CN113793639B

CN113793639B - 一种管理玉米螟对Bt毒素抗性的方法

Info

Publication number: CN113793639B
Application number: CN202110884409.4A
Authority: CN
Inventors: 许超; 沈志成
Original assignee: Hangzhou Ruifeng Bio Tech Co ltd
Current assignee: Hangzhou Ruifeng Bio Tech Co ltd
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2024-01-05
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113793639A

Abstract

本发明公开了一种管理玉米螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法，所述的方法通过在同一植物细胞中同时表达至少一种Bt杀虫晶体蛋白Cry和至少一种Bt营养期杀虫蛋白Vip3实现；本发明将Bt杀虫晶体蛋白Cry的编码基因与所述Bt营养期杀虫蛋白Vip3的编码基因同时导入到植物细胞，获得的转基因植物能够同时表达两种对玉米螟具有高效杀虫效果且不具有交互抗性的Bt毒素，能够有效管理玉米螟对Bt毒素的抗性，可以极大缓解玉米螟对Bt毒素抗性的产生，大大延长转基因植物的使用年限，为实现国家生物育种战略提供了重要的种质资源储备，是对现有的害虫抗性防治技术的创造性提升。

Description

一种管理玉米螟对Bt毒素抗性的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种管理鳞翅目害虫玉米螟，包括欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)和亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)对苏云金芽孢杆菌Bt毒素发生抗性的方法。

(二)背景技术

害虫给全球农业生产带来每年数十亿美元的损失。害虫的防治目前主要依靠使用化学农药和推广转基因作物。化学农药的残留会对人体健康和环境带来不良影响。利用生物技术方法培育含有抗虫基因的转基因抗虫农作物，可以大幅度降低化学杀虫剂的使用，有效保护农作物免受害虫为害。杀虫蛋白质有多种，目前使用最多的是来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的杀虫晶体蛋白，如Cry1A、Cry1F等；以及Bt营养期杀虫蛋白，如Vip3等(Estruch,Warren et al.1996,Adang,Crickmore et al.2014)。Bt杀虫蛋白质在转基因植物上的应用已经超过二十年，2017年全球抗虫转基因作物的应用面积超过7000万公顷(ISAAA 2018)。

杀虫晶体蛋白是发现最早、使用最广泛的Bt杀虫蛋白质。目前商业化应用的抗虫转基因玉米中使用较多的杀虫晶体蛋白是Cry1Ab，Cry1Fa和Cry2Ab等，这些杀虫蛋白质对部分鳞翅目昆虫如玉米螟、棉铃虫、小菜蛾、二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟等具有较高的杀虫活性。其中，转cry1Ab基因玉米、转cry1Ac基因棉花已经被广泛应用。Frankenhuyzen和Jakka等总结多项研究的生物活性测定数据后指出，Cry1Ab\1Ac蛋白对鳞翅目螟蛾科害虫的杀虫活性较高，但是对多种鳞翅目夜蛾科害虫(如草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、小地老虎等)的杀虫活性较低(Frankenhuyzen 2009,Jakka,Ferré et al.2015)。Cry1D与Cry1F与Cry1A类蛋白在氨基酸序列上同源性不高，对鳞翅目昆虫的杀虫谱也与Cry1A类蛋白有差异。Cry1Fa蛋白对草地贪夜蛾、棉铃虫、粉纹夜蛾、小菜蛾、甜菜夜蛾等具有高杀虫生物活性，转cry1Fa基因玉米在美洲地区被大量应用于防治草地贪夜蛾等鳞翅目害虫(Frankenhuyzen2009)。

长期大量地使用单一的杀虫蛋白质，可以导致害虫对Bt杀虫蛋白质抗性的产生和发展(Carriere,Crickmore et al.2015)。自2005年发现第一例Bt抗性害虫以来，全球抗性害虫发生量逐年升高，并呈现快速增长的趋势(Tabashnik and Carrière 2017)。田间检测到部分鳞翅目害虫已经产生了抗性，如Bagla等报道了印度等地种植的表达Cry1Ac蛋白的转基因棉花上发现了抗性棉铃虫和抗性棉红铃虫(Bagla 2010)；Monnerat等报道了巴西种植的表达Cry1Fa蛋白的转基因玉米产品上发现了抗性草地贪夜蛾(Monnerat,Martins etal.2015)。

对于治理害虫抗性的发生，国际上通行的方式有两种，即基因堆叠策略和高剂量/庇护所策略。基因堆叠策略的主要途径是将两种表达单一抗虫蛋白的转化体进行杂交，使得后代植株能够同时表达两种抗虫蛋白，例如拜耳(原孟山都)公司的Power Core^TM玉米是将表达Cry1A.105、Cry2Ab蛋白的MON89034与表达Cry1F蛋白的TC1507进行杂交、育种后开发的产品。

中国专利CN102843903B中提供了一种利用Cry1Da和Cry1Fa蛋白管理草地贪夜蛾对Bt毒素的抗性的方法；中国专利CN102753012B提供了一种将Cry1I、Cry1E等与Cry1Fa配合用于控制草地贪夜蛾和欧洲玉米螟的方法。上述Cry蛋白与Cry1Fa蛋白都是Bt杀虫晶体蛋白Cry1家族的成员，其氨基酸序列相似度较高，杀虫机理比较相似(Frankenhuyzen,2017)。

Vip3家族蛋白与Cry1或Cry2家族蛋白在进化上没有同源性，在杀虫机理上完全不同(Chakroun,2016)。Vip3蛋白与杀虫晶体蛋白Cry在昆虫中肠上具有不同的结合受体，它们对昆虫的成毒机制不同，不存在交互抗性。Chakroun等总结文献研究指出，Cry1A、Cry1Fa等蛋白质在昆虫中肠上典型的几种结合受体均无法与Vip3蛋白发生相互作用，杀虫晶体蛋白与Vip3蛋白在昆虫中肠的作用机理不同(Chakroun,Banyuls et al.2016)。Wang等通过研究草地贪夜蛾发现，Cry1F蛋白在草地贪夜蛾中肠上的结合受体蛋白质为ABCC2，而Vip3A蛋白的受体则是SR-C(Wang et al.，2019)。

但是目前广泛使用的杀虫蛋白Vip3Aa对玉米螟没有杀虫活性。因此，使用Vip3Aa对玉米螟的抗性管理没有作用。本发明首次披露通过在转基因玉米中同时表达Bt晶体杀虫蛋白质和对玉米螟具有杀虫活性的Vip3基因，如Vip3Af,Vip3Ag和Vip3Ab，以控制和减缓玉米螟的抗性发生和发展。

(三)发明内容

本发明提供一种管理玉米螟对Bt毒素发生抗性的方法，将多种Bt营养期杀虫蛋白Vip3用于降低抗Bt杀虫晶体蛋白Cry的玉米螟抗性。本发明将两种具有完全不同作用机理的Bt抗虫蛋白在同一植物转化体中高剂量表达，从而达到延缓玉米螟对Bt杀虫蛋白抗性发生的目的。本发明构建了包含所述的Bt抗虫蛋白编码基因的T-DNA载体，并将其导入植物基因组中，获得的转基因植物对普通玉米螟和抗性玉米螟都具有高效杀虫效果，实现延缓玉米螟对Bt毒素抗性发生的目标。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种管理玉米螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法，所述的方法通过在同一植物细胞中同时表达至少一种Bt杀虫晶体蛋白Cry和至少一种Bt营养期杀虫蛋白Vip3实现。所述Bt杀虫晶体蛋白包括Cry1和Cry2蛋白质家族中的一种或多种，优选包括Cry1Ab、Cry1F、Cry2Ab；所述Bt营养期杀虫蛋白是对玉米螟具有杀虫活性的Vip3蛋白，包括Vip3Af、Vip3Ag、Vip3Ab中的任意一种或多种。

进一步，所述Cry1Ab核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；Cry1Fa核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；Cry2Ab核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步，Vip3Af核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；Vip3Ag核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；Vip3Ab核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

需要指出的是，Bt杀虫晶体蛋白Cry和Bt营养期杀虫蛋白Vip3可以由不同的核苷酸序列编码。特别是在不同植物中，不同密码子的使用频率可以是不同的，可以根据在不同植物中的应用使用不同的核苷酸序列。例如玉米等单子叶植物往往使用GC含量高的密码子，而双子叶植物中GC含量往往低一些。因此，只要是使用了本发明披露的编码了Bt杀虫晶体蛋白或Bt营养期杀虫蛋白Vip3的氨基酸序列的基因，均应视为本发明的内容。

进一步，本发明管理玉米螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法包括：(1)构建同时含Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框和Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框的转化载体，再将转化载体的T-DNA导入到植物细胞中，获得能够表达Bt杀虫蛋白的转基因植物细胞，进而延缓玉米螟对Bt毒素抗性发生；(2)分别构建含Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框的转化载体和含Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框的转化载体，并分别将各个转化载体的T-DNA导入到植物细胞中，分别获得表达Bt杀虫晶体蛋白Cry的转基因植物细胞和表达Bt营养期杀虫蛋白Vip3的转基因植物细胞，然后将两种转基因植物细胞通过植物杂交产生同时表达Bt杀虫晶体蛋白Cry和Bt营养期杀虫蛋白Vip3的转基因植物细胞，进而延缓玉米螟对Bt毒素抗性发生。

