CN103215243A

CN103215243A - 甘蓝型油菜抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用

Info

Publication number: CN103215243A
Application number: CN2013101162282A
Authority: CN
Inventors: 刘东风; 王承旭; 唐晓艳; 邓兴旺
Original assignee: SHENZHEN XINGWANG BIOLOGICAL SEED INDUSTRY Co Ltd; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Current assignee: SHENZHEN JIETIAN MODEL BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.; Shenzhen Xingwang Biological Seed Industry Co.,Ltd.; Shenzhen Institute of Molecular Crop Design
Priority date: 2013-04-07
Filing date: 2013-04-07
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2033-04-07
Also published as: CN103215243B

Abstract

本发明公开了使植物具有除草剂抗性的ALS蛋白质序列及其应用，其衍生自甘蓝型油菜品种中双9号的突变株，其氨基酸序列如SEQIDNO：2、4、6、8、10或12所示。另外，本发明还提供了相应的核酸、表达盒、载体、细胞、植物、获得具有除草剂抗性的植物的应用和方法、以及鉴定本发明的植物的方法。

Description

甘蓝型油菜抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用

技术领域

本发明属于植物蛋白质领域，具体而言，本发明涉及能赋予植物（尤其是油菜）除草剂抗性（耐受性）的蛋白及其在植物育种中的应用。

背景技术

农田中杂草是影响农作物产量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力资源和成本很高，而且不便于农业集约化生产，严重制约了农作物种植向高产、优质和低成本方向的发展进程。因此，除草剂就应运而生，其使用为解决农田草害、促进栽培方式的革新及增产起了很大的作用。

常见的除草剂，包括有磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类等除草剂，目前已经大面积商业推广使用。然而，由于这些除草剂通常也能杀死农作物本身，因此对一般不具有除草剂抗性（耐受性）的农作物而言，除草剂的使用在时间和空间上受到了极大限制，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂。

为此，人们研究开发具有除草剂抗性（耐受性）的植物（农作物），这样可以在种植期间使用除草剂，杀死杂草，但不影响植物本身的生长，由此拓宽了除草剂的使用范围。尽管当前有不少文献报道在某些基因上进行突变再导入野生型植物成为转基因植物，可以给植物带来除草剂抗性，但是实验多针对拟南芥等遗传背景比较清楚的模式植物，但是对于实际种植的农作物，尤其是经过大量前期转基因和/或非转基因育种获得的具有良好性状（同时遗传背景复杂）的农作物来说，往往情况很不乐观，如我们发现，在体外和/或拟南芥导入测试具有除草剂抗性的突变基因，导入植株等后却发生大量发生了回复丧失除草剂抗性的情况，有些虽然保留了除草剂抗性，但是植株生长发育不正常而根本无法实践中应用，这很可能是由于植株中大量基因协同作用的结果。所以，对于复杂遗传背景的植物（如油菜，尤其是改良过的油菜），具有除草剂抗性的植物及其真实能起决定性的物质（如蛋白、基因等）目前还没有理论来定向设计出，只能依赖于科研人员艰苦实践而获得，尤其是依赖长期筛选，并且凭借一些运气才能获得。对于四倍体的植物来说，情况更为复杂。

本发明人正是经过长期而艰苦的研究实践，凭借运气偶然地利用灭草烟在油菜中双9号突变植株中发现了一系列（突变）蛋白，其能够在除草剂存在的条件下基本保持原有蛋白的正常植物生理功能，从而使得油菜（尤其是中双9号）具有除草剂抗性（耐受性）。本发明人还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，如油菜等。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的使植物具有除草剂抗性的蛋白质，弥补原有专利或技术的不足。另外，本发明还提供了编码这些蛋白质的核酸以及基因工程中间体（如，表达盒、载体和细胞等），获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用，并且提供了判断植物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。

具体而言，在第一方面，本发明提供了使植物具有除草剂抗性的ALS突变蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示。该蛋白质能使植物（如油菜，尤其是中双9号）具有除草剂抗性。在本文中，ALS就是乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase）的简称，其酶分类编号为EC4,1.3.18。乙酰乳酸合成酶是支链氨基酸合成中的一个关键酶，如在缬氨酸和亮氨酸的合成中催化丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在异亮氨酸的合成中催化丙酮酸与丁酮酸生成2-乙醛基-2-羟基丁酸（James C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2006. ISAAA Briefs. Ithaca, NY）。

