CN115873088A - Als抗性突变蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及ALS蛋白技术领域，尤其涉及ALS抗性突变蛋白及其应用；以拟南芥野生型ALS蛋白的氨基酸序列为基准，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe；或，第197位氨基酸由Pro突变为Val；和，第198位氨基酸由Arg突变为Cys；和，第199位氨基酸由Arg突变为Cys；其中，ALS抗性突变蛋白的突变点位为植物体内的通用保守序列；通过对拟南芥进行单碱基编辑阶段，发现了当拟南芥氨基酸序列出现上述突变形式时，由于该突变形式是连续突变，较单一碱基编辑的单一突变位点或者多个间隔的突变位点，ALS的氨基酸抗性位点密集，有效的提高了ALS突变蛋白对多种除草剂的抗性。

Description

ALS抗性突变蛋白及其应用

技术领域

本申请涉及ALS蛋白技术领域，尤其涉及ALS抗性突变蛋白及其应用。

背景技术

农田杂草是导致农作物减产的最主要原因之一，与传统的栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是人们公认的防除农田杂草最高效、简便和经济的方法；目前化学除草剂主要包括磺酰脲类(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、磺酰氨基-羰基三唑啉酮类(SCT)、嘧啶水杨酸类(PTB)和三唑并嘧啶类(TP)除草剂，而这些化学类除草剂都是根据乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS；也称乙酰羟酸合成酶，AHAS；Ec4.1.3.18)为靶点所研制并开发出的，由于乙酰乳酸合成酶是催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成途径中的第一个酶，因而这些除草剂也被称为ALS抑制剂类除草剂；由于ALS抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效、对哺乳动物毒性低等优点，目前已大面积推广使用。

现阶段，以拟南芥ALS蛋白的氨基酸序列为参考标准，已发现的ALS抗性突变蛋白为在不同植物(包括玉米、小麦、水稻、油菜、烟草、番茄、西瓜、马铃薯和向日葵等)ALS的第Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654等位点发生突变，从而使得相应植物对咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑并嘧啶类、嘧啶水杨酸类和磺酰氨基-羰基三唑啉酮类中的一种或几种除草剂产生抗性，而ALS突变蛋白抗除草剂的类型和抗性水平不仅与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关，因此，对新的抗除草剂突变类型的制作和筛选，有利于丰富抗除草剂基因的遗传多样性，为培育作物新品种提供基因资源。

以往产生点突变植物材料多通过随机诱变的方法实现，该方法效率低，经济成本和时间成本都比较高，并且一般获得单点突变。基因编辑育种效率显著高于传统诱变育种，不仅大大缩短育种周期，而且可以在不影响其他基本性状的基础上精确编辑具体性状，基因编辑产生的突变可以稳定遗传给后代，并且基因编辑元件可以通过自交和杂交分离出去，获得无外源转基因成分的基因编辑植物，但是目前大部分通过单碱基编辑的方式将水稻、玉米、小麦、大豆、西瓜、烟草、油菜、土豆、番茄和拟南芥中ALS的Pro197突变为Phe从而产生除草剂抗性，但该突变形式的除草剂抗性较为单一，仅能磺酰脲类和嘧啶水杨酸类除草剂产生抗性，且抗性有待进一步提高。

因此如何提供ALS突变蛋白，以实现对多种除草剂产生强抗性，是目前亟需解决的技术问题。

发明内容

本申请提供了ALS突变蛋白及其应用，以解决现有技术中ALS突变蛋白的除草剂抗性较为单一的问题。

第一方面，本申请提供了一种ALS抗性突变蛋白，以拟南芥野生型ALS蛋白的氨基酸序列为基准，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe；或，

第197位氨基酸由Pro突变为Val；和，

第198位氨基酸由Arg突变为Cys；和，

第199位氨基酸由Arg突变为Cys；

其中，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位在植物内高度保守。

可选的，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys。

可选的，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:1所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

可选的，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys。

可选的，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:2所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