进一步，Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因的表达框由启动子、编码基因和终止子构成。所述的启动子包括但不限于玉米泛素启动子pZmUbi、花椰菜花叶病毒35s启动子pCaMV35s，优选启动子为pZmUbi(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)；所述的终止子包括但不限于农杆菌烟脂碱合成酶终止子tNOS，花椰菜花叶病毒35s RNA的终止子tCaMV 35s，优选终止子为tNOS(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)。

进一步，Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因的表达框由启动子、编码基因和终止子构成。所述的启动子包括但不限于玉米泛素启动子pZmUbi、花椰菜花叶病毒35s启动子pCaMV 35s，优选启动子为pZmUbi(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)；所述的终止子包括但不限于农杆菌烟脂碱合成酶终止子tNOS，花椰菜花叶病毒35s RNA的终止子tCaMV 35s，优选终止子为tNOS(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)。

进一步，所述的Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框和Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框的相对顺序以及表达框在转化载体中的插入位置没有限制，只要包含有所述的Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框和所述的Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框的转化载体均应视为本发明的内容。所述转化载体的基础载体为常规的植物遗传转化载体，包括但不限于pCambia1300、pCambia1301、pCambia2301等。

本发明还提供一种用于玉米螟对Bt杀虫蛋白抗性管理的转化载体，所述转化载体含Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框和Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框，优选所述转化载体包括同时含Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框和Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框的转化载体，或者分别包含Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框的转化载体和Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框的转化载体；所述Bt杀虫晶体蛋白包括Cry1和Cry2蛋白质家族中的一种或多种，优选包括Cry1Ab、Cry1F、Cry2Ab；所述Bt营养期杀虫蛋白是对玉米螟具有杀虫活性的Vip3蛋白，包括Vip3Af、Vip3Ag、Vip3Ab中的任意一种或多种。

本发明还提一种用于玉米螟对Bt杀虫蛋白抗性管理的抗虫植物细胞，所述的植物细胞同时表达至少一种所述的Bt杀虫晶体蛋白Cry和至少一种所述的Bt营养期杀虫蛋白Vip3。只要将能够同时表达本发明所述的Bt杀虫晶体蛋白Cry和Bt营养期杀虫蛋白Vip3的植物细胞应用于制备转基因农作物，均应视为本发明的内容。

进一步，本发明所述的抗虫植物细胞可以通过植物遗传转化方法获得。将所述的同时包含一种所述Cry基因和Vip3基因的转化载体的T-DNA通过遗传转化方法整合到植物基因组中，或者将含所述Bt杀虫晶体蛋白Cry基因转化载体的植物细胞和Bt营养期杀虫蛋白Vip3基因转化载体的植物细胞杂交后得到同时表达Bt杀虫晶体蛋白Cry和Bt营养期杀虫蛋白Vip3的植物细胞，该植物细胞能够同时表达所述的Cry蛋白和Vip3蛋白。

本发明所述的抗虫植物细胞可以通过植物杂交的方式获得。将一种表达至少一种所述Bt杀虫晶体蛋白的植物细胞，与一种至少表达一种所述Vip3蛋白的植物细胞进行有性生殖，获得的后代中能够同时表达至少一种所述Bt杀虫晶体蛋白和至少一种所述的Vip3蛋白的植物细胞即为本发明所述的抗虫植物细胞。

进一步，所述植物细胞包括玉米、大豆或水稻细胞；所述玉米螟为亚洲玉米螟和欧洲玉米螟，此外本发明方法还适用于抗Bt毒素的鳞翅目害虫。

所述的遗传转化方法如：将包含所述T-DNA转化载体的农杆菌，通过成熟的转化方法导入到玉米(Ishida,Saito et al.1996)、大豆(Zeng,Vadnais et al.2004)、水稻(Hiei,Komari et al.1997)等植物中。这些植物的转化方法在技术上已经成熟，本专业的一般技术人员就可以实现这个技术目的。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

所述的Bt营养期杀虫蛋白Vip3与Bt杀虫晶体蛋白Cry的杀虫机理完全不同，不存在交互抗性，而现有技术常规使用的Vip3Aa蛋白(例如Vip3Aa1、Vip3Aa19、Vip3Aa20)对玉米螟没有杀虫活性，例如表达Vip3Aa20蛋白的商业化转基因产品MIR162无法杀灭普通玉米螟和抗性玉米螟害虫。本发明所述的Vip3蛋白能够高效杀灭普通玉米螟和抗Cry蛋白的玉米螟。因此，本发明突破了现有技术的障碍，将Bt杀虫晶体蛋白Cry的编码基因与所述Bt营养期杀虫蛋白Vip3的编码基因同时导入到植物细胞，获得的转基因植物能够同时表达两种对玉米螟具有高效杀虫效果且不具有交互抗性的Bt毒素，能够有效管理玉米螟对Bt毒素的抗性，可以极大缓解玉米螟对Bt毒素抗性的产生，大大延长转基因植物的使用年限，是对现有的害虫抗性防治技术的创造性提升。

(四)附图说明

图1为转化载体示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology，和J.Sambrook等编写的Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例1、Bt重组蛋白质的制备

本发明涉及的编码基因均由上海生工公司进行人工合成，其中，Cry1Ab蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码基因cry1Ab的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；Cry1Fa蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码基因cry1Fa的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；Cry2Ab蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码基因cry1Fa的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示；Vip3Af蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码基因vip3Af的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；Vip3Ag蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，编码基因vip3Ag的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；Vip3Ab蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码基因vip3Ab的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

利用大肠杆菌(Escherichia coli)pET表达系统进行重组蛋白质的表达和制备。将目的基因导入pET表达载体中，再将表达载体转入合适的表达菌株，在一定条件下诱导目的基因的表达，制备重组蛋白质。本实施例中重组Cry蛋白和重组Vip3蛋白的制备过程完全一致，以下以Cry1Ab蛋白为例进行说明。

Cry1Ab蛋白的制备过程如下：将cry1Ab基因克隆到表达载体pet28a(Novagen，69015-3，美国)的BamHI和SacI这二个限制性内切酶酶切位点之间，获得重组质粒pet28a-cry1Ab；重组质粒通过热击转化法导入大肠杆菌BL21(DE3)细胞系，在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜培养，筛选得到单克隆阳性菌落；单克隆阳性菌落接种至含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃过夜培养后，取0.2ml菌液继代接种至装有200毫升含50mg/L卡那霉素的LB液体培养液的锥形瓶中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6，然后加入IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)至终浓度为0.5mM，并继续在同样的条件下振荡培养4小时，诱导重组蛋白质的表达；表达完成后，将培养液5000rpm离心15分钟，弃掉上清培养液，收集细胞沉淀，并以50毫升20mM磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)重悬细胞；随后将重悬液置于冰水中充分冷却后，用超声波破碎仪(宁波新芝生物科技公司，型号JY92-IIN)粉碎细胞(探头直径10mm，以650W、50％机显功率破碎15min，工作3s间歇6s)，12000rpm离心10min后，分别收集上清和沉淀，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证目标蛋白的条带大小，将含有正确目的条带的蛋白质样品储存于-80℃冰箱中备用。

Cry重组蛋白存在于超声破碎后的沉淀中，将含Cry1Ab蛋白的沉淀以Carbonatebuffer(50mM Na₂CO₃,pH＝10)重悬2h后即可溶解，获得重组蛋白Cry1Ab溶液，采用莫纳生物科技公司eva3100超微量核酸蛋白检测仪(货号GD30101)测定溶液中A280的吸光度，即可得到重组蛋白质中目的蛋白的浓度。用同样的Carbonate buffer缓冲液调整蛋白浓度均为1.5mg/ml，得到重组Cry1Ab蛋白溶液，同样条件下制备蛋白浓度为1.5mg/ml的重组蛋白Cry1Fa溶液，蛋白浓度为1.5mg/ml的重组蛋白Cry2Ab溶液。

Vip3A重组蛋白存在于超声破碎后的上清中，将携带有Vip3Af、Vip3Ag或Vip3Ab蛋白的上清进行His-tag纯化(Qiagen，Ni-NTA superflow,Lot No.160049084)，纯化步骤参照该试剂的说明书进行，具体如下：(1)向柱中填入1ml Ni-NTA树脂，静置至分层；(2)流出保存液，用8～10倍柱体积的Lysis Buffer清洗树脂至完全平衡；(3)将样品加入到柱中，封口，轻轻摇晃(或将柱平躺)，在室温(或4℃，视蛋白情况而定)下静置30min；(4)将柱子放置在铁架台上，以1ml/min的流速释放上清液；(5)用5倍柱体积Wash buffer清洗，流速1ml/min，洗掉杂蛋白；(6)用5倍柱体积Elution buffer洗脱，流速1ml/min，保存洗脱液。最后采用莫纳eva3100检测仪测定洗脱液中A280的吸光度，即可得到重组蛋白质中目的蛋白的浓度，用同样的Carbonate buffer缓冲液调整蛋白浓度为2.5mg/ml，获得Vip3A重组蛋白溶液。同样条件下，制备蛋白浓度为2.5mg/ml含重组蛋白Vip3Ag溶液，蛋白浓度为2.5mg/ml的含重组蛋白Vip3Ab蛋白溶液。

所述蛋白纯化过程中Lysis buffer的配方为：20mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑，用NaOH调整pH至8.0；Wash buffer的配方为：20mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、20mM咪唑，用NaOH调整pH至8.0；Elution buffer的配方为20mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、250mM咪唑，用NaOH调整pH至8.0。

