CN110117599A

CN110117599A - 甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因及应用

Info

Publication number: CN110117599A
Application number: CN201910298124.5A
Authority: CN
Inventors: 江建霞; 李延莉; 蒋美艳; 杨立勇; 王伟荣; 孙超才; 周熙荣; 张俊英; 朱吉风
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences; Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2019-08-13

Abstract

一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因及其应用，其在ALS1和ALS3两个基因上均发生单位点突变，其中，在ALS1基因的编码序列中第1676位碱基由G突变为T，使第559个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；在ALS3基因的编码序列中，第1667位碱基由G突变为T，使第556个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，将两对显性基因控制的抗除草剂抗性位点转育到甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系及其临保系中，选育甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系，用于生产具有抗除草剂特性的全不育系。

Description

甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因及应用

技术领域

本发明属于甘蓝型油菜育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因及应用。

背景技术

隐性细胞核雄性不育因其具有不育性彻底且稳定、恢复源广等优点，在国内已经成为油菜杂种优势利用的一个重要途径，但由于得不到100％的不育系，在杂交制种时需人工拔除不育系株行中50％的可育株，限制了其广泛应用，如双隐性核不育S45A和117A等。

20118A是上海市农业科学院孙超才研究员于1997年选育的一种新的隐性细胞核雄性不育系，其不育株花药空瘪，无花粉，套袋自交不结实，且不育性稳定，不受环境条件的影响。

通过普通遗传学研究证明，20118A受3对隐性基因控制，为了便于描述其遗传，将三个隐性基因分别命名为a、b和rf，其中a和b为隐性不育基因，rf为隐性上位基因，能抑制a和b不育基因的表达，使育性恢复可育。根据这一遗传原理，这种核不育材料可以实现“三系化”制种。

参见图1，首先是纯合两型系内的纯合型不育株与可育株杂交，不育株上产生的后代世代间基因型相同，2种基因型始终各占50％，因而能稳定遗传。三隐性纯合体aabbrfrf作为父本，与纯合型不育株杂交获得全不育系，因此三隐性纯合体可以作为临保系。基因型为AA----、--BB--或AABB--的可育株与全不育系的不育株杂交，后代全部可育，因此其可以作为恢复系。这种核不育的优点是能通过“临保系”繁殖不育系，理论上可获得全不育系群体，减少了大面积生产杂交种时要拔去母本行50％可育株的麻烦。

然而，因不育性状、临保系的性状都受隐性基因控制，容易受外来花粉，机械混杂等影响，导致获得高纯度的全不育系非常困难。纯合两型系和临保系中混有外来杂种或受到外来花粉污染，无法对这些杂种进行有效识别和剔除。另外，全不育系的纯度鉴定有两种方式，第一种是利用特异的分子标记鉴定技术，这种方式需要鉴定单位具备分子实验室和相关技术人员；第二种是利用花期的育性调查进行鉴定，这种方式需要在苗期进行低温春化，等到开花后才能进行，周期较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因及其应用，将两对显性基因控制的抗除草剂抗性位点转育到甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系及其临保系中，选育甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系，用于生产具有抗除草剂特性的全不育系。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因，其在ALS1和ALS3两个基因上均发生单位点突变，其中，在ALS1基因的编码序列中第1676位碱基由G突变为T，使第559个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；在ALS3基因的编码序列中，第1667位碱基由G突变为T，使第556个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，编码所述ALS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述ALS3基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供所述甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因的应用，以甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变体亲本材料为供体，与甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系及其临保系进行杂交选育，获得具有抗磺酰脲类除草剂特征的甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系。

进一步，利用所述甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系杂交生产甘蓝型油菜抗除草剂的全不育系，基因型为aabbRfrfR1R1R3R3。

又，利用所述抗除草剂的全不育系与基因型为AA----r1r1r3r3、--BB--r1r1r3r3或AABB--r1r1r3r3的恢复系杂交，生产对磺酰脲类除草剂具有抗性的商用F₁杂交种。

