WO2022213520A1 - 草甘膦抗性基因gr79和gat的表达载体、高抗草甘膦玉米及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
提供了草甘膦抗性基因GR79和GAT的表达载体、高抗草甘膦玉米及其检测方法。对草甘膦具有高耐受性的GR79基因和GAT基因的密码子优化并合成的新的DNA序列，同时构建了双基因植物表达载体pCGG，结果证明，转入了所述植物表达载体的转基因玉米对靶标除草剂草甘膦具有高抗性，转基因玉米GG2是一个耐草甘膦效果显著的转化事件，通过染色体步移的方法获得了其左边界旁侧序列和右边界边界序列。两端的边界序列可以作为本转化事件的特异检测序列，通过两个边界序列设计引物，可以对转基因事件GG2特异性检测，并应用于检测试剂盒的开发。
Description
本发明属于生物技术领域，特别是涉及GR79和GAT两个草甘膦抗性基因的表达载体、高抗草甘膦玉米及其检测。
玉米(Zea mays L.)是大宗的粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，杂草不仅与玉米竞争水、肥、光和空间等，而且易滋生病虫害，严重影响作物的生长发育，造成作物产量降低、品质下降，因此杂草防治是玉米生产中的重要环节。中国农田的主要杂草超过250种，分布面积达4000多万公顷，其中1000多万公顷农田受害严重，平均每年因草害造成作物减产约13％，直接经济损失占农作物总产值的10％～20％。人工除草会消耗大量的劳动力，造成种植成本的增加，机械中耕除草费用较高且容易造成土壤流失和板结，因此利用除草剂来控制杂草已成为现代农业不可缺少的一部分。但由于除草剂的非选择性特点使其在使用过程中不可避免的会对农作物的生长发育产生影响。20世纪80年代以来，随着生物基因工程技术的迅猛发展以及对植物抗除草剂机理分子水平上的研究进展使得通过转基因技术让农作物获得耐除草剂性状成为可能。1983年第一个除草剂抗性作物烟草问世，标志着这一领域的研究从探索走向成功，至今已经有多种耐除草剂转基因作物进行商业化种植，如玉米、大豆、棉花、油菜等，产生了巨大社会经济效益并在提高耕地利用效率、提高人工效率方面产生了巨大推动作用。
草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，凭借其广谱高效、环境友好等优点，现已成为世界上应用最广泛的农药品种。莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。在高等植物体内芳香族氨基酸中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的生物合成过程中，5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是关键性的酶之一。EPSPS在莽草酸代谢途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与莽草酸-3-磷酸(S3P)缩合。草甘膦是PEP的竞争类似物，其作用机理就是通过与EPSPS和S3P形成稳定的复合体EPSPS-S3P-草甘膦，竞争性地抑制EPSPS的活性，阻断了莽草酸-3-磷酸转化为5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸，使芳香族氨基酸化合物的形成受阻，同时造成莽草酸大量积累，促使类黄酮以及酚类化合物等激素和关键性代谢物失调，打乱了生物正常氮代谢进而导致生物体的的死亡。根据草甘膦除草剂的作用机理，目前主要有3种方式培育抗草甘膦转基因作物：(1)过量表达EPSPS蛋白来补偿草甘膦造成的EPSPS蛋白损失；(2)转入epsps/aroA等基因，产生对草甘膦不敏感的EPSPS蛋白，如孟山都 公司利用农杆菌菌株cp4的EPSPS基因开发的转基因玉米NK603和转基因大豆40-3-2；(3)转入草甘膦-N-乙酰转移酶GAT，直接使草甘膦失活。
耐除草剂转基因玉米的研发工作，国际上起步较早且发展十分迅猛。2017年，全球转基因玉米种植面积达到5970万公顷，其中耐除草剂玉米(包含复合性状)的种植面积占比达到90％以上。目前商业化的耐除草剂转基因玉米品种全部为几大国际种业公司研发的，如孟山都公司研发的“NK603”耐除草剂玉米(含有cp4-epsps基因)、“GA21”耐除草剂玉米(含mepsps基因)，陶氏杜邦公司研发的“TC1507”抗虫耐除草剂玉米(含有cry1Fa2和pat基因)，先正达公司研发的“Bt11”抗虫耐除草剂玉米(含有cry1Ab和pat基因)、“Bt176”抗虫耐除草剂玉米(含有cry1Ab和bar基因)。2019年-2020年，中国批准了北京大北农生物技术有限公司研发的“DBN9936”抗虫耐除草剂玉米(含cry1Ab和epsps基因)、“DBN9858”耐除草剂玉米(含epsps和pat基因)以及杭州瑞丰生物科技有限公司和浙江大学联合研发的“瑞丰125”抗虫耐除草剂玉米(含cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因)的生产应用安全证书。这对中国转基因玉米的研发工作具有巨大的鼓舞和推动作用。