所述LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为双蒸水，120℃高温高压灭菌15分钟；LB固体培养基是在LB液体培养基中再加入15g/L琼脂，高温高压灭菌后倒置于已灭菌的培养皿中冷却即可。

通过相同的方法分别制备得到Cry1Fa、Cry2Ab、Vip3Af、Vip3Ag和Vip3Ab蛋白，储存在-80℃冰箱中备用。此外，用相同方法制备Vip3Aa20蛋白(NCBI accessionNO.ABG20429)作为实验对照，该蛋白是商业化转基因产品MIR162(USDA Petition forDetermination of Nonregulated Status for Insect-Resistant MIR162 Maize,07-253-01p)中表达的Bt杀虫蛋白质。

实施例2、重组蛋白质对玉米螟的生物活性测定

实验对象：选取新生2h以内的普通玉米螟(采集自海南三亚试验基地田间)、抗Cry1Ab玉米螟和抗Cry1Fa玉米螟的初孵幼虫作为被试昆虫。抗性玉米螟(抗Cry1Ab玉米螟和抗Cry1Fa玉米螟)通过人工饲养筛选获得，具体方法参考文献资料(Kain,Wendy C.,etal."Inheritance of resistance to Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin in agreenhouse-derived strain of cabbage looper(Lepidoptera:Noctuidae)."Journalof economic entomology 97.6(2004):2073-2078.；Huang,Fangneng,et al."Baselinesusceptibility and changes in susceptibility to Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki under selection pressure in European corn borer(Lepidoptera:Pyralidae)."Journal of Economic Entomology 90.5(1997):1137-1143.)提供的方法进行筛选。抗性玉米螟对Bt杀虫晶体蛋白(Cry1Ab或Cry1Fa)不敏感，普通玉米螟对Bt杀虫晶体蛋白质敏感。

实验组：实施例1方法制备的重组蛋白质(重组蛋白Cry1Ab溶液，重组蛋白Cry1Fa溶液，重组蛋白Cry2Ab溶液，重组蛋白Vip3Af溶液，重组蛋白Vip3Ag溶液，重组蛋白Vip3Ab蛋白溶液)进行生物活性的预实验(分别设置1ng/cm²、10ng/cm²、100ng/cm²、1000ng/cm²、10000ng/cm²五组浓度)；根据预实验结果，将被试昆虫全部死亡的最低浓度设为上限浓度，设置8组浓度梯度(浓度范围如下表1所示，以pH＝7.4的PBS缓冲液稀释)，测定其对昆虫具有50％致死率的浓度区间。每组浓度测试虫数为80头。

阴性对照组：阴性对照的准备方法与实施例1相同，唯一的区别是大肠杆菌表达菌株中转入的质粒为不含任何插入DNA序列的pet28a空载体。

测定方法：以表面平铺法测定重组蛋白质对昆虫的致死中浓度LC₅₀。

昆虫人工饲料煮熟后平铺到24孔培养板(每孔直径为1.5cm)中，等待饲料凝固。每块24孔板中随机设置20个孔为实验组，4个为阴性对照组。实验组每孔的饲料表面铺上重组蛋白200微升，阴性对照组每孔的饲料表面铺上阴性对照蛋白200微升，待整块板铺完后将其放置在120rpm的摇床上，在室温(25-30℃)下晃动至液体晾干。每孔接入2头被试昆虫，并用透气封口膜封闭，在28℃培养箱中遮光饲养7天，统计昆虫死亡率，得出对应的致死中浓度LC₅₀，结果如下表2所示。

表1对玉米螟生物活性测定的重组蛋白浓度梯度表(ng/cm²)

重组蛋白质	浓度1	浓度2	浓度3	浓度4	浓度5	浓度6	浓度7	浓度8
									Cry1Ab	10	20	30	40	50	60	75	100
Cry1Fa	10	20	30	40	50	60	75	100
									Cry2Ab	50	100	250	500	750	1000	1500	2000
Vip3Af	10	25	50	75	100	125	150	200
									Vip3Ag	10	25	50	75	100	125	150	200
Vip3Ab	10	25	50	75	100	125	150	200

表2重组蛋白质对玉米螟和抗性玉米螟的致死中浓度LC₅₀

注：a、95％ CI，95％置信区间。b、Cry1Ab+Vip3Af，Cry1Ab、Vip3Af蛋白以摩尔比1：1的混合物，以下类同。c、NA，not active。

从上述对玉米螟的生物活性测定结果可以得出结论：(1)Vip3Af、Vip3Ag和Vip3Ab蛋白对玉米螟具有极高的杀虫活性，而Vip3Aa20蛋白对玉米螟没有活性；(2)Vip3Af、Vip3Ag、Vip3Ab蛋白对抗性玉米螟和普通玉米螟的LC₅₀没有显著差异，都具有极高活性，表明Vip3Af、Vip3Ag、Vip3Ab蛋白与Cry1Ab或Cry2Ab蛋白之间均不存在对玉米螟的交互抗性；(3)将Cry蛋白与Vip3蛋白按摩尔比1：1比例进行物理混合后，混合蛋白对普通玉米螟和抗性玉米螟都具有高杀虫活性。

实施例3、转化载体的构建

在本实施例中，转化载体是基于pCambia1300(NCBI序列编号AF234296)载体而构建的，本发明的读者可以根据本实施例提供的方法，在其他植物遗传转化载体上实现相同的效果，例如pCambia1301、pCambia2301等。本实施例以构建含有cry1Fa和vip3Af两个基因的表达框为例阐述转化载体的构建方法，将cry1Fa基因替换为任意本发明中所述的Cry蛋白、将vip3Af基因替换为任意本发明中所述的Vip3蛋白，均能实现转化载体的构建。此外，抗虫基因的表达框中使用的启动子可以是任意组成型启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子PCAMV35S、玉米泛素启动子pZMUBI等；终止子的选择没有限制，例如常用的农杆菌NOS终止子tNOS、花椰菜花叶病毒35S终止子T35S等等都可以作为抗虫基因的终止子。

本发明涉及的编码基因均由上海生工公司进行人工合成。编码基因cry1Ab的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码基因cry1Fa的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码基因cry2Ab的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；编码基因vip3Af的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，编码基因vip3Ag的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码基因vip3Ab的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

启动子均选用玉米泛素启动子pZmUbi(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，终止子均为农杆菌烟脂碱合成酶终止子tNOS(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)。将pCambia1300载体用限制性内切酶HindIII和KpnI进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳、割胶回收后，已被线性化的载体片段储存在-20℃冰箱中备用。

设计合成表3所示PCR引物，扩增获得用于快速克隆的元件片段：

启动子pZmUbi(Genebank NO:S94464)从玉米的基因组中通过PCR获得，使用的引物分别是：ZmUbi-F(5’-GCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC-3’)；ZmUbi-R(5’-TCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG)。选用快速无缝克隆试剂盒(诺唯赞公司产品ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit，货号C113-01)，实验步骤参照说明书，获得玉米泛素启动子pZmUbi，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

农杆菌烟脂碱合成酶终止子tNOS由上海生工公司人工合成，核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。

表3各片段根据无缝克隆(ClonExpress)方法设计的引物序列

PCR反应选用高保真酶2×Phanta Max Master Mix(诺唯赞,货号P515-01)，反应体系按说明书进行，按如下表4进行反应：

表4

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、割胶回收后，测定回收产物的浓度。

快速无缝克隆反应参考试剂盒(诺唯赞公司货号C113-01)说明书，按如下表5体系配制：

表5无缝克隆反应液

将表5无缝克隆反应液混匀后，37℃孵育30min，结束后快速放置到冰上冷却2min以上。随后进行大肠杆菌DH5α感受态细胞(上海唯地生物公司，CAT#:DL1001)的转化：取出感受态细胞后冰上融化，加入上述反应完成后的无缝克隆反应液，冰浴25min，随后42℃水浴热激45s，再在冰上快速冷却2min，加入1ml LB培养液，37℃下200rpm振荡培养1h，随后在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上涂板，37℃过夜培养后挑单个克隆进行测序鉴定。最终构建完成的载体如图1所示。获得转化载体pCambia1300-pZmUbi-cry-tNOS-pZmUbi-vip3-tNOS，其中cry为cry1Ab、cry1Fa、cry2Ab；vip3为vip3Af、vip3Ag、vip3Ab。

实施例4、制备用于玉米遗传转化的根癌农杆菌

由实施例3制备得到的包含转化载体的大肠杆菌经测序鉴定正确后保存在-80℃冰箱。将保存的大肠杆菌菌株在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，37℃过夜培养后挑取单克隆至含有50mg/L卡那霉素的3毫升LB液体培养基中，37℃过夜培养后提取质粒。将上述质粒通过电击转化法转入农杆菌EHA105的感受态细胞中，在同时含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平和100mg/L链霉素的YEP固体培养基上均匀涂板，置于28℃下培养48～72h，待长出单克隆后挑取单菌落至同时含有50mg/L卡那霉素、25mg/L利福平和100mg/L链霉素的YEP液体培养基中，28℃培养48～72h后，获得农杆菌培养液，提取质粒进行测序鉴定，鉴定正确的阳性克隆菌保存于-80℃冰箱中备用。

LB培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为水，高温高压灭菌；若配制固体培养基，则加入15g/L琼脂。

YEP培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L、NaCl 5g/L，溶剂为水，高温高压灭菌；若配制固体培养基，则加入15g/L琼脂。