一种甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系的选育方法，包括以下步骤：

a)甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系的不育株aabbRfRfr1r1r3r3与甘蓝型油菜抗除草剂突变体5N的可育株AABBRfRfR1R1R3R3杂交，以其F₁代抗除草剂可育株AaBbRfRfR1r1R3r3为父本，与甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系的不育株aabbRfRfr1r1r3r3杂交，BC₁代分离群体中会分离出3/4的可育株和1/4的不育株，其中，不育株中又包括杂合抗性不育株和敏感型不育株，通过喷施除草剂、利用SNP分子标记辅助检测基因型，筛选，得到杂合抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3；

b)以步骤a)中得到的杂合抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3为母本，与甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系可育株AabbRfRfr1r1r3r3杂交，分离出1：1的可育株和不育株，不育株包含1：1：1：1的杂合抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3、杂合抗性不育株aabbRfRfR1r1r3r3、杂合抗性不育株aabbRfRfr1r1R3r3和敏感型不育株aabbRfRfr1r1r3r3；

c)以步骤b)中的杂合抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3为母本，继续与甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系可育株AabbRfRfr1r1r3r3杂交，分离出1：1的可育株和不育株，可育株包含1：1：1：1的杂合抗性可育株AabbRfRfR1r1R3r3、杂合抗性可育株AabbRfRfR1r1r3r3、杂合抗性可育株AabbRfRfr1r1R3r3和敏感型可育株AabbRfRfr1r1r3r3；将步骤c)的杂合抗性可育株AabbRfRfR1r1R3r3套袋自交，其后代中出现1/64的纯合抗性不育株aabbRfRfR1R1R3R3和1/32的纯合抗性可育株AabbRfRfR1R1R3R3，将这两种基因型植株进行兄妹交，其后代始终按照1：1的比例分离，由此选育出甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系；

d)以步骤c)中的纯合抗性不育株aabbRfRfR1R1R3R3与临保系aabbrfrfr1r1r3r3杂交，杂交后代为杂合高抗性不育株aabbRfrfR1r1R3r3；

e)以步骤d)中的杂合高抗性不育株aabbRfrfR1r1R3r3继续与临保系aabbrfrfr1r1r3r3杂交，杂交后代分离得到1/8的抗性可育株aabbrfrfR1r1R3r3，将其进行自交，自交后代群体全部为可育株，包括1/16的纯合抗性可育株aabbrfrfR1R1R3R3以及1/16的纯合敏感型可育株aabbrfrfr1r1r3r3，剩余的为杂合抗性可育株，筛选出纯合抗性可育株aabbrfrfR1R1R3R3，即为抗除草剂临保系。

优选地，在步骤a)、b)、c)、d)和/或e)中，获得杂交后代后，先在油菜四叶期通过喷施目标除草剂除去敏感型油菜，然后在花期通过育性鉴定区分剩余抗性株中的可育株和不育株，最后利用SNP分子标记辅助检测基因型，区分抗性基因的纯杂合情况，最终筛选获得符合预期的基因型的植株。

又，步骤e)中，通过喷施除草剂除去纯合敏感型可育株，通过SNP分子标记辅助检测基因型，区分杂合抗性可育株和纯合抗性可育株中抗性基因的纯杂合情况。

进一步，其中，SNP分子标记辅助检测基因型时的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明中的抗除草剂突变体材料为ALS1和ALS3两个基因均发生单位点突变的双突变体，总的来说，突变体材料中，ALS1基因的第559个氨基酸和ALS3基因的第556个氨基酸均由色氨酸突变为亮氨酸，是抗性产生的分子基础，而ALS1和ALS3碱基突变位点是SNP分子标记辅助基因型检测的关键，在选育抗除草剂隐性核不育纯合两型系和临保系中起到重要的作用。

本发明将抗磺酰脲类除草剂油菜突变体中因发生单位点突变而对磺酰脲类除草剂产生抗性的ALS1基因简称为R1抗性基因，ALS3基因简称为R3抗性基因，遗传研究表明：R1和R3两个抗性基因对磺酰脲类除草剂的抗性性状为显性性状，当基因位点R1和R3均为纯合或杂合时，即基因型为R1R1R3R3或R1_R3_，植株表现为高抗性；当植株基因型为R1_r3r3或r1r1R3_时，植株表现为低抗性；当植株基因型为隐性纯合r1r1r3r3时，植株表现为除草剂敏感型植株。

本发明利用抗除草剂这一特殊标记可以对全不育系生产全程进行纯度和质量控制，同时也为全不育系纯度鉴定提供一种高效、快捷、简单可行的方法，尤其是利用该标记可实现全不育系的除杂，为商用杂交种的生产节省了大量的用工和时间。

