CN105624177A - 一种抗虫融合基因、编码蛋白、载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗虫融合基因、编码蛋白、载体及其应用，所述抗虫融合基因是将编码BT杀虫晶体蛋白Cry1Ab的核苷酸序列和编码BT营养期杀虫蛋白Vip3A的核苷酸序列用连接肽编码基因连接构成；所述连接肽氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1所示；本发明所述抗虫融合蛋白杀虫活性提高，杀虫谱更广。本发明的杀虫蛋白质可以杀灭粘虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾等水稻、玉米的主要鳞翅目害虫。此外，本发明所述抗虫融合蛋白还可以有效减缓害虫抗性的发生。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种抗虫融合基因及其应用。
(二)背景技术
害虫给全球农业生产带来每年约80亿美元的损失，害虫的防治目前主要依靠使用化学农药，但是农药的残留会对人体健康和环境带来不良影响。利用生物技术方法培育含有抗虫基因的转基因抗虫农作物，可以大幅度降低化学杀虫剂的使用，有效保护农作物免受害虫为害，目前转基因抗虫玉米、棉花等已经大量推广种植。
转基因作物抗虫的关键技术是获得性能优良的杀虫蛋白质，杀虫蛋白质有多种。比较常用的是BT杀虫晶体蛋白，如Cry1Ab、Cry1C等，它们已被大量运用于转基因抗虫作物；近年来在BT中发现的另一种营养期杀虫蛋白也被证明具有较好的抗虫活性，如Vip1A、Vip3A等。单个杀虫毒素往往杀虫谱比较窄，杀虫活性有限；同时，长期大量地使用单一的杀虫蛋白质，还可能引起害虫抗性的产生和发展。因此，获得高杀虫活性的新型蛋白质杀虫毒素，对提高杀虫能力和减缓害虫抗性的发生具有重要的应用价值。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种具有高杀虫能力的抗虫融合蛋白、编码基因及其应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种抗虫融合基因，所述抗虫融合基因是将编码BT杀虫晶体蛋白Cry1Ab的核苷酸序列(SEQIDNO:4所示)和编码BT营养期杀虫蛋白Vip3A的核苷酸序列(SEQIDNO:5所示)用连接肽编码基因从5’-3’依次连接构成；所述连接肽氨基酸序列为SEQIDNO:1所示，核苷酸序列为SEQIDNO:6所示。
进一步，所述抗虫融合基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2所示。
本发明还提供一种所述抗虫融合基因编码蛋白，所述抗虫融合基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:3所示，融合蛋白从N端至C端依次为Cry1Ab蛋白、连接肽和Vip3A蛋白。
本发明还涉及一种所述抗虫融合基因构建的重组载体。
本发明提供一种所述抗虫融合基因在制备抗虫植物细胞中的应用，所述植物为单子叶植物，优选为水稻、玉米、小麦或高粱。
本发明还提供一种所述抗虫融合基因在制备抗虫剂中的应用，所述抗虫剂为鳞翅目幼虫抗虫剂，包括粘虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫或甜菜夜蛾。
本行业的技术人员均知道以下理论：
1)两个抗虫基因的简单融合并不是都能够增强杀虫能力的。例如Cry1Ab和Cry1Ca的融合蛋白质的杀虫能力比相同重量的单独Cry1Ab和Cry1Ca的混合物的杀虫能力还要低。
2)即使两个单独蛋白质组合使用具有增效作用，但也并不能得出它们的混合蛋白具有高效杀虫能力。这是因为：在蛋白质生物化学上，两个单独蛋白质的物理混合与融合是不同的，不能根据物理混合所具有的增效作用来肯定融合后所获得的增效作用；且在不同位置融合所得的融合蛋白的活性是大相径庭的。
3)Vip3A基因单独转入植物可能对转基因植物产生一定毒性。在获得的高表达Vip3A蛋白的转基因作物中，该蛋白由于信号肽的分泌作用大量聚集并结合在植物细胞膜上并形成孔道，从而对植物细胞形成一定的损坏，影响植株生长发育，同时转基因植株的抗虫活性也不高。
本发明所设计的以一段24个氨基酸为连接肽、将Cry1Ab蛋白和Vip3A蛋白融合成人工蛋白质分子。24个氨基酸的连接肽来自于单子叶植物玉米(Zeamays)，是玉米几丁质酶(Chitinase)中的一段短肽。几丁质是真菌细胞壁、昆虫外壳的重要组成部分。几丁质酶(Chitinase)是一种广泛存在于植物中的内源性蛋白质，具有抵御病原性真菌、食草昆虫等重要作用。几丁质酶可以将几丁质链随机切割，从而达到自我保护的作用(Shoresh,2008)。玉米几丁质酶是一段长度为283个氨基酸的蛋白质，它有两个功能域(domain)，分别是几丁质结合功能域(chitin-bindingdomain,CBD)以及几丁质酶催化功能域(catalyticdomainofchitinase)(Zshen,1998)。在这两段功能域之间有一段短肽，其本身并非相邻两个功能域的任何一部分、无活性结构，它将两段功能域连接起来，使这两个功能域能够有效地发挥活性。本发明中所使用的连接肽即该段短肽，它由玉米基因组中的几丁质酶基因编码而来，可以将两个独立的蛋白质有效连接成为一个融合蛋白质、同时该蛋白具有这两个蛋白质的功能。