油菜是四倍体植物，其基因组具有五个ALS基因，但是在我们的实验中发现两个基因的突变能够导致除草剂抗性，这两个分别是ALS1和ALS3，ALS1的氨基酸序列如GenBank登录号GU192448所示，ALS3的氨基酸序列如GenBank登录号AB618066.1所示，这两个基因在本文中被称为“野生型”的ALS，其不具有除草剂抗性。本发明提供的的蛋白质的氨基酸序列是在野生型ALS1的氨基酸序列上带有Ala107、Ala190、Trp559和/或Ser638突变，和/或，在野生型ALS3的氨基酸序列上带有Ala104和/或Trp179突变。在本文中，中双9号是中国农业科学院油料作物研究所培育的非转基因油菜品种，其来源是中油821/双低油菜品系84004//中双4号变异株系，已经商业推广，其品种审定编号为国审油2005014。本发明人发现中双9号可以通过灭草烟实验而筛选出抗咪草烟突变植株。

本发明第一方面的蛋白质是经过大量筛选才终于从本发明人突变的油菜植株（如，中双9号）中发现的，能使相应植株具有除草剂抗性。目前，还没有报道表明，在来自油菜的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12所示的突变蛋白，会使得相应植物（尤其是油菜）具有除草剂抗性，更无法预测在保持除草剂抗性的同时，还能保持正常的生长情况。

除了本发明具体实施方式所述的突变植株筛选和扩增方法之外，在蛋白质序列已知的情况下，本领域技术人员有能力通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入表达载体，就可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的蛋白质，这些方法记载于《分子克隆实验指南》（北京：科学出版社，2002年）等文献中。通过转基因技术，编码这些蛋白质的基因可以导入植物中，优选导入油菜中，例如导入（野生型）中双9号中，从而赋予植物抗除草剂性能。

目前，以抑制ALS为靶位的除草剂包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类等除草剂（Peter Babczinski, Thomas Zelinski. Mode of action herbicidal ALS-inhibitors on acetolactate synthase from green plant cell cultures，yeast，and Escherichia coli. Pesticide science, 1991, 31: 305-323; 郑培忠, 沈健英. 乙酰乳酸合成酶抑制剂的种类及其耐药性研究进展. 杂草科学, 2009, 2: 4-8）。因此，在本文中，除草剂抗性指的是对包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类在内的除草剂具有耐受性。优选在本发明中，除草剂是咪唑啉酮类除草剂，如在本发明的具体实施方式中，除草剂是灭草烟（其化学名称为3-吡啶羧酸-2-[4,5-二氢-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧-1H-咪唑-2-基]酯，其CAS号为81334-34-1）。即优选在本发明中，除草剂抗性是咪唑啉酮类除草剂抗性，更优选是灭草烟抗性。

在第二方面，本发明提供了核酸，其编码本发明第一方面的蛋白质。在本文中，核酸可以是DNA，也可以是RNA，优选是DNA。在知晓所编码蛋白序列或核酸序列的前提下，通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率，运用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，本领域技术人员有能力获得并优化编码本发明第一方面的蛋白质的核酸。一旦获得该核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。优选本发明第二方面的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或3或5或7或9或11所示。

在第三方面，本发明提供了表达盒（cassette），其包含本发明第二方面的核酸。本发明第三方面的表达盒优选在5’-3’的转录方向上包含启动子区、本发明第二方面的核酸和转录和翻译的终止区。本发明第三方面的表达盒优选适合在植物中表达本发明第二方面的核酸。示例性的启动子包括来自CaMV 35S启动子或烟草花叶病毒(TMV) Ω元件的启动子；示例性的转录和翻译的终止区包括转录终止元件或多聚腺苷酸化信号等。本发明第三方面的表达盒还可以包括，在细菌中复制所需的复制起点（例如，来自pBR322或P15A ori的ORI区），土壤杆菌T-DNA转移所需要的元件（例如，T-DNA的左边界和/或右边界），从而方便从细菌往植物中的转化过程。另外，本发明第三方面表达盒还可以包含增强子、内含子、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等，例如来自TMV或苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列等作为增强子。