本发明的有益效果：

1)本发明将除草剂抗性基因转育到纯合两型系和临保系中，并以对磺酰脲类除草剂抗性和敏感性作为指示性状，可对纯合两型系和临保系繁殖过程中的机械混杂、外源花粉或次生苗进行有效识别、除杂，从源头上保证全不育系生产的质量；每个步骤中，获得杂交后代后都通过喷施目标除草剂、育性鉴定和分子标记辅助基因型检测筛选出预期基因型的植株。

2)本发明将一对除草剂抗性基因转育到纯合两型系和临保系中，生产具有高抗磺酰脲类除草剂特性的全不育系，利用抗除草剂全不育系和恢复系生产的杂交种对除草剂具有抗性，这样可以简化生产栽培中除草环节，简化杂交育种程序，节约生产成本。

附图说明

图1为现有隐性核不育杂交制种的生产模式。

图2为本发明实施例1中通过分子标记辅助基因型检测抗除草剂突变体和杂交后代植株中ALS1基因的纯合、杂合和野生型情况。

图3为本发明实施例1中通过分子标记辅助基因型检测抗除草剂突变体和杂交后代植株中ALS3基因的纯合、杂合和野生型情况。

图4为本发明实施例2中甘蓝型油菜抗除草剂突变体(左)和不抗除草剂的沪油15(右)在四叶期喷施除草剂24天后植株长势的比较图。

图5为本发明实施例2中甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系选育过程的示意图。

图6为本发明实施例3中甘蓝型油菜抗除草剂临保系选育过程的示意图。

图7为本发明实施例3中利用抗除草剂全不育系生产商用杂交种示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例与附图进一步详细描述本发明的技术方案。

实施例中所需试验材料：

1.隐性核不育纯合两型系

甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系20118AB，20118A基因型为aabbRfRf，20118B基因型为AabbRfRf，其芥酸含量为0.56％，硫甙含量为23.45μmol/g。

2.临保系

临保系M-6029，其基因型为aabbrfrf，可育，与隐性核不育20118A(aabbRfRf)杂交，其后代基因型为aabbRfrf，仍为不育，但是该不育性只能保持一代，其后代会发生育性分离，故称基因型aabbrfrf的M-6029为甘蓝型油菜隐性核不育20118A的临保系。

3.恢复系

因甘蓝型油菜隐性核不育是受三对隐性基因控制的，所以恢复系的选择自由度大，生产上的品系(自交系)基因型大多为AA----、--BB--或AABB--，故均可以用作恢复系。

4.甘蓝型油菜抗除草剂突变体5N

实施例1确定突变位点

对突变体材料5N以及敏感野生型对照油菜品种沪油15中的ALS1、ALS3基因进行克隆，通过测序和序列分析鉴定突变体材料5N中ALS1、ALS3基因的抗性突变位点。

实验材料均成功克隆获得ALS1和ALS3，两个基因的CDS大小分别是1968bp和1959bp，分别编码655和652个氨基酸，经过序列比对发现，抗性突变体材料5N中ALS1和ALS3基因的CDS上均发生了一个点突变，ALS1基因CDS上的第1676个碱基G突变为T，对应编码的第559个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；ALS3基因CDS上的第1667个碱基G突变为T，对应的第556个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，ALS1和ALS3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，对ALS1进行PCR扩增所用的引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，将PCR产物利用Bsr DI限制性内切酶进行酶切并将酶切产物通过电泳检测，当酶切产物长度为1694bp时，ALS1基因为纯合型抗性类型，当酶切产物长度为1694bp、1499bp和195bp三种带型时，ALS1基因型为杂合型抗性类型；当酶切产物长度为1499bp和195bp两种带型时，ALS1基因型为纯合敏感性类型(图2)。

同样，利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8对ALS3进行PCR扩增，利用Bsr DI限制性内切酶进行酶切并利用凝胶电泳检测酶切产物，当酶切产物长度为1686bp时，ALS3基因型为纯合抗性类型；当酶切产物长度为1686bp、1492bp和194bp三种带型时，ALS3基因型为杂合型抗性类型；当酶切产物长度为1492bp和194bp时，ALS3基因型为纯合型敏感性类型(图3)。

实施例2抗性基因R1和R3的遗传研究

甘蓝型油菜一般对磺酰脲类除草剂敏感，即不具备除草剂抗性特点，本发明的抗除草剂突变体材料对磺酰脲类除草剂具有高度抗性，它们对磺酰脲类除草剂，例如苯磺隆、噻吩磺隆、苄嘧磺隆、甲基二磺隆等的抗性是除草剂有效杀草浓度的12～16倍(图4)。

