CN105755024A - Als突变型基因及其蛋白和应用 - Google Patents

Als突变型基因及其蛋白和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105755024A
CN105755024A CN201610225976.8A CN201610225976A CN105755024A CN 105755024 A CN105755024 A CN 105755024A CN 201610225976 A CN201610225976 A CN 201610225976A CN 105755024 A CN105755024 A CN 105755024A
Authority
CN
China
Prior art keywords
als
nucleotide
green plants
mutated genes
albumen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610225976.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105755024B (zh
Inventor
张保龙
陈天子
凌溪铁
王金彦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Academy of Agricultural Sciences filed Critical Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610225976.8A priority Critical patent/CN105755024B/zh
Publication of CN105755024A publication Critical patent/CN105755024A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105755024B publication Critical patent/CN105755024B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
    • A01N47/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=CX2 groups, e.g. isothiourea
    • A01N47/44—Guanidine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种ALS突变型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C；和/或第339位核苷酸由A变成核苷酸C；和/或第710位核苷酸由C突变为核苷酸T。本发明还公开了一种ALS突变型基因所编码的ALS蛋白及其应用。该蛋白来源于抗ALS抑制剂类除草剂的水稻突变体植株，与水稻野生型ALS序列相比，其蛋白序列在Gln25、Gln113或Ala237位点发生突变。绿色植物表达该蛋白序列可以抗（耐）乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂，特别是咪唑啉酮和磺酰脲类除草剂。

Description

ALS突变型基因及其蛋白和应用
技术领域
本发明属于植物蛋白和植物抗除草剂领域。具体而言，本发明涉及水稻的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变蛋白，该蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的特性。本发明公开了该蛋白的序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。
背景技术
杂草是制约农业生产稳产高产的不利因素。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是一种高效的、简便的和经济的治理杂草方法。
乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称乙酰羟酸合成酶，AHAS；EC4.1.3.18)抑制剂类除草剂以ALS作为靶标而导致杂草死亡，主要包括磺酰脲类(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMI)、三唑嘧啶类(Triazolopyrimidines,TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[Pyrimidinylthio(oroxy)–benzoates,PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones,SCT)等13类化合物。ALS抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效等特点，目前已大面积推广使用。但这些除草剂对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身也产生药害，极大限制了其使用时间和使用空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。培育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽除草剂的使用范围。
成熟的ALS蛋白大约由670个氨基酸组成，其序列在不同物种间高度保守。ALS蛋白在Gly95、Ala96、Ala122、Pro171、Pro196、Pro197、Ala205、Asp376、Trp537、Trp548、Trp552、Trp557、Trp563、Trp574、Ser621、Ser627、Ser638、Ser653、Gly654、Val669等氨基酸位点(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)发生突变可以产生ALS抑制剂类除草剂抗性，这在多种农作物(包括玉米、小麦、水稻、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。
