛选60对分子标记引物扩增产物多态性。理论上，若样品中的等位位点与等位基因特异PCR引物的3’末端相匹配，便能进行有效扩增，反之则不能进行有效扩增。遗憾的是，经过多次PCR扩增，我们发现有些引物得不到PCR目的片段。有些引物可以扩增出目的片段，但在野生型和突变体间没有多态性。其中有1组引物野生型和突变体间显示出多态性，但当我们将该组引物在F2分离群体中进行验证时，结果表明该组引物不能有效检测出F2分离群体中的三种BnALS3R基因型。因此，根据以上的实验结果，与理论上不符的是，我们在60对分子标记引物中都没有筛选获得检测油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的AS-PCR分子标记。

(2)检测油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的ARMS-PCR分子标记的开发

四引物扩增受阻突变体系PCR(amplification refractory mutationsystemPCR，ARMS-PCR)也是基于核苷酸单碱基突变的分子标记开发方法。为了能获得检测油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的ARMS-PCR标记，我们也基于SNP(G/T)设计了12条ARMS-PCR引物，其中SU42F和SU42，RSU47F和SU47R为外引物，其它为内引物(表2)。两对外引物与8条内引物组合成16个组合在野生型和突变体间进行多态性筛选。提取的油菜基因组DNA为模板，进行多次PCR扩增，我们发现其中有1组引物野生型和突变体间显示出多态性。但遗憾的是，当我们将该组引物在遗传分离群体F2中进行验证时，结果表明该组引物不能有效检测出F2分离群体中的三种BnALS3R基因型。因此，根据以上的实验结果，在16个组合中也没有筛选获得检测油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的ARMS-PCR分子标记。

表2 设计用于检测抗性基因的ARMS-PCR标记引物序列(加粗表示突变碱基，斜体加粗表示错配碱基)

(3)检测油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的CAPS分子标记的开发

与上述两种PCR分子标记不同，CAPS分子标记的开发涉及到PCR扩增和限制性内切酶的使用，操作相对烦琐，费用比较昂贵。同时，甘蓝型油菜为白菜型油菜(A基因组)和甘蓝(C基因组)天然杂交自然加倍而来的异源四倍体(2n＝38)，基因组相对复杂。二倍体研发的分子标记在四倍体油菜的应用难度很大，至今油菜中CAPS标记开发成功的报道相对较少(孔芳等，作物学报，2008，7：1188-1192；邱敦莲，作物育种信息，2006，5：4-5；马永彪，华中农业大学硕士论文)，因此，在标记开发之前我们想筛选、获得成本低廉、操作快捷的PCR标记检测油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R。然而，通过经过上述2种基于SNP的PCR分子标记开发并没有获得检测油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的标记引物。因此，我们又进行了CAPS分子标记的开发。首先，通过序列比对与酶切位点分析发现，抗野生型N131的乙酰乳酸合酶III基因的+1667处“G”与其上游+1662至+1666的5个碱基组合构成了“GCAATG”序列，能够作为限制性核酸内切酶BsrDI酶识别和剪切的序列。为了进一步探明乙酰乳酸合酶III这6个碱基“GCAATG”在多个非抗性甘蓝型油菜中的保守性，设计了引物对(1：5’-TCTCATTTCTCTCTCTCTCTCATC-3’和2：5’-AGTCTGGGAACAAACCAAAAGC-3’)，CTAB法提取除草剂敏感性常规油菜品种宁油20号(江苏省农作物品种审定委员会审定品种)以及MICMS双低恢复系N221、N340和N341(浦惠明等，中国油料学报，2011，33(1)：15-19)的DNA，PCR克隆了4种除草剂敏感性油菜的乙酰乳酸合酶III基因。产物用北京Tiangen公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209)纯化回收，连接于克隆载体pEASY-T1(购自北京TransGen生物技术有限公司)，热激转化DH5α。通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，将阳性克隆送于南京金斯瑞生物有限公司测序。

测序结果表明，4种敏感性油菜的乙酰乳酸合酶III基因在+1662至+1667的序列保守性很强，对应序列均为“GCAATG”，能够作为限制性核酸内切酶BsrDI酶识别和剪切的序列。而抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R从+1662至+1667的相应序列为“GCAATT”，不能作为限制性核酸内切酶BsrDI酶识别的位点。由此，可以开发一个能够检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的CAPS分子标记BsrDI-ALS3R。