将抗除草剂突变体材料与正常植株进行杂交，F₁代植株表现为对磺酰脲类除草剂具有抗性，将F₁代植株作为父本与隐性核不育纯合两型系中的不育株杂交获得BC₁代，BC₁代分离群体中除草剂抗性植株和敏感型植株的单株数分别为358和115，卡方值为0.25，符合3：1的分离比例。

通过育性鉴定、喷施除草剂和分子标记辅助基因型检测筛选出BC₁代分离群体中R1和R3抗性位点均杂合的抗性不育植株aabbRfRfR1r1R3r3，大约筛选到27株，以该杂合抗性不育株作为母本，与甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系中可育株杂交，获得BC₂分离群体，喷施除草剂发现抗性植株与敏感型植株比例为3：1，观察BC₂分离群体的育性可发现可育植株与不育植株比例为1：1，通过分子标记辅助基因型检测发现R1和R3位点均杂合的抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3比例占整个群体数量的1/8，参见图5。

以抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3继续与甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系中可育株杂交，获得BC₃分离群体，喷施除草剂可发现BC₃分离群体中抗性植株与敏感型植株比例为3：1，通过育性鉴定和分子标记辅助基因型检测筛选R1和R3均杂合的抗性可育株AabbRfRfR1r1R3r3，该基因型植株数量占整个BC₃群体数量的1/8。

对BC₃中该抗性可育株AabbRfRfR1r1R3r3进行套袋自交，通过喷施目标除草剂、育性鉴定和分子标记辅助基因型检测筛选纯合高抗不育植株aabbRfRfR1R1R3R3和纯合高抗可育植株AabbRfRfR1R1R3R3，这两种基因型植株比例分别为1/64和1/32，这两种基因型植株进行兄妹交，其后代全部为高抗性植株，且始终按照纯合抗性不育株和纯合抗性可育株比例为1：1分离，因此，该两种基因型植株为抗除草剂隐性核不育纯合两型植株。

利用获得的抗除草剂隐性核不育纯合两型系中的不育株aabbRfRfR1R1R3R3与临保系aabbrfrfr1r1r3r3杂交，获得R1和R3杂合的不育株aabbRfrfR1r1R3r3，该类型植株与临保系继续回交，从回交后代中筛选R1和R3杂合的抗性可育株aabbrfrfR1r1R3r3，其占群体植株数量比例为1/8，将该抗性可育株进行自交，从自交后代群体中筛选纯合高抗性可育株aabbrfrfR1R1R3R3，即为抗除草剂临保系。

表明：R1和R3两个抗性基因对磺酰脲类除草剂的抗性性状为显性性状，当基因位点R1和R3均为纯合或杂合时，即基因型为R1R1R3R3或R1_R3_，植株表现为高抗性；当植株基因型为R1_r3r3或r1r1R3_时，植株表现为低抗性；当植株基因型为隐性纯合r1r1r3r3时，植株表现为除草剂敏感型植株。

实施例3甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系的选育

参见图5，以隐性核不育纯合两型系不育株20118A为母本，与甘蓝型油菜抗除草剂突变体AABBRfRfR1R1R3R3为父本杂交，并利用临保系M-6029同时对该不育株进行测交，测交后代全不育，表明当选单株基因型为aabbRfRf。