其中，水稻已知的抗ALS抑制剂突变位点包括Gly95、Ala96、Ala122、Trp548、Ser627、Ser653和Gly654。ALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关。
目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ALS蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现ALS蛋白新的除草剂抗性位点。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种ALS突变型基因。
本发明还要解决的技术问题是提供上述ALS突变型基因所编码的ALS蛋白。
本发明还要解决的技术问题是提供了含有上述的ALS突变型基因的表达盒、重组载体或细胞。
本发明还要解决的技术问题是提供了上述ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载体或细胞在制备绿色植物除草剂方面的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供了鉴定具有除草剂抗性的绿色植物的方法。
本发明人通过长期、艰苦的研究，对籼稻优良恢复系9311的EMS突变植株进行长期、不断地筛选，发现了一系列ALS突变蛋白，包括前文所述的某些已知ALS突变蛋白和新ALS突变蛋白，其对ALS抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性。本发明在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等作物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种ALS突变型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C；和/或第339位核苷酸由A变成核苷酸C；和/或第710位核苷酸由C突变为核苷酸T。
上述ALS突变型基因其核苷酸序列如SEQIDNo:1或3所示。
上述的ALS突变型基因所编码的ALS蛋白。该突变来源于水稻，与对ALS抑制剂类除草剂敏感的野生型水稻ALS(如Genbank登录号BAB20812.1)相比，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C、第339位核苷酸由A变成核苷酸C，即其氨基酸在Gln25、Gln113(突变植株1)位点上发生突变；或其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C、第339位核苷酸由A变成核苷酸C和第710位核苷酸由C突变为核苷酸T，即Gln25、Gln113、Ala237(突变植株2)位点上发生突变。目前还没有报道表明，在来自水稻的ALS的Gln25、Gln113和Ala237位点突变，会使得水稻具有ALS抑制剂类除草剂抗性。
上述的ALS蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2或4所示。
本发明内容还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有上述的ALS突变型基因。
本发明内容还包括上述的ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。
上述绿色植物为水稻、烟草、拟南芥、棉花等。
本发明内容还包括获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法，包括如下步骤：
1)使绿色植物包含所述的ALS突变型基因；或
2)使绿色植物表达所述的ALS蛋白。
上述的方法，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
鉴定权利要求上述的方法获得的绿色植物的方法，包括以下步骤：
1)测定所述绿色植物是否包含上述的ALS突变型基因；或，
2)测定所述绿色植物是否表达上述的ALS蛋白。
有益效果：田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，含有本发明的ALS突变蛋白的水稻(突变植株1和突变植株2)3-4叶幼苗在施用3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型水稻3-4叶幼苗在施用1mL百垄通/3L水(1倍推荐使用浓度)30天后表现为整株死亡。
附图说明
图1百垄通除草剂筛选获得的抗性水稻突变体；
图2PCR扩增ALS基因5’端结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第2泳道为9311野生型水稻DNA，第3～13泳道为抗除草剂突变植株1的DNA，其它泳道为抗除草剂突变植株2的DNA；目的片段长度1162bp；
图3PCR扩增ALS基因3’端结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第2泳道为9311野生型水稻DNA，第3～13泳道为抗除草剂突变植株1的DNA，其它泳道为抗除草剂突变植株2的DNA；目的片段长度1207bp；
图4A和图4B分别为百垄通除草剂对野生型和抗除草剂突变植株1和突变植株2的ALS酶活性抑制；
图5百垄通除草剂对野生型和抗除草剂水稻突变体突变植株1和突变植株2的ALS酶活性抑制的吸光值测定；
图6A和图6B分别为甲嘧磺隆除草剂对野生型和抗除草剂水稻突变体突变植株1和突变植株2的ALS酶活性抑制；
图7甲嘧磺隆除草剂对野生型和抗除草剂水稻突变体突变植株1和突变植株2的ALS酶活性抑制的吸光值测定。