实施例5、转基因玉米的获得

转基因玉米的获得方法是根据现有技术，采用根癌农杆菌介导法转化玉米幼胚(Ishida,Saito etal.1996)，具体步骤如下：取授粉后8～10天的玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0～1.5mm)。取实施例4中阳性克隆菌的农杆菌细胞与未成熟胚共培育2～3天(22℃)。随后，转移未成熟胚到愈伤诱导培养基(含200mg/L特美汀)上，28℃暗培养10～14天。接下来将所有的愈伤组织转移到带有50ng/ml潮霉素的筛选培养基上进行筛选，28℃暗培养2～3周。转移所有的组织到新鲜潮霉素的筛选培养基上进行第二次筛选，28℃暗培养2～3周。随后转移所有筛选后仍然成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10～14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10～14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根系发育完全。将cry为cry1Fa，vip3为vip3Af的转基因玉米T₀代转化体记为FZ。

实施例6、转基因农作物转化体中抗虫蛋白表达量的测定

由于转化体表现型与非转基因玉米差异较大，从实施例5获得的T₀代转化体FZ中，取植株表现型与非转基因无明显差异的10个株系，使用新鲜组织测定每个转化体中抗虫蛋白的含量，具体为：取每个株系在V6叶期的新鲜叶片组织50mg，每个叶片组织取3份样品作为重复。对于新鲜组织，经液氮研磨后加入500微升PBS缓冲液，充分混合后12000rpm离心5min，将上清液用PBS缓冲液稀释500倍后进行酶联免疫法(ELISA)测定。使用的试剂盒为上海佑隆生物公司的Cry1F ELISA定量试剂盒(产品编号AA0641)，参照产品使用说明书进行操作；测定Vip3A蛋白的试剂盒为Vip3A ELISA定量试剂盒(产品编号AA1641)，实验操作方法与上述Cry1F ELISA试剂盒一致。测得的T₀代转基因玉米转化体中Cry1Fa蛋白和Vip3Af蛋白的结果表6所示。实验结果表明，T₀代转基因玉米转化体中Cry1Fa蛋白表达量在2.9-15.5μg/g-fwt之间，Vip3Af表达量在2.9-13.6μg/g-fwt之间，转化体个体之间不同蛋白的表达量有所差异。

同样方法检测，实施例5获得的cry为cry1Ab、cry2Ab；vip3为vip3Ag、vip3Ab的转基因玉米T₀代转化体中Cry蛋白含量在3.3～10.6μg/g-fwt之间，Vip3蛋白含量在2.9～12.8μg/g-fwt之间。

表6 T0代玉米转化体中抗虫蛋白表达量的测定

注：*μg/g-fwt：微克每克新鲜组织

实施例7、转基因抗虫玉米转化体的抗虫性鉴定

通过实施例5、6所述方法获得的转基因植物转化体，移栽至温室，待植物能够稳定生长(玉米进入V6-8叶期)后进行生物活性测定。选取实施例6中测定了抗虫蛋白表达量的转化体进行生测，选用玉米螟和抗性玉米螟(抗Cry1Ab玉米螟和抗Cry1Fa玉米螟)进行转基因玉米转化体的生物活性测定。取5-6cm新鲜的植物叶片组织，放置在直径7.5cm的培养皿中，垫上一片湿润的滤纸，接入10头初孵2h内的幼虫，盖上盖子后用封口膜封闭培养皿，防止幼虫逃逸。每个转化体设置5个重复的处理组，每次生物测定实验以单独表达Vip3Aa20蛋白的转基因玉米转化体AZ-54(Vip3Aa20蛋白表达量为12.5μg/g-fwt)作为实验对照，以相同生长期的非转基因植物作为阴性对照。5天后，统计每个实验组中幼虫的存活头数，计算出幼虫的死亡率。根据统计得到的死亡率数据。表达Cry1Fa和Vip3Af的转基因玉米抗虫性，结果见表7所示。

生测结果表明，相比于非转基因玉米和表达单独Vip3Aa20蛋白(表达量为12.5μg/g-fwt)的转基因玉米AZ-54，同时表达Cry蛋白和Vip3A蛋白的玉米转化体FZ能在72h内杀灭玉米螟和抗性玉米螟幼虫，显示出对普通玉米螟和抗性玉米螟均具有极高的杀虫活性，这一结论与实施例2中Bt蛋白的生测数据一致。此外，从本实施例的生测数据中可以看到，Bt蛋白的表达量与杀虫效率存在一定的相关性。例如，转化体FZ72中Cry1Fa和Vip3Af蛋白的表达量相对较低，分别为2.9、7.5μg/g-fwt，表现在生测试验中即为24h玉米螟的死亡率为80％，该死亡率数据在所有转化体中是最低的。总的来说，表达Cry1Fa和Vip3Af的转化体FZ能够在72h内高效杀灭玉米螟、抗Cry1Ab玉米螟和抗Cry1Fa玉米螟，而Vip3Aa20蛋白的转化体AZ-54对玉米螟没有杀虫效果，因此本实施例所述的FZ转化体可以为玉米螟对Bt蛋白的抗性管理提供了一种新的研究思路和产品解决方案。

表7玉米螟和抗性玉米螟饲喂转基因玉米转化体后的死亡率统计

注：^*CK：对照组非转基因玉米。

同样条件下，测试实施例3中其他转化载体转化植物获得的转基因玉米(如同时表达Cry1Ab+Vip3Ag蛋白的转化体、同时表达Cry1Fa+Vip3Ab蛋白的转化体)，结果显示所有筛选得到的转化体都能够在72h内杀灭普通玉米螟和抗性玉米螟。这一结果与实施例2中原核表达的蛋白质对玉米螟生物活性测定的结论一致。因此，在同一转基因玉米中同时表达所述Cry蛋白与所述Vip3蛋白，在防治玉米螟的同时，可以有效降低抗性玉米螟的发生，是一种在玉米上全新的管理玉米螟对Bt毒素抗性的有效手段。

实施例8、通过植物杂交方法获得的转基因玉米及其对玉米螟的生物活性

通过本发明所述的转化载体构建方法(实施例3)和植物遗传转化方法(实施例4、5)，可以获得表达一种或多种Cry蛋白的转基因玉米，也可以获得表达一种或多种Vip3蛋白的转基因玉米。在实施例3中描述了转化载体的构建方法，可以制备得到含有一个或多个Cry基因的植物转化载体，也可以制备得到含有一个或多个Vip3基因的植物转化载体。在实施例4中详细描述了通过农杆菌制备转基因玉米的具体步骤。通过上述实施例，将只有Cry基因的转化载体导入植物细胞，可以获得只表达Cry蛋白的转基因玉米；或将只有Vip3基因的转化载体导入植物细胞，可以获得只表达Vip3蛋白的转基因玉米。

例如，通过本发明实施例3、4、5中提供的方法，获得了一种表达Cry1Fa蛋白的转基因玉米转化体TF43和一种表达Vip3Af蛋白的转基因玉米转化体TM19。通过ELISA方法测定TF43中Cry1Fa蛋白的表达量达到10.4μg/g-fwt，TM19中Vip3Af蛋白的表达量达到20.5μg/g-fwt。将TF43和TM19植株同时种植在温室中，在生育期通过常规的有性生殖方式进行植物杂交，在玉米开花期将TF43的花粉人工授粉至TM19的雌穗上，获得了同时表达Cry1Fa蛋白和Vip3Af蛋白的杂交玉米后代TMF4319；或是将TM19的花粉人工授粉至TF43的雌穗上，获得了同时表达Cry1Fa蛋白和Vip3Af蛋白的杂交玉米后代TMF1943。将TMF1943和TMF4319种子种植于试验田中，用转基因快速检测试纸(上海佑隆生物公司，货号AA0831-CP4)对每棵植株进行检测，只留下检测阳性的植株，剔除阴性植株；再对阳性植株进行外源蛋白表达量的测定，使用实施例6中所述的ELISA方法，测定TMF1943中Cry1Fa蛋白的表达量平均为10.1μg/g-fwt，Vip3Af蛋白的表达量平均为19.7μg/g-fwt；TMF4319中Cry1Fa蛋白的表达量平均为10.3μg/g-fwt，Vip3Af蛋白的表达量平均为19.6μg/g-fwt。

对TMF4319和TMF1943进行玉米螟的生物活性测定(测定方法如实施例7中所述的方法一致)，结果显示，玉米螟、抗Cry1Ab玉米螟和抗Cry1Fa玉米螟均在24h内全部死亡，表明TMF4319和TMF1943对普通玉米螟和抗性玉米螟都具有极高的杀虫活性。因此，通过植物杂交方法在同一植株中同时表达所述的Cry蛋白和所述的Vip3蛋白，也可以实现玉米螟抗性管理的目的，可以有效减缓抗性害虫的发生。

最后，以上列举的仅是本发明的若干实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多延伸和拓展。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接到导出或联想到的所有延伸，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州瑞丰生物科技有限公司

<120> 一种管理玉米螟对Bt毒素抗性的方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 649

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Gly Gly Glu Arg Ile Glu Thr Gly

20 25 30

Tyr Thr Pro Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Gln Phe Leu Leu Ser

35 40 45

Glu Phe Val Pro Gly Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Val Asp Ile Ile

50 55 60

Trp Gly Ile Phe Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Gln Ile Tyr Ala Glu

100 105 110

Ser Phe Arg Glu Trp Glu Ala Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Thr Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Ala Val Gln Asn Tyr Gln Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Val Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Gln Arg Trp Gly Phe Asp Ala Ala Thr Ile Asn Ser Arg