抗除草剂可育株AABBRfRfR1R1R3R3和该不育株aabbRfRfr1r1r3r3的杂交后代即F₁均为抗除草剂可育株，其基因型为AaBbRfRfR1r1R3r3，以F₁代为父本，与纯合两型系中的不育株杂交获得BC₁，将收获的BC₁代种子秋播到田间，在油菜四叶期喷施苯磺隆除草剂除去敏感型植株，在花期进行田间观察，不育性状为明显的指示性状，同时，取抗性不育株的叶片提取DNA进行PCR，利用抗性基因R1和R3的分子标记辅助基因型检测分析R1和R3基因的基因型，有利于选出R1和R3位点杂合的抗除草剂不育株。通过观察，在473个BC₁代分离群体中，发现了27株抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3，以该类型抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3与隐性核不育纯合两型系可育株20118B杂交，收获杂交后代种子并秋播到田间，在油菜四叶期喷施除草剂并观察统计抗性苗和除草剂敏感植株比例，发现在475个回交后代中有62株敏感植株慢慢黄化死亡，剩余植株对除草剂具有很强或一定抗性，在花期观察育性发现212个抗性可育株和201个抗性不育株，分离比例约为1：1，对201个抗性不育株叶片取样提取DNA进行PCR，利用抗性基因R1和R3的分子标记辅助基因型检测筛选基因型为aabbRfRfR1r1R3r3的抗性不育株，筛选到57株该类型植株。将筛选到的该基因型抗性不育株继续与隐性核不育纯合两型系可育株20118B回交，通过对回交群体植株在四叶期油菜喷施除草剂、育性鉴定和分子标记辅助基因型检测分析，在342个回交群体中获得46株基因型为AabbRfRfR1r1R3r3的抗性可育株，占整个回交群体植株数量的1/8，将此基因型类型植株进行套袋自交，对1312株的自交后代进行四叶期喷施除草剂、花期的育性鉴定和分子标记辅助基因型检测分析，筛选得到18株基因型为aabbRfRfR1R1R3R3的抗性不育株和45株基因型为AabbRfRfR1R1R3R3的抗性可育株，这两种类型植株进行兄妹交，后代群体中抗性可育株和抗性不育株植株数量比例始终以1：1分离。

本实施例中，将抗除草剂突变体材料与正常植株进行杂交，F₁代植株表现为对磺酰脲类除草剂具有抗性，将F₁代植株作为父本与隐性核不育纯合两型系中的不育株杂交获得BC₁代，BC₁代分离群体中除草剂抗性植株和敏感型植株的单株数分别为358和115，卡方值为0.25，符合3：1的分离比例。通过育性鉴定、喷施除草剂和分子标记辅助基因型检测筛选出BC₁代分离群体中R1和R3抗性位点均杂合的抗性不育植株aabbRfRfR1r1R3r3，大约筛选到27株，以该杂合抗性不育株作为母本，与甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系中可育株杂交，获得BC₂分离群体，喷施除草剂发现抗性植株与敏感型植株比例为3：1，观察BC₂分离群体的育性可发现可育植株与不育植株比例为1：1，通过分子标记辅助基因型检测发现R1和R3位点均杂合的抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3比例占整个群体数量的1/8。

对BC₃中该抗性可育株AabbRfRfR1r1R3r3进行套袋自交，通过喷施目标除草剂、育性鉴定和分子标记辅助基因型检测筛选纯合高抗不育植株aabbRfRfR1R1R3R3和纯合高抗可育植株AabbRfRfR1R1R3R3，这两种基因型植株比例分别为1/64和1/32，这两种基因型植株进行兄妹交，其后代全部为高抗性植株，且始终按照纯合抗性不育株和纯合抗性可育株比例为1：1分离，因此该两种基因型植株为选育的抗除草剂隐性核不育纯合两型植株。

本发明利用新获得的抗除草剂隐性核不育纯合两型系中的不育株aabbRfRfR1R1R3R3与临保系aabbrfrfr1r1r3r3杂交，获得R1和R3杂合的不育株aabbRfrfR1r1R3r3，该类型植株与临保系继续回交，从回交后代中筛选R1和R3杂合的抗性可育株aabbrfrfR1r1R3r3，其占群体植株数量比例为1/8，将该抗性可育株进行自交，从自交后代群体中筛选纯合高抗性可育株aabbrfrfR1R1R3R3，即为新获得的抗除草剂临保系。

实施例4甘蓝型油菜抗除草剂临保系的选育和全不育系的生产

参见图6，以实施例1中新获得的抗除草剂纯合两型系中的不育株aabbRfRfR1R1R3R3为母本，与临保系M-6029杂交，杂交后代全部为抗除草剂不育株，基因型为aabbRfrfR1r1R3r3，以该抗性不育株与临保系M-6029回交，在237个回交群体中有33株基因型为aabbrfrfR1r1R3r3的抗性可育株，选择20株该抗性可育株进行套袋自交，将收获的种子进行播种，对自交后代喷施除草剂发现群体出现抗性和敏感性植株分离，在花期进行育性鉴定以及利用分子标记辅助基因型检测从516株自交后代群体中筛选到35株基因型为aabbrfrfR1R1R3R3的抗性可育株，这些抗性可育株即为甘蓝型油菜抗除草剂临保系。

参见图7，将抗除草剂隐性核不育纯合两型系种植在母本行，抗除草剂临保系种植在父本行，父本与母本的行比为1：2，在花期，除去母本行中的抗性可育株AabbRfRfR1R1R3R3，留下抗性不育株aabbRfRfR1R1R3R3，抗除草剂临保系作为唯一授粉源。种子成熟后，收获不育株上的种子，即为甘蓝型油菜抗除草剂全不育系aabbRfrfR1R1R3R3。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂抗性突变体的应用及其方法

<130> 1911066

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 655

<212> PRT

<213> Brassica napus L.