图8A突变突变植株1的ALS基因的过量表达载体BamHI/SacI双酶切验证图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925bp，第2泳道为未经酶切的重组载体，第3泳道为重组载体经BamHI/SacI双酶切后产生的基因片段和质粒片段DNA；图8B突变突变植株2的ALS基因的过量表达载体BamHI/SacI双酶切验证图；第1泳道为未经酶切的重组载体，第2泳道为Marker，分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第3、4泳道为重组载体经BamHI/SacI双酶切后产生的基因片段和质粒片段DNA，基因片段大小符合预期，证明载体构建成功；
图9转突变型ALS基因水稻PCR检测图；总共有21个泳道，第1泳道、第9泳道、第19泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第8泳道、第18泳道为为野生型DNA，作为阴性对照，第20、21泳道为质粒DNA，作为阳性对照，第3～7泳道为突变植株1的转基因DNA，其他泳道为突变植株2的转基因DNA。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：水稻抗咪唑啉酮类除草剂突变体获取过程(百垄通)
将籼型常规水稻9311种子(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台)(此为M0，用清水浸泡2小时)150kg分6次用0.5-1.0％(w/w)甲磺酸乙酯(EMS)室温下浸泡6-9小时，期间每1小时摇动一次种子；弃去EMS溶液，自来水翻动浸泡种子5次，每次5分钟，然后用自来水冲洗种子过夜，次日进行田间播种，并进行常规肥水管理(此为M1)。植株成熟后，种子混收、晾干，过冬保存。次年播种田间。待水稻(此为M2)幼苗长至3-4叶期时，喷施为3mL百垄通/L水(“百垄通”是德国巴斯夫公司生产一种水剂型咪唑啉酮类除草剂，推荐最低使用浓度为1mL百垄通/1.5～3L水)，30天后还呈正常绿色植株即为抗咪唑啉酮类除草剂的水稻突变植株(图1)。共计获得抗除草剂的M2单株370株，这些抗性单株进行常规肥水管理，有320个M2单株可正常结实，种子成熟后，单株收种、晾干，过冬保存。
实施例2：抗咪唑啉酮类除草剂水稻突变体突变位点分析
取上述实施例1获得的抗除草剂水稻突变植株选取突变植株1和突变植株2的叶片，分别提取基因组DNA，送上海翰宇生物科技有限公司进行基因组测序。测序结果与9311参考基因组序列(http://rise2.genomics.org.cn/page/rice/download.jsp)相比，发现上述抗除草剂水稻突变体在ALS基因上发生了多个位点的突变，其中抗除草剂突变植株1在ALS基因的第75、339位点碱基发生突变，分别由G变成C、A变成C，导致其相应编码的氨基酸序列的第25、113位点由谷氨酰胺变为组氨酸、谷氨酰胺变为组氨酸，即抗除草剂突变植株1的ALS基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；抗除草剂突变植株2在ALS基因的第75、339、710位点碱基发生突变，分别由G变成C、A变成C、C变成T，导致其相应编码的氨基酸序列的第25、113、237位点分别由谷氨酰胺变为组氨酸、谷氨酰胺变为组氨酸、丙氨酸变成缬氨酸，即抗除草剂突变植株2的ALS基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其编码的ALS蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本发明的突变植株1(9311M1)其分类命名为籼型常规水稻9311(OryzasativaindicaGroupcultivar9311)的抗除草剂突变体”，该菌株已于2016年3月30号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCCNo.12265。本发明的突变植株2(9311M2)其分类命名为籼型常规水稻9311(OryzasativaindicaGroupcultivar9311)的抗除草剂突变体，该菌株已于2016年3月30号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCCNo.12266。该保藏的水稻种子与普通水稻种子的培养条件一致，喜高温、多湿、短日照，对土壤要求不严，在20-32℃、湿润的土壤(pH5.5-7.5)、正常日照条件下都可较好地生长。将水稻种子用清水浸泡后，置于恒温培养箱25-30℃培养48小时，早晚各换一次水；接着将水稻种子放在垫有湿纱布的平皿中，盖上盖子，放在恒温培养箱25-30℃培养，大约3-4天就可检测发芽情况。
实施例3抗咪唑啉酮类除草剂水稻突变体ALS基因克隆
取上述抗除草剂水稻突变体9311M1和9311M2的叶片，分别提取基因组DNA。根据9311水稻野生型ALS基因(BAC克隆Genbank登录号AAAA02006431.1)所在的染色体序列设计扩增ALS基因3’端序列的特异引物为：正向引物3F5’-GGTCTTGCGTCTGGTTGGCGAGT-3’、反向引物3R5’-CTCTTTATGGGTCATTCAGGTCAA-3’，设计扩增ALS基因5’端序列的特异引物为：正向引物5F5’-ATCCGAGCCACACATCGCCTCAC-3’，反向引物5R5’-AGCAACAGGTCAGCCTTATCCAC-3’。该两对特异引物扩增的序列有230bp的重叠部分，可以拼接成完整的ALS基因序列。
采用TakaraPrimerSTARMaxDNAPolymerase聚合酶(购自Takara公司)扩增ALS基因5’端序列、3’端序列，其反应体系如下：
PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。
程序如下：预变性：98℃3min；35个循环：变性98℃10sec；延伸68℃1min；保温：72℃10min。
取2μlPCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图2、图3)，剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收后，克隆至pMD19-T载体(购自Takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行PCR检测，取PCR结果呈阳性的6个单克隆，送金斯瑞生物科技有限公司测序，获得突变ALS基因序列。