180 185 190

Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu Ile Gly Asn Tyr Thr Asp His Ala Val

195 200 205

Arg Trp Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Arg Val Trp Gly Pro Asp Ser Arg

210 215 220

Asp Trp Ile Arg Tyr Asn Gln Phe Arg Arg Glu Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ser Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Arg Thr Val Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asn Pro Val

260 265 270

Leu Glu Asn Phe Asp Gly Ser Phe Arg Gly Ser Ala Gln Gly Ile Glu

275 280 285

Gly Ser Ile Arg Ser Pro His Leu Met Asp Ile Leu Asn Ser Ile Thr

290 295 300

Ile Tyr Thr Asp Ala His Arg Gly Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly His Gln

305 310 315 320

Ile Met Ala Ser Pro Val Gly Phe Ser Gly Pro Glu Phe Thr Phe Pro

325 330 335

Leu Tyr Gly Thr Met Gly Asn Ala Ala Pro Gln Gln Arg Ile Val Ala

340 345 350

Gln Leu Gly Gln Gly Val Tyr Arg Thr Leu Ser Ser Thr Leu Tyr Arg

355 360 365

Arg Pro Phe Asn Ile Gly Ile Asn Asn Gln Gln Leu Ser Val Leu Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Thr Ser Ser Asn Leu Pro Ser Ala Val

385 390 395 400

Tyr Arg Lys Ser Gly Thr Val Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln

405 410 415

Asn Asn Asn Val Pro Pro Arg Gln Gly Phe Ser His Arg Leu Ser His

420 425 430

Val Ser Met Phe Arg Ser Gly Phe Ser Asn Ser Ser Val Ser Ile Ile

435 440 445

Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp Ile His Arg Ser Ala Glu Phe Asn Asn

450 455 460

Ile Ile Pro Ser Ser Gln Ile Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Ser Thr

465 470 475 480

Asn Leu Gly Ser Gly Thr Ser Val Val Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly

485 490 495

Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr Ser Pro Gly Gln Ile Ser Thr Leu Arg

500 505 510

Val Asn Ile Thr Ala Pro Leu Ser Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg

515 520 525

Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu Gln Phe His Thr Ser Ile Asp Gly Arg

530 535 540

Pro Ile Asn Gln Gly Asn Phe Ser Ala Thr Met Ser Ser Gly Ser Asn

545 550 555 560

Leu Gln Ser Gly Ser Phe Arg Thr Val Gly Phe Thr Thr Pro Phe Asn

565 570 575

Phe Ser Asn Gly Ser Ser Val Phe Thr Leu Ser Ala His Val Phe Asn

580 585 590

Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Val Pro Ala Glu

595 600 605

Val Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg Ala Gln Lys Ala Val

610 615 620

Asn Glu Leu Phe Thr Ser Ser Asn Gln Ile Gly Leu Lys Thr Asp Val

625 630 635 640

Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Arg

645

<210> 2

<211> 605

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Glu Asn Asn Ile Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu Asn

1 5 10 15

Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Asn Glu Glu Arg Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Pro Leu Asp Ile Ser Leu Ser Leu Thr Arg Phe Leu Leu Ser Glu Phe

35 40 45

Val Pro Gly Val Gly Val Ala Phe Gly Leu Phe Asp Leu Ile Trp Gly

50 55 60

Phe Ile Thr Pro Ser Asp Trp Ser Leu Phe Leu Leu Gln Ile Glu Gln

65 70 75 80

Leu Ile Glu Gln Arg Ile Glu Thr Leu Glu Arg Asn Arg Ala Ile Thr

85 90 95

Thr Leu Arg Gly Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Tyr Ile Glu Ala Leu

100 105 110

Arg Glu Trp Glu Ala Asn Pro Asn Asn Ala Gln Leu Arg Glu Asp Val

115 120 125

Arg Ile Arg Phe Ala Asn Thr Asp Asp Ala Leu Ile Thr Ala Ile Asn

130 135 140

Asn Phe Thr Leu Thr Ser Phe Glu Ile Pro Leu Leu Ser Val Tyr Val

145 150 155 160

Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Leu Leu Arg Asp Ala Val Ser Phe

165 170 175

Gly Gln Gly Trp Gly Leu Asp Ile Ala Thr Val Asn Asn His Tyr Asn

180 185 190

Arg Leu Ile Asn Leu Ile His Arg Tyr Thr Lys His Cys Leu Asp Thr

195 200 205

Tyr Asn Gln Gly Leu Glu Asn Leu Arg Gly Thr Asn Thr Arg Gln Trp

210 215 220

Ala Arg Phe Asn Gln Phe Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp

225 230 235 240

Ile Val Ala Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Val Arg Thr Tyr Pro Ile Gln

245 250 255

Thr Ser Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Ser Val Ile Glu

260 265 270

Asp Ser Pro Val Ser Ala Asn Ile Pro Asn Gly Phe Asn Arg Ala Glu

275 280 285

Phe Gly Val Arg Pro Pro His Leu Met Asp Phe Met Asn Ser Leu Phe

290 295 300

Val Thr Ala Glu Thr Val Arg Ser Gln Thr Val Trp Gly Gly His Leu

305 310 315 320

Val Ser Ser Arg Asn Thr Ala Gly Asn Arg Ile Asn Phe Pro Ser Tyr

325 330 335

Gly Val Phe Asn Pro Gly Gly Ala Ile Trp Ile Ala Asp Glu Asp Pro

340 345 350

Arg Pro Phe Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Pro Val Phe Val Arg Gly Gly

355 360 365

Phe Gly Asn Pro His Tyr Val Leu Gly Leu Arg Gly Val Ala Phe Gln

370 375 380

Gln Thr Gly Thr Asn His Thr Arg Thr Phe Arg Asn Ser Gly Thr Ile

385 390 395 400

Asp Ser Leu Asp Glu Ile Pro Pro Gln Asp Asn Ser Gly Ala Pro Trp

405 410 415

Asn Asp Tyr Ser His Val Leu Asn His Val Thr Phe Val Arg Trp Pro

420 425 430

Gly Glu Ile Ser Gly Ser Asp Ser Trp Arg Ala Pro Met Phe Ser Trp

435 440 445

Thr His Arg Ser Ala Thr Pro Thr Asn Thr Ile Asp Pro Glu Arg Ile

450 455 460

Thr Gln Ile Pro Leu Val Lys Ala His Thr Leu Gln Ser Gly Thr Thr

465 470 475 480

Val Val Arg Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Arg Arg Thr

485 490 495

Ser Gly Gly Pro Phe Ala Tyr Thr Ile Val Asn Ile Asn Gly Gln Leu

500 505 510

Pro Gln Arg Tyr Arg Ala Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Leu

515 520 525

Arg Ile Tyr Val Thr Val Ala Gly Glu Arg Ile Phe Ala Gly Gln Phe

530 535 540

Asn Lys Thr Met Asp Thr Gly Asp Pro Leu Thr Phe Gln Ser Phe Ser

545 550 555 560

Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ala Phe Thr Phe Pro Met Ser Gln Ser Ser

565 570 575

Phe Thr Val Gly Ala Asp Thr Phe Ser Ser Gly Asn Glu Val Tyr Ile

580 585 590

Asp Arg Phe Glu Leu Ile Pro Val Thr Ala Thr Leu Glu

595 600 605

<210> 3

<211> 633

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

Met Ala Ser Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile Cys Asp Ala Tyr

1 5 10 15

Asn Val Ala Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Gln His Lys Ser Leu Asp

20 25 30

Thr Val Gln Lys Glu Trp Thr Glu Trp Lys Lys Asn Asn His Ser Leu

35 40 45

Tyr Leu Asp Pro Ile Val Gly Thr Val Ala Ser Phe Leu Leu Lys Lys

50 55 60

Val Gly Ser Leu Val Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Arg Asn Leu

65 70 75 80

Ile Phe Pro Ser Gly Ser Thr Asn Leu Met Gln Asp Ile Leu Arg Glu

85 90 95

Thr Glu Lys Phe Leu Asn Gln Arg Leu Asn Thr Asp Thr Leu Ala Arg

100 105 110

Val Asn Ala Glu Leu Thr Gly Leu Gln Ala Asn Val Glu Glu Phe Asn

115 120 125

Arg Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Asn Arg Asn Ala Val Pro Leu

130 135 140

Ser Ile Thr Ser Ser Val Asn Thr Met Gln Gln Leu Phe Leu Asn Arg

145 150 155 160

Leu Pro Gln Phe Gln Met Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro Leu

165 170 175

Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Phe Ile Arg Asp Val Ile

180 185 190

Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Leu Arg Thr Tyr

195 200 205

Arg Asp Tyr Leu Lys Asn Tyr Thr Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Cys Ile

210 215 220

Asn Thr Tyr Gln Ser Ala Phe Lys Gly Leu Asn Thr Arg Leu His Asp

225 230 235 240

Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr Val

245 250 255

Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Leu Val Ser Ser Gly

260 265 270

Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser Phe

275 280 285

Thr Ser Gln Asp Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn Ser

290 295 300

Asn Tyr Val Leu Asn Gly Phe Ser Gly Ala Arg Leu Ser Asn Thr Phe

305 310 315 320

Pro Asn Ile Val Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr His Ala Leu Leu

325 330 335

Ala Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Ile Ser Ser Gly Asp Ile Gly