在第四方面，本发明提供了载体，其包含本发明第二方面的核酸。在本文中，载体是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。根据所应用的目的不同，载体可以分为克隆载体、表达载体和转化载体，指的是所使用的目的分别针对克隆并验证基因、表达相应基因和将相应基因转化。本发明中可用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体（原核表达载体）、在酵母中表达用的载体（如毕赤酵母载体）、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体（痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等）、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。本发明第四方面的载体是转化载体，尤其是植物转化载体，特别是适合农杆菌转化植物的载体。这些载体很多已经商品化了。

在第五方面，本发明提供了细胞，其包含本发明第二方面的核酸。细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。在本文中，植物细胞指的是来自植物的细胞（可以包括细胞群，但优选是单个细胞），但是这些细胞不能仅仅借助光合作用而以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来发育成存活的单个植株。植物细胞可以是必须使用有机物（如某些植物激素）才能发育的植物细胞或细胞群，也可以是完全无发育成植株能力的植物细胞或细胞群，通俗地说，即死亡的植物细胞或细胞群，如榨油后的菜饼等。

本发明的第二方面的核酸可被插入转化进细胞中的任何载体中。优选的细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存核酸、或是用于转化植物细胞的细菌细胞，例如农杆菌、大肠杆菌，包括根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌等。另外优选的细胞是植物细胞，优选是油菜细胞，更优选是中双9号细胞，所述植物细胞中包含的本发明第二方面的核酸可以是通过转基因技术导入植物细胞的，包括导入到植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中，也可以是通过突变技术（如本发明具体实施方式所述的技术）使得本发明第二方面的核酸存在于植物细胞中的。

在第六方面，本发明提供了植物，其包含本发明第二方面的核酸，和/或其表达本发明第一方面的蛋白质。由于引入了本发明第二方面的核酸和本发明第一方面的蛋白质，本发明第六方面的植物具有除草剂抗性。在本文中，植物指的是借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物就能合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的单个植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品种、植株、植物事件、植物后代、植物种子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通过转基因技术产生的植物后代、与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代。

本发明第六方面的植物可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。示例性的植物包括油菜、玉米、小麦、黑麦、燕麦、大麦、大豆、马铃薯、油菜、甜菜、甘蔗、高粱、西红柿、南瓜、辣椒、生菜、向日葵、咖啡、茶、棉花、苜蓿、烟草、或拟南芥等。在本发明的具体实施方式中，优选本发明第六方面的植物是油菜，更优选是中双9号。其中，中双9号是中国农业科学院油料作物研究所培育的非转基因油菜品种，其来源是中油821/双低油菜品系84004//中双4号变异株系，已经商业推广，其品种审定编号为国审油2005014。本发明优选的植物，可以继承了中双9号高产、抗病、优质等特性，并带来除草剂抗性，尤其是咪唑啉酮类除草剂抗性，特别是灭草烟抗性。当然，如在本发明的具体实施方式中，拟南芥也是可选的植物品种。

在第七方面，本发明提供了前述各方面在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用。在获得具有除草剂抗性的植物过程中，可以应用到本发明前述各方面。本发明第七方面所提供的包括，本发明第一方面的蛋白质在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第二方面的核酸在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第三方面的表达盒在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第四方面的载体在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第五方面的细胞在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用，本发明第六方面的植物在获得具有除草剂抗性的植物过程中的应用。优选在本发明的第七方面中，除草剂是咪唑啉酮类除草剂，优选是灭草烟。

在本文中，获得包括制备、培育、生产或以其他方式产生得到，包括通过转基因育种方式获得，如将本发明第二方面的核酸转化入植物后使之表达本发明第一方面的蛋白质；也包括通过非转基因育种方式获得，如通过杂交、回交、自交或无性繁殖本发明第六方面的植物并分选出仍旧包含本发明第二方面的核酸并表达本发明第一方面的蛋白质的植物。因此，本发明的第七方面提供的应用包括，在获得具有除草剂抗性的转基因植物过程中的应用和在获得具有除草剂抗性的非转基因植物过程中的应用。

在第一个独立的方面，本发明提供了（野生型）中双9号在获得具有除草剂抗性的植物（如，油菜）中的应用，优选是在获得包含本发明第二方面的核酸和/或表达本发明第一方面的蛋白质的具有除草剂抗性的油菜中的应用。中双9号本身具有优良的性状，但是更重要的是，本发明人发现，对它的种子用化学诱变剂处理后用除草剂灭草烟进行筛选，能够获得具有除草剂抗性的油菜，而针对其他品种或使用其他除草剂的筛选则困难。