实施例4水稻M3突变体抗咪唑啉酮类除草剂(百垄通)
将9311M1和9311M2收获的种子播种出苗(此为M3)，待M3水稻幼苗长至3-4叶期时，喷施4mL百垄通/L水(推荐最低使用浓度为1mL百垄通/3L水，相当于12倍浓度)。喷施除草剂15天后，抗性苗M3呈正常绿色、能继续长高至20-30cm，而非抗性苗叶片失去绿色甚至部分枯黄，植株不长高，只有5-9cm。30天后，M3抗性株呈正常绿色植株，而喷施同样浓度除草剂的野生型水稻都已全部枯死，表明突变水稻至少抗12倍浓度的百垄通除草剂。
实施例5水稻M3突变体抗磺酰脲类除草剂(甲嘧磺隆)
将9311M1和9311M2收获的种子播种出苗(此为M3)，待M3水稻幼苗长至3-4叶期时，喷施4.5g/L甲嘧磺隆(帆邦生物科技有限公司生产的水分散粒剂，有效成分75％；推荐最低使用浓度为0.5625g/L，相当于8倍推荐使用浓度)。喷施除草剂15天后，抗性苗M3呈正常绿色、能继续长高至20-30cm，而非抗性苗叶片失去绿色甚至部分枯黄，植株不长高，只有5-9cm。30天后，M3抗性株呈正常绿色植株，而喷施同样浓度除草剂的野生型水稻都已全部枯死，表明突变水稻至少抗8倍浓度的甲嘧磺隆除草剂。
实施例6水稻M3突变体的ALS酶活测定
为了验证水稻突变体的除草剂抗性是否由ALS突变所致，本发明人进行了ALS酶活性测定。测定方法参照Singh等的方法(SinghB.K.,StidhamM.A.,ShanerD.L.Assayofacetohydroxyacidsynthase.AnalyticalBiochemistry,1988,171:173-179.)。具体的，分别取野生型、9311M1和9311M2的M3植株叶片0.2g，在研钵中用液氮研磨粉碎，加入2mL提取液(100mMK2HPO4，pH7.5、10mM丙酮酸钠、5mMEDTA、1mM缬氨酸、1mM亮氨酸、10mM半胱氨酸、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸、5mM氯化镁、10％(V/V)甘油、1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)，待提取液解冻后继续研磨1min左右。12000rpm、4℃离心30min，吸取上清液，加入硫酸铵使之达到50％饱和度，于冰上放置半小时，12000rpm、4℃离心30min，弃上清，将沉淀溶解于0.2mL反应缓冲液(100mMK2HPO4,pH7.0、1mMEDTA、10mM氯化镁、100mM丙酮酸钠、1mM焦磷酸硫胺素、0.1mM黄素腺嘌呤二核苷酸)，分别得各植株的ALS提取液。
在获得ALS提取液中分别加入10μL除草剂“百垄通”(水剂，有效成分240g/L)，或1mg甲嘧磺隆(帆邦生物科技有限公司生产的水分散粒剂，有效成分75％)，混匀，37℃孵育1h，加0.1ml3M硫酸终止反应，反应混合物在60℃反应孵育30分钟便于脱羧。然后加0.4mL显色液(0.09g/L1-萘酚和0.009g/L肌酸，用2.5MNaOH溶解)。混合液在37℃孵育30分钟进行显色(ALS催化2个丙酮酸形成乙酰乳酸，乙酰乳酸脱羧形成3-羟基丁酮，再与肌酸和1-萘酚形成粉红色复合物，该复合物在530nm处有最大吸收值)，随后测定其530nm的吸光度，ALS活性用A530吸光值表示，A530吸光值的高低反映ALS活性的高低。实验以水为对照，野生型、9311M1株系和9311M2株系都各测5个单株。
A530吸光值测定结果发现，当野生型、9311M1和9311M2的ALS提取液中没有ALS抑制剂百垄通时，它们的A530吸光值均在1.2-1.4间，表明野生型和突变体的ALS酶活性无显著性差异(图4、图5)；而加入ALS抑制剂百垄通后，野生型的A530吸光值仅为0.3，9311M1和9311M2的A530吸光值为1.1左右，即野生型的ALS酶活性仅为对照的25％左右，而9311M1和9311M2的ALS酶活性仍有80％左右(图4、图5)，突变体的ALS酶活性是野生型的3倍多，表明9311M1和9311M2的突变ALS对百垄通不敏感，从而赋予了抗性。
同样的，A530吸光值测定结果发现，当野生型、9311M1和9311M2的ALS提取液中没有ALS抑制剂甲嘧磺隆时，它们的A530吸光值均在1.3-1.5间，表明野生型和突变体的ALS酶活性无显著性差异(图6、图7)；而加入ALS抑制剂甲嘧磺隆后，野生型的A530吸光值仅为0.2，9311M1和9311M2的A530吸光值为0.7-0.8左右，即野生型的ALS酶活性仅为对照的16％左右，而9311M1和9311M2的ALS酶活性仍有54％左右(图6、图7)，突变体的ALS酶活性是野生型的3倍多，表明9311M1和9311M2的突变ALS对甲嘧磺隆不敏感，从而赋予了抗性。
实施例7转基因ALS水稻抗百垄通、甲嘧磺隆
设计特异引物5’-CGCGGATCCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3’和5’-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3’，其5’分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。参考实施例3的方法，通过PCR从上述水稻突变体9311M1和9311M2的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，用BamHI和SacI分别双酶切突变ALS基因片段和植物表达载体pCAMBIA1301质粒(购自pcambia公司)，酶切产物用T4-DNA酶(购自TaKaRa公司)连接，连接产物转化大肠杆菌。重组质粒提取DNA，用BamHI和SacI双酶切验证，可以产生大的质粒片段和小的基因片段(图8)，证明已将核苷酸序列如SEQIDNO.1或3所示的ALS基因克隆至植物表达载体pCAMBIA1301质粒(购自pcambia公司)中。将构建好的质粒载体转化农杆菌EHA105，培养菌体。