接着，需要在甘蓝型油菜乙酰乳酸合酶III的+1662至+1667序列的两端找到一对上、下游引物可以特异扩增甘蓝型油菜乙酰乳酸合酶III基因片段。然而，栽培种甘蓝型油菜为具有两套基因组A和C的异源四倍体物种，进化过程中基因组内高度重排导致甘蓝型油菜基因多以基因家族的形式存在(Chen X,et al.,PlantPhysiol,2011,155(2):851-65)。在甘蓝型油菜A、C基因组内共存在3个ALS功能基因，其中位于C基因组上的乙酰乳酸合酶I和A基因组上的乙酰乳酸合酶III在核酸和蛋白水平的同源性达98％(Rutledge R G,etal.,Mol Gen Genet,1991,229:31-40)，导致在基因编码区内很难开发出特异引物分别扩增乙酰乳酸合酶I和乙酰乳酸合酶III的基因片段。为此，必须尽可能找到这2个基因在多个油菜品种或品系间的序列差异性，通过乙酰乳酸合酶I和乙酰乳酸合酶III的序列差异设计引物特异扩增乙酰乳酸合酶III基因序列片段，消除乙酰乳酸合酶I基因序列对检测抗性基因的干扰。因此，我们在基因编码区段两侧且与乙酰乳酸合酶III的非同源区设计1对特异引物(3：5’-AGAACAGTTAGATCCAC-3’和4：5’-CAGCTTCATCTCTCAGTA-3’)，PCR克隆了4种除草剂敏感性油菜(常规油菜品种宁油20号、MICMS恢复系N221、N340和N341)的乙酰乳酸合酶I基因。用同样的方法进行TA克隆、测序。根据测序结果，结合甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变体M342与野生型N131以及上述4种敏感性油菜的乙酰乳酸合酶I和乙酰乳酸合酶III基因序列差异，在甘蓝型油菜乙酰乳酸合酶III的+1662至+1667序列的两端分别设计8条引物(表3)，其中引物SU52F～SU54F为上游引物，SU56R～SU59R为下游引物。上、下游引物序列锚定在乙酰乳酸合酶I与乙酰乳酸合酶III单核甘酸变异序列上，消除油菜乙酰乳酸合酶I基因序列对PCR扩增的干扰。

以甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变体M342的5个单株、野生型N131和上述4种除草剂敏感性油菜(宁油20号、N221、N340和N341)以及M342的上述5个单株为父本与5种除草剂敏感性油菜为母本(N131、宁油20号、N221、N340和N341)杂交的F1为材料，提取油菜基因组DNA，使用上述引物8条引物组合成16个对，在MJ Research PTC-200型PCR仪上对基因组DNA进行扩增。PCR反应体系包括：DNA模板5μL(10ng/μL)，引物各5μL(10μmol/L)，10×酶反应缓冲液5μL，MgC12(25mmol/L)3μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，Taq酶0.5μL(5U/L)，加水至50μL；PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，然后72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测后，将每个引物对的PCR产物分为2份，1份送公司纯化测序，另外1份用限制性内切酶BsrD I进行酶切处理。酶切反应体系包括：PCR产物5μL，内切酶0.5μL，10×酶反应缓冲液2.5μL,加水至25μL。在65℃下反应3～5h后，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

表3 设计用于检测抗性基因的CAPS标记引物序列

进行多次PCR扩增结果发现，有些引物对无PCR扩增产物，而有些引物对PCR扩增产物为多个条带，不能进行酶切实验，其中引物对(SU54F/SU58R)PCR扩增产物非常特异，上游引物序列特征为SEQ ID NO.1所示的5'-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3'；下游引物序列特征为SEQ ID NO.2所示的5’-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3’。该PCR产物的酶切结果显示，抗磺酰脲类除草剂油菜M342的5个单株都含有分子量为766bp的条带，5种除草剂敏感性油菜都含有分子量分别约为570bp和196bp的条带，5种杂交的F1植株都含有分子量分别为766bp、320bp和160bp的条带(图1)。PCR产物测序结果表明，引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2扩增的PCR产物属于油菜乙酰乳酸合酶III基因片段而非其他非特异性扩增,且在抗性油菜与常规油菜中存在单碱基突变G/T(图2)。而田间苗期用磺酰脲类除草剂苯磺隆喷药处理表明,未发现抗性油菜和5种杂交的F1植株死苗,但5种除草剂敏感型油菜喷药后20d全部死亡。以上结果表明,用CAPS分子标记BsrDI-ALS3R可以准确检测油菜种质资源中是否含有抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R。