在第八方面，本发明提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法，其包括如下步骤：

（1）使植物包含本发明第二方面的核酸；和/或，

（2）使植物表达本发明第一方面的蛋白质。

优选在本发明第八方面的方法中，植物是油菜，更优选是中双9号。当然，如在本发明的具体实施方式中，拟南芥也是可选的植物品种。

可以采用前述或者本领域技术人员能获知的转基因和非转基因方法，使植物包含本发明第二方面的核酸，或者使植物表达本发明第一方面的蛋白质。实施本发明第八方面的方法，能够获得本发明第六方面的植物。优选在本发明的第八方面中，可以采用的步骤包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖步骤。这些步骤本身对于转基因或非转基因育种领域的技术人员来说，都是可以获知并实施的。

在第九方面，本发明提供了鉴定本发明第六方面的植物或者本发明第八方面的方法获得的植物的方法，其包括如下步骤：

（1）测定所述植物是否包含本发明第二方面的核酸；和/或，

（2）测定所述植物是否表达本发明第一方面的蛋白质。

通过该方法，可以判断植物是否属于本发明的植物，即是否属于本发明第六方面的植物，或者是否属于本发明第八方面的方法获得的植物。测定的步骤可以通过常规的核酸检测和/或蛋白质检测方法来进行，只需要能够检测出蛋白质或其编码核酸带有前述非天然存在的突变或其相应核酸突变的方法都可以，优选能够检测出蛋白质或其编码核酸带有如SEQ ID NO：2、4、6、7、8、10或12所示的突变蛋白或其相应核酸突变的方法。示例性的方法包括蛋白质测序、核酸测序、聚合酶链式反应（PCR）检测、探针杂交检测等。

本发明取得的有益效果在于获得可替代现有技术的使植物具有除草剂抗性的蛋白质、核酸、表达盒、载体、细胞、植物、获得具有除草剂抗性的植物的应用和方法、以及鉴定本发明的植物的方法，并且可以通过转基因或非转基因方法获得具有除草剂抗性的植物品种，尤其是油菜品种。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的了。

附图说明

图1示例性地显示了抗咪唑啉酮类除草剂的油菜突变植株的照片。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。例如，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^rd edition)》（Sambrook，J.，Russell, David W.， 2001，Cold Spring Harbor），《Plant Propagation by Tissue Culture》(Edwin F. George,Michael A. Hall,Geert-Jan De Klerk, 2008, Springer)。

实施例1 从中双9号突变植株中提取抗咪唑啉酮类除草剂的蛋白突变体

播种各品种/品系油菜种子，其中包括中双9号（可购自中国农业科学院油料作物研究所）。播种前将各品种/品系油菜种子在25℃培养箱中用水浸泡22小时后，将种子捞出，控干水分。然后，用0.4%（w/w）甲磺酸乙酯（EMS）浸泡各油菜种子，浸泡12小时，期间每1小时摇动一次种子。12小时后弃去EMS 溶液，换自来水浸泡种子，弃自来水，浸泡共重复5次，每次浸泡5 分钟，然后用自来水冲洗种子2小时，冲洗过程中翻动种子，从而将EMS洗净。取少量种子放在湿纸表面，放入28℃培养箱中，测定发芽率为60~70%，剩余的种子播种于大田。待植株成熟后分地块收割，每个地块面积30平方米，同一品种/品系的种子混收，晾干至含水量8%。将收割的种子分别用咪唑啉酮类除草剂“灭草烟”（3-吡啶羧酸-2-[4,5-二氢-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧-1H-咪唑-2-基]酯，CAS号81334-34-1）水剂（浓度为0.345%，购自山东先达化工有限公司）浸泡处理10 h后播种，20天后调查秧苗生长情况，有6株秧苗已长出真叶（图 1），确认它们均为来自中双9号的抗咪唑啉酮类除草剂的突变株。保留并繁殖这些绿色秧苗，这些植株均能够正常生长发育，其余油菜均死亡。