采用常规的农杆菌介导法转化粳型水稻日本晴(购自江苏省农业种质资源保护与利用平台)，获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期时，PCR检测转基因植株(图9)。PCR检测引物为正向引物35SF5’-ATGGTTAGAGAGGCTTACGC-3’，反向引物5R5’-AGCAACAGGTCAGCCTTATCCAC-3’，扩增片段涵括CaMV35S启动子和ALS基因的5’端序列，大小约2kb。PCR扩增反应体系参考实施例3，PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。扩增程序如下：预变性：98℃3min；30个循环：变性98℃10sec；延伸68℃2min；保温：72℃10min。经PCR鉴定呈阳性后，喷施4mL百垄通/L水(12倍推荐使用浓度)或喷施4.5g/L甲嘧磺隆(8倍推荐使用浓度)，7天后，参照实施例6所述方法测定ALS酶活性，发现转基因水稻的ALS酶活性显著高于非转基因水稻；30天后发现转基因水稻生长状态良好，而非转基因日本晴水稻则全部枯死。
实施例8转基因ALS烟草抗百垄通、甲嘧磺隆
设计特异引物5’-CGCGGATCCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3’和5’-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3’，其5’分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。通过PCR从上述水稻突变体9311M1和9311M2的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，参照实施例7的方法将核苷酸序列如SEQIDNO.1或3所示的ALS基因克隆至植物表达载体pCAMBIA2301质粒(购自pcambia公司)中。挑选阳性克隆转化农杆菌EHA105，采用常规的农杆菌介导法转化本氏烟叶盘，获得转基因植株收种后，后代植株长至3-4叶期时，经PCR鉴定呈阳性后，喷施4mL百垄通/L水(12倍推荐使用浓度)或喷施4.5g/L甲嘧磺隆(8倍推荐使用浓度)，7天后，参照实施例6所述方法测定ALS酶活性，发现转基因烟草的ALS酶活性显著高于非转基因烟草；30天后发现转基因烟草生长状态良好，而非转基因烟草则全部枯死。
实施例9转基因拟南芥获得
设计特异引物5’-CGCGGATCCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3’和5’-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3’，其5’分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。通过PCR从上述水稻突变体9311M1和9311M2的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，参照实施例7的方法将核苷酸序列如SEQIDNO.1或3所示的ALS基因克隆至植物表达载体pCAMBIA2301质粒(购自pcambia公司)中，挑选阳性克隆转化农杆菌EHA105，培养菌体，通过农杆菌介导方法转化拟南芥(CloughS,BentA.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJournal,1998,16(6):735-743.)，转化的拟南芥成熟收种后，随即播种，对未抽薹的拟南芥幼苗喷施3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)，30天后发现非转基因拟南芥枯死，而转基因拟南芥生长状态良好。
实施例10转基因棉花获得
设计特异引物5’-CGCGGATCCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3’和5’-TCCCCGCGGCCTACGGAAAACAACACAC-3’，其5’分别加入BamHI和SacI酶切修饰位点。通过PCR从上述水稻突变体9311M1和9311M2的基因组DNA中扩增出突变ALS基因，测序正确后，参照实施例7的方法将核苷酸序列如SEQIDNO.1或3所示的ALS基因克隆至植物表达载体pCAMBIA2301质粒(购自pcambia公司)中，挑选阳性克隆转化农杆菌LAB4404，培养菌体，通过农杆菌介导方法转化棉花下胚轴和子叶，获得转基因植株收种后，后代植株长至2-3叶期时，经PCR鉴定呈阳性后，对幼苗喷施3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)，30天后发现非转基因棉花枯死，而转基因棉花生长状态良好。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。

Claims (11)

1.一种ALS突变型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C；和/或第339位核苷酸由A变成核苷酸C；和/或第710位核苷酸由C突变为核苷酸T。
2.根据权利要求1所述的ALS突变型基因，其特征在于，所述ALS突变型基因其核苷酸序列如SEQIDNo:1或3所示。
3.权利要求1或2所述的ALS突变型基因所编码的ALS蛋白。
4.根据权利要求3所述的ALS蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2或4所示。
5.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求1或2所述的ALS突变型基因。
6.权利要求1或2所述的ALS突变型基因、权利要求3或4所述的蛋白，权利要求5所述的表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述绿色植物为水稻、烟草、拟南芥或棉花。
8.获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）使绿色植物包含权利要求1或2所述的ALS突变型基因；或