340 345 350

Ala Ser Pro Phe Asn Gln Asn Phe Asn Cys Ser Thr Phe Leu Pro Pro

355 360 365

Leu Leu Thr Pro Phe Val Arg Ser Trp Leu Asp Ser Gly Ser Asp Arg

370 375 380

Glu Gly Val Ala Thr Val Thr Asn Trp Gln Thr Glu Ser Phe Glu Thr

385 390 395 400

Thr Leu Gly Leu Arg Ser Gly Ala Phe Thr Ala Arg Gly Asn Ser Asn

405 410 415

Tyr Phe Pro Asp Tyr Phe Ile Arg Asn Ile Ser Gly Val Pro Leu Val

420 425 430

Val Arg Asn Glu Asp Leu Arg Arg Pro Leu His Tyr Asn Glu Ile Arg

435 440 445

Asn Ile Ala Ser Pro Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Arg Ala Tyr Met

450 455 460

Val Ser Val His Asn Arg Lys Asn Asn Ile His Ala Val His Glu Asn

465 470 475 480

Gly Ser Met Ile His Leu Ala Pro Asn Asp Tyr Thr Gly Phe Thr Ile

485 490 495

Ser Pro Ile His Ala Thr Gln Val Asn Asn Gln Thr Arg Thr Phe Ile

500 505 510

Ser Glu Lys Phe Gly Asn Gln Gly Asp Ser Leu Arg Phe Glu Gln Asn

515 520 525

Asn Thr Thr Ala Arg Tyr Thr Leu Arg Gly Asn Gly Asn Ser Tyr Asn

530 535 540

Leu Tyr Leu Arg Val Ser Ser Ile Gly Asn Ser Thr Ile Arg Val Thr

545 550 555 560

Ile Asn Gly Arg Val Tyr Thr Ala Thr Asn Val Asn Thr Thr Thr Asn

565 570 575

Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn Ile

580 585 590

Gly Asn Val Val Ala Ser Ser Asn Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Asn

595 600 605

Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Gln Phe Asp Leu Met Asn Ile Met Leu

610 615 620

Val Pro Thr Asn Ile Ser Pro Leu Tyr

625 630

<210> 4

<211> 1950

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60

gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120

agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180

gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240

gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300

gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360

cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420

ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480

tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540

cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600

ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660

cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720

ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780

agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840

cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900

aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960

atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020

atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080

accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140

agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200

taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260

ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320

agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380

gagttcaaca acatcatccc cagcagccag atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440

aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500

cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560

cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620

atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680

ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740

agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800

cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860

cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920

accgactacc acatcgatca ggtgcgataa 1950

<210> 5

<211> 1818

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atggagaaca acatccagaa ccagtgcgtg ccgtacaact gcctgaacaa cccagaggtg 60

gagatcctga acgaggagag gagcaccggc aggctgccgc tggacatcag cctgagcctg 120

accaggttcc tgctgagcga gttcgtgcct ggcgtgggag tggccttcgg cctgttcgac 180

ctgatctggg gcttcatcac cccgagcgac tggagcctgt tcctgctaca gatcgagcag 240

ctgatcgagc agaggatcga gaccctggag aggaacaggg ccatcaccac cctgcgtggc 300

ctggccgaca gctacgagat ctacatcgag gccctgaggg agtgggaggc caacccgaac 360

aacgcacagc tgagggagga cgtgaggatc aggttcgcca acaccgacga cgccctgatc 420

accgccatca acaacttcac cctgaccagc ttcgagatcc cgctgctgag cgtgtacgtg 480

caggctgcca acctgcacct gagcctgctg agggacgccg tgagcttcgg ccagggctgg 540

ggcctggaca tcgccaccgt gaacaaccac tacaacaggc tgatcaacct gatccacagg 600

tacaccaagc actgcctgga cacctacaac cagggtctgg agaacctgag gggcaccaac 660

accaggcagt gggccaggtt caaccagttc aggagggacc tgaccctgac cgtgctggac 720

atcgtggccc tgttcccgaa ctacgacgtg aggacctacc cgatccagac cagcagccag 780

ctgaccaggg agatctacac cagcagcgtg atcgaggact caccggtgag cgccaacatc 840

ccgaacggct tcaacagggc cgagttcggc gtgaggcctc cgcacctgat ggacttcatg 900

aacagcctgt tcgtgaccgc cgagaccgtg aggagccaga ccgtgtgggg tggccacctg 960

gtgagcagca ggaacacagc tggcaacagg atcaacttcc cgagctacgg cgtgttcaac 1020

ccaggcggtg ccatctggat cgccgacgag gacccgaggc cgttctacag gaccctgagc 1080

gacccggtgt tcgtgagggg aggcttcggc aacccgcact acgtgctggg cctgcgaggg 1140

gtggccttcc agcagaccgg caccaaccac accaggacct tcaggaacag cggcaccatc 1200

gacagcctgg acgagatccc accgcaggac aacagcggtg ctccgtggaa cgactacagc 1260

cacgtgctga accacgtgac cttcgtgagg tggcctggcg agatcagcgg cagcgacagc 1320

tggagggctc cgatgttcag ctggacccac aggagcgcca ccccgaccaa caccatcgac 1380

ccggagagga tcacccagat cccgctggtg aaggctcaca ccctgcagag cggcaccacc 1440

gtggtgaggg gtccaggctt caccggtggc gacatcctga ggaggaccag cggaggccct 1500

ttcgcctaca ccatcgtgaa catcaacggc cagctgccgc agaggtacag ggccaggatc 1560

aggtacgcca gcaccaccaa cctgaggatc tacgtgaccg tggcaggcga gaggatcttc 1620

gctggccagt tcaacaagac gatggacaca ggcgacccgc tgaccttcca gagcttcagc 1680

tacgccacca tcaacaccgc cttcaccttc ccgatgagcc agagcagctt caccgtggga 1740

gccgacacct tcagcagcgg caacgaggtg tacatcgaca ggttcgagct gatccctgtg 1800

accgccaccc tggagtga 1818

<210> 6

<211> 1902

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

atggcttccg tgctcaactc cggccgcacc accatctgcg acgcctacaa cgtggccgct 60

cacgaccctt tctccttcca gcacaagtcc ctcgacaccg tgcagaagga gtggacagag 120

tggaagaaga acaaccactc tctctacctc gacccaatcg tgggcaccgt ggcctccttc 180

ctcctcaaga aggtgggctc cctcgtggga aagcgcatcc tctccgagct tcgcaacctc 240

atcttcccgt ccggctccac taacctcatg caggacatcc tccgcgagac cgagaagttc 300

ctcaaccagc gcctcaacac cgacactctc gctcgcgtga acgccgagct aaccggcctc 360

caggccaacg tggaggagtt caaccgtcag gtggacaact tcctcaaccc gaaccgcaac 420

gccgtgccgc tctccatcac ctcttccgtg aacaccatgc agcagctctt cctcaaccgc 480

cttccgcagt tccagatgca gggctaccag cttctcctac tccctctctt cgcccaggct 540

gccaacctcc acctctcttt catccgcgac gtgatcctca acgccgacga gtggggcatc 600

tccgctgcca ccctccgcac ctaccgcgac tacctcaaga actacacccg cgactactcc 660

aactactgca tcaacaccta ccagtccgcc ttcaagggcc tcaacacccg cctccacgac 720

atgctcgaat tccgcaccta catgttcctc aacgtgttcg agtacgtgtc catctggtcc 780

ctcttcaagt accagtccct cctcgtgtcc tccggcgcca acctctacgc ctccggctcc 840

ggcccgcagc agacccagtc cttcacctcc caggactggc cgttcctcta ctccctcttc 900

caggtgaact ccaactacgt gctcaacggc ttctccggcg cccgcctctc caacaccttc 960

ccgaacatcg tgggcctccc tggctccaca actacccacg ccctcctcgc cgctcgcgtg 1020

aactactccg gtggcatctc ttccggcgac atcggcgctt ccccgttcaa ccagaacttc 1080

aactgctcta ccttcctccc tccgctcctc acaccgttcg tgcgctcctg gctcgactcc 1140

ggctccgacc gcgagggcgt ggctaccgtg accaactggc agaccgagtc cttcgagacc 1200

accctcggcc tccgctccgg tgccttcacc gcacgcggca actccaacta cttcccggac 1260

tacttcatcc gcaacatctc cggcgtgccg ctcgtggtgc gcaacgagga cctccgtcgc 1320

ccactccact acaacgagat ccgcaacatc gcctccccgt ccggcacccc tggaggtgca 1380

cgcgcttaca tggtgtccgt gcacaaccgc aagaacaaca tccacgctgt gcacgagaac 1440

ggctccatga tccacctcgc tccaaacgac tacaccggct tcaccatctc cccgatccac 1500

gctacccagg tgaacaacca gacccgcacc ttcatctccg agaagttcgg caaccagggc 1560

gactctctcc gcttcgagca gaacaacacc accgctcgtt acaccctccg cggtaacggc 1620

aactcctaca acctctacct ccgcgtgtct tccatcggca actccaccat ccgcgtgacc 1680

atcaacggcc gtgtgtacac cgccacaaac gtgaacacca ccacaaacaa cgacggcgtg 1740

aacgacaacg gtgctcgctt ctccgacatc aacatcggca acgtggtggc ctcctccaac 1800

tccgacgtgc cgctcgacat caacgtgacc ctcaactctg gcacacagtt cgacctcatg 1860

aacatcatgc tcgtgccgac caacatctcc ccgctctact aa 1902

<210> 7

<211> 788

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile

530 535 540

Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Gly Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Asn Leu Lys Asp Tyr Gln Thr Ile Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu

645 650 655

Ala Trp Gly Asp Lys Phe Thr Ile Leu Glu Ile Lys Pro Ala Glu Asp

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro

675 680 685

Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn

690 695 700

Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser

705 710 715 720

Ile Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His

740 745 750

Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val

755 760 765

Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn

770 775 780

Val Ser Ile Lys

785

<210> 8

<211> 787

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asn Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Asn Asp Val

115 120 125

Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Met

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Asp Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Thr Leu Lys Val Lys Lys Asn Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Phe Ile Met Asn Glu His Leu Asp Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Ser Asn Glu Asp Ala Lys Ile Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Ala Tyr Gln Ala Lys Leu Lys Gln Asp Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Ala Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe Thr Lys Lys Met Asn

420 425 430

Ser Leu Arg Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Asp Ile Asp Leu Asn Lys Thr Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Ser Thr Leu Ser Ala Ser Thr Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Ile

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Ile Val Val

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Lys Leu Val Asn Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Val Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ile Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn Leu

530 535 540

Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Ser Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Ile Val Lys Gly Lys Ala Ser Ile Leu

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Lys Asn Gly Asp Cys Ile Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Gly Leu Glu Asp Phe Gln Thr Ile Thr Lys Ser Phe Ile Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Ser Ser Gly Val His Leu Ile Phe Asn Ser Gln Asn Gly Asp Glu

645 650 655

Ala Phe Gly Glu Asn Phe Thr Ile Ser Glu Ile Arg Leu Ser Glu Asp

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Ser Asp Ala Trp Val Gly Ser Gln

675 680 685

Gly Thr Trp Ile Ser Gly Asn Ser Leu Thr Ile Asn Ser Asn Val Asn

690 695 700

Gly Thr Phe Arg Gln Asn Leu Ser Leu Glu Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser

705 710 715 720

Met Asn Phe Asn Val Asn Gly Phe Ala Lys Val Thr Val Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Asn Tyr Pro Gln Leu Ser Pro Lys Asp

740 745 750

Ile Ser Glu Lys Phe Thr Thr Ala Ala Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val

755 760 765

Glu Leu Ser Arg Phe Thr Ser Gly Gly Ala Ile Asn Phe Arg Asn Phe

770 775 780

Ser Ile Lys

785

<210> 9

<211> 787

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Val Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Lys Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Met Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Ser Asp Met Asp Lys Leu Leu

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asn Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ile Ser Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn Leu

530 535 540

Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Ile Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Ile Asn Gly Thr Lys Val Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Val Gly Gly Lys Leu Lys Ser Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Ile Val Lys Gly Lys Ala Ser Ile Tyr

595 600 605

Leu Lys Asp Lys Lys Asn Glu Asn Ser Ile Tyr Glu Glu Ile Asn Asn

610 615 620

Asp Leu Glu Gly Phe Gln Thr Val Thr Lys Arg Phe Ile Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Ser Ser Gly Ile His Leu Ile Phe Thr Ser Gln Asn Gly Glu Gly

645 650 655

Ala Phe Gly Gly Asn Phe Ile Ile Ser Glu Ile Arg Thr Ser Glu Glu

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Met Ser Asp Ala Trp Val Gly Ser Gln

675 680 685

Gly Thr Trp Ile Ser Gly Asn Ser Leu Thr Ile Asn Ser Asn Val Asn

690 695 700

Gly Thr Phe Arg Gln Asn Leu Pro Leu Glu Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser

705 710 715 720

Met Asn Phe Thr Val Asn Gly Phe Gly Lys Val Thr Val Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Ser Tyr Pro Gln Leu Ser Pro Lys Asp

740 745 750

Ile Ser Glu Lys Phe Thr Thr Ala Ala Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val

755 760 765

Glu Leu Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Ala Ile Asn Phe Arg Asp Phe

770 775 780

Ser Ile Lys

785

<210> 10

<211> 2367

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

atgaacaaga acaacaccaa gctgagcacc agggccctgc cgagcttcat cgactacttc 60

aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120

gacaccggtg gcaacctgac cctggacgag atcctgaaga accagcagct gctgaacgag 180

atcagcggca agctggacgg cgtgaacggc agcctgaacg acctgatcgc ccagggcaac 240

ctgaacaccg agctgagcaa ggagatcctg aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctg 300

aacgacgtga acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcacatcta cctgccgaag 360

atcaccagca tgctgagcga cgtgatgaag cagaactacg ccctgagcct gcagatcgag 420

tacctgagca agcagctgca ggagatcagc gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtg 480

ctgatcaaca gcaccctgac cgagatcacc cctgcctacc agaggatcaa gtacgtgaac 540

gagaagttcg aggagctgac cttcgccacc gagaccaccc tgaaggtgaa gaaggacagc 600

agcccagccg acatcctgga cgagctgacc gagctgaccg agctggccaa gagcgtgacc 660

aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720

aacaacctgt tcggcaggag cgccctgaag accgccagcg agctgatcgc caaggagaac 780

gtgaagacca gcggcagcga ggtgggcaac gtgtacaact tcctgatcgt gctgaccgcc 840

ctgcaggcca aggccttcct gaccctgacc acctgcagga agctgctggg cctggctgac 900

atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ctgaacaagg agaaggagga gttcagggtg 960

aacatcctgc cgaccctgag caacaccttc agcaacccga actacgccaa ggtgaagggc 1020

agcgacgagg acgccaagat gatcgtggag gccaagccag gccacgccct ggtgggcttc 1080

gagatgagca acgacagcat caccgtgctg aaggtgtacg aggccaagct gaagcagaac 1140

taccaggtgg acaaggacag cctgagcgag gtgatctacg gcgacaccga caagctgttc 1200

tgcccggacc agagcgagca gatctactac accaacaaca tcgtgttccc gaacgagtac 1260

gtgatcacca agatcgactt caccaagaag atgaagaccc tgaggtacga ggtgaccgcc 1320

aacttctacg acagcagcac cggcgagatc gacctgaaca agaagaaggt ggagagcagc 1380

gaggccgagt acaggaccct gagcgccaac gacgacggcg tgtacatgcc gctgggcgtg 1440

atcagcgaga ccttcctgac cccgatcaac ggcttcggcc tgcaggccga cgagaacagc 1500

aggctgatca ccctgacctg caagagctac ctgagggagc tgctgctggc caccgacctg 1560

agcaacaagg agaccaagct gatcgtgcca ccgagcggct tcatcagcaa catcgtggag 1620

aacggcagca tcgaggagga caacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680

gtggaccaca ccggtggcgt gaacggcacc aaggccctgt acgtgcacaa ggacggtggc 1740

ttcagccagt tcatcggcga caagctgaag ccgaagaccg agtacgtgat ccagtacacc 1800

gtgaagggca agccgagcat ccacctgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860

gacaccaaca acaacctgaa ggactaccag accatcacca agaggttcac caccggcacc 1920

gacctgaagg gcgtgtacct gatcctgaag agccagaacg gcgacgaggc ctggggcgac 1980

aagttcacca tcctggagat caagcctgcc gaggacctgc tgagcccgga gctgatcaac 2040

ccgaacagct ggatcaccac ccctggtgcc agcatcagcg gcaacaagct gttcatcaac 2100

ctgggcacca acggcacctt caggcagagc ctgagcctga acagctacag cacctacagc 2160

atcagcttca ccgccagcgg cccgttcaac gtgaccgtga ggaacagcag ggaagtgctg 2220

ttcgagagga gcaacctgat gagcagcacc agccacatca gcggcacctt caagaccgag 2280

agcaacaaca ccggcctgta cgtggagctg agcaggagga gcggtggcgg aggccacatc 2340

agcttcgaga acgtgagcat caagtag 2367

<210> 11

<211> 2367

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

atgaacatga acaacaccaa gctcaacgct cgtgccctcc cgtccttcat cgactacttc 60

aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120

gacaccggag gcaacctcac cctcgacgag atcctcaaga accagcagct cctcaacgag 180

atttccggca agctcgacgg cgtgaacggc tccctcaacg acctcatcgc ccagggcaac 240

ctcaacaccg agctgtccaa ggagatcctc aagatcgcca acgagcagaa ccaggtgctc 300

aacgacgtga acaacaagct caacgccatc aacaccatgc tccacatcta cctcccgaag 360

atcacctcca tgctcaacga cgtgatgaag cagaactacg ccctctccct ccagatcgag 420

tacctctcca agcagctcca ggagatttcc gacaagctcg acgtgatcaa cgtgaacgtg 480

ctcatcaact ccaccctcac cgagatcacc cctgcctacc agcgcatgaa gtacgtgaac 540

gagaagttcg aggacctcac cttcgccacc gagaccaccc tcaaggtgaa gaagaactcc 600

tcccctgccg acatcctcga cgagctgacc gagctgaccg agctggccaa gtccgtgacc 660

aagaacgacg tggacggctt cgagttctac ctcaacacct tccacgacgt gatggtgggc 720

aacaacctct tcggacgctc cgccctcaag accgcctccg agctgatcgc caaggagaac 780

gtgaagacct ccggctccga ggtgggcaac gtgtacaact tcctcatcgt gctcaccgct 840

ctccaggcca aggccttcct caccctcacc acctgccgca agctcctcgg cctcgccgac 900

atcgactaca ccttcatcat gaacgagcac ctcgacaagg agaaggagga gttccgcgtg 960

aacatcctcc cgaccctctc caacaccttc tccaacccga actacgccaa ggccaagggc 1020

tccaacgagg acgccaagat catcgtggag gccaagccag gctacgccct cgtgggcttc 1080

gagatgtcca acgactccat caccgtgctc aaggcctacc aggccaagct caagcaggac 1140

taccaggtgg acaaggactc cctctccgag atcgtgtacg gcgacatgga caagctcctc 1200

tgccctgacc agtccgagca aatctactac accaacaaca tcgccttccc gaacgagtac 1260

gtgatcacca agatcacctt caccaagaag atgaactccc tccgctacga ggccacagcc 1320

aacttctacg actcctccac aggcgacatc gacctcaaca agaccaaggt ggagtcctcc 1380

gaggccgagt actccaccct ctctgcctcc accgacggcg tgtacatgcc gctcggcatc 1440

atctccgaga ccttcctcac cccgatcaac ggcttcggca tcgtggtgga cgagaactcc 1500

aagctcgtga acctcacctg caagtcctac ctccgcgagg tgctcctcgc caccgacctc 1560

tccaacaagg agaccaagct catcgtgccg ccgatcggct tcatctccaa catcgtggag 1620

aacggcaacc tggagggcga gaacctggag ccgtggaagg ccaacaacaa gaacgcctac 1680

gtggaccaca ccggtggcgt gaacggcacc aaggccctct acgtgcacaa ggacggcgag 1740

ttctcccagt tcatcggcga caagctcaag tccaagaccg agtacgtgat ccagtacatc 1800

gtgaagggca aggcctccat cctcctcaag gacgagaaga acggcgactg catctacgag 1860

gacaccaaca acggcctgga ggacttccag accatcacca agtccttcat caccggcacc 1920

gactcctctg gcgtgcacct catcttcaac tcccagaacg gcgacgaggc cttcggcgag 1980

aacttcacca tctccgagat ccgcctctcc gaggacctcc tctccccgga gctgatcaac 2040

tccgacgcct gggtgggctc ccagggcacc tggatctccg gcaactccct caccatcaac 2100

tccaacgtga acggcacctt ccgccagaac ctctccctgg agtcctactc cacctactcc 2160

atgaacttca acgtgaacgg cttcgccaag gtgaccgtgc gcaactctcg cgaggtgctc 2220

ttcgagaaga actacccgca gctctcccca aaggacatct ccgagaagtt caccaccgct 2280

gccaacaaca ccggcctcta cgtggagctg tcccgcttca cctccggtgg agccatcaac 2340

ttccgcaact tctccatcaa gtagtga 2367

<210> 12

<211> 2364

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

atgaatatga ataatactaa attaaacgca agggccctac cgagttttat tgattatttt 60

aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120

gatacaggtg gtaatctaac cttagacgaa atcctaaaga atcagcagtt actaaatgag 180

atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240

ttaaatacag aattatctaa ggaaatctta aaaattgcaa atgaacagaa tcaagtctta 300

aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcatatata tctacctaaa 360

atcacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg cgctaagtct gcaagtagaa 420

tacttaagta aacaattgaa agaaatttct gataaattag atgttattaa cgtaaatgtt 480

cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcatatc aacggattaa atatgtaaat 540

gaaaaatttg aagaattaac ttttgctaca gaaaccactt taaaagtaaa aaaggatagc 600

tcgcctgctg atattcttga cgagttaact gaattaactg aactagcgaa aagtgttaca 660

aaaaatgacg tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720

aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcttcag aattaattgc taaagaaaat 780

gtgaaaacaa gtggcagtga agtaggaaat gtttataatt tcttaattgt attaacagct 840

ctacaagcaa aggcttttct tactttaaca acatgccgaa aattattagg cttagcagat 900

attgattata catctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960

aacatccttc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgcaaa agttaaagga 1020

agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gacatgcatt ggttgggttt 1080

gaaattagta atgattcaat gacagtatta aaagtatatg aagctaagct aaaacaaaat 1140

taccaagttg ataaggattc cttatcggaa gtcatttata gtgatatgga taaattattg 1200

tgcccagatc aatctgaaca aatttattat acaaataata tagtatttcc aaatgaatat 1260

gtaattacta aaattgattt tactaagaaa atgaaaactt taagatatga ggtaacagct 1320

aattcttacg attcttctac aggagaaatt gacttaaata agaagaaagt agaatcaagt 1380

gaagcggagt ataggacgtt aagtgctaat aatgatggag tatatatgcc gttaggtgtc 1440

atcagtgaaa catttttgac tccaattaat ggatttggcc tccaagctga tgaaaattca 1500

agattaatta ctttaacatg taaatcatat ttaagggaac tactactagc gacagactta 1560

agcaataaag aaactaaatt gattgtcccg cctattagtt ttattagtaa tattgtagaa 1620

aatgggaact tagagggaga aaacttagag ccgtggatag caaataacaa aaatgcgtat 1680

gtagatcata caggtggtat aaatggaact aaagttttat atgttcataa ggatggtgag 1740

ttttcacaat ttgttggagg taagttaaaa tcgaaaacag aatatgtaat tcaatatatt 1800

gtaaagggaa aggcttctat ttatttaaaa gataaaaaaa atgagaattc catttatgaa 1860

gaaataaata atgatttaga aggttttcaa actgttacta aacgttttat tacaggaacg 1920

gattcttcag ggattcattt aatttttacc agtcaaaatg gcgagggagc atttggagga 1980

aactttatta tctcagaaat taggacatcc gaagagttat taagtccaga attgattatg 2040

tcggatgctt gggttggaag ccagggaact tggatctcag gaaattctct cactattaat 2100

agtaatgtaa atggaacctt tcgacaaaat cttccgttag aaagttattc aacctatagt 2160

atgaacttta ctgtgaatgg atttggcaag gtgacagtaa gaaattctcg tgaagtatta 2220

tttgaaaaaa gttatccgca gctttcacct aaagatattt ctgaaaaatt tacaactgca 2280

gccaataata ccggattata tgtagagctt tctcgctcaa cgtcgggtgg tgcaataaat 2340

ttccgagatt tttcaattaa gtaa 2364

<210> 13

<211> 2010

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

gcatgcctac agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca 60

tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt 120

tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta 180

caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac 240

aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc 300

cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca 360

tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc 420

tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt 480

tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat 540

taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc 600

cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga 660

agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac 720

cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc 780

cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg gattcctttc 840

ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac 900

cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa 960

atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct 1020

ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt 1080

catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat 1140

gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat 1200

cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt 1260

tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc 1320

gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt 1380

cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat 1440

ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc 1500

gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt 1560

ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg 1620

gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt 1680

gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta 1740

tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca 1800

tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt 1860

gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct 1920

gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt 1980

ttggtgttac ttctgcaggt cgactctaga 2010

<210> 14

<211> 253

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atc 253

Claims

1.一种管理玉米螟对Bt杀虫蛋白抗性的方法，其特征在于所述的方法通过在同一植物细胞中同时表达至少一种Bt杀虫晶体蛋白Cry和至少一种Bt营养期杀虫蛋白Vip3实现；所述Bt杀虫晶体蛋白Cry包括Cry1Ab、Cry1F、Cry2Ab中的一种；所述Bt营养期杀虫蛋白Vip3包括Vip3Af、Vip3Ag、Vip3Ab中的任意一种；Cry1Ab氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示； Cry1F氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；Cry2Ab氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述Vip3Af氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；Vip3Ag氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；Vip3Ab氨基酸序列如SEQID NO:9所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括：（1）构建同时含Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框和Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框的转化载体，再将转化载体的T-DNA导入到植物细胞中，获得能够表达Bt杀虫蛋白的转基因植物细胞，进而延缓玉米螟对Bt毒素抗性发生；（2）分别构建含Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框的转化载体和含Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框的转化载体，并分别将各个转化载体的T-DNA导入到植物细胞中，分别获得表达Bt杀虫晶体蛋白Cry的转基因植物细胞和表达Bt营养期杀虫蛋白Vip3的转基因植物细胞，然后将两种转基因植物细胞通过植物杂交产生同时表达Bt杀虫晶体蛋白Cry和Bt营养期杀虫蛋白Vip3的转基因植物细胞，进而延缓玉米螟对Bt毒素抗性发生。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因的表达框由启动子、编码基因和终止子构成，所述的启动子包括玉米泛素启动子pZmUbi、花椰菜花叶病毒 35s启动子pCaMV 35s；所述的终止子包括农杆菌烟脂碱合成酶终止子tNOS，花椰菜花叶病毒 35s RNA的终止子TCaMV 35s。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因的表达框由启动子、编码基因和终止子构成，所述的启动子包括玉米泛素启动子pZmUbi、花椰菜花叶病毒 35s启动子pCaMV 35s；所述的终止子包括农杆菌烟脂碱合成酶终止子tNOS，花椰菜花叶病毒 35s RNA的终止子TCaMV 35s。

5.一种用于权利要求1所述管理玉米螟对Bt杀虫蛋白抗性的转化载体，其特征在于所述转化载体含Bt杀虫晶体蛋白Cry编码基因表达框和Bt营养期杀虫蛋白Vip3编码基因表达框。

6.如权利要求5所述的转化载体，其特征在于所述Bt杀虫晶体蛋白Cry包括Cry1Ab、Cry1F、Cry2Ab中的一种；所述Bt营养期杀虫蛋白Vip3包括Vip3Af、Vip3Ag、Vip3Ab中的任意一种。