<400> 1

Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Leu Thr Pro Gln Lys Asp Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

35 40 45

Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu

50 55 60

Lys Thr Asp Lys Asn Lys Thr Phe Val Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu

65 70 75 80

Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly

85 90 95

Val Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His

100 105 110

Gln Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His

115 120 125

Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly

130 135 140

Lys Pro Gly Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu

145 150 155 160

Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala

165 170 175

Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln

180 185 190

Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr

195 200 205

Leu Val Met Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe

210 215 220

Phe Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro

225 230 235 240

Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met

245 250 255

Arg Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser

260 265 270

Gln Leu Gly Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val

275 280 285

Leu Tyr Val Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg

290 295 300

Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu

305 310 315 320

Gly Ser Tyr Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met

325 330 335

His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu

340 345 350

Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu

355 360 365

Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala

370 375 380

Glu Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val

385 390 395 400

Lys Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu

405 410 415

Glu Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln

420 425 430

Lys Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro

435 440 445

Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala

450 455 460

Ile Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe

465 470 475 480

Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly

485 490 495

Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn

500 505 510

Pro Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met

515 520 525

Asn Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys

530 535 540

Ile Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu

545 550 555 560

Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro

565 570 575

Ala Arg Glu Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala

580 585 590

Cys Gly Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu

595 600 605

Ala Ile Gln Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val

610 615 620

Ile Cys Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly

625 630 635 640

Thr Phe Lys Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

645 650 655

<210> 2

<211> 652

<212> PRT

<213> Brassica napus L.

<400> 2

Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro Ile Ser Leu Thr Ala Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser

20 25 30

Leu Thr Pro Gln Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

35 40 45

Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp

50 55 60

Lys Ile Lys Thr Phe Ile Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys

65 70 75 80

Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Glu Thr

85 90 95

Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu

100 105 110

Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly

115 120 125

Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly

130 135 140

Ile Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly

145 150 155 160

Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly

165 170 175

Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro

180 185 190

Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met

195 200 205

Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala

210 215 220

Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp Ile

225 230 235 240

Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro

245 250 255

Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser Gln Leu Gly

260 265 270

Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu

290 295 300

Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr

305 310 315 320

Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr

325 330 335

Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe

340 345 350

Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala

355 360 365

Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly

370 375 380

Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala

385 390 395 400

Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys

405 410 415

Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys

420 425 430

Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr

435 440 445

Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Gln Gly Lys Ala Ile Ile Ser

450 455 460

Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr

465 470 475 480

Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly

485 490 495

Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala

500 505 510

Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln

515 520 525

Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu

530 535 540

Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp Arg Phe

545 550 555 560

Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu

565 570 575

Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala Cys Gly Ile

580 585 590

Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln

595 600 605

Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro

610 615 620

His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr Phe Lys

625 630 635 640

Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

645 650

<210> 3

<211> 1968

<212> DNA

<213> Brassica napus L.