分子标记BsrDI-ALS3R的引物包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核甘酸序列。更优选的，其核甘酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.1：5’-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3’

SEQ ID No.2：5’-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3’

在距离乙酰乳酸合酶III基因正义链起始密码子第一个核甘酸+1662上游的序列中，设计与油菜乙酰乳酸合酶III基因反义链同源配对的正向引物SU54F，序列为：5’-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3’。

在距离乙酰乳酸合酶III基因正义链起始密码子第一个核甘酸+1667下游的序列中，设计与油菜乙酰乳酸合酶III基因正义链同源配对的反向引物SU58R，序列为：5’-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3’。

利用上述引物快速检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的分子标记方法包括以下步骤：

(1)以CTAB法提取的甘蓝型油菜总DNA作为模板，加入上述引物进行PCR扩增。PCR反应体系包括：DNA模板2μL(10ng/μL)，引物各2μL(10μmol/L)，10×酶反应缓冲液2μL，MgCl2(25mmol/L)1.2μL，dNTP(2.5mmol/L)1.6μL，Taq酶0.1μL(5U/L)，加水至20μL；PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环，然后72℃延伸5min。

(2)PCR产物用限制性内切酶BsrD I(New England Biolabs)进行酶切处理。酶切反应体系包括：PCR产物5μL，内切酶0.5μL，10×酶反应缓冲液2.5μL,加水至25μL。在65℃下反应3～5h。

(3)酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，优选在1％～1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测；更优选用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

检测结果显示，酶切产物含有分子量为766bp一种条带时，则为含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的纯合型抗性油菜；酶切产物含有分子量为766bp、570bp和196bp三种条带时，则为含抗性基因BnALS3R杂合型抗性油菜；酶切产物含有分子量为570bp、196bp两种条带时，则为不含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的纯合型敏感性油菜。

实施例2分子标记BsrDI-ALS3R在分离群体中对抗性基因BnALS3R基因型的检测鉴定

为验证分子标记BsrDI-ALS3R在分离群体中对甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂BnALS3R基因型的检测效果，我们在3种类型的BnALS3R基因型分离群体中对其进行了检测。F2群体由MICMS双低恢复系N221和M342杂交的F1自交获得；BC1群体由N221和M342杂交的F1再与N221回交获得；BC2群体由N221和M342杂交的F1再与抗磺酰脲类除草剂油菜M342回交获得。在油菜苗期取植株叶片，提取基因组DNA，进行PCR扩增。DNA提取、PCR反应、酶切反应、电泳检测方法同上。检测结果表明，在F2群体中呈现3种基因型的植株(图3)，即含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的纯合型抗性单株，酶切产物含分子量为766bp一种条带；含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R杂合型抗性单株，酶切产物含有分子量为766bp、570bp和196bp三种条带；不含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的除草剂敏感型单株，酶切产物含有分子量为570bp、196bp两种条带。在BC1群体中呈现2种基因型的植株(图4)，即含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R杂合型抗性单株，酶切产物含有分子量为766bp、570bp和196bp三种条带；不含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的除草剂敏感型BC1单株，酶切产物含有分子量为570bp、196bp两种条带。在BC2群体中也呈现2种基因型的植株(图5)，即含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的纯合型抗性BC2单株，酶切产物含分子量为766bp一种条带；含抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R杂合型抗性单株，酶切产物含有分子量为766bp、570bp和196bp三种条带。以上3种群体分子标记检测结果与苗期喷施磺酰脲类除草剂苯磺隆鉴定表型结果完全一致，并且与遗传分离规律中的一对基因自交及回交预期结果也完全一致。由此表明，使用本发明开发的CAPS分子标记BsrDI-ALS3R及检测方法可以有效区分出油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的三种不同基因型，提高对抗性基因的选择效率。