与Cry1Ab和Vip3A蛋白的物理混合相比，本发明方法具有如下优点：本发明所述抗虫融合蛋白杀虫活性提高，杀虫谱更广。本发明的杀虫蛋白质可以杀灭粘虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾等水稻、玉米的主要鳞翅目害虫。此外，本发明所述抗虫融合蛋白还可以有效减缓害虫抗性的发生。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology，和J.Sambrook等编写的ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdED.等文献均有详细的说明。
实施例1、Cry1Ab-Vip3A融合基因的构建
由上海生工人工合成抗虫基因Cry1Ab核苷酸序列为SEQIDNO:4，Vip3A核苷酸序列为SEQIDNO:5和连接肽CL核苷酸序列为SEQIDNO:6。将抗虫基因Cry1Ab和Vip3分别克隆到表达载体pET28a(Novagen，69864-3，美国)中限制性内切酶BamHI和SacI的位点之间，得到的载体分别命名为pET-1Ab和pET-v3。
Cry1Ab-Vip3A构建过程：Cry1Ab片段由BamHI和XmaI酶切pET-1Ab获得，Vip3A片段由XmaI和SacI酶切pET-v3获得。载体pET28a经过BamHI和SacI酶切以后，与Cry1Ab及Vip3A连接，得到载体pET-1Ab-v3。用XmaI单酶切载体pET-1Ab-v3，与CL连接，得到载体pET-1Ab-CL-v3。这个载体包含一个融合基因，Cry1Ab-Vip3A(如SEQIDNO:2)，其编码一个氨基酸序列为SEQIDNO:3的融合蛋白质。
实施例2、杀虫蛋白质的制备
将实施例1方法制备的包含抗虫基因的载体pET-1Ab、pET-v3、pET-1Ab-v3、pET-1Ab-CL-v3分别导入BL21(DE3)细胞系(Escherichiacoli)，在包含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜培养，选取单克隆。单个菌落接种到100毫升LB培养液，在37℃中振荡培养至OD600＝0.6，然后加入IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)至0.5mM，并继续在同样的条件下培养4小时。培养液经过5000g离心10分钟沉淀大肠杆菌细胞，然后弃上清收集沉淀。沉淀中加30毫升20mMTris-HCl缓冲液，超声粉碎，获得重组蛋白质占总蛋白的含量达到60％以上的破碎混合液，用来进行杀虫活性的测定。上述LB培养液的配方为：每升含蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，溶解于双蒸水中，高温高压灭菌15分钟；若配制固体培养基，则每升中再加入15g琼脂。
实施例3、在大肠杆菌中表达的抗虫蛋白的抗虫活性测定
实施例2所得的抗虫蛋白(即破碎混合液)各200微升单独或混合在1平方厘米昆虫人工饲料的表面，饲养新生一龄幼虫用以进行抗虫活性测定。阴性对照的准备方法与实施例2相同，但质粒为不含任何插入DNA的pET28a载体本身。饲养7天后统计杀虫率，结果如表1所示：
表1、Cry1Ab-Vip3A的杀虫率
实施例4、农杆菌转化T-DNA载体的构建：
农杆菌转化T-DNA载体是基于pCambia1300(NCBI序列编号AF234296)载体而构建的。编码抗虫蛋白的合成核苷酸序列Cry1Ab-CL-Vip3A(SEQIDNO:2，5’端被设计上BamHI位点，3’端被设计上SacI位点，BamHI-SacI酶切片段)与玉米的pepc终止子(SEQIDNO:7，5’端被设计上SacI位点，3’端被设计上KpnI位点，SacI-KpnI片段)连接，获得包括基因和终止子的BamHI-KpnI片段。
玉米的ubiquitin-1启动子从玉米的基因组中通过PCR获得，使用的引物分别是：
ZmUbi-F(5’GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC，添加了HindIII位点)；
ZmUbi-R
(5’GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG，添加了BamHI位点)。
玉米ubiquitin-1启动子经过HindIII和BamHI酶切后和基因-终止子片段(BamHI-KpnI片段)共同连接到经过HindIII-KpnI酶切的pCambia1300载体中，获得T-DNA载体pCam-1Ab-CL-v3。由于玉米ubiquitin-1启动子在和本科植物中均有启动子活性，pCam-1Ab-CL-v3可以作为多种禾本科植物的抗虫转化T-DNA载体。
