CN103981199A - 一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用 - Google Patents

一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用。本发明所提供的表达载体为同时表达草甘膦抗性基因1和草甘膦抗性基因2的环形载体；所述草甘膦抗性基因1编码的蛋白质为序列1所示的蛋白质或其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有草甘膦抗性的蛋白质；所述草甘膦抗性基因2编码的蛋白质为序列2所示的蛋白质或其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质。实验证明，转入了所述表达载体的转基因棉花具有非常强的草甘膦抗性。本发明对于进一步培育高抗草甘膦植物及其应用具有非常重要的意义。

Description

一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用。
背景技术
转基因作物是指通过特定方法将来自于动物、植物、微生物等来源的目的基因转移到天然作物中，从而使作物定向获得某种特性并使之能稳定遗传，例如抗除草剂、抗虫、抗逆、抗病等。该技术能克服物种遗传壁垒，改变传统耕作方式，大幅度提升作物产量及品质。第一种转基因作物于1983年首次研发成功，至今已有35科120多种植物成功应用转基因技术，产生了巨大社会经济效益并在提高耕地利用效率、减少农药施用及环境污染、提高人工效率方面产生了巨大推动作用。
对于转基因作物的研究早在20世纪80年代初期就已经开始，至今已经有多种转基因作物的研究报道，涵盖了大部分粮食作物及经济作物，如水稻、玉米、棉花、烟草、番茄、辣椒、大豆、杨树等，目的基因大部分为抗虫，抗除草剂，抗病，抗逆等抗性基因。
草甘膦是一种具有广谱灭生性、内吸传导型除草剂。广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理，是全世界除草剂使用量最大的品种之一。草甘膦具有独特的除草机理，草甘膦是植物莽草酸合成途径关键酶EPSPS的抑制剂，从而打断植物的莽草酸合成途径，植物中的莽草酸含量增加，植物体所必需的芳香族氨基酸合成减弱或停止，随之植物失绿而死亡。草甘膦是一种灭生性除草剂，直接在田间喷施，会对作物产生危害。随着抗草甘膦EPSPS基因的发现和抗草甘膦作物的培育，使草甘膦在田间大量使用成为可能。
草甘膦化学名称N-磷酸甲基甘氨酸(N-(phosphonomethyl)-glyeine)，结构式HO2CCH2NHCH2PO3H2分子量为169.1，常态为白色固体，熔点200℃,230℃融化分解，密度0.5g/cm3不可燃，常温能稳定储藏。草甘膦可与碱(有机或无机)生成极易溶于水的盐，而且又不损失其母体化合物的除草活性，草甘膦异丙胺盐是最常用的易容盐，溶解度达500g/L，且不降低草甘膦的毒性。
目前应用最广泛的抗草甘膦转基因棉花是美国孟山都公司，抗农达(草甘膦)棉花(Roundup ReadyCotton)，于1994年通过环境释放许可，1997年开始在主要产棉区推广种植。已商业化的抗农达棉花含有CP4-EPSPS基因。该基因是从Agrobacteriumspp中分离出来的对草甘膦不敏感。草甘膦对CP4-EPSPS作用和结合位点与草甘膦对大多数植物中发现的敏感型EPSPS的作用和结合位点是一致的。总体来看，虽然CP4-EPSPS蛋白有50.1％与传统玉米的EPSPS相似，但只有23.3％是完全一致的。因此，通过在草甘膦与PEP(磷酸稀醇式丙酮酸)结合区以外的氨基酸序列变化所引起的构象变化，可以有效降低对草甘膦的亲和性CP4-EPSPS基因插入后，避开了植物体内原有的EPSPS系统，从而使莽草酸代谢得以正常进行，产生了对草甘膦的抗性。目前商业化的抗草甘膦作物大都采用了CP4-EPSPS基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用。
本发明所提供的表达载体，为同时表达草甘膦抗性基因1和草甘膦抗性基因2的环形载体；
所述草甘膦抗性基因1(GR79基因)编码的蛋白质(GR79蛋白)可为下述a1)或a2)：
a1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；
a2)将a1)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质；
所述草甘膦抗性基因2(GAT基因)编码的蛋白质(GAT蛋白)可为下述b1)或b2)：
b1)氨基酸序列为序列表中序列2所示的蛋白质；
b2)将b1)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质。
为了便于蛋白的纯化，可在由序列表中序列1或序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述a2)和b2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)和b2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列3或序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
进一步，所述草甘膦抗性基因1(GR79基因)为如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码a1)所述蛋白质的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码a1)所述蛋白质的DNA分子；和/或
所述草甘膦抗性基因2(GAT基因)为如下4)至6)中任一所述的DNA分子：
4)编码序列为序列表中序列4所示的DNA分子；
5)在严格条件下与4)限定的DNA分子杂交且编码b1)所述蛋白质的DNA分子；
6)与4)或5)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码b1)所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列3由1338个核苷酸组成，整个序列3即为ORF，编码序列表中序列1所示的GR79蛋白。序列4由441个核苷酸组成，整个序列4即为ORF，编码序列表中序列2所示的GAT蛋白。
