CN110157828A - 甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂抗性突变体的应用及其方法 - Google Patents
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Abstract
甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂抗性突变体的应用及其方法，以甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂的抗性突变体为供体，以“沪油15”为轮回亲本，通过杂交、多次回交和自交，最终获得BC4F2，在每个后代群体中都通过喷施磺酰脲类除草剂筛选抗性单株，通过PCR检测SNP位点进行前景选择，并利用SSR标记筛选背景回复率趋近“沪油15”的植株，最终获得遗传背景回复率高于96％的具有“沪油15”优良农艺性状的抗除草剂油菜新品系。
Description
技术领域
本发明属于甘蓝型油菜育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂抗性突变体的应用及其方法。
背景技术
甘蓝型油菜一般对磺酰脲类除草剂敏感，即不具备除草剂抗性特点，甘蓝型油菜的抗除草剂突变体5N对磺酰脲类除草剂具有高度抗性，对磺酰脲类除草剂，例如苯磺隆、噻吩磺隆、苄嘧磺隆、甲基二磺隆等的抗性是除草剂有效杀草浓度的12～16倍(参见图1)。
抗除草剂突变体5N是油菜乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性突变体，是ALS1和ALS3两个基因均发生单位点突变的双突变体。
通过对抗性突变体5N以及敏感野生型对照油菜品种“沪油15”中的BnALS1、BnALS3基因进行克隆，通过测序和序列分析鉴定突变体材料中BnALS1、BnALS3基因的抗性突变位点，材料中均成功克隆获得BnALS1和BnALS3，两个基因的CDS大小分别是1968bp和1959bp，分别编码655和652个氨基酸。
通过序列比对发现，抗性突变体材料5N的BnALS1和BnALS3基因的CDS上均发生了一个点突变；5N突变体材料BnALS1基因CDS上的第1676个碱基G突变为T，对应编码的第559个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸，BnALS3基因CDS上的第1667个碱基G突变为T，对应的第556个氨基酸由色氨酸突变为亮氨酸。
总的来说，突变体材料5N中BnALS1基因的第559个氨基酸和BnALS3基因的第556个氨基酸均由色氨酸突变为亮氨酸，是抗性产生的分子基础，而BnALS1和BnALS3的碱基突变位点可以作为SNP标记在选育抗除草剂新品系中起到重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂抗性突变体的应用及其方法，将两对显性基因控制的抗除草剂抗性位点转育到国审双低品种“沪油15”中，获得遗传背景回复率大于96％的抗磺酰脲类除草剂的油菜新品系。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂突变体的应用，以甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂的抗性突变体5N为供体，以“沪油15”为轮回亲本，通过杂交、多次回交和自交，最终获得BC4F2，在每一个后代群体中都通过喷施磺酰脲类除草剂筛选抗性单株，通过PCR检测SNP位点进行前景选择，并利用SSR标记筛选背景回复率趋近“沪油15”的植株，最终获得遗传背景回复率高于96％的具有“沪油15”优良农艺性状的抗除草剂油菜新品系。
利用甘蓝型油菜抗除草剂突变体选育抗除草剂油菜的方法，包括以下步骤：
a)以甘蓝型油菜抗除草剂突变体材料5N为母本，以甘蓝型油菜“沪油15”为父本杂交，F1代全部为抗性株R1r1R3r3，以F1代植株为母本，与“沪油15”回交获得BC1F1代群体，BC1F1群体中分离出1：1：1：1的敏感型植株r1r1r3r3、抗性植株R1r1r3r3、抗性植株r1r1R3r3和高抗性植株R1r1R3r3，通过在油菜四叶期喷施磺酰脲类除草剂，除去敏感型植株，并提取抗性株叶片DNA，通过PCR检测SNP位点鉴定得到R1r1R3r3抗性植株；
b)以步骤a)中的杂合抗性株R1r1R3r3为母本，继续与“沪油15”回交，获得BC2F1回交群体，通过喷施磺酰脲类除草剂，通过PCR检测SNP位点进行前景选择，并利用SSR标记筛选背景回复率趋近“沪油15”基因型为R1r1R3r3的抗性株，该种基因型植株占整个BC2F1群体的1/4，将该类型抗性株继续与“沪油15”进行连续回交至获得BC4F1群体；
从BC4F1群体中挑选背景回复率高于96％并具有磺酰脲类除草剂抗性且基因型为R1r1R3r3的株系，对这些植株进行套袋自交获得BC4F2代群体，喷施除草剂，通过PCR检测SNP位点进行前景选择，从BC4F2中挑选基因型为R1R1R3R3的抗性植株，该类型植株占整个BC4F2群体植株数量的1/16，利用SSR标记进行背景选择，筛选出背景回复率高于96％的基因型为R1R1R3R3的抗性植株，即为选育出的抗除草剂油菜。
优选地，在每一步骤中获得杂交后代之后通过喷施磺酰脲类除草剂和PCR检测SNP位点进行前景选择，筛选出抗除草剂的植株，接着利用SSR标记进行背景选择，筛选出背景回复率趋近“沪油15”基因型为R1r1R3r3的抗性株。
进一步，步骤a)中，获得四种基因型的BC1F1回交群体后，在油菜四叶期喷施目标除草剂，除去敏感型植株r1r1r3r3，之后利用PCR检测SNP位点筛选基因型为R1r1R3r3的高抗性植株，接着利用SSR标记进行背景选择，筛选出背景回复率趋近“沪油15”基因型为R1r1R3r3的抗性株。
又，所述甘蓝型油菜抗除草剂突变体材料5N中，ALS1和ALS3两个基因均发生单位点突变，其中，在ALS1基因的编码序列中，第1676位碱基由G突变为T，具体核苷酸序列如SEQID NO.1所示；在ALS3基因的编码序列中，第1667位碱基由G突变为T，具体核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
进一步，所述PCR标记筛选时有两对引物，分别用于扩增ALS1和ALS3基因，两对引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明将抗磺酰脲类除草剂油菜突变体中因发生单位点突变而对磺酰脲类除草剂产生抗性的ALS1基因简称为R1抗性基因，ALS3基因简称为R3抗性基因，R1和R3两个抗性基因对磺酰脲类除草剂的抗性性状为显性性状，当基因位点R1和R3均为纯合或杂合时，即基因型为R1R1R3R3或R1_R3_，植株表现为高抗性；当植株基因型为R1_r3r3或r1r1R3_时，植株表现为低抗性；当植株基因型为隐性纯合r1r1r3r3时，植株表现为除草剂敏感型植株。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1)本发明将一对除草剂抗性基因转育到国审常规品种“沪油15”中，以对磺酰脲类除草剂抗性和敏感性作为指示性状，可对“沪油15”繁殖过程中的机械混杂、外源花粉或次生苗进行有效识别、除杂，从源头上保证后代种子的纯度和质量。
2)本发明将一对除草剂抗性基因转育到“沪油15”中，生产具有高抗磺酰脲类除草剂特性的“沪油15”，利用SNP标记和SSR标记，从抗性株中筛选得到背景回复率高于96％的高抗性株，并对植株的含油量和品种性状进行鉴定，最终筛选获得抗除草剂油菜新品系，简化生产栽培中的除草环节，节约生产成本。
附图说明
图1为本发明实施例中抗除草剂突变体和“沪油15”喷施除草剂24天后植株对比照。
图2为本发明实施例中‘抗除草剂沪油15’新品系的选育过程。
图3为本发明实施例中通过SNP标记鉴别抗除草剂突变体和杂交后代植株中ALS1基因的纯合、杂合和野生型情况。
图4为本发明实施例中通过SNP标记鉴别抗除草剂突变体和杂交后代植株中ALS3基因的纯合、杂合和野生型情况。
具体实施方式
以下结合具体实施例与附图进一步详细描述本发明的技术方案。
本发明实施例中，所需的试验材料：
1.甘蓝型油菜抗除草剂突变体5N由江苏省农业科学院经济作物研究所提供，是ALS1和ALS3两个基因均发生单位点突变的双突变体，对乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂具有抗性，5N对磺酰脲类除草剂具有高度抗性，它们对苯磺隆、噻吩磺隆、苄嘧磺隆、甲基二磺隆等的抗性是除草剂有效杀草浓度的12～16倍(参见图1)。
2.“沪油15”是上海市农业科学院培育的第一个双低油菜常规品种，获得国家植物新品种权保护，是国家重点推荐种植的双低油菜品种。
实施例 选育‘抗除草剂沪油15’
参见图2，以甘蓝型油菜抗除草剂突变体5N为母本，以“沪油15”为父本进行杂交，收种获得F1代，将F1代植株播种到大田中并统计植株数量，在四叶期对F1代植株喷施目标除草剂，并统计抗性株和敏感株数量，统计后发现所有F1代植株都是抗性植株，没有敏感性状植株，表明对除草剂的抗性是显性性状，抗性基因是显性遗传，因此可以将5N抗性突变体基因型记为R1R1R3R3，“沪油15”的基因型记为r1r1r3r3。
以F1代植株为母本与“沪油15”轮回亲本进行回交，将收获的BC1F1代种子秋播到田间，统计植株数量，在油菜四叶期喷施目标除草剂，统计抗性植株和敏感型植株数量，发现BC1F1代植株总数量为213株，喷施除草剂后对除草剂敏感的植株有53株，剩余的都为抗性株，分离比例约为1：3。
对抗性株叶片取样提取DNA，利用抗性基因R1和R2的SNP标记引物进行PCR，筛选基因型为R1r1R3r3的植株，利用SSR标记引物进行PCR，根据结果从基因型为R1r1R3r3的植株中筛选出背景回复率高的植株，继续与“沪油15”进行回交，获得BC2F1，对BC2F1群体在四叶期喷施目标除草剂发现敏感型植株与抗性株数量比例约为1：3，再利用SNP标记和SSR标记筛选背景回复率高的基因型为R1r1R3r3的抗性株。
依据以上方法依次对BC3F1和BC4F1进行喷施除草剂和挑选背景回复率高的基因型为R1r1R3r3的抗性株。最后，对BC4F1中群体基因型为R1r1R3r3的抗性株套袋自交，获得BC4F2分离群体，对BC4F2分离群体在四叶期喷施除草剂发现喷施前有356株植株，在喷施后有24株敏感型植株，占总数比率为1/16，剩余的都为抗性株，在对抗性株取样提取DNA利用SNP标记和SSR标记进行PCR检测后，一共筛选得到约25株基因型为R1R1R3R3的植株，约占群体植株总数量的1/16，从基因型为R1R1R3R3的植株中筛选背景回复率高于96％的植株，选育出抗除草剂新品系，命名为‘抗除草剂沪油15’。
其中，ALS1和ALS3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，对ALS1进行PCR扩增所用的引物为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，将PCR产物利用Bsr DI限制性内切酶进行酶切并将酶切产物通过电泳检测，当酶切产物长度为1694bp时，ALS1基因为纯合型抗性类型，当酶切产物长度为1694bp、1499bp和195bp三种带型时，ALS1基因型为杂合型抗性类型；当酶切产物长度为1499bp和195bp两种带型时，ALS1基因型为纯合敏感性类型(图3)。
同样，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6对ALS3进行PCR扩增，利用Bsr DI限制性内切酶进行酶切并利用凝胶电泳检测酶切产物，当酶切产物长度为1686bp时，ALS3基因型为纯合抗性类型；当酶切产物长度为1686bp、1492bp和194bp三种带型时，ALS3基因型为杂合型抗性类型；当酶切产物长度为1492bp和194bp时，ALS3基因型为纯合型敏感性类型(图4)。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂抗性突变体的应用及其方法
<130> 1911067
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1968
<212> DNA
<213> Brassica napus L.
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gtcagcgggt tagcagacgc gatgcttgac agtgttcctc ttgtcgccat tacaggacag 540
gtccctcgcc ggatgatcgg tactgacgcc ttccaagaga caccaatcgt tgaggtaacg 600
aggtctatta cgaaacataa ctatttggtg atggatgttg atgacatacc taggatcgtt 660
caagaagctt tctttctagc tacttccggt agacccggac cggttttggt tgatgttcct 720
aaggatattc agcagcagct tgcgattcct aactgggatc aacctatgcg cttacctggc 780
tacatgtcta ggttgcctca gcctccggaa gtttctcagt taggtcagat cgttaggttg 840
atctcggagt ctaagaggcc tgttttgtac gttggtggtg gaagcttgaa ctcgagtgaa 900
gaactgggga gatttgtcga gcttactggg atccccgttg cgagtacttt gatggggctt 960
ggctcttatc cttgtaacga tgagttgtcc ctgcagatgc ttggcatgca cgggactgtg 1020
tatgctaact acgctgtgga gcatagtgat ttgttgctgg cgtttggtgt taggtttgat 1080
gaccgtgtca cgggaaagct cgaggctttc gctagcaggg ctaaaattgt gcacatagac 1140
attgattctg ctgagattgg gaagaataag acacctcacg tgtctgtgtg tggtgatgta 1200
aagctggctt tgcaagggat gaacaaggtt cttgagaacc gggcggagga gctcaagctt 1260
gatttcggtg tttggaggag tgagttgagc gagcagaaac agaagttccc tttgagcttc 1320
aaaacgtttg gagaagccat tcctccgcag tacgcgattc agatcctcga cgagctaacc 1380
gaagggaagg caattatcag tactggtgtt ggacagcatc agatgtgggc ggcgcagttt 1440
tacaagtaca ggaagccgag acagtggctg tcgtcatcag gcctcggagc tatgggtttt 1500
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gatcggttct acaaagctaa cagagctcac acttatctcg gggacccggc aagggagaac 1740
gagatcttcc ctaacatgct gcagtttgca ggagcttgcg ggattccagc tgcgagagtg 1800
acgaagaaag aagaactccg agaagctatt cagacaatgc tggatacacc aggaccatac 1860
ctgttggatg tgatatgtcc gcaccaagaa catgtgttac cgatgatccc aagtggtggc 1920
actttcaaag atgtaataac agaaggggat ggtcgcacta agtactga 1968
<210> 2
<211> 1959
<212> DNA
<213> Brassica napus L.
<400> 2
atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60
cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa accctcctcc 120
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gaaaaaaccg acaagatcaa gactttcatc tcccgctacg ctcccgacga gccccgcaag 240
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gtcctccccc gtcacgaaca aggaggagtc ttcgccgccg agggttacgc tcgttcctcc 420
ggcaaaccgg gaatctgcat agccacttcg ggtcccggag ctaccaacct cgtcagcggg 480
ttagccgacg cgatgcttga cagtgttcct ctcgtcgcca tcacaggaca ggtccctcgc 540
cggatgatcg gtactgacgc gttccaagag acgccaatcg ttgaggtaac gaggtctatt 600
acgaaacata actatctggt gatggatgtt gatgacatac ctaggatcgt tcaagaagca 660
ttctttctag ctacttccgg tagacccgga ccggttttgg ttgatgttcc taaggatatt 720
cagcagcagc ttgcgattcc taactgggat caacctatgc gcttgcctgg ctacatgtct 780
aggctgcctc agccaccgga agtttctcag ttaggccaga tcgttaggtt gatctcggag 840
tctaagaggc ctgttttgta cgttggtggt ggaagcttga actcgagtga agaactgggg 900
agatttgtcg agcttactgg gatccctgtt gcgagtacgt tgatggggct tggctcttat 960
ccttgtaacg atgagttgtc cctgcagatg cttggcatgc acgggactgt gtatgctaac 1020
tacgctgtgg agcatagtga tttgttgctg gcgtttggtg ttaggtttga tgaccgtgtc 1080
acgggaaagc tcgaggcgtt tgcgagcagg gctaagattg tgcacataga cattgattct 1140
gctgagattg ggaagaataa gacacctcac gtgtctgtgt gtggtgatgt aaagctggct 1200
ttgcaaggga tgaacaaggt tcttgagaac cgggcggagg agctcaagct tgatttcggt 1260
gtttggagga gtgagttgag cgagcagaaa cagaagttcc cgttgagctt caaaacgttt 1320
ggagaagcca ttcctccgca gtacgcgatt caggtcctag acgagctaac ccaagggaag 1380
gcaattatca gtactggtgt tggacagcat cagatgtggg cggcgcagtt ttacaagtac 1440
aggaagccga ggcagtggct gtcgtcctca ggactcggag ctatgggttt cggacttcct 1500
gctgcgattg gagcgtctgt ggcgaaccct gatgcgattg ttgtggacat tgacggtgat 1560
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aagatactct tgttaaacaa ccagcatctt gggatggtca tgcaattgga agatcggttc 1680
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cctaacatgc tgcagtttgc aggagcttgc gggattccag ctgcgagagt gacgaagaaa 1800
gaagaactcc gagaagctat tcagacaatg ctggatacac ctggaccgta cctgttggat 1860
gtcatctgtc cgcaccaaga acatgtgtta ccgatgatcc caagtggtgg cactttcaaa 1920
gatgtaataa ccgaagggga tggtcgcact aagtactga 1959
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 23
<212> DNA
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<400> 4
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacatccaac aggtacggtc ca 22
Claims (6)
1.甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂抗性突变体的应用，其特征在于，以甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂抗性突变体5N为供体，以“沪油15”为轮回亲本，通过杂交、多次回交和自交，最终获得BC4F2，在每个后代群体中都通过喷施磺酰脲类除草剂筛选抗性单株，通过PCR检测SNP位点进行前景选择，并利用SSR标记筛选背景回复率趋近“沪油15”的植株，最终获得遗传背景回复率高于96％的具有“沪油15”优良农艺性状的抗除草剂油菜新品系。
2.利用甘蓝型油菜抗除草剂突变体选育抗除草剂油菜的方法，包括以下步骤：
a)以甘蓝型油菜抗除草剂突变体材料5N为母本，以甘蓝型油菜“沪油15”为父本杂交，F1代全部为抗性株R1r1R3r3，以F1代植株为母本，与“沪油15”回交获得BC1F1代群体，BC1F1群体中分离出1：1：1：1的敏感型植株r1r1r3r3、抗性植株R1r1r3r3、抗性植株r1r1R3r3和高抗性植株R1r1R3r3，通过在油菜四叶期喷施磺酰脲类除草剂，除去敏感型植株，并提取抗性株叶片DNA，通过PCR检测SNP位点鉴定得到R1r1R3r3抗性植株；
b)以步骤a)中的杂合抗性株R1r1R3r3为母本，继续与“沪油15”回交，获得BC2F1回交群体，通过喷施磺酰脲类除草剂，通过PCR检测SNP位点进行前景选择，并利用SSR标记筛选背景回复率趋近“沪油15”基因型为R1r1R3r3的抗性株，该种基因型植株占整个BC2F1群体的1/4，将该类型抗性株继续与“沪油15”进行连续回交至获得BC4F1群体；
从BC4F1群体中挑选背景回复率高于96％并具有磺酰脲类除草剂抗性且基因型为R1r1R3r3的株系，对这些植株进行套袋自交获得BC4F2代群体，喷施除草剂，通过PCR检测SNP位点进行前景选择，从BC4F2中挑选基因型为R1R1R3R3的抗性植株，该类型植株占整个BC4F2群体植株数量的1/16，利用SSR标记进行背景选择，筛选出背景回复率高于96％的基因型为R1R1R3R3的抗性植株，即为选育出的抗除草剂油菜。
3.根据权利要求2所述利用甘蓝型油菜抗除草剂突变体选育抗除草剂油菜的方法，其特征在于，在每一步骤中获得杂交后代之后通过喷施磺酰脲类除草剂和PCR检测SNP位点进行前景选择，筛选出抗除草剂的植株，接着利用SSR标记进行背景选择，筛选出背景回复率趋近“沪油15”基因型为R1r1R3r3的抗性株。
4.根据权利要求2所述利用甘蓝型油菜抗除草剂突变体选育抗除草剂油菜的方法，其特征在于，步骤a)中，获得四种基因型的BC1F1回交群体后，在油菜四叶期喷施目标除草剂，除去敏感型植株r1r1r3r3，之后通过PCR检测SNP标记筛选基因型为R1r1R3r3的高抗性植株，接着利用SSR标记进行背景选择，筛选出背景回复率趋近“沪油15”基因型为R1r1R3r3的抗性株。
5.根据权利要求3所述利用甘蓝型油菜抗除草剂突变体选育抗除草剂油菜的方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜抗除草剂突变体材料5N中，ALS1和ALS3两个基因均发生单位点突变，其中，在ALS1基因的编码序列中，第1676位碱基由G突变为T，具体核苷酸序列如SEQID NO.1所示；在ALS3基因的编码序列中，第1667位碱基由G突变为T，具体核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
6.根据权利要求4所述利用甘蓝型油菜抗除草剂突变体选育抗除草剂油菜的方法，其特征在于，通过PCR检测SNP位点时有两对引物，分别用于扩增ALS1和ALS3基因，两对引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
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