实施例5、转基因水稻的获得
转基因植物的获得方法是采用现有技术(卢雄斌、龚祖埙，1998生命科学10：125-131；刘凡等，2003分子植物育种1：108-115).选取成熟饱满的水稻种子去壳，诱导产生愈伤组织为转化材料。取含有目的基因的农杆菌(实施例4制备的pCam-1Ab-CL-v3)划板，挑单菌落接种准备转化农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2～3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤组织，转移到含抗生素的筛选培养基上，筛选培养(50ng/ml潮霉素)两个月(中间继代一次)。把筛选后生长活力良好的愈伤组织转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织转移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2～3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植到温室，作为鉴定材料。
实施例6、转基因玉米的获得
玉米转化事件所用的方法是农杆菌介导方法，根据Frame等报道的方法和培养基配方(PlantPhysiol,2002,129:13-22)进行转化，具体步骤如下：取授粉后8～10天的Hi-2玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0～1.5mm)，将含有T-DNA载体pCam-1Ab-CL-v3的农杆菌与未成熟胚共培育2～3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上挂(含200mg/L的timentin杀农杆菌)，28℃暗培养10～14天。将所有的愈伤组织转移到带有50ng/ml潮霉素的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。
转移所有的组织到新鲜潮霉素的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。随后转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10～14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10～14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全。
实施例7、转基因农作物抗虫能力的测定
利用二化螟和稻纵卷叶螟测定了通过实施例5获得的10个转基因水稻系的抗虫活性。取实施例5获得的转基因水稻嫩叶饲喂一龄幼虫，每叶接虫10头，28℃暗培养5天后记录数据。新生二化螟和稻纵卷叶螟的一龄幼虫取食转基因水稻后，有7个系的致死率是100％。
利用玉米螟和棉铃虫测定了通过实施例6获得的10个转基因玉米系的抗虫活性。取实施例6获得的转基因玉米嫩叶饲喂一龄幼虫，每叶接虫10头，28℃暗培养5天后记录数据。新生玉米螟一龄幼虫取食10个转基因玉米系后，全部100％死亡；新生棉铃虫一龄幼虫取食10个转基因玉米系后，有8个系的棉铃虫100％死亡，其他两个系的棉铃虫死亡率在60％～90％之间。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接到导出或联想到的所有延伸，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种抗虫融合基因，其特征在于所述抗虫融合基因是将编码BT杀虫晶体蛋白Cry1Ab的核苷酸序列和编码BT营养期杀虫蛋白Vip3A的核苷酸序列用连接肽编码基因连接构成；所述连接肽氨基酸序列为SEQIDNO:1所示。
2.如权利要求1所述抗虫融合基因，其特征在于所述连接肽编码基因核苷酸序列为SEQIDNO:6所示。
3.如权利要求1所述抗虫融合基因，其特征在于所述抗虫融合基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2所示。
4.一种权利要求1所述抗虫融合基因编码蛋白，其特征在于所述抗虫融合基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:3所示。
5.一种权利要求1所述抗虫融合基因构建的重组载体。
6.一种权利要求1所述抗虫融合基因在制备抗虫植物细胞中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述植物为水稻、玉米、小麦或高粱。
8.一种权利要求1所述抗虫融合基因在制备抗虫剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述抗虫剂为鳞翅目幼虫抗虫剂。
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