<400> 3

atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60

cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa agactcctcc 120

cgtctccacc gtcctctcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180

ccttcccctg aaaaaaccga caagaacaag actttcgtct cccgctacgc tcccgacgag 240

ccccgcaagg gtgctgatat cctcgtcgaa gccctcgagc gtcaaggcgt cgaaaccgtc 300

tttgcttatc ccggaggtgc ttccatggag atccaccaag ccttgactcg ctcctccacc 360

atccgtaacg tccttccccg tcacgaacaa ggaggagtct tcgccgccga gggttacgct 420

cgttcctccg gcaaaccggg aatctgcata gccacttcgg gtcccggagc taccaacctc 480

gtcagcgggt tagcagacgc gatgcttgac agtgttcctc ttgtcgccat tacaggacag 540

gtccctcgcc ggatgatcgg tactgacgcc ttccaagaga caccaatcgt tgaggtaacg 600

aggtctatta cgaaacataa ctatttggtg atggatgttg atgacatacc taggatcgtt 660

caagaagctt tctttctagc tacttccggt agacccggac cggttttggt tgatgttcct 720

aaggatattc agcagcagct tgcgattcct aactgggatc aacctatgcg cttacctggc 780

tacatgtcta ggttgcctca gcctccggaa gtttctcagt taggtcagat cgttaggttg 840

atctcggagt ctaagaggcc tgttttgtac gttggtggtg gaagcttgaa ctcgagtgaa 900

gaactgggga gatttgtcga gcttactggg atccccgttg cgagtacttt gatggggctt 960

ggctcttatc cttgtaacga tgagttgtcc ctgcagatgc ttggcatgca cgggactgtg 1020

tatgctaact acgctgtgga gcatagtgat ttgttgctgg cgtttggtgt taggtttgat 1080

gaccgtgtca cgggaaagct cgaggctttc gctagcaggg ctaaaattgt gcacatagac 1140

attgattctg ctgagattgg gaagaataag acacctcacg tgtctgtgtg tggtgatgta 1200

aagctggctt tgcaagggat gaacaaggtt cttgagaacc gggcggagga gctcaagctt 1260

gatttcggtg tttggaggag tgagttgagc gagcagaaac agaagttccc tttgagcttc 1320

aaaacgtttg gagaagccat tcctccgcag tacgcgattc agatcctcga cgagctaacc 1380

gaagggaagg caattatcag tactggtgtt ggacagcatc agatgtgggc ggcgcagttt 1440

tacaagtaca ggaagccgag acagtggctg tcgtcatcag gcctcggagc tatgggtttt 1500

ggacttcctg ctgcgattgg agcgtctgtg gcgaaccctg atgcgattgt tgtggatatt 1560

gacggtgatg gaagcttcat aatgaacgtt caagagctgg ccacaatccg tgtagagaat 1620

cttcctgtga agatactctt gttaaacaac cagcatcttg ggatggtcat gcaattggaa 1680

gatcggttct acaaagctaa cagagctcac acttatctcg gggacccggc aagggagaac 1740

gagatcttcc ctaacatgct gcagtttgca ggagcttgcg ggattccagc tgcgagagtg 1800

acgaagaaag aagaactccg agaagctatt cagacaatgc tggatacacc aggaccatac 1860

ctgttggatg tgatatgtcc gcaccaagaa catgtgttac cgatgatccc aagtggtggc 1920

actttcaaag atgtaataac agaaggggat ggtcgcacta agtactga 1968

<210> 4

<211> 1959

<212> DNA

<213> Brassica napus L.