2）使绿色植物表达权利要求3或4之任一所述的ALS蛋白。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。
10.鉴定权利要求8或9所述的方法获得的绿色植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)测定所述绿色植物是否包含权利要求1或2所述的ALS突变型基因；或，
2)测定所述绿色植物是否表达权利要求3或4之任一所述的ALS蛋白。
11.一种除草剂的防护剂，其特征在于，该防护剂由权利要求3或4之任一所述的ALS蛋白制成。
CN201610225976.8A 2016-04-12 2016-04-12 Als突变型基因及其蛋白和应用 Active CN105755024B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610225976.8A CN105755024B (zh) 2016-04-12 2016-04-12 Als突变型基因及其蛋白和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610225976.8A CN105755024B (zh) 2016-04-12 2016-04-12 Als突变型基因及其蛋白和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105755024A true CN105755024A (zh) 2016-07-13
CN105755024B CN105755024B (zh) 2018-02-13

Family

ID=56333768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610225976.8A Active CN105755024B (zh) 2016-04-12 2016-04-12 Als突变型基因及其蛋白和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105755024B (zh)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636028A (zh) * 2017-02-08 2017-05-10 上海市农业科学院 具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的水稻蛋白质、其编码基因及应用
CN106636027A (zh) * 2017-02-08 2017-05-10 上海市农业科学院 具有抗除草剂活性的小麦蛋白质、其编码基因及应用
CN106754809A (zh) * 2017-02-08 2017-05-31 上海市农业科学院 具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的小麦蛋白质、其编码基因及应用
CN106868028A (zh) * 2017-03-02 2017-06-20 江苏省农业科学院 粳稻的als突变型基因及其蛋白和应用
CN106867977A (zh) * 2017-01-20 2017-06-20 湖南杂交水稻研究中心 一种水稻抗除草剂蛋白与基因及其应用
CN107090447A (zh) * 2017-06-23 2017-08-25 江苏省农业科学院 使植物具有除草剂抗性的水稻als突变型蛋白、基因及其应用
WO2017177765A1 (zh) * 2016-04-12 2017-10-19 江苏省农业科学院 一种als突变型基因在抗除草剂方面的应用
CN107354139A (zh) * 2017-09-18 2017-11-17 江苏省农业科学院 小麦als突变型蛋白、核酸及其应用
CN113717957A (zh) * 2021-11-04 2021-11-30 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 一种als突变蛋白及其应用
CN115873088A (zh) * 2022-11-24 2023-03-31 北京大学现代农业研究院 Als抗性突变蛋白及其应用
CN115948592A (zh) * 2022-07-28 2023-04-11 中国农业科学院生物技术研究所 抗磺酰脲类除草剂胡麻的抗性基因及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005020673A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Instituto Nacional De Technologia Agropecuaria Rice plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
CN102586215A (zh) * 2011-09-06 2012-07-18 深圳兴旺生物种业有限公司 水稻抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用
CN102763506A (zh) * 2012-06-25 2012-11-07 北京兴博雅生物技术有限公司 提高植物品种纯度的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005020673A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Instituto Nacional De Technologia Agropecuaria Rice plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
CN102586215A (zh) * 2011-09-06 2012-07-18 深圳兴旺生物种业有限公司 水稻抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用