可选的，以水稻野生型ALS蛋白的氨基酸序列为基准，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第171位氨基酸由Pro突变为Phe；或，

第171位氨基酸由Pro突变为Val；和，

第172位氨基酸由Arg突变为Cys；和，

第173位氨基酸由Arg突变为Cys；

其中，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位在植物内高度保守。

可选的，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第171位氨基酸由Pro突变为Phe、第172位氨基酸由Arg突变为Cys和第173位氨基酸由Arg突变为Cys。

可选的，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:5所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

可选的，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第171位氨基酸由Pro突变为Val、第172位氨基酸由Arg突变为Cys和第173位氨基酸由Arg突变为Cys。

可选的，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:6所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

第二方面，本申请提供了一种编码第一方面所述的ALS抗性突变蛋白的ALS抗性突变基因，当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列；或，

当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列。

第三方面，本申请提供了另外一种编码第一方面所述的ALS抗性突变蛋白的ALS抗性突变基因，当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第171位氨基酸由Pro突变为Phe、第172位氨基酸由Arg突变为Cys和第173位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列；或，

当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第171位氨基酸由Pro突变为Val，第172位氨基酸由Pro突变为Val和第177位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列。

第四方面，本申请提供了一种表达盒、重组载体或细胞，所述表达盒、所述重组载体和所述细胞均含有第二方面或第三方面所述的ALS抗性突变基因。

第五方面，本申请提供了一种ALS抗性突变蛋白的应用，将第一方面所述的ALS抗性突变蛋白在植物抗除草剂产品方面的应用。

第六方面，本申请提供了一种对多种除草剂具有高抗性的植物的制备方法，所述方法包括：

使所述植物表达出具有第一方面所述的ALS抗性突变蛋白；和/或，

使所述植物包含第二方面或第三方面所述的ALS抗性突变基因；和/或，

对所述植物的细胞、组织和枝干的内源ALS基因进行基因编辑，以使所述植物表达出ALS抗性突变蛋白。

本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本申请实施例提供的一种ALS抗性突变蛋白，通过对拟南芥进行单碱基编辑阶段，发现了当拟南芥氨基酸序列出现第197位氨基酸由Pro突变为Phe，或者第197位氨基酸由Pro突变为Val，以及第198位氨基酸由Arg突变为Cys，以及第199位氨基酸由Arg突变为Cys时，由于该突变形式是连续突变，较单一碱基编辑的单一突变位点或者多个间隔的突变位点，ALS的氨基酸位点密集，因此可对多种现有的ALS抑制剂类除草剂产生很高的抗性，有效的提高了ALS突变蛋白对多种除草剂的抗性。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的pHEE901和pHEE901-A3A-PBE载体示意图及其在ALS靶点的突变效率的示意图；

图2为本申请实施例提供的AtALS-FCC突变植株测序峰图；

图3为本申请实施例提供的ALS-FCC突变体拟南芥对除草剂的抗性结果示意图；

图4为本申请实施例提供的拟南芥野生型AtALS与水稻野生型OsALS氨基酸序列比对图，其中，数字表示氨基酸位点，红框表示拟南芥AtALS的Pro197位点、Arg198位点和Arg199位点在水稻OsALS中对应的同源位点为Pro171位点Arg172位点和Arg173位点；

图5为本申请实施例提供的ALS-FCC突变体拟南芥的生长与产量性状对比示意图；

图6为本申请实施例提供的OsALS、OsALS-F和OsALS-FCC转基因水稻对除草剂的抗性对比示意图；

图7为本申请实施例提供的ALS-VCC突变植株测序峰图；

图8为本申请实施例提供的ALS-VCC突变体拟南芥对除草剂的抗性示意图；

图9为本申请实施例提供的AtALS-VCC突变体拟南芥的生长表型示意图；

图10为本申请实施例提供的ALS和ALS-VCC转基因水稻对除草剂的抗性示意图；

图11为本申请实施例提供的不同植物ALS序列在突变区域比对结果示意图，其中，红框标注的是在包括拟南芥、番茄、烟草、马铃薯、大豆、油菜的双子叶植物和包括水稻、小麦、玉米和高粱的单子叶植物的氨基酸序列中，拟南芥AtALS的Pro197/Arg198/Arg199位点对应分布的情况图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本申请的创造性思维为：

以ALS为靶点来研制开发的除草剂的作用机理是通过抑制其活性，破坏蛋白质合成，进而干扰DNA合成及细胞分裂与生长，最终造成植株死亡来达到杀死植物的目的，而植物对这类除草剂的抗性则来自ALS一个或多个氨基酸突变而导致的酶的结构发生变化。以往产生点突变植物材料多通过随机诱变的方法实现，该方法效率低，经济成本和时间成本都比较高，并且一般获得单点突变。基因编辑育种效率显著高于传统诱变育种，不仅大大缩短育种周期，而且可以在不影响其他基本性状的基础上精确编辑具体性状，基因编辑产生的突变可以稳定遗传给后代，并且基因编辑元件可以通过自交和杂交分离出去，获得无外源转基因成分的基因编辑植物，但是目前大部分通过单碱基编辑的方式将水稻、玉米、小麦、大豆、西瓜、烟草、油菜、土豆、番茄和拟南芥中ALS的Pro197突变为Phe从而产生除草剂抗性，但该突变形式的除草剂抗性较为单一，仅能磺酰脲类和嘧啶水杨酸类除草剂产生抗性，且抗性有待进一步提高。

因此如何提供ALS突变蛋白，以实现对多种除草剂产生强抗性，是目前亟需解决的技术问题。

本申请实施例提供了一种ALS抗性突变蛋白，以拟南芥野生型ALS蛋白的氨基酸序列为基准，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe；或，

第197位氨基酸由Pro突变为Val；和，

第198位氨基酸由Arg突变为Cys；和，

第199位氨基酸由Arg突变为Cys；

其中，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位在植物内高度保守。

本申请实施例中，由图11可知，未发生突变的ALS在不同植物(例如拟南芥、玉米、油菜、马铃薯、水稻、高粱、大豆、烟草、番茄、小麦)中的位点近似相同，都分布在ALS蛋白的第140～200位氨基酸序列中，同时根据标识可以看出，未发生突变的拟南芥的第197位氨基酸、第198位氨基酸和第199位氨基酸在植物内高度保守，因此也侧面说明了本申请中发生突变的点位在植物内高度保守。

本申请实施例中，该连续突变位点由高效的单碱基编辑工具实现，该单碱基编辑guide sequence序列如SEQ ID NO:9所示。

拟南芥野生型AtALS氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，拟南芥野生型AtALS的CDS序列如SEQ ID NO:11所示。

在一些可选的实施方式中，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys。

本申请实施例中，限定ALS抗性突变蛋白的突变点位为三个连续点位的突变，较单一碱基编辑的单一突变位点或者多个间隔的突变位点，ALS的氨基酸位点密集，因此能提高拟南芥中ALS突变蛋白对多种除草剂的抗性。

在一些可选的实施方式中，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:1所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

本申请实施例中，限定ALS抗性突变蛋白的具体同源氨基酸序列，能保证其突变点位满足要求的同时，还能促使ALS抗性突变蛋白的有效表达。

在一些可选的实施方式中，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys。

本申请实施例中，限定ALS抗性突变蛋白的突变点位的积极效果是在三个连续点位的突变，较单一碱基编辑的单一突变位点或者多个间隔的突变位点，ALS的氨基酸位点密集，因此能提高ALS突变蛋白对多种除草剂的抗性。

在一些可选的实施方式中，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:2所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

本申请实施例中，限定ALS抗性突变蛋白的具体同源氨基酸序列，能保证其突变点位满足要求的同时，还能促使ALS抗性突变蛋白的有效表达。

在一些可选的实施方式中，以水稻野生型ALS蛋白的氨基酸序列为基准，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第171位氨基酸由Pro突变为Phe；或，

第171位氨基酸由Pro突变为Val；和，

第172位氨基酸由Arg突变为Cys；和，

第173位氨基酸由Arg突变为Cys；

其中，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位在植物内高度保守。

本申请实施例中，水稻野生型OsALS氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，水稻野生型OsALS的CDS序列如SEQ ID NO:13所示。

进一步的，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第171位氨基酸由Pro突变为Phe、第172位氨基酸由Arg突变为Cys和第173位氨基酸由Arg突变为Cys。

本申请实施例中，限定ALS抗性突变蛋白的突变点位为三个连续点位的突变，较单一碱基编辑的单一突变位点或者多个间隔的突变位点，ALS的氨基酸位点密集，因此能提高水稻中ALS突变蛋白对多种除草剂的抗性。

在一些可选的实施方式中，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:5所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

本申请实施例中，限定ALS抗性突变蛋白的具体同源氨基酸序列，能保证其突变点位满足要求的同时，还能促使ALS抗性突变蛋白的有效表达。

在一些可选的实施方式中，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第171位氨基酸由Pro突变为Val、第172位氨基酸由Arg突变为Cys和第173位氨基酸由Arg突变为Cys。

本申请实施例中，限定ALS抗性突变蛋白的突变点位为三个连续点位的突变，较单一碱基编辑的单一突变位点或者多个间隔的突变位点，ALS的氨基酸位点密集，因此能提高水稻中ALS突变蛋白对多种除草剂的抗性。

在一些可选的实施方式中，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:6所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

本申请实施例中，限定ALS抗性突变蛋白的具体同源氨基酸序列，能保证其突变点位满足要求的同时，还能促使ALS抗性突变蛋白的有效表达。

基于一个总的发明构思，本申请提供了一种编码所述ALS抗性突变蛋白的ALS抗性突变基因，当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列；或，

当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列。

本申请实施例中，通过进一步限定编码ALS抗性突变蛋白的基因序列，能针对两种不同的ALS抗性突变蛋白中的一种突变位点进行转录、翻译和表达出对应的ALS抗性突变蛋白。

该ALS抗性突变基因是针对上述ALS抗性突变蛋白进行编码所需的基因，该ALS抗性突变蛋白的具体氨基酸序列或突变位点可参照上述实施例，由于该ALS抗性突变基因采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

基于一个总的发明构思，本申请提供了另外一种编码第一方面所述的ALS抗性突变蛋白的ALS抗性突变基因，当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第171位氨基酸由Pro突变为Phe、第172位氨基酸由Arg突变为Cys和第173位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列；或，

当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第171位氨基酸由Pro突变为Val，第172位氨基酸由Pro突变为Val和第177位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列。

本申请实施例中，通过进一步限定编码ALS抗性突变蛋白的基因序列，能针对两种不同的ALS抗性突变蛋白中的另一种突变位点进行转录、翻译和表达出对应的ALS抗性突变蛋白。

该ALS抗性突变基因是针对上述ALS抗性突变蛋白进行编码所需的基因，该ALS抗性突变蛋白的具体氨基酸序列或突变位点可参照上述实施例，由于该ALS抗性突变基因采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

基于一个总的发明构思，本申请提供了一种表达盒、重组载体或细胞，所述表达盒、所述重组载体和所述细胞均含有所述ALS抗性突变基因。

本申请实施例中，通过限定表达盒、重组载体或细胞中含有ALS抗性突变基因，能拓宽该类型的ALS抗性突变蛋白的使用场景和使用方式。

该表达盒、重组载体或细胞是针对上述ALS抗性突变基因的应用，该ALS抗性突变基因的具体核苷酸序列或突变位点可参照上述实施例，由于该ALS抗性突变基因采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

基于一个总的发明构思，本申请提供了一种ALS抗性突变蛋白的应用，将所述ALS抗性突变蛋白在植物抗除草剂产品方面的应用。

该应用是针对上述ALS抗性突变蛋白的应用，该抗性突变蛋白的具体氨基酸序列或突变位点可参照上述实施例，由于该应用采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

基于一个总的发明构思，本申请提供了一种对多种除草剂具有高抗性的植物的制备方法，所述方法包括：

使所述植物表达出具有所述ALS抗性突变蛋白；和/或，

使所述植物包含所述ALS抗性突变基因；和/或，

对所述植物的细胞、组织和枝干的内源ALS基因进行基因编辑，以使所述植物表达出ALS抗性突变蛋白。

本申请实施例中，限定对多种除草剂具有高抗性的植物的制备方法的具体流程，能涵盖现阶段的大部分植物的ALS抗性突变蛋白的表达途径。

使所述植物表达出具有所述ALS抗性突变蛋白具体的方法包括但不限于使用ALS启动子、使用烟草花叶病毒35S启动子、使用泛素UBQ启动子、使用肌动蛋白ACT启动子表达自身内源ALS抗性突变蛋白或使用外源其它物种中ALS抗性突变蛋白中的一种或者多种。

使所述植物包含所述ALS抗性突变基因的方式包括通过突变的方式或者转化的方式使植物内包含ALS抗性突变基因，其中，突变的方式包括但不限于：EMS诱变、叠氮化钠诱变、超声波诱变、γ射线诱变、中子诱变、低重力诱变中的一种或多种；转化的方式包括：农杆菌介导的遗传转化、PEG/CaCl2介导的转化、花粉管通道法介导的转化、纳米材料转化和基因枪转化。

对所述植物的细胞、组织和枝干的内源ALS基因进行基因编辑，以使所述植物表达出ALS抗性突变蛋白，其基因编辑的具体方法包括但不限于碱基编辑、先导编辑、同源重组中的一种或者多种。

该应用是针对上述ALS抗性突变蛋白的应用，该抗性突变蛋白的具体氨基酸序列或突变位点可参照上述实施例，由于该应用采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

拟南芥ALS突变形式的获得的具体步骤：

1.获得pHEE901载体(参考：ChenY,Wang Z,Ni H,etal.,CRISPR/Cas9-mediatedbase-editing system efficiently generates gain-of-function mutationsin Arabidopsis.Sci China Life Sci.2017，60:520-523)，具体来源于中国农业大学陈其军教授实验室。

2.将pHEE901中的APOBEC1-nCas9-UGI换为A3A-PBE，其中A3A-PBE序列(Zong Y,Song Q,Li C ET AL.,Efficient C-to-T base editing in plants using a fusion ofnCas9 and human APOBEC3A.Nat Biotechnol.2018)来源于中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞实验室。

3.将未替换前的pHEE901用XbaI和SacI酶切，回收12.8kb片段；将替换后的pH-A3A-PBE用AvrII和SacI酶切，回收5.1kb片段，二者用T4连接酶连接得到pHEE901-A3A-PBE。

4.将sgRNA-AtALS-F/sgRNA-AtALS-R引物退火后与BsaI酶切后的pHEE901-A3A-PBE和pHEE901进行T4连接酶连接得到pHEE901-A3A-PBE-ALS和pHEE901-ALS。选择测序正确的质粒进行后续步骤。

5.将正确的pHEE901-A3A-PBE-ALS和pHEE901-ALS通过电击转化法转入农杆菌GV3101菌株中；随后挑选正确的农杆菌单克隆在含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB液体培养基中28℃培养过夜。

6.次日，按照1:200的比例将过夜培养的农杆菌菌液转接至含有50mg/L卡那霉素、20mg/L利福平的液体LB培养基中28℃培养过夜；随后离心收集菌体，重悬于含有0.02％的Silwet L-77的5％蔗糖溶液中，再通过浸花转化法转入野生型拟南芥Col-0中。

7.转化拟南芥的种子收获后烘干，将种子消毒后均匀铺在含有20mg/L潮霉素和200mg/L特美汀的1/2MS固体培养基上，筛选获得抗潮霉素的转基因植株。

8.将植株栽植在土中，一周后取叶片提取DNA，使用ALS-F/ALS-R引物通过PCR扩增ALS的目的片段并进行测序分析。

9.选择测序结果中目的区域已发生突变的株系，使用ALS-HiT-F/ALS-HiT-R引物扩增目的区域进行Hi-TOM高通量测序(具体测量方法参考：Qing Liu 1,Chun Wang 1,Xiaozhen Jiao et al.,Hi-TOM:a platform for high-throughput tracking ofmutations induced by CRISPR/Cas systems.Sci China Life Sci.2019,62:1-7)，结果如图1所示。

上述过程的各引物如表1所示：

表1各引物序列情况表

引物名称	引物序列
		sgRNA-AtALS-F	ATTGaagtccctcgtcgtatgat
sgRNA-AtALS-R	AAACgagtgtatcatctgccact
		ALS-F	CCTTAACCCGCTCTTCCTCA
ALS-R	CCCCGTAAGCTCAACAAACC
		ALS-HiT-F	ggagtgagtacggtgtgcGTTAGCGGATTAGCCGATGC
ALS-HiT-R	gagttggatgctggatggACCAAAACAGGTCCAGGTCTAC

经过上述步骤的检测，如图2所示，发现了第197位氨基酸由Pro突变为Phe(以下简称Pro197Phe)、第198位氨基酸由Arg突变为Cys(以下简称Arg198Cys)和第199位氨基酸由Arg突变为Cys(以下简称Arg199Cys)的突变形式的拟南芥(以下简称AtALS-FCC)，并获得了该突变形式纯合突变体，命名为拟南芥AtALS-FCC突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，该突变形式连续突变三个氨基酸，未在现有文献和研究中被报道。

实施例2

将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：

10.选择AtALS Pro197Phe突变形式(以下简称AtALS-F)和含有AtALS-FCC突变体的植株作为比较，这两个突变株系均是通过基因编辑所产生的纯合碱基突变。

11.将野生型(WT)、AtALS-F和AtALS-FCC的植株分别铺种在含有不同浓度除草剂的1/2MS培养基上生长14天检测其抗性，结果如表2至表6和图3所示。

表2不同ALS突变形式对双草醚的抗性情况表

表中，+号代表除草剂抗性强弱，-号代表未表现出除草剂抗性。

表3不同ALS突变形式对氯磺隆的抗性情况表

表中，+号代表除草剂抗性强弱，-号代表未表现出除草剂抗性。

表4不同ALS突变形式对氟唑磺隆的抗性情况表

表中，+号代表除草剂抗性强弱，-号代表未表现出除草剂抗性。

表5不同ALS突变形式对甲咪唑烟酸的抗性情况表

表中，+号代表除草剂抗性强弱，-号代表未表现出除草剂抗性。

表6不同ALS突变形式对甲氧磺草胺的抗性情况表

表中，+号代表除草剂抗性强弱，-号代表未表现出除草剂抗性。

同时检测AtALS-FCC突变体在正常生长条件下的植物生长和产量情况，结果如图4所示，AtALS-F和AtALS-FCC在植物大小、叶片大小、植株高度和种子产量上与野生型相比没有显著差异。

实施例3

将实施例3和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于：

12.进一步分析拟南芥的Pro197Phe突变点位，如图5所示，Pro197该点位对应的是水稻的Pro171，因此使用OsALSpro-F1-HindIII/OsALSpro-R1和OsALS-F2/OsALS-R2引物对水稻ALS的启动子、编码区和终止子序列进行PCR扩增，完成水稻ALS的构建，命名为水稻OsALS-FCC突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

13.通过Gibson assembly构建方式，将上述两个片段构建至HindIII和EcoRI酶切后的pHUE411载体，得到内源ALS启动子表达的水稻野生型OsALS。

14.采用OsALSpro-F1-HindIII/OsALS-P171F-R1、OsALSpro-F1-HindIII/OsALS-FCC-R1扩增ALS 5’端序列，使用OsALS-F2/OsALS-R2扩增ALS 3’端序列，二者使用Gibsonassembly构建至HindIII和EcoRI酶切后的pHUE411载体，分别获得包含OsALS-F和OsALS-FCC突变形式的质粒。上述扩增所用引物如表7所示：

表7各扩增引物情况表

引物名称	引物序列
		OsALSpro-F1-HindIII	aaacgacggccagtgccaagcttgtacccgtaaagtcttcactcctc
OsALSpro-R1	ggcgtcggtgccgatcatgcggcgggggacctggcccgtgat
		OsALS-F2	atgatcggcaccgacgcctt
OsALS-R2	cagctatgacatgattacgaattcgtagcagttcaccaactatcatacc
		OsALS-P171F-R1	ggcgtcggtgccgatcatgcggcgAAAgacctggcccgtgatggcga
OsALS-FCC-R1	ggcgtcggtgccgatcatgcAGCAAAAgacctggcccgtgatggcga

15.将测序正确的质粒通过电击转化转入农杆菌EHA105中，然后挑选正确的农杆菌单克隆在含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB液体培养基中28℃培养过夜。

16.次日，按照1∶200的比例将过夜培养的农杆菌菌液转接至含有50mg/L卡那霉素、20mg/L利福平的液体LB培养基中28℃培养过夜。

17.离心收集菌体，按照高彩霞实验室(Zhang，Y.，Li，J.，and Gao，C.2016Generation of stable transgenic rice(Oryza sativa L.)by Agrobacterium-mediated transformation.Curr.Protoc.Plant Biol.1：235-246.)的方法转化水稻中花11(ZH11)。

18.挑选PCR鉴定阳性的潮霉素抗性株系，移栽到含有不同除草剂的MS固体培养基上筛选15天，结果如图6所示

实施例4

将实施例4和实施例1进行对比，实施例4和实施例1的区别在于：

19.筛选部分拟南芥阳性转基因株系，进行栽植，并收获T2代种子。

20.将收获T2代种子铺在含有双草醚、甲咪唑烟酸等除草剂的1/2MS固体培养基上，筛选发现在甲咪唑烟酸培养基上有一株强抗性植株。

21.对该强抗性植株利用PCR扩增ALS靶点区域，并进行测序分析，结果如图7所示，发现一种新的除草剂抗性突变形式Pro197Val/Arg198Cys/Arg199Cys(以下简称为AtALS-VCC)，该突变体命名为拟南芥AtALS-VCC突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

22.将得到的AtALS-VCC突变体植物栽植培育，获取种子后对后代进行不同种类除草剂的抗性分析，结果如图8所示。

23.同时将AtALS-VCC突变体植物在正常生长条件下的植物生长情况，结果如图9所示，AtALS-VCC突变体植物在植物大小和植株高度上与野生型相比没有显著差异。

实施例5

将实施例5和实施例4进行对比，实施例5和实施例4的区别在于：

24.同实施例3的方式，在水稻的ALS基因中产生类似AtALS-VCC的突变，并使用OsALSpro-F1-HindIII/OsP171V-R1扩增OsALS的5’端序列，使用OsP171VCC-F2/OsALS-R2扩增OsALS的3’端序列。