实施例3应用分子标记辅助选择选育抗除草剂MICMS恢复系

选育抗除草剂杂交油菜可以解决当前油菜田间双子叶杂草的化学除草难题，节工省本，而且抗除草剂性状还能作为标记性状在杂交油菜制种中加以利用，前提是必须将抗除草剂性状导入到MICMS恢复系。利用本发明的分子标记BsrDI-ALS3R通过标记辅助选择技术可以快速选育抗磺酰脲类除草剂的MICMS恢复系。我们对三种F1(N221×M342、N340×M342和N341×M342)单株自交获得的F2群体中的植株进行抗性基因检测，将含有分子量为766bp条带的可育单株套袋自交，就获得了含有抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R纯合型的F3种子。同时淘汰分子量为766bp、570bp和196bp三种条带的杂合型以及分子量570bp和196bp两种条带的纯合除草剂敏感性单株，减小了育种的工作量，免去了后续在每个分离后代中都需要喷施除草剂进行鉴定的大量田间试验工作。另外，由于F1的母本N221、N340和N341为带有不育细胞质的恢复系，自交后代中选择可育的单株套袋自交，就可育出抗磺酰脲类除草剂的MI CMS恢复系。目前已从三种F2后代群体中选择到生长势强、成熟期适中的抗性株系100多个。这些材料可为抗磺酰脲类除草剂的杂交油菜选育提供亲本。

本实施例给出了采用本发明的分子标记BsrDI-ALS3R在F2代群体选择纯合抗性恢复系的过程。当然，育种家还可以通过多代回交、标记辅助选择、最后一代自交的方法，即可将抗性基因BnALS3R转育到普通油菜中。基本选育过程是以抗磺酰脲类除草剂油菜M342为父本，普通油菜为母本杂交获得F1，然后以普通油菜为轮回亲本，在每次回交世代前，采用本发明的分子标记BsrDI-ALS3R进行基因型检测，将含分子量为766bp、570bp和196bp三种条带的抗性基因杂合型单株与轮回亲本回交。这样通过多次回交，在最后一代自交的群体中通过基因型检测，选择含分子量为766bp条带的抗性基因纯合型单株就可以培育出抗除草剂油菜。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的引物与应用

<130> 0

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 1

gtttgcgagc agggctaaga 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> 引物

<222> (1)..(22)

<223>

<400> 2

gacatccaac aggtacggtc ca 22

Claims

1.检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的引物，其核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5'-GTTTGCGAGCAGGGCTAAGA-3'

SEQ ID NO.2：5'-GACATCCAACAGGTACGGTCCA-3'。

2.权利要求1所述的引物用于检测甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待测甘蓝型油菜总DNA为模板，用权利要求1所述引物的核苷酸序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行PCR扩增；将PCR扩增的产物用限制性核酸内切酶BsrDI消化；将消化的酶切产物经凝胶电泳检测:

3.权利要求1所述的引物在辅助选择选育抗除草剂品种中的应用，其特征在于，用权利要求1所述引物的核苷酸序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2对以恢复系为母本、以含甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的品种为父本进行杂交的F1单株自交获得的F2群体中的植株进行抗性基因PCR扩增检测，将含有分子量为766bp条带的可育单株套袋自交，自交后代即为获得的含有抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R纯合型的含甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R的F3种子。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在含有分子量为766bp条带的可育单株套袋自交后代中选择可育的单株套袋自交，自交后代即育出抗磺酰脲类除草剂的MICMS恢复系。

5.权利要求1所述的引物在辅助选择选育抗除草剂品种中的应用，其特征在于，以普通油菜为母本、抗磺酰脲类除草剂油菜为父本杂交获得F1，然后以普通油菜为轮回亲本，在每次回交世代前，采用权利要求1所述引物的核苷酸序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行基因型检测，将含分子量为766bp、570bp和196bp三种条带的抗性基因杂合型单株与轮回亲本回交，通过多次回交，在最后一代自交的群体中用权利要求1所述引物的核苷酸序列SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2对甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因BnALS3R进行分子标记辅助基因型检测，选择含分子量为766bp条带的抗性基因纯合型单株即培育出抗除草剂油菜。