取上述中双9号突变植株的叶片，连同野生型的中双9号植株叶片，分别提取它们的基因组DNA，委托深圳华大基因研究院进行测序，发现：相对于野生型中双9号, 突变植株的乙酰乳酸合成酶（ALS）基因分别有6种不同的变异。突变植株1在乙酰乳酸合成酶（ALS）基因的第1913位点发生突变，由G变为A，导致相应编码蛋白的第638位由丝氨酸变为天冬酰胺，即中双9号突变植株1的ALS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；中双9号突变植株2在乙酰乳酸合成酶（ALS1）基因的第569位点发生突变，由C变为T，导致相应编码蛋白的第190位由丙氨酸变为缬氨酸，即中双9号突变植株2的ALS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；中双9号突变植株3在乙酰乳酸合成酶（ALS1）基因的第319位点发生突变，由G变为A，导致相应编码蛋白的第107位由丙氨酸变为苏氨酸，即中双9号突变植株3的ALS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。相对于野生型中双9号，中双9号突变植株4在ALS基因的第1775位点发生突变，由G变为T，导致相应编码蛋白的第559位由色氨酸变为半胱氨酸，即中双9号突变植株4的ALS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，其编码的ALS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；中双9号突变植株5在乙酰乳酸合成酶（ALS3）基因的第311位点发生突变，由C变为T，导致相应编码蛋白的第104位由丙氨酸变为缬氨酸，即中双9号突变植株5的ALS3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；中双9号突变植株6在乙酰乳酸合成酶（ALS3）基因的第536位点发生突变，由G变为T，导致相应编码蛋白的第179位由脯氨酸变为亮氨酸，即中双9号突变植株6的ALS3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

实施例2 蛋白突变体的抗咪唑啉酮类除草剂的离体活性测定

参照Fan ZJ等的方法（Specific activity determination of acetolactate synthase from maize（Zea mays L.）. 参见Han WN等编. The Proceedings of the 18 th Asia-Pacific Weed Science Society Conference . 515 - 522 . May 28 -June 2，2001 . Beijing：Standards Press of China.），提取上述中双9号的野生型和突变植株的ALS酶，并测定相应酶活性被咪唑啉酮类除草剂抑制的比率。过程简而言之，分别取各植株苗5g切碎后，加入10 mL pH 7的50 mmol/L K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液（其中含1 mmol/L丙酮酸钠，0.5 mmol/L MgCl₂，0.5 mmol/L TPP，10μmol/L FAD），用石英砂研磨粉碎后用8 层纱布过滤，滤液于4℃、20000rpm离心30分钟。取上清液，加入硫酸铵使之达到50%饱和度，然后0℃放置2小时后，于4℃、20000rpm离心30分钟。弃上清液，将沉淀溶解于5mL pH 7的50 mmol/L K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液（其中含20mmol/L丙酮酸钠，0.5 mmol/L MgCl₂），分别得各植株的ALS酶液。将0.1mL 0.345%“灭草烟”水剂（对照用水替代）、0.5mL 酶反应液（其中含24 mmol/L丙酮酸钠，0.6 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L TPP，20μmol/L FAD，50 mmol/L K₂HPO₄-KH₂PO₄，pH 7）和0.4 mL ALS酶液混合，与35℃避光静置反应1小时，然后加入0.1mL 3mol/L硫酸终止反应，于60℃放置15分钟脱羧。然后加入显色剂（0.5ml 0.5%（w/w）肌酸和0.5 ml 5%（w/w）α-萘酚的混合溶液（溶于2.5mol/L的NaOH 溶液））于60℃放置15分钟显色，测定525 nm 处的吸光度。将加入对照的野生型中双9号的ALS酶活性分别记为100%，计算咪唑啉酮类除草剂对中双9号的野生型和突变ALS酶的活性的影响。

结果如下表所示，中双9号的突变ALS酶都基本保持了野生型ALS酶的活性，而且在存在咪唑啉酮类除草剂的情况下，野生型ALS酶的活性都有十分显著的下降，而突变ALS酶却都基本保持了原有酶活性，表明突变ALS酶能够带来抗咪唑啉酮类除草剂的性能。

咪唑啉酮类除草剂对中双9号的野生型和突变ALS酶活性的影响表

除草剂浓度	0	0.345%
			野生型ALS的相对酶活性	100%	5%
突变植株1的ALS的相对酶活性	99%	76%
			突变植株2的ALS的相对酶活性	98%	70%
突变植株3的ALS的相对酶活性	97%	80%
			突变植株4的ALS的相对酶活性	102%	88%
突变植株5的ALS的相对酶活性	98%	70%
			突变植株6的ALS的相对酶活性	97%	67%