GR79和GAT基因是从草甘膦严重污染的土壤细菌宏基因组中分离并克隆。GR79基因编码EPSPS酶，草甘膦不能阻断GR79-EPSPS合酶催化PEP与S3P生成EPSP的反应，使植物芳香族氨基酸和其他化合物合成代谢继续进行，使植物获得抗除草剂能力，保护植物正常生长。GAT基因编码草甘膦-N-乙酰转移酶，草甘膦N-乙酰转移酶为作物抗草甘膦提供了不同于GR79-EPSPS途径的全新作用机制。在草甘膦-N-乙酰转移酶的作用下，乙酰辅酶A作为乙酰基供体，草甘膦分子的次级胺则作为乙酰基的受体，使草甘膦乙酰化失去除草剂活性，使转基因植物获得抗除草剂能力，保护植物正常发育生长。
GR79和GAT基因是创制耐除草剂植物的候选基因，研究者将CaMV35S启动子分别连接在GR79基因和GAT基因的前面构建了植物表达载体pGBIGRGAT转化棉花，获得转基因棉花，在T1代检测对草甘膦的耐受性，喷施草甘膦异丙胺盐溶液稀释至1/200(绝对浓度为0.205g/100ml草甘膦异丙胺盐)，喷施量为450升/公顷，存活率在84％以上(CN 103981199 B)，在转基因棉花叶片中表现了低草甘膦残留量(Liang et al.Co-expression of GR79 EPSPS and GAT yields
resistant cotton with low glyphosate residues.Plant Biotechnology Journal,2017,15:1622–1629)。
玉米是重要的农作物，目前转基因耐草甘膦玉米多选用的单基因EPSPS酶，Ren等将AM79基因(AM79基因即GR79基因，氨基酸序列相同)利用玉米Ubiquitin启动子连接豌豆RuBP羧化酶小亚基的叶绿体信号肽及AM79基因构建单基因载体转化玉米，获得了耐4倍剂量(3600g/公顷有效成分)的转基因玉米(Ren et al.Overexpression of a modified AM79 aroA gene in transgenic maize confers high tolerance to glyphosate.Journal of Integrative Agriculture,2015,14(3):414–422)。在培育高抗草甘膦玉米，尤其选用功能不同的耐草甘膦基因，利用单子叶植物高表达的启动子提高外源基因的表达量，可获得田间草甘膦耐受性强的转基因玉米材料，减少田间人工除草的劳动力成本，更适于玉米的机械化种植。
由于外源基因整合到玉米基因组上的位置会影响外源基因的表达，若想获得表达量高、耐除草剂效果好的转基因植株，需要从大量转化事件中筛选，并经过多代的遗传稳定性检测，才可以获得有产业化前景的耐除草剂玉米，同时，转基因玉米事件插入玉米基因组的边界序列可作为该转基因材料的身份标签，在染色体的一个插入位点可作为一个独立的转化事件，可以利用特异性引物检测出来。利用GR79和GAT两个草甘膦抗性基因的表达载体转化玉米获得了高抗草甘膦转基因玉米转化体GG2，其插入玉米基因组中的位置与其他转基因事件不同，其边界序列可作为身份标签做特异性鉴定。
发明内容
针对上述领域中的需求，本发明提供GR79和GAT两个草甘膦抗性基因在耐草甘膦中的组合应用，通过对GR79和GAT基因进行密码子优化并合成新的DNA序列，构建了含有GR79和GAT基因的植物表达载体pCGG，转化玉米得到了含GR79和GAT基因的转基因玉米植株，筛选到一个高抗草甘膦的转基因事件GG2；通过染色体步移的方法获得了其插入玉米基因组的左边界旁侧序列和右边界旁侧序列，边界两端的旁侧序列可以作为本转化事件的特异检测序列，通过两个边界旁侧序列设计引物，可以对转基因事件GG2特异性检测。
一种表达载体，其含有GR79和GAT两个草甘膦抗性基因，所述GR79基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述GAT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述表达载体命名为植物表达载体pCGG，其骨架载体为pCAMBIA2300。
所述植物表达载体pCGG其结构如图2所示。
所述植物表达载体pCGG的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
一种表达载体在植物耐草甘膦中的应用，所述应用为将含编码GR79和GAT蛋白的基因的植物表达载体转化植物中表达GR79和GAT蛋白，使植物具有抗草甘膦的特性。
所述转化的方法为农杆菌介导法。
所述植物为玉米。
转GR79和GAT基因耐草甘膦玉米，所述GR79基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述GAT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
转GR79和GAT基因耐草甘膦玉米GG2外源插入片段的左边界旁侧序列，如SEQ ID NO.6 中第269-462位所示；或如SEQ ID NO.8的1-440位所示。
转GR79和GAT基因耐草甘膦玉米GG2外源插入片段的右边界旁侧序列，如SEQ ID NO.7中第456-1773位所示，或如SEQ ID NO.8的6556-7873位所示。
根据左边界旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物对。
所述左边界旁侧序列的特异性引物对为：
GG2-Left-F3：5'-GGAGCAAGGAAGCGGACTAC-3'，
GG2-Left-R1：5'-CCCCACATCCTGATGTACAAG-3'。
根据右边界旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物对。
所述右边界旁侧序列的特异性引物对为：
GG2-Ubi-F1：5'-ATGATTCTCTAAAACACTG-3'，
GG2-Right-R1：5'-GCGAACATAGCGTCTTAC-3'。
转GR79和GAT基因耐草甘膦玉米GG2的PCR反应检测方法，其特征在于：其PCR反应中的引物为上述的特异性引物对。
所述的特异性引物对为：
GG2-Left-F3：5'-GGAGCAAGGAAGCGGACTAC-3'，
GG2-Left-R1：5'-CCCCACATCCTGATGTACAAG-3'。
所述PCR反应得到的片段大小为734bp；或者
所述的特异性引物对为：
GG2-Ubi-F1：5'-ATGATTCTCTAAAACACTG-3'，
GG2-Right-R1：5'-GCGAACATAGCGTCTTAC-3'。
所述PCR反应得到的片段大小为1773bp。
一种检测耐草甘膦玉米的试剂盒，其特征在于含有左边界旁侧序列的特异性引物对或/和右边界旁侧序列的特异性引物对，所述左边界旁侧序列如SEQ ID NO.6中第269-462位所示；所述右边界旁侧序列如SEQ ID NO.7中第456-1773位所示。
所述左边界旁侧序列的特异性引物为：
GG2-Left-F3：5'-GGAGCAAGGAAGCGGACTAC-3'，
GG2-Left-R1：5'-CCCCACATCCTGATGTACAAG-3'。
所述右边界旁侧序列的特异性引物为：
GG2-Ubi-F1：5'-ATGATTCTCTAAAACACTG-3'，
GG2-Right-R1：5'-GCGAACATAGCGTCTTAC-3'。
上述旁侧序列、旁侧序列的特异性引物、检测耐草甘膦玉米试剂盒在检测转基因玉米中 的应用。
本发明对GR79(SEQ ID NO.1)和GAT(SEQ ID NO.2)的核苷酸序列进行了密码子优化，并通过人工合成的方式合成了新基因GR79(SEQ ID NO.3)和GAT(SEQ ID NO.4)，构建GR79和GAT双价植物表达载体转化玉米，转化共获得103株T0代转化植株，经过PCR检测阳性植株为76株。将所有阳性转化植株转移至温室并收获种子。种植T1代转基因玉米于大田，在玉米长至四-六叶期时人工喷施草甘膦(喷施量为农药登记标签的中剂量的1倍、2倍、4倍，兑水450L/公顷，农达(Roundup，草甘膦农药商品名)中剂量为900g有效成分/公顷，下同)，经过多代筛选转基因耐草甘膦玉米GG2(保藏编号CGMCC No.20132)都没有受到草甘膦危害，耐草甘膦效果显著，通过染色体步移的方法获得了其左边界旁侧序列和右边界旁侧序列，边界两端的旁侧序列可以作为本转化事件的特异检测序列，通过两个边界旁侧序列设计引物，可以对转基因事件GG2特异性检测，并应用于检测试剂盒的开发。
田间非靶标除草剂耐受性检测结果表明转GAT和GR79双价耐草甘膦转基因玉米可以用其他类型的除草剂杀灭，不会成为“超级杂草”。此外与同期的研究工作比较发现，单表达GAT蛋白的耐草甘膦转基因玉米筛选得到高抗草甘膦除草剂的转化事件概率明显比双价耐草甘膦转基因玉米的低，而且部分单GAT高抗事件喷施高浓度草甘膦(中剂量4倍量)后前期叶片会出现轻微药害症状，喷施中剂量8倍量的草甘膦后无存活植株。这表明GR79和GAT基因协同表达更能提高玉米的耐草甘膦特性，对于培育具有自主知识产权的高耐草甘膦玉米具有非常重要的意义。
转基因玉米GG2，分类命名为玉米，Zea mays
保藏号为CGMCC No.20132
保藏日期：2021年1月14日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101
图1为植物表达载体pCGAT示意图。
图2为植物表达载体pCGG示意图。
图3为T1代GAT单价转基因玉米中GAT基因(A)以及GAT和GR79双价转基因玉米中GAT基因(B)和GR79基因(C)的PCR检测。
其中M为DNA分子量标准Super Marker；CK+：以质粒pCGG为模板扩增产物；CK-：是以非转基因玉米基因组DNA为模板扩增的产物；0：空白，以水为模板扩增产物；1-9：以T1代GG1-GG9转基因玉米基因组DNA为模板扩增产物。
图4为GG2转基因玉米的田间草甘膦耐受性检测；
其中图A为BC4代GG2喷施4倍草甘膦，图B为BC5代GG2喷施4倍草甘膦。
图5为GAT单价耐草甘膦玉米喷洒中剂量4倍量(A)和8倍量(B)的草甘膦后的结果。
图6为转基因玉米GG2的southern blot杂交结果；
其中图A为GAT探针检测结果，图B为GR79探针检测结果。Marker为DNA分子量标准由7条DNA片段组成，条带大小自上而下分别为23,130bp、9,416bp、6,557bp、4,361bp、2,322bp、2,027bp和564bp；CK+：pCGG质粒/HindIII酶切；CK-：非转基因玉米基因组DNA/HindIII酶切；
图7为插入片段的酶切位点示意图及预期的southern blot杂交条带大小；
图8为转基因玉米GG2左边界旁侧序列染色体步移检测图；
M为Trans5K DNA Marker，1
st为第1轮PCR结果，2
nd为第2轮PCR结果，3
rd为第3轮PCR结果；
图9为T2-T4代转基因玉米GG2右边界(A)及左边界(B)特异性PCR电泳图谱；
Marker：Trans5K DNA Marker，CK1(H
2O)：以H
2O为模板作为空白对照，CK2(pCGG)：以质粒pCGG为模板扩增产物，CK3(sister event GG3)：是以转化体GG3基因组DNA为模板扩增的产物，CK4(sister event GG4)：是以转化体GG4基因组DNA为模板扩增的产物，CK5(receptor B104)：是以转化受体B104基因组DNA为模板扩增的产物，CK6(Z58)：是以回交转育受体Z58基因组DNA为模板扩增的产物，T2：以T2代转化体GG2基因组DNA为模板扩增产物，T3：以T2代转化体GG2基因组DNA为模板扩增产物，T4：以T2代转化体GG2基因组DNA为模板扩增产物；
图10为转基因玉米GG2插入片段在玉米基因组中的位置。
图11为GAT和GR79双价耐草甘膦玉米GG2的田间非靶标除草剂耐受性检测。
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
下面所涉及的生物材料在本申请人的实验室均有保藏，可以对外发放。
实施例1、GR79和GAT基因的密码子改造和优化
GR79基因是从草甘膦严重污染的土壤细菌宏基因组中分离并克隆的，具有自主知识产权 (专利号：ZL 200710177090.1)。GR79基因的编码序列有1338bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.1，其编码的EPSPS酶由445个氨基酸组成。按照植物偏好的密码子对GR79基因的编码序列进行优化，原始GR79基因GC含量45.85％，优化后的GR79基因GC含量为64.56％，优化后的核苷酸序列见SEQ ID NO.3。GAT基因是通过免培养技术构建草甘膦污染土壤微生物总DNA的基因文库，用功能筛选的方法克隆得到的，具有自主知识产权(专利号：ZL200510086626.X)。GAT基因的编码序列有441bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.2，其编码的草甘膦乙酰转移酶由146个氨基酸组成。按照植物偏好的密码子对GAT基因的编码序列进行优化，原始GAT基因GC含量47.86％，优化后的GAT基因GC含量为63.90％，优化后的核苷酸序列见SEQ ID NO.4。
实施例2、GAT单价、GAT和GR79双价植物表达载体的构建
人工合成优化后的GAT基因和GR79基因，同时在GAT基因上游增加了增强基因表达的OMK序列，在GR79基因上游增加了增强基因表达的OMK序列和玉米叶绿体信号肽序列ZmRuBP。商用载体pCAMBIA2300通过XhoI酶切去掉T-DNA中的nptII基因，将合成的OMK-GAT片段通过无缝克隆的方式连入，构建获得的载体称为pCGAT(载体示意图见图1)，该载体含有单GAT基因。pUC57-UN是一个中间载体，载体中含有一个Ubiquitin启动子和一个NOS终止子(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，合成的OMK-RuBPs-GR79片段通过BamHI和KpnI酶切连入pUC57-UN载体，通过HindIII和EcoRI酶切将GR79表达盒连入pCGAT载体中，构建获得最终载体pCGG(载体示意图见图2)，该载体含有GAT和GR79基因。
实施例3、GAT单价、GAT和GR79双价转基因玉米的获得
本发明将载体pCGAT和pCGG通过冻融法分别转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1.2mm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚放到侵染培养基中一个小时后，用侵染培养基洗一次，再浸入到添加100μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，放到共培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。再将幼胚转移至恢复培养基上培养10天至诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织先去芽后再转移到含有相应筛选剂的筛选培养基上，每两周继代一次，经过6周的筛选将抗性愈伤组织转移到再生培养基上见光分化，见光约一周后，开始出现绿色的芽点，将愈伤块进行切分使绿色的芽点分开并转移到再生培养基上培养，利于主茎的生长，待主茎伸长至3～4cm时，将其转移至再生培养基上诱导生根，待玉米植株长得粗壮且根系发达后，将其转移至温室小花盆中生长。继续培养两周后，待转化苗生长状态良好后转移至温室，待雌穗吐丝后，用纸袋套住，等雄穗散粉后进行授粉，并收获果实。
所述培养基：
侵染培养液：N6盐和N6维生素(Chu等，Science Sinica，1975，18:659-668)，1.5mg/L 2,4-D，0.7/L g脯氨酸，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖(pH 5.2)，过滤灭菌，于4℃储存；使用前加入已过滤灭菌的乙酰丁香酮(AS)，终浓度为100μM；
共培养培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶(pH 5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银，100μM的AS，300mg/L的半胱氨酸；
恢复培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，0.5g/L MES，4g/L植物凝胶(pH 5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银和200mg/L的羧苄青霉素；
筛选培养基：恢复培养基加入筛选剂1mM草甘膦；
再生培养基：MS盐和MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3g/L植物凝胶(pH5.8)，高压灭菌。
所述玉米幼胚为新鲜剥离的1.2mm长的幼胚。
所述农杆菌菌液中添加有100μM乙酰丁香酮
实施例4、GAT单价、GAT和GR79双价转基因玉米植株PCR检测
采用CTAB法提取转化玉米植株的基因组DNA，按照GAT和GR79优化后的序列设计引物，GAT引物序列：GAT-F1:5'-TCGACGTGAACCCGATCAAC-3'，GAT-R1:5'-TCTGCTCCCTGTAGCCCTCC-3'；GR79引物序列：GR79-F1:5'-TCAGCAGGGCGAGTGGA-3'，GR79-R1:5'-TCGTCGTGCGGGTTCAG-3'。扩增GAT基因获得的目的片段大小为249bp，扩增GR79基因获得的片段大小为831bp；
GAT基因PCR反应体系(20μL)：
GAT基因PCR反应条件：
95℃3min；95℃20s,58℃15s,72℃20s,30cycles；72℃5min；4℃pause。
GR79基因PCR反应体系(20μL)：
GR79基因PCR反应条件：
95℃3min；95℃20s,59.4℃15s,72℃40s,30cycles；72℃5min；4℃pause。
PCR检测结果见图3。
在转GAT和GR79基因的玉米转化中，共获得103株T0代转化植株，经过PCR检测GAT和GR79双阳性转基因玉米植株为76株，阳性率为73.79％；同时获得转GAT单基因46个转化体，PCR检测阳性植株38株，阳性率为82.6％。
实施例5、GAT单价、GAT和GR79双价转基因玉米高抗草甘膦事件的筛选
PCR检测GAT和GR79双阳性的76个转化事件T1代材料播种于大田，4叶期喷施草甘膦，草甘膦除草剂施用量为农药登记标签中剂量(有效成分900g/公顷)，存活72个转化事件，无药害94.7％，继续施用2倍中剂量的草甘膦(有效成分1800g/公顷)，用药4周后调查，其中63个转化事件无药害症状。将筛选得到的63个转化事件T2代材料播种，4-5叶期喷施草甘膦，草甘膦除草剂施用量为农药登记标签中剂量(有效成分900g/公顷)的1倍、2倍、4倍，用药4周后调查和记录每个转化事件的成活率、药害症状，其中47个转化事件在4倍中剂量草甘膦喷施无药害症状，为高抗草甘膦材料，占76个阳性转基因材料的61.84％。继续加大筛选浓度，在达到中剂量8倍(有效成分7200g/公顷)时，有6个转化事件生长未受影响，GG2转化事件在多代的筛选过程中没有受到草甘膦危害，田间耐草甘膦效果显著(图4)。
为了确定双基因组合应用对高耐受草甘膦的作用，对转GAT单基因的转基因玉米进行了草甘膦耐受性实验，经过同样的筛选过程最终得到8个可抗4倍草甘膦转化事件，占38个阳性转基因材料的21.05％。两者相比，转GAT和GR79双价耐草甘膦转基因玉米更易获得高抗草甘膦材料。此外转GAT基因高抗草甘膦的玉米转化事件虽然能够耐受中剂量4倍的草甘膦，但与GAT和GR79双价转基因玉米高抗草甘膦事件相比，部分事件在喷施中剂量4倍的草甘膦后的几天时间内叶片会出现轻微药害症状(图5中A)。转GAT基因玉米在中剂量8倍(有效成分7200g/公顷)草甘膦喷施后无存活植株(图5中B)。
实施例6、转基因玉米事件GG2的田间草甘膦耐受性鉴定
依据《转基因植物及其产品环境安全检测抗除草剂玉米第1部分：除草剂耐受性》(农 业部953号公告-11.1-2007)对转基因玉米的田间除草剂耐受性进行检测。
试验材料为GG2转基因玉米、对应的非转基因玉米。除草剂选用草甘膦。区组设计(未随机)，2次重复，小区面积为30m
2(5m×6m)，行距60cm，株距25cm。小区间设有1.0m宽隔离带。处理包括转基因玉米不喷施除草剂、转基因玉米喷施目标除草剂(草甘膦)、非转基因玉米不喷施除草剂、非转基因玉米喷施目标除草剂(草甘膦)。除草剂施用量分别为农药登记标签中剂量(有效成分900g/公顷)的1倍、2倍、4倍。在玉米4-5叶期施用。分别在用药1、2、4周调查和记录成活率、植株高度、药害症状。药害症状分级按GB/T 19780.42执行。对转基因玉米GG2及其对应的转基因对照、非转基因对照进行草甘膦鉴定，连续两代的田间草甘膦耐受性鉴定结果显示：与转基因玉米未喷施除草剂比较，转基因玉米GG2在喷施不同草甘膦处理后，各时期均未出现受害症状，株高未出现显著性差异(表1和表2)，这说明GG2转基因玉米均能够抗中剂量4倍及以下草甘膦且耐草甘膦性状稳定遗传。
表1草甘膦处理GG2植物株高调查
注：表中数据为平均值±标准差，同一列数据后英文小写字母不同表示不同处理间差异显著(P<0.05)。以下同。
表2草甘膦处理GG2受害率调查
实施例7、转基因玉米事件GG2的外源基因插入位点分析
1、玉米基因组DNA的大量提取(CTAB法略改进)：
(1)称取5g叶片，液氮充分研磨成粉(勿使材料融化)后加入50mL的离心管中；
(2)加入15mL 2×CTAB缓冲液(Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，2％CTAB，0.1％巯基乙醇)充分混匀，65℃进行水浴1小时；
(3)冷却至室温后，加入15mL的氯仿/异戊醇(24：1)，上下颠倒混匀至乳浊液，室温下放置15～60分钟；
(4)室温下12,000rpm离心15min；
(5)将上清液转入到干净离心管后，加入2/3体积的异丙醇，上下颠倒数次，挑出DNA，放入干净的1.5mL离心管；
(6)将DNA用70％乙醇清洗2次，空气干燥1小时；
(7)500μL TE溶解DNA后，再加入5μL RNase A(10mg/mL)，在4℃过夜溶解或37℃1小时溶解；
(8)加入500μL苯酚，颠倒充分混匀，12,000rpm离心5min，将上清液转移至另一离心管；
(9)分别加入250μL苯酚和氯仿，颠倒充分混匀，12,000rpm离心5min，将上清液转移至另一离心管；
(10)加入500μL氯仿，颠倒充分混匀，12,000rpm离心5min，将上清液转移至10mL离心管中；
(11)加TE至3mL，然后加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积3M NaAc，上下颠倒数次；
(12)将沉淀出的DNA用70％乙醇清洗2次；转移DNA至1.5mL离心管，空气干燥并溶于500μL TE，DNA定量，备用。
2、基因组DNA小量酶切的预实验：
混匀后，于37℃酶切2～3hr；酶切反应物在0.7％琼脂糖上电泳分离，检查酶切效果。3、基因组DNA的大量酶切：
基因组DNA 100μg
酶(10U/μL) 5μL
(本实验选用Hind III、Kpn I酶切)
10×Buffer 40μL
Total 400μL
混匀后于37℃酶切10hr；取2μL酶切产物进行电泳分离，检查酶切效果；酶切完全后，对酶切产物进行沉淀，加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，混匀后，于-20℃放置2hr；于12,000rpm，4℃离心20min，弃上清，往沉淀中加入1mL 70％乙醇，12,000rpm离心2min弃上清,沉淀吹干后溶于30μL ddH
2O中备用。
4、探针的制备
按照PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书制备探针。
GAT基因探针引物：
GAT probe-F1:5'-TCGACGTGAACCCGATCAAC-3'，
GAT probe-R1:5'-TCTGCTCCCTGTAGCCCTCC-3'，
GAT基因探针大小249bp。
GR79基因探针引物：
GR79probe-F1:5'TCAGCAGGGCGAGTGGA 3'，
GR79probe-R1:5'TCGTCGTGCGGGTTCAG 3'，
GR79基因探针大小831bp。
PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
PCR结束后电泳检测DIG标记的探针并测定浓度。
5、Southern blot杂交
(1)制备0.7％的琼脂糖凝胶，在30μL基因组DNA酶切产物中加入6μL 6×loading buffer进行电泳分离，上样后静置10min，开始时采用低电压，待溴酚蓝跑出加样孔2～3cm后，加大电压至50V，电泳5～6小时；
(2)电泳结束后，依次对凝胶进行如下处理：0.125M盐酸中浸泡胶10min，凝胶中溴酚蓝变为黄色；蒸馏水处理凝胶5min；中和液中浸泡胶30min；
(3)采用毛细管转移方法将DNA转移至尼龙膜(具体操作见《分子克隆》实验手册)；
(4)转膜结束后6×SSC浸泡尼龙膜5min，将尼龙膜置超净台内吹干或室温晾干；
(5)80℃，烘膜2hr，固定DNA样品；
(6)DIG标记探针的制备：按照PCR DIG Probe Synthesis Kit试剂盒(购自Roche公司)中探针制备的方法进行，制备GAT和GR79基因标记探针并测定探针的浓度；
(7)预杂交：用镊子小心将尼龙膜装入杂交管中，小心操作不要产生气泡，然后加入42℃预热的DIG Easy Hyb杂交液(地高辛标记和检测试剂盒Ⅱ购自Roche公司)10mL，42℃预杂交3hr；
(8)杂交：首先进行探针的处理，将标记的探针于99℃变性6min，立即放于冰中冷却2min。取7mL DIG Easy Hyb杂交液，加入处理过的探针(25ng/ml Hyb杂交液)，轻轻混匀小心不要产生气泡，放入杂交炉中，42℃杂交16～20hr；
(9)洗膜：先用50mL的2×SSC，0.1％SDS溶液室温下洗涤两次，每次15min。然后用0.5×SSC，0.1％SDS溶液50mL65℃洗涤两次，每次30min。用镊子将膜小心取出转入装有50mL Washing buffer的平皿中振荡洗涤1～5min；
(10)用100ml 1×Blocking solution室温孵育60min；
(11)用20ml Antibody solution孵育30min；
(12)用50ml Washing buffer洗涤2次，每次30min；
(13)在20ml Detection buffer中平衡2～5min；
(14)用镊子将膜平放于两层保鲜膜之间，先将上层保鲜膜提起，然后加入1ml CSPD底物，从一端缓慢放下上层保鲜膜，使底物均匀地覆盖在膜的表面，于室温静置5min；
(15)用玻璃棒赶出多余液体，用滤纸吸干膜外的底物，37℃孵育10min；
(16)用AI600(GE，美国)自动化学发光成像分析系统进行图像分析，结果见图6。
根据转基因玉米事件GG2的Southern blot结果进行分析：在插入玉米基因组的T-DNA序列中有1个HindIII酶切位点，1个KpnⅠ酶切位点，这两个酶切位点不会影响对GAT和 GR79基因拷贝数的鉴定。插入片段的酶切位点示意图及预期的southern blot杂交条带大小如图7所示。以GAT基因片段和GR79基因片段做探针，southern blot检测GG2转基因玉米插入序列的拷贝数，结果显示HindIII、KpnⅠ的酶切产物都杂交出1个条带(图6)，证明GAT和GR79基因是1个拷贝插入玉米的基因组中。分析结果见表3。