上述所用的扩增引物如表8所示：

表8各扩增引物情况表

25.通过Gibson assembly构建方式，将上述两个片段构建至HindIII和EcoRI酶切后的pHUE411载体，获得OsALS-VCC过表达质粒。

26.将上述质粒转入水稻ZH11中，获得阳性转基因水稻，该水稻过表达株系命名为水稻

OsALS-VCC，其中，水稻OsALS-VCC突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

27.将在生根培养基上生长3周的上述OsALS-VCC过表达水稻幼苗移栽到含有不同除草剂的MS固体培养基上筛选15天，结果如图10所示，

由上述实验可知，本申请提供的一种ALS抗性突变蛋白，不仅可对多种现有的ALS抑制剂类除草剂产生很高的抗性，还不会对植物的产量性状没有明显影响，同时将水稻ALS突变为相同的突变形式并转入水稻，转基因水稻同样可以对多种除草剂产生强抗性。本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (15)

1.一种ALS抗性突变蛋白，其特征在于，以拟南芥野生型ALS蛋白的氨基酸序列为基准，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe；或，

第197位氨基酸由Pro突变为Val；和，

第198位氨基酸由Arg突变为Cys；和，

第199位氨基酸由Arg突变为Cys；其中，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位为植物体内的通用保守序列。

2.根据权利要求1所述的ALS抗性突变蛋白，其特征在于，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys。

3.根据权利要求2所述的ALS抗性突变蛋白，其特征在于，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:1所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的ALS抗性突变蛋白，其特征在于，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys。

5.根据权利要求4所述的ALS抗性突变蛋白，其特征在于，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:2所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的ALS抗性突变蛋白，其特征在于，以水稻野生型ALS蛋白的氨基酸序列为基准，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第171位氨基酸由Pro突变为Phe；或，

第171位氨基酸由Pro突变为Val；和，

第172位氨基酸由Arg突变为Cys；和，

第173位氨基酸由Arg突变为Cys；

其中，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位在植物内高度保守。

7.根据权利要求6所述的ALS抗性突变蛋白，其特征在于，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第171位氨基酸由Pro突变为Phe、第172位氨基酸由Arg突变为Cys和第173位氨基酸由Arg突变为Cys。

8.根据权利要求7所述的ALS抗性突变蛋白，其特征在于，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:5所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

9.根据权利要求6所述的ALS抗性突变蛋白，其特征在于，所述ALS抗性突变蛋白的突变点位包括：第171位氨基酸由Pro突变为Val、第172位氨基酸由Arg突变为Cys和第173位氨基酸由Arg突变为Cys。

10.根据权利要求6所述的ALS抗性突变蛋白，其特征在于，所述ALS抗性突变蛋白具有至少如SEQ ID NO:6所示的氨基序列的50％的相同性的氨基酸序列。

11.一种编码如权利要求1-5任一项所述的ALS抗性突变蛋白的ALS抗性突变基因，其特征在于，

当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列；或，

当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第197位氨基酸由Pro突变为Phe、第198位氨基酸由Arg突变为Cys和第199位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列。

12.一种编码如权利要求6-10任一项所述的ALS抗性突变蛋白的ALS抗性突变基因，其特征在于，

当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第171位氨基酸由Pro突变为Phe、第172位氨基酸由Arg突变为Cys和第173位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列；或，

当所述ALS抗性突变蛋白的突变点位满足：第171位氨基酸由Pro突变为Val，第172位氨基酸由Pro突变为Val和第177位氨基酸由Arg突变为Cys时，所述ALS抗性突变基因具有至少如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列的50％的相同性的核苷酸序列。

13.一种表达盒、重组载体或细胞，其特征在于，所述表达盒、所述重组载体和所述细胞均含有如权利要求11或12所述的ALS抗性突变基因。

14.一种ALS抗性突变蛋白的应用，其特征在于，将如权利要求1-10任一项所述的ALS抗性突变蛋白在植物抗除草剂产品方面的应用。

15.一种对多种除草剂具有高抗性的植物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

使所述植物表达出具有如权利要求1-10任一项所述的ALS抗性突变蛋白；和/或，

使所述植物包含如权利要求11或12所述的ALS抗性突变基因；和/或，

对所述植物的细胞、组织和枝干的内源ALS基因进行基因编辑，以使所述植物表达出ALS抗性突变蛋白。

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