实施例3转蛋白突变体基因的转基因植物的获得

用常规的农杆菌介导法将上述中双9号的突变ALS酶的编码基因分别转入野生型拟南芥植株。过程简而言之，利用正向引物（5’ -catcatctctctctcctctaaccatggc -3’）和反向引物（5’ - CCAGCTTCATCTCTCAGTACTTAG -3’），分别从上述中双9号的突变植株的基因组DNA中PCR扩增出突变ALS基因，测序正确后，将核苷酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、7、9和11所示的ALS基因克隆入pCAMBIA1303质粒（购自Cambia公司）中，挑选阳性克隆转化农杆菌EHA105，培养菌体并转化拟南芥，PCR鉴定转化阳性的拟南芥收种后得到T1代的转基因种子，种植时用咪唑啉酮类除草剂“灭草烟”水剂喷雾处理，发现生长状态良好，而未转基因的拟南芥苗枯死。

序列表（SEQUENCE LISTING）

<110> 深圳兴旺生物种业有限公司；深圳市作物分子设计育种研究院

<120> 甘蓝型油菜抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1968

<212> DNA

<213> 油菜

<400> 1

atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60

cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa agactcctcc 120

cgtctccacc gtcctctcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180

ccttcccctg aaaaaaccga caagaacaag actttcgtct cccgctacgc tcccgacgag 240

ccccgcaagg gtgctgatat cctcgtcgaa gccctcgagc gtcaaggcgt cgaaaccgtc 300

tttgcttatc ccggaggtgc ttccatggag atccaccaag ccttgactcg ctcctccacc 360

atccgtaacg tccttccccg tcacgaacaa ggaggagtct tcgccgccga gggttacgct 420

cgttcctccg gcaaaccggg aatctgcata gccacttcgg gtcccggagc taccaacctc 480

gtcagcgggt tagcagacgc gatgcttgac agtgttcctc ttgtcgccat tacaggacag 540

gtccctcgcc ggatgatcgg tactgacgcc ttccaagaga caccaatcgt tgaggtaacg 600

aggtctatta cgaaacataa ctatttggtg atggatgttg atgacatacc taggatcgtt 660

caagaagctt tctttctagc tacttccggt agacccggac cggttttggt tgatgttcct 720

aaggatattc agcagcagct tgcgattcct aactgggatc aacctatgcg cttacctggc 780

tacatgtcta ggttgcctca gcctccggaa gtttctcagt taggtcagat cgttaggttg 840

atctcggagt ctaagaggcc tgttttgtac gttggtggtg gaagcttgaa ctcgagtgaa 900

gaactgggga gatttgtcga gcttactggg atccccgttg cgagtacttt gatggggctt 960

ggctcttatc cttgtaacga tgagttgtcc ctgcagatgc ttggcatgca cgggactgtg 1020

tatgctaact acgctgtgga gcatagtgat ttgttgctgg cgtttggtgt taggtttgat 1080

gaccgtgtca cgggaaagct cgaggctttc gctagcaggg ctaaaattgt gcacatagac 1140

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1 5 10 15

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Leu Thr Pro Gln Lys Asp Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

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Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu

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Lys Thr Asp Lys Asn Lys Thr Phe Val Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu

65 70 75 80

Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly

85 90 95

Val Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His

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Gln Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His