<400> 4

atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60

cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa accctcctcc 120

cgtctccacc gtccactcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180

gaaaaaaccg acaagatcaa gactttcatc tcccgctacg ctcccgacga gccccgcaag 240

ggtgctgata tcctcgtgga agccctcgag cgtcaaggcg tcgaaaccgt cttcgcttat 300

cccggaggtg cctccatgga gatccaccaa gccttgactc gctcctccac catccgtaac 360

gtcctccccc gtcacgaaca aggaggagtc ttcgccgccg agggttacgc tcgttcctcc 420

ggcaaaccgg gaatctgcat agccacttcg ggtcccggag ctaccaacct cgtcagcggg 480

ttagccgacg cgatgcttga cagtgttcct ctcgtcgcca tcacaggaca ggtccctcgc 540

cggatgatcg gtactgacgc gttccaagag acgccaatcg ttgaggtaac gaggtctatt 600

acgaaacata actatctggt gatggatgtt gatgacatac ctaggatcgt tcaagaagca 660

ttctttctag ctacttccgg tagacccgga ccggttttgg ttgatgttcc taaggatatt 720

cagcagcagc ttgcgattcc taactgggat caacctatgc gcttgcctgg ctacatgtct 780

aggctgcctc agccaccgga agtttctcag ttaggccaga tcgttaggtt gatctcggag 840

tctaagaggc ctgttttgta cgttggtggt ggaagcttga actcgagtga agaactgggg 900

agatttgtcg agcttactgg gatccctgtt gcgagtacgt tgatggggct tggctcttat 960

ccttgtaacg atgagttgtc cctgcagatg cttggcatgc acgggactgt gtatgctaac 1020

tacgctgtgg agcatagtga tttgttgctg gcgtttggtg ttaggtttga tgaccgtgtc 1080

acgggaaagc tcgaggcgtt tgcgagcagg gctaagattg tgcacataga cattgattct 1140

gctgagattg ggaagaataa gacacctcac gtgtctgtgt gtggtgatgt aaagctggct 1200

ttgcaaggga tgaacaaggt tcttgagaac cgggcggagg agctcaagct tgatttcggt 1260

gtttggagga gtgagttgag cgagcagaaa cagaagttcc cgttgagctt caaaacgttt 1320

ggagaagcca ttcctccgca gtacgcgatt caggtcctag acgagctaac ccaagggaag 1380

gcaattatca gtactggtgt tggacagcat cagatgtggg cggcgcagtt ttacaagtac 1440

aggaagccga ggcagtggct gtcgtcctca ggactcggag ctatgggttt cggacttcct 1500

gctgcgattg gagcgtctgt ggcgaaccct gatgcgattg ttgtggacat tgacggtgat 1560

ggaagcttca taatgaacgt tcaagagctg gccacaatcc gtgtagagaa tcttcctgtg 1620

aagatactct tgttaaacaa ccagcatctt gggatggtca tgcaattgga agatcggttc 1680

tacaaagcta acagagctca cacttatctc ggggacccgg caagggagaa cgagatcttc 1740

cctaacatgc tgcagtttgc aggagcttgc gggattccag ctgcgagagt gacgaagaaa 1800

gaagaactcc gagaagctat tcagacaatg ctggatacac ctggaccgta cctgttggat 1860

gtcatctgtc cgcaccaaga acatgtgtta ccgatgatcc caagtggtgg cactttcaaa 1920

gatgtaataa ccgaagggga tggtcgcact aagtactga 1959

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccttcccct gaaaaaaccg 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcacatccaa caggtatggt cct 23

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctgaaaaaa ccgacaagat caaga 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacatccaac aggtacggtc ca 22

Claims

1.一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因，其在ALS1和ALS3两个基因上均发生单位点突变，其中，在ALS1基因的编码序列中第1676位碱基由G突变为T，使第559个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；在ALS3基因的编码序列中，第1667位碱基由G突变为T，使第556个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，具体氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因，其特征在于，编码ALS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码ALS3基因的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.如权利要求1所述甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变基因的应用，以甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变体亲本材料为供体，与甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系及其临保系进行杂交选育，获得具有抗磺酰脲类除草剂特征的甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，利用所述甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系杂交生产甘蓝型油菜抗除草剂的全不育系，基因型为aabbRfrfR1R1R3R3。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，利用所述抗除草剂的全不育系与基因型为AA----r1r1r3r3、--BB--r1r1r3r3或AABB--r1r1r3r3的恢复系杂交，生产对磺酰脲类除草剂具有抗性的商用F₁杂交种。

6.一种甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系的选育方法，包括以下步骤：

c)以步骤b)中的杂合抗性不育株aabbRfRfR1r1R3r3为母本，继续与甘蓝型油菜隐性核不育纯合两型系可育株AabbRfRfr1r1r3r3杂交，分离出1：1的可育株和不育株，可育株包含1：1：1：1的杂合抗性可育株AabbRfRfR1r1R3r3、杂合抗性可育株AabbRfRfR1r1r3r3、杂合抗性可育株AabbRfRfr1r1R3r3和敏感型可育株AabbRfRfr1r1r3r3；

将步骤c)的杂合抗性可育株AabbRfRfR1r1R3r3套袋自交，其后代中出现1/64的纯合抗性不育株aabbRfRfR1R1R3R3和1/32的纯合抗性可育株AabbRfRfR1R1R3R3，将这两种基因型植株进行兄妹交，其后代始终按照1：1的比例分离，由此选育出甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系；

7.根据权利要求5所述甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系的选育方法，其特征在于，在步骤a)、b)、c)、d)和/或e)中，获得杂交后代后，先在油菜四叶期通过喷施目标除草剂除去敏感型油菜，然后在花期通过育性鉴定区分剩余抗性株中的可育株和不育株，最后利用SNP分子标记辅助检测基因型，区分抗性基因的纯杂合情况，最终筛选获得符合预期的基因型的植株。

8.根据权利要求5所述甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系的选育方法，其特征在于，步骤e)中，通过喷施除草剂除去纯合敏感型可育株，通过SNP分子标记辅助检测基因型，区分杂合抗性可育株和纯合抗性可育株中抗性基因的纯杂合情况。

9.根据权利要求5-7任一项中所述甘蓝型油菜抗除草剂隐性核不育纯合两型系及其临保系的选育方法，其特征在于，其中，SNP分子标记辅助检测基因型时的引物序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。