CN102763506A (zh) * 2012-06-25 2012-11-07 北京兴博雅生物技术有限公司 提高植物品种纯度的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK 登录号: CP012610.1: "Oryza sativa Indica Group cultivar RP Bio-226 chromosome 2 sequence", 《GENBANK数据库》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017177765A1 (zh) * 2016-04-12 2017-10-19 江苏省农业科学院 一种als突变型基因在抗除草剂方面的应用
CN106867977A (zh) * 2017-01-20 2017-06-20 湖南杂交水稻研究中心 一种水稻抗除草剂蛋白与基因及其应用
CN106867977B (zh) * 2017-01-20 2018-06-05 湖南杂交水稻研究中心 一种水稻抗除草剂蛋白与基因及其应用
CN106636027A (zh) * 2017-02-08 2017-05-10 上海市农业科学院 具有抗除草剂活性的小麦蛋白质、其编码基因及应用
CN106754809A (zh) * 2017-02-08 2017-05-31 上海市农业科学院 具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的小麦蛋白质、其编码基因及应用
CN106636028A (zh) * 2017-02-08 2017-05-10 上海市农业科学院 具有抗咪唑啉酮类除草剂活性的水稻蛋白质、其编码基因及应用
CN106868028A (zh) * 2017-03-02 2017-06-20 江苏省农业科学院 粳稻的als突变型基因及其蛋白和应用
CN106868028B (zh) * 2017-03-02 2019-12-06 江苏省农业科学院 粳稻的als突变型基因及其蛋白和应用
CN107090447A (zh) * 2017-06-23 2017-08-25 江苏省农业科学院 使植物具有除草剂抗性的水稻als突变型蛋白、基因及其应用
CN107354139A (zh) * 2017-09-18 2017-11-17 江苏省农业科学院 小麦als突变型蛋白、核酸及其应用
CN113717957A (zh) * 2021-11-04 2021-11-30 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 一种als突变蛋白及其应用
CN115948592A (zh) * 2022-07-28 2023-04-11 中国农业科学院生物技术研究所 抗磺酰脲类除草剂胡麻的抗性基因及其应用
CN115873088A (zh) * 2022-11-24 2023-03-31 北京大学现代农业研究院 Als抗性突变蛋白及其应用
CN115873088B (zh) * 2022-11-24 2023-06-27 北京大学现代农业研究院 Als抗性突变蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105755024B (zh) 2018-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105755024A (zh) Als突变型基因及其蛋白和应用
CN108004224B (zh) 使植物具有除草剂抗性的水稻als突变型蛋白及其应用
CN105779479A (zh) 一种als突变型基因及其在抗除草剂方面的应用
CN105695493A (zh) 一种als突变型基因在抗除草剂方面的应用
CN102586215B (zh) 水稻抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用
CN105734071A (zh) Als突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用
WO2019136938A1 (zh) 使植物具有除草剂抗性的ACCase突变型蛋白及其应用
CN107964543B (zh) 水稻除草剂抗性als突变型蛋白、核酸及其应用
CN109371000B (zh) 一种水稻ACCase突变型基因及其在植物抗除草剂中的应用
CN110157718B (zh) 一种来源于玉米的硝态氮调控基因ZmNRG2.7及其用途
CN103215243B (zh) 甘蓝型油菜抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用
CN110819635B (zh) 豆科植物han同源基因在调控豆科植物根瘤数目中的应用
CN107090447A (zh) 使植物具有除草剂抗性的水稻als突变型蛋白、基因及其应用
CN106755019B (zh) 一种小麦als突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用
CN102936591A (zh) 乙酰乳酸合成酶突变体及其应用
CN103266118B (zh) 一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用
CN107022540B (zh) 使植物具有除草剂抗性的小麦als突变型蛋白、基因及其应用
CN111154738A (zh) 一种als突变型基因、蛋白及其应用
CN106868027B (zh) 粳稻als突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用
CN112410308A (zh) 水稻ACCase突变型基因及其蛋白在植物抗除草剂中的应用
CN106591334B (zh) 一种小麦als突变型基因及其在抗除草剂方面的应用
CN114540373B (zh) 一种降低水稻籽粒中镉含量的基因及其应用
CN116103314A (zh) 来源于拟南芥和小麦的氮素调控基因gds1及其用途
CN114196684B (zh) 玉米ZmCYP724B3基因及其用途
CN106868028B (zh) 粳稻的als突变型基因及其蛋白和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant