CN105017391A - 抗虫蛋白、抗虫融合蛋白、编码基因、载体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗虫蛋白、抗虫融合蛋白、编码基因、载体及应用，抗虫蛋白的氨基酸序列与SEQ？ID？NO:1相比具有90％的同源性；所述抗虫融合蛋白从N端到C端依次含有BT晶体毒素Cry1蛋白和抗虫蛋白Cry2Aj；本发明首次公开了一种具有高杀虫能力的BT晶体毒素Cry2Aj蛋白，并且设计了用一个Cry1Ab晶体毒素与该Cry2Aj晶体毒素融合成的人工蛋白质分子，与原先的Cry1和Cry2晶体毒素物理混合相比，具有如下优点：杀虫活性提高了10倍以上，杀虫谱更广；本发明的杀虫蛋白质可以杀灭棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫；此外，本发明发现的融合蛋白质还可以有效的减缓害虫抗性的发生。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种具有高杀虫能力的抗虫基因和抗虫蛋白质、一种具有高杀虫能力的抗虫融合基因和融合蛋白质、以及用该抗虫蛋白或抗虫融合蛋白构建抗虫农作物的具体应用。
(二)背景技术
害虫给全球农业生产带来每年约80亿美元的损失。水稻害虫种类复杂，自播种、秧苗期至成熟期，由种、苗、根、茎、叶、花穗、谷粒均可受不同害虫危害。国内已知的水稻害虫已达385余种，其中最主要的有40余种，如三化螟、二化螟和大螟等分布广泛，危害严重。目前，害虫的防治主要是依靠化学农药，化学农药的使用对于农业持续稳定的发展发挥了重要作用。但是，在经过半个多世纪的使用之后，化学农药已经暴露出了严重的问题。例如化学农药在自然界和农作物中的残留以及在食物链中的富积已经造成了严重的环境污染，对人畜安全直接构成威胁；由于化学农药非特异性的作用方式，杀死靶标害虫的同时也对毒害了许多益虫和捕虫鸟类，破坏了生态平衡；并且由于长期使用化学农药，特别是不合理的滥用，许多害虫已逐步对其产生了抗性(林良斌等,1997)，常规剂量已不能有效地防治害虫，然而随着用药剂量的加大，害虫的抗性也随之增强，由此形成恶性循环，导致防治成本显著增加，并且带来了更为严重的环境污染、生态失调和人类健康的危害。
近年来，随着分子生物学技术特别是植物基因工程的迅速发展，为防治农作物害虫提供了新的途径。抗虫是目前农作物转基因改良领域中应用最广泛的技术之一，国际上的主要农业生物技术公司和种子公司都在从事该方面的研发，并且已经取得了革命性的进展。利用基因工程技术，将抗虫基因导入农作物，使其在农作物体内表达抗虫蛋白并能稳定遗传，形成抗虫转基因农作物新品系。种植转基因抗虫农作物大幅度降低了化学农药的使用量，减少了害虫造成的损失，为农业生产创造了巨大的价值。目前应用于农作物抗虫性状改良的外源基因主要有苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)杀虫基因、植物凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因等。其中Bt杀虫基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因，Bt蛋白对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫都具有很好的杀虫活性。
获得转基因抗虫农作物的关键技术是获得性能优良的杀虫蛋白质。杀虫蛋白质有多种，比较常用的是苏云金芽孢杆菌(简称Bt)晶体蛋白质，例如Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ab等，它们已被大量运用于转基因抗虫农作物(Crickmore N,Zeigler D,FeitelsonJ,Schnepf E,Van Rie J,Lereclus D,Baum J,Dean D.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62,807-813)。但是，单个杀虫蛋白质往往杀虫谱比较窄，杀虫活性比较低。同时，长期大量使用单一的杀虫蛋白质还可能引起害虫抗性的发展(Ferre J,Van Rie J.(2002)Annu.Rev.Entomol.47,501-533；Gassmann A,Carrière Y,Tabashnik B.(2009)Annu.Rev.Entomol.54,147-163)。因此，获得具有高杀虫活性的新型蛋白质杀虫毒素，对提高杀虫能力和减缓害虫抗性的发生具有重要的应用价值(Chen,M.,Shelton,A.,Ye,G.(2011)Annu.Rev.Entomol.56,81-101)。
相比单个基因的转化，多个基因的聚合使用在转基因作物中具有明显的优势。所谓基因聚合就是指在同种作物品种中转入两个不同的抗虫基因。这两个基因可以是两种不同的Bt基因，也可以是一种Bt基因和一种非Bt抗虫基因，例如Cheng等在转基因水稻中表达Bt融合蛋白基因Cry1AbCry1Ac，对于二化螟防治效果良好(Cheng XY,Sardana R,Kaplan H,Altosaar I.(1998)Proc Natl Acad Sci USA.95,2767-2772)；Bohorova等将融合基因cry1Bcry1Ab转入玉米中来防治多种农业害虫(Bohorova N,Frutos R,Royer M,P,Pacheco M,Rascon Q,McLean S,Hoisington D.(2011)Thoer Appl Genet.103,817-826)。使用二价或多价抗虫基因相对于单个基因有以下几个方面的优势：杀虫效果更好，经济实用；杀虫谱更广，多个抗虫基因之间杀虫谱可以互相弥补，不同的基因对同种害虫的杀虫效果也存在差异，可以相互补充；可以有效延缓抗性品种的使用寿命，理论上昆虫同时对两种不同的Bt基因同时产生抗性的几率大大低于对单个Bt基因产生抗性的几率，因而能有效延缓昆虫产生抗性的时间。因此，同时使用无交互抗性的Bt毒素对于治理昆虫抗性是一种经济而有效的措施，必须加快发展利用抗虫融合基因创建具有更好抗虫活性的转基因农作物。
然而，本领域的技术人员都知道，并不是所有的两个杀虫基因的融合都能够增强杀虫能力的。例如Cry1Ab和Cry1Ca的融合蛋白质的杀虫能力比相同重量的单独Cry1Ab和Cry1Ca的混合物的杀虫能力还要低。另外，即使两个单独的抗虫蛋白质组合使用具有增效作用，但也并不能得出它们的融合蛋白具有高效杀虫能力；这是因为：在蛋白质生物化学上，两个单独蛋白质的物理混和与融合是不同的，不能根据物理混和所具有的增效作用来肯定融合后所获得的增效作用；而且在不同位置融合所得的融合蛋白的活性是大相径庭的。
本发明首次公开了一种具有高杀虫能力的BT晶体毒素Cry2蛋白质，并且设计了用一个Cry1晶体毒素与该Cry2晶体毒素融合成的人工蛋白质分子，与原先的Cry1和Cry2晶体毒素物理混合相比，具有如下优点：杀虫活性提高了10倍以上，杀虫谱更广。本发明的杀虫蛋白质可以杀灭棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫。此外，本发明发现的融合蛋白质还可以有效的减缓害虫抗性的发生。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种具有高杀虫能力的抗虫蛋白及抗虫融合蛋白，以及在抗虫药物及抗虫农作物中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种抗虫蛋白，所述抗虫蛋白(Cry2Aj)的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有90％的同源性，更优选所述氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
本发明还涉及所述抗虫蛋白编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。
本发明涉及一种由所述抗虫蛋白编码基因构建的重组载体，以及由重组载体转化制备的重组工程菌。
本发明提供一种所述抗虫蛋白在制备抗虫药物中的应用，所述虫为水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫，如棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等。
本发明提供一种所述抗虫蛋白在制备抗虫植物细胞中的应用，所述植物为水稻、玉米、棉花、小麦、高粱、大豆、油菜、萝卜或甘蓝等农作物。
此外，本发明还提供一种含所述抗虫蛋白的抗虫融合蛋白，所述抗虫融合蛋白从N端到C端依次含有BT晶体毒素Cry1蛋白和抗虫蛋白(Cry2Aj)，优选所述抗虫融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，更优选所述融合蛋白是由SEQ ID NO:1所示蛋白Cry2Aj与SEQ ID NO:5所示蛋白Cry1Ab连接构成，其中蛋白Cry1Ab编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示，该融合蛋白从N端至C端依次为Cry1Ab晶体毒素和抗虫蛋白Cry2Aj。
本发明涉及一种所述的抗虫融合蛋白的编码基因，所述编码基因与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列相比具有92％以上的同源性，更优选所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。抗虫融合基因包括从5’-3’依次含有编码BT晶体毒素Cry1的核苷酸序列和编码抗虫蛋白Cry2Aj的核苷酸序列，且这两个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内，其中BT晶体毒素Cry1为Cry1Ab、Cry1Ac或Cry1Aa及其修饰改良基因。
本发明提供一种由所述抗虫融合蛋白编码基因构建的重组载体，以及由重组载体转化制备的重组工程菌。
本发明涉及一种所述抗虫融合蛋白在制备抗虫药物中的应用，所述虫为水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫，如棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等。
本发明涉及一种所述抗虫融合蛋白在制备抗虫植物细胞中的应用，所述植物为水稻、玉米、棉花、小麦、高粱、大豆、油菜、萝卜或甘蓝等农作物。
本发明所述抗虫蛋白、抗虫融合蛋白在制备抗虫植物细胞中的应用，具体为：将含抗虫蛋白编码基因或抗虫融合蛋白编码基因的载体转入农杆菌中，然后用农杆菌侵染植物细胞或植物组织，从而获得具有抗虫性能的植物细胞或植物组织。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明首次公开了一种具有高杀虫能力的BT晶体毒素Cry2Aj蛋白，并且设计了用一个Cry1Ab晶体毒素与该Cry2Aj晶体毒素融合成的人工蛋白质分子，与原先的Cry1和Cry2晶体毒素物理混合相比，具有如下优点：杀虫活性提高了10倍以上，杀虫谱更广；本发明的杀虫蛋白质可以杀灭棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫。此外，本发明发现的融合蛋白质还可以有效的减缓害虫抗性的发生。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology和J.Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的MolecularCloning：ALabortory Manual，3rd ED.等文献均有详细的说明。
实施例1、Cry2Aj基因的获得及表达载体构建
编码Cry2Aj杀虫蛋白的基因委托上海生工合成，其DNA序列为SEQ ID NO：2。Cry2Aj基因被克隆到表达载体pET28a(Novagen,Cambridge,UK)中限制性内切酶BamHI和SacI的位点之间，得到的载体命名为pET-2Aj，Cry2Aj基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质。
说明：SEQ ID NO：2核酸序列的表达框从第一个起始密码子(ATG)开始，到最后终止密码子(TAA)前结束，长度为1902bp。第一个ATG前的核酸序列GGATCC为BamHI酶切位点，其后的ACC为核糖体结合位点，最后GAGCTC为SacI酶切位点。
实施例2、Cry1Ab-Cry2Aj融合基因的获得及表达载体构建
编码Cry1Ab-Cry2Aj的杀虫蛋白的融合基因由上海生工合成，在Cry1Ab和Cry2Aj之间是一个连接肽，其氨基酸序列是PGKGGG。Cry1Ab-Cry2Aj融合基因的DNA序列为SEQ ID NO：4。Cry1Ab-Cry2Aj融合基因被克隆到表达载体pET28a中限制性内切酶BamHI和SacI的位点之间，得到的载体命名为pET-1Ab-2Aj，Cry1Ab-Cry2Aj融合基因编码一个氨基酸序列为SEQ ID No：3的融合蛋白质。
因实验需要，委托上海生工合成Cry1Ab基因，其DNA序列为SEQ ID NO：6。Cry1Ab基因被克隆到表达载体pET28a中限制性内切酶BamHI和SacI的位点之间，得到的载体命名为pET-1Ab，Cry1Ab基因编码一个氨基酸序列为SEQ ID NO：5的蛋白质。
说明：SEQ ID NO：4核酸序列的表达框从第一个起始密码子(ATG)开始，到最后终止密码子(TAA)前结束，长度为3864bp。第一个ATG前的核酸序列GGATCC为BamHI酶切位点，其后的ACC为核糖体结合位点，最后GAGCTC为SacI酶切位点。
SEQ ID NO：6核酸序列的表达框从第一个起始密码子(ATG)开始，到最后终止密码子(TAA)前结束，长度为1950bp。第一个ATG前的核酸序列GGATCC为BamHI酶切位点，其后的ACC为核糖体结合位点，最后GAGCTC为SacI酶切位点。
实施例3、杀虫蛋白质的制备
包含杀虫基因的载体pET-1Ab、pET-2Aj和pET-1Ab-2Aj分别导入BL21Star(Escherichia coli)细胞系，在包含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养选取单克隆。单个菌落接种到100毫升LB细菌培养液，在37℃下震动培养至OD600＝0.6，然后加IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactoside)至浓度为0.5mM，并继续在同样的条件下培养4小时。培养液经过5000g离心10分钟沉淀大肠杆菌细胞，然后弃上清收集沉淀。沉淀中加30毫升pH7.0、20mM Tris-HCl缓冲液，超声破碎，分别获得杀虫蛋白Cry1Ab、杀虫蛋白Cry 2Aj和杀虫蛋白Cry 1Ab-Cry 2Aj。这样获得
的重组蛋白质用来进行杀虫活性的测定。
(1)LB固体培养基组成为：
LB细菌培养液组成为：
实施例4、在大肠杆菌中表达的杀虫蛋白的杀虫活性测定
实施例3所获得的杀虫蛋白Cry1Ab、杀虫蛋白Cry 2Aj和杀虫蛋白Cry 1Ab-Cry2Aj各100微升单独或者混合涂在0.5平方厘米昆虫人工饲料的表面，饲养新生一龄幼虫用来进行杀虫活性测定。以含有pET28a空载体的BL21Star为阴性对照，准备方法与实施例3类同。饲养7天以后统计杀虫率，结果如表1所示。
表1、Cry1Ab、Cry2Aj和Cry1Ab-Cry2Aj的杀虫率
所述昆虫人工饲料制备方法为：(1)将玉米面1200g、黄豆面600g、酵母粉540g放入牛皮纸袋，再放入烘箱中120℃2小时。(2)将步骤(1)烘好的原料与300g白糖放入一小锅内，在大锅内烧水6000ml，温水时向小锅内放入大锅一半的温水，用勺子搅拌均匀，同时将100g琼脂粉放入大锅内，放入11g山梨酸和11g对羟基苯甲酸甲酯，熬到开锅，搅拌，加入小锅内的东西，熬，加入KOH(22.4g+100ml水)，再加10％甲醛90ml(40％甲醛30ml+90ml水)，再加乙酸240ml(180ml冰乙酸+320ml水，然后取40ml上述乙酸溶液再+200ml水)放入锅内，搅拌均匀，加入37.5g抗坏血酸和90ml维生素，搅拌均匀，分装到4个白瓷盘中，置于4度冰箱备用。
结果表明，Cry2Aj对棉铃虫有100％的杀虫活性，对玉米螟有80％的杀虫活性；融合蛋白质Cry1Ab-Cry2Aj的杀虫活性比单独的Cry2Aj或者Cry1Ab明显提高，同时也比Cry1Ab和Cry2Aj混合的杀虫活性明显提高。
实施例5、农杆菌转化T-DNA载体的构建
农杆菌转化T-DNA载体是基于pCambia 1300(CAMBIA,Canberra,Australia)载体而构建的。编码杀虫蛋白质的合成核苷酸序列Cry2Aj(SEQ ID No：2，5’端被设计上BamHI位点，3’端被设计上SacI位点，BamHI-SacI酶切片段)和Cry1Ab-Cry2Aj(SEQ ID No：4，5’端被设计上BamHI位点，3’端被设计上SacI位点，BamHI-SacI酶切片段)，分别与玉米的pepc终止子(SEQ ID No：8，5’端被设计上SacI位点，3’端被设计上KpnI位点，SacI-KpnI酶切片段)连接，获得包括基因和终止子的BamHI-KpnI片段。
玉米ubiquitin-1启动子从玉米的基因组中通过PCR获得，使用的引物分别是：
ZmUbiF(5’GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC，添加了HindIII位点，SEQ ID No：9)。
ZmUbiR(5’GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG，添加了BamHI位点，SEQ ID No：10)。
玉米ubiquitin-1启动子(SEQ ID No：7)经过HindIII和BamHI酶切后和基因-终止子片段(BamHI-KpnI片段)共同连接到经过HindIII和KpnI酶切的pCambia1300载体中，获得T-DNA载体pCAM-Cry2Aj和pCAM-Cry1Ab-Cry2Aj。由于玉米ubiquitin-1启动子在禾本科植物中均有启动子活性，pCAM-Cry2Aj和pCAM-Cry1Ab-Cry2Aj可以作为多种禾本科植物的抗虫转化T-DNA载体。
实施例6、转Cry2Aj基因及Cry1Ab-Cry2Aj融合基因水稻的获得
转基因植物的获得方法是采用现有技术(卢雄斌龚祖埙，1998生命科学10：125-131；刘凡等，2003分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取含T-DNA载体pCAM-Cry2Aj和pCAM-Cry1Ab-Cry2Aj的农杆菌划板，挑单菌落接种，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含抗生素的筛选培养基上，筛选培养(50ng/mL潮霉素)两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织转移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，分别获得含基因Cry2Aj和基因Cry1Ab-Cry2Aj的植株，作为鉴定材料。
实施例7、转Cry2Aj基因及Cry1Ab-Cry2Aj融合基因玉米的获得
玉米转化方法基本按照Ishida的方法(Yuji Ishida,Hideaki Saito,Shozo Ohta,Yukoh Hiei,Toshihiko Komari&Takashi Kumashiro,1996,High efficiencytransformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens.NatureBiotechnlogy,14:745-750)。取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。分别将含有T-DNA载体pCAM-Cry2Aj和pCAM-Cry1Ab-Cry2Aj的农杆菌与未成熟胚共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(含200mg/L的Timentin杀农杆菌)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有50ng/mL潮霉素的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。
转移所有的组织到新鲜潮霉素的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，分别获得含基因Cry2Aj和基因Cry1Ab-Cry2Aj的植株。
实施例8、转基因农作物抗虫能力的测定
利用二化螟和稻纵卷叶螟分别测定了通过实施例6获得的10个转基因水稻的杀虫活性。新生二化螟的一龄幼虫取食转Cry2Aj基因水稻后，有4个株系的致死率是100％。稻纵卷叶螟的一龄幼虫取食转Cry2Aj基因水稻后，有6个株系的致死率是100％；新生二化螟的一龄幼虫取食转Cry1Ab-Cry2Aj融合基因水稻后，有8个株系的致死率是100％。稻纵卷叶螟的一龄幼虫取食转Cry1Ab-Cry2Aj融合基因水稻后，有9个株系的致死率是100％。
利用玉米螟和棉铃虫分别测定了通过实施例7获得的10个转基因玉米株系的杀虫活性。新生玉米螟一龄幼虫取食10个转Cry2Aj基因玉米株系后，有8个株系100％死亡，其他2个株系对玉米螟杀灭活性在20％到50％之间。新生棉铃虫一龄幼虫取食10个转Cry2Aj基因玉米株系后，10个株系全部100％死亡；
新生玉米螟一龄幼虫取食10个转Cry1Ab-Cry2Aj融合基因玉米株系后，10个株系全部100％死亡。新生棉铃虫一龄幼虫取食10个转Cry1Ab-Cry2Aj融合基因玉米株系后，10个株系全部100％死亡。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种抗虫蛋白，其特征在于：所述抗虫蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有90％的同源性。
2.如权利要求1所述抗虫蛋白，其特征在于：所述抗虫蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示。
3.一种编码权利要求1或2所述抗虫蛋白的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。
4.一种由权利要求2所述抗虫蛋白编码基因构建的重组载体。
5.一种权利要求1所述抗虫蛋白在制备抗虫植物细胞中的应用。
6.一种含权利要求1所述抗虫蛋白的抗虫融合蛋白，其特征在于所述抗虫融合蛋白从N端到C端依次含有BT晶体毒素Cry1蛋白和抗虫蛋白。
7.如权利要求6所述含抗虫蛋白的抗虫融合蛋白，其特征在于所述抗虫融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示。
8.一种权利要求6所述的抗虫融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。
9.一种由权利要求8所述抗虫融合蛋白编码基因构建的重组载体。
10.一种权利要求6或7所述抗虫融合蛋白在制备抗虫植物细胞中的应用。
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