表3 GG2转基因玉米中目的基因southern杂交试验结果汇总表
实施例8、通过染色体步移获得转基因事件GG2的左边界和右边界旁侧序列
插入到玉米基因组的外源片段如图7所示，因为ubiquitin启动子是来自玉米泛素蛋白基因，玉米基因组中含有该基因，所以用染色体步移方法不易获得右边界旁侧序列，因此从GAT基因开始设计引物，从GAT基因的5’端往3’端扩增左边界的旁侧序列。
1、通过染色体步移获得转基因事件GG2的左边界旁侧序列
扩增左边界旁侧序列的特异性引物设计如下：
GAT-SP1：5'-GATGACGCACAATCCCAC-3'(位于CaMV 35S启动子上)
GAT-SP2：5'-CTACGCTGGAGGGCTACA-3'(位于GAT基因上)
GAT-SP4：5'-GAGCAGGGCGAGGTGTTC-3'(位于GAT基因上)
染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit，Code No.6108)购自TaKaRa公司，试剂盒里有4种简并引物，用GAT-SP1、GAT-SP2分别和4种简并引物(AP1、AP2、AP3、AP4)进行2轮扩增，根据扩增效果，最后选择了AP4引物，用AP4引物与GAT-SP4进行了第三轮的扩增，得到的PCR产物送去测序。
(1)第1轮PCR反应
以GAT-SP1为上游引物，4种简并引物分别为下游引物，以AP4为例，进行第1轮PCR反应。
反应体系：
反应条件：
(2)第2轮PCR反应
取第1轮PCR反应产物5μL电泳(图8)，根据第一轮电泳条带亮度选择稀释倍数。取1μL第1轮PCR反应稀释产物作为模板进行第2轮PCR反应，GAT-SP2为上游引物，4种简并引物分别为下游引物，以AP4为例，进行第2轮PCR反应。
反应体系：
反应条件：
(3)第3轮PCR反应
取第2轮PCR反应产物5μL电泳(图8)，根据第2轮电泳条带亮度选择稀释倍数。取1μL第2轮PCR反应稀释产物作为模板进行第3轮PCR反应，以GAT-SP4为上游引物，AP4为下游引物，进行第3轮PCR反应。
反应体系：
反应条件：
(4)取第3轮PCR反应产物5μL，1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳图见图8，切胶回收清晰的电泳条带，以GAT-SP4为引物对第3轮PCR产物进行DNA测序。
测序结果见SEQ ID NO.6。经过序列比对SEQ ID NO.6的1-268位为GG2的T-DNA序列，载体序列左边界3’端缺失22bp。SEQ ID NO.6的269-462位为玉米基因组第1号染色体chr1:269325682-269325493(Zea mays(B73_RefGen_v4))序列。
转基因耐草甘膦玉米GG2外源插入片段的3’端旁侧序列染色体步移测序结果
划线为玉米基因组序列。
2、插入片段的右边界旁侧序列的获得
根据已经获得的左边界旁侧序列，检索已知的玉米基因组序列，在载体的ubiquitin启动子序列和推测的右边界旁侧序列设计特异性引物进行PCR扩增。
特异性引物：
GG2-Ubi-F1：5'-ATGATTCTCTAAAACACTG-3'(在Ubiquitin启动子序列上)
GG2-Right-R1：5'-GCGAACATAGCGTCTTAC-3'(在玉米基因组上)
PCR产物大小：1773bp。
反应体系：
反应条件：
取2μLPCR产物电泳检测，结果见图9。剩余PCR产物进行DNA测序。
测序结果见SEQ ID NO.7。经过序列比对SEQ ID NO.7的1-435位为载体右边界内T-DNA序列，载体序列右边界内(包含右边界)5’端缺失46bp。436-455为重组序列。456-1773位为玉米基因组第1号染色体chr1:269325753-269326914(Zea mays(B73_RefGen_v4))序列。转基因耐草甘膦玉米GG2外源插入片段的5’端旁侧序列特异性PCR测序结果
划线为玉米基因组序列。
3、插入片段的左边界旁侧序列的获得
由于染色体步移获得的左边界旁侧序列太短(小于300bp)，为了获得更长的左边界旁侧序列，检索已知的玉米基因组序列，在载体的GAT基因序列和左边界玉米基因组参考序列设计特异性引物进行PCR扩增。
特异性引物：
GG2-Left-F3：5'-GGAGCAAGGAAGCGGACTAC-3'(在玉米基因组上)
GG2-Left-R1：5'-CCCCACATCCTGATGTACAAG-3'(在gat基因序列上)
PCR产物大小：734bp。
反应体系：
反应条件：
取2μLPCR产物电泳检测，结果见图9。剩余PCR产物进行DNA测序。
结合左右边界旁侧序列的测序结果，插入片段在玉米中的位置见图10所示。GG2转基因玉米T-DNA序列整合到玉米基因组1号染色体269325682-269325753位点(Zea mays(B73_RefGen_v4))，造成插入位点玉米基因组有70bp序列缺失，对应chr1:269325683-269325752(Zea mays(B73_RefGen_v4))。转基因玉米GG2外源插入序列如SEQ ID NO.8的441-6535位所示，左边界旁侧序列如SEQ ID NO.8的1-440位所示，右边界旁侧序列如SEQ ID NO.8的6556-7873位所示。
转基因玉米GG2是高耐草甘膦除草剂的转基因玉米品系，具有重要的生产应用价值。转基因耐草甘膦玉米GG2外源插入片段的两端旁侧序列以及特异性引物，可作为分子标记物用于简单、快速、准确的检测转基因耐草甘膦玉米品系GG2及其衍生材料。
实施例9、GAT和GR79双价转基因玉米对非靶标除草剂的耐受性检测
本试验设3种除草剂，分别为玉米田常用的硝磺异丙莠(硝磺草酮3.5％、异丙草胺15％、莠去津15％)，及对玉米敏感的草铵膦(草铵膦有效成分20％)，高效氟吡甲禾灵(有效成分10.8％)。设置4个处理：(1)不喷除草剂；(2)喷施硝磺异丙莠；(3)喷施草铵膦；(4)喷施高效氟吡甲禾灵。喷施剂量为农药登记标签的高剂量。在玉米生长至4～6叶期进行茎叶喷施。分别在用药后1周、2周和4周调查成苗率和药害症状。结果表明在喷施相同剂量的非目标除草剂硝磺异丙莠处理下GAT和GR79双价转基因耐除草剂玉米与和非转基因对照玉米都未有药害症状，植株正常生长；在分别喷施相同剂量的草铵膦、高效氟吡甲禾灵处理下，GAT和GR79双价转基因耐除草剂玉米与和非转基因对照玉米全部死亡(图11)。硝磺异丙莠是玉米田苗后除草剂，对转基因玉米和非转基因玉米都未造成危害，而草铵膦和高效氟吡甲禾灵对玉米有很强的的危害，从转基因生物安全性的角度来看，耐草甘膦玉米对草铵膦和高效氟吡甲禾灵敏感，说明可以用其他除草剂杀灭耐草甘膦玉米，防止耐除草剂玉米徒长，成为“田间超级杂草”。
Claims (18)
- 一种表达载体，其含有GR79和GAT两个草甘膦抗性基因，所述GR79基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述GAT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
- 根据权利要求1所述的表达载体，命名为植物表达载体pCGG，其骨架载体为pCAMBIA2300。
- 根据权利要求2所述的表达载体，所述植物表达载体pCGG结构如图2所示。
- 根据权利要求3所述的表达载体，所述植物表达载体pCGG的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
- 权利要求1-4任一所述表达载体在植物耐草甘膦中的应用，所述应用为将权利要求1-4任一所述的表达载体转化植物中表达GR79和GAT蛋白，使植物具有抗草甘膦的特性。
- 根据权利要求5所述的应用，所述转化的方法为农杆菌介导法。
- 根据权利要求5所述的应用，所述植物为玉米。
- 转GR79和GAT基因耐草甘膦玉米，所述GR79基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述GAT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
- 根据权利要求8所述的转GR79和GAT基因耐草甘膦玉米的外源插入片段的左边界旁侧序列，如SEQ ID NO.8的1-440位所示。
- 根据权利要求8所述的转GR79和GAT基因耐草甘膦玉米的外源插入片段的右边界旁侧序列，如SEQ ID NO.8的6556-7873位所示。
- 根据权利要求9所述的左边界旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物对。
- 根据权利要求11所述的左边界旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物对，其序列为：GG2-Left-F3：5'-GGAGCAAGGAAGCGGACTAC-3'，GG2-Left-R1：5'-CCCCACATCCTGATGTACAAG-3'。
- 根据权利要求10所述的右边界旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物对。
- 根据权利要求13所述的右边界旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物对，其序列为：GG2-Ubi-F1：5'-ATGATTCTCTAAAACACTG-3'，GG2-Right-R1：5'-GCGAACATAGCGTCTTAC-3'。
- 转基因耐草甘膦玉米GG2的PCR反应检测方法，其特征在于：其PCR反应中的引物对为权利要求11-14任一所述的特异性引物对。
- 根据权利要求15所述的PCR反应检测方法，其特征在于：所述的特异性引物对为：GG2-Left-F3：5'-GGAGCAAGGAAGCGGACTAC-3'，GG2-Left-R1：5'-CCCCACATCCTGATGTACAAG-3'，所述PCR反应得到的片段大小为734bp；或者所述的特异性引物对为：GG2-Ubi-F1：5'-ATGATTCTCTAAAACACTG-3'，GG2-Right-R1：5'-GCGAACATAGCGTCTTAC-3'。所述PCR反应得到的片段大小为1773bp。
- 一种检测耐草甘膦玉米的试剂盒，其特征在于含有权利要求11或12所述的左边界旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物对，或/和含有权利要要求13或14所述的右边界旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物对。
- 权利要求9或10所述的旁侧序列、权利要求11-14任一所述的特异性引物对、权利要求17所述的检测耐草甘膦玉米的试剂盒在检测转基因玉米中的应用。
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