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<210> 9

<211> 1959

<212> DNA

<213> 油菜

<400> 9

atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60

cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa accctcctcc 120

cgtctccacc gtccactcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180

gaaaaaaccg acaagatcaa gactttcatc tcccgctacg ctcccgacga gccccgcaag 240

ggtgctgata tcctcgtgga agccctcgag cgtcaaggcg tcgaaaccgt cttcgcttat 300

cccggaggtg tttccatgga gatccaccaa gccttgactc gctcctccac catccgtaac 360

gtcctccccc gtcacgaaca aggaggagtc ttcgccgccg agggttacgc tcgttcctcc 420

ggcaaaccgg gaatctgcat agccacttcg ggtcccggag ctaccaacct cgtcagcggg 480

ttagccgacg cgatgcttga cagtgttcct ctcgtcgcca tcacaggaca ggtccctcgc 540

cggatgatcg gtactgacgc gttccaagag acgccaatcg ttgaggtaac gaggtctatt 600

acgaaacata actatctggt gatggatgtt gatgacatac ctaggatcgt tcaagaagct 660

ttctttctag ctacttccgg tagacccgga ccggttttgg ttgatgttcc taaggatatt 720

cagcagcagc ttgcgattcc taactgggat caacctatgc gcttgcctgg ctacatgtct 780

aggctgcctc agccaccgga agtttctcag ttaggtcaga tcgttaggtt gatctcggag 840

tctaagaggc ctgttttgta cgttggtggt ggaagcttga actcgagtga agaactgggg 900

agatttgtcg agcttactgg gatccctgtt gcgagtacgt tgatggggct tggctcttat 960

ccttgtaacg atgacttgtc cctgcagatg cttggcatgc acgggactgt gtatgctaac 1020

tacgctgtgg agcatagtga tttgttgctg gcgtttggtg ttaggtttga tgaccgtgtc 1080

acgggaaagc tcgaggcgtt tgcgagcagg gctaagattg tgcacataga cattgattct 1140

gctgagattg ggaagaataa gacacctcac gtgtctgtgt gtggtgatgt aaagctggct 1200

ttgcaaggga tgaacaaggt tcttgagaac cgggcggagg agctcaagct tgatttcggt 1260

gtttggagga gtgagttgag cgagcagaaa cagaagttcc cgttgagctt caaaacgttt 1320

ggagaagcca ttcctccgca gtacgcgatt caggtcctag acgagctaac ccaagggaag 1380

gcaattatca gtactggtgt tggacagcat cagatgtggg cggcgcagtt ttacaagtac 1440

aggaagccga ggcagtggct gtcgtcctca ggactcggag ctatgggttt cggacttcct 1500

gctgcgattg gagcgtctgt ggcgaaccct gatgcgattg ttgtggacat tgacggtgat 1560

ggaagcttca taatgaacgt tcaagagctg gccacaatcc gtgtagagaa tcttcctgtg 1620

aagatactct tgttaaacaa ccagcatctt gggatggtca tgcaatggga agatcggttc 1680

tacaaagcta acagagctca cacttatctc ggggacccgg caagggagaa cgagatcttc 1740

cctaacatgc tgcagtttgc aggagcttgc gggattccag ctgcgagagt gacgaagaaa 1800

gaagaactcc gagaagctat tcagacaatg ctggatacac ctggaccgta cctgttggat 1860

gtcatctgtc cgcaccaaga acatgtgtta ccgatgatcc caagtggtgg cactttcaaa 1920

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<210> 10

<211> 652

<212> PRT

<213> 油菜

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<211> 652

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<213> 油菜

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Claims

1.ALS突变蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4或6或8或10或12所示。

2.权利要求1所述的蛋白质，其中除草剂是咪唑啉酮类除草剂，优选是灭草烟。

3.权利要求1或2所述的蛋白质，其来自油菜，如甘蓝型油菜，如中双9号。

4.核酸，其编码权利要求1~3之任一所述的蛋白质，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或3或5或7或9或11所示。

5.表达盒、载体或细胞，其包含权利要求4所述的核酸。

6.权利要求1~3之任一所述的蛋白质、权利要求4所述的核酸、权利要求5所述的表达盒、载体或细胞、包含权利要求4所述的核酸的植物、表达权利要求1~3之任一所述的蛋白质的植物、或者中双9号在获得具有除草剂抗性的植物中的应用，优选其中除草剂是咪唑啉酮类除草剂，优选是灭草烟。

7.获得具有除草剂抗性的植物的方法，其包括如下步骤：

（1）使植物包含权利要求4所述的核酸；或，

（2）使植物表达权利要求1~3之任一所述的蛋白质。

8.权利要求7所述的方法，其包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖步骤。

9.权利要求6或7所述的应用或方法，其中所述植物是油菜。

10.鉴定植物的方法，其中植物是包含权利要求4所述的核酸的油菜、表达权利要求1~3之任一所述的蛋白质的油菜、或者权利要求7、8或9所述的方法获得的植物（如，油菜），其包括如下步骤：其包括如下步骤：

（1）测定所述植物是否包含权利要求4所述的核酸；或，

（2）测定所述植物是否表达权利要求1~3之任一所述的蛋白质。