在所述表达载体中，所述草甘膦抗性基因1(GR79基因)存在于表达盒1中；所述草甘膦抗性基因2(GAT基因)存在于表达盒2中。
所述表达盒1中启动所述草甘膦抗性基因1(GR79基因)转录的启动子，以及所述表达盒2中启动所述草甘膦抗性基因2(GAT基因)转录的启动子均为35S启动子；
在本发明中，所述35S启动子的序列具体为序列表中序列5的第1-710位或第2863-3572位。
所述表达盒1中终止所述草甘膦抗性基因1(GR79基因)转录的终止子，以及所述表达盒2中终止所述草甘膦抗性基因2(GAT基因)转录的终止子均为NosT终止子；
在本发明中，所述NosT终止子的序列具体为序列表中序列5的第2370-2846位或第4110-4586位。
所述表达盒1和所述表达盒2中，在所述35S启动子的下游均还包括Ω序列。
在本发明中，所述Ω序列具体为序列表中序列5的第717-787位或第3579-3649位。
所述表达盒1中，在所述Ω序列和所述草甘膦抗性基因1之间还包括叶绿体前导肽序列。
在本发明中，所述叶绿体前导肽序列具体为序列表中序列5的第792-1018位。
进一步，所述表达载体中，所述表达盒1的序列具体为序列表中序列5的第1-2846位；所述表达盒2的序列具体为序列表中序列5的第2863-4586位。
在本发明中，所述表达盒1和所述表达盒2方向相同。
更加具体的，在本发明中，所述表达载体的全序列具体为序列表中序列5。
其中，序列5由15811个核苷酸组成。
含有所述表达载体的重组细胞系或转基因微生物也属于本发明的保护范围。
所述表达载体在培育耐草甘膦转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种培育耐草甘膦转基因植物的方法。
本发明所提供的培育耐草甘膦转基因植物的方法，具体可包括如下B1)和B2)的步骤：
B1)向目的植物中导入所述表达载体，得到同时表达所述草甘膦抗性基因1和所述草甘膦抗性基因2的转基因植物；
B2)从步骤B1)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，草甘膦抗性增强的转基因植物。
以上应用或方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
在本发明中，所述植物为双子叶植物——棉花，具体为棉花品种棉花品种柯字312(Coker312)。
本发明的又一个目的是提供如下DNA分子1和/或DNA分子2。
所述DNA分子1为如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码a1)所述蛋白质的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码a1)所述蛋白质的DNA分子；
所述DNA分子2为如下4)至6)中任一所述的DNA分子：
4)编码序列为序列表中序列4所示的DNA分子；
5)在严格条件下与4)限定的DNA分子杂交且编码b1)所述蛋白质的DNA分子；
6)与4)或5)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码b1)所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有所述DNA分子1和/或所述DNA分子2的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌都属于本发明的保护范围。
本发明对草甘膦抗性基因GR79和GAT，均按照棉花宿主偏爱密码子表对两个基因进行核苷酸水平上的编辑，而后通过生物信息学工具进一步对编辑后的序列进行加工，目的是调整基因总体GC水平，优化限制性酶切位点，去除可能抑制性负调控元件及优化mRNA结构提高mRNA稳定性等。本发明将优化后的草甘膦抗性基因GR79和GAT构建到双价表达载体上进行同时表达，将获得的双价抗草甘膦转基因棉花在4-5片真叶期进行田间草甘膦喷施试验，喷施草甘膦异丙胺盐溶液(农达Ω)稀释至1/300浓度，喷施量为30升/亩。实验表明，所得转基因棉花并未发现明显受害症状，叶片未出现萎蔫失绿现象且生长点长势良好，与未进行草甘膦处理对照植株生长状况差异不明显，以上结果证明获得的双价抗草甘膦转基因棉花具有较强的草甘膦抗性。本发明对于培育具有自主知识产权的高抗草甘膦棉花具有非常重要的意义。
附图说明
图1为中间载体pG4ACGR79和pG4AGAT的表达盒图示。其中，CTP-2表示拟南芥基因的叶绿体前导肽序列。
图2为中间载体pGBIGAT的表达盒图示。
图3为双价表达载体pGBIGRGAT的表达盒图示。其中，CTP-2表示拟南芥基因的叶绿体前导肽序列。
图4为转入双价表达载体pGBIGRGAT的T1代转基因棉花植株的PCR鉴定结果。其中，M为DNA分子量标准Fermentas1301；1：pGBIGRGAT质粒阳性对照(引物1和引物2)；2-4为T1代转基因棉花植株(引物1和引物2)；5为转入空载体pBI121的对照棉花植株(引物1、引物2、引物3、引物4)；6为pGBIGRGAT质粒阳性对照(引物3和引物4)；7-9为T1代转基因棉花植株(引物3和引物4)；10为未转基因的对照棉花植株(引物1、引物2、引物、引物4)。
图5为转入双价表达载体pGBIGRGAT的T1代转基因棉花植株的Western blot鉴定结果。M：蛋白分子量标准；1：阳性对照；2：转入空载体pBI121的对照棉花植株；3：未转基因的对照棉花植株；4和5：两个T1代转基因棉花植株。
图6为转入双价表达载体pGBIGRGAT的T1代转基因棉花植株的草甘膦抗性鉴定结果。A：T1代转基因棉花植株(喷施草甘膦后第7天)；B：未转基因的对照棉花植株(喷施草甘膦后第7天)；C：T1代转基因棉花植株(喷施草甘膦后第30天)；D：未转基因的对照棉花植株(喷施草甘膦后第30天)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pG4AB载体：记载于“李根英,夏兰芹,夏先春等.Pina和Pinb融合基因表达载体的构建及其在硬粒小麦中的转化.中国农业科学,2007年07期”一文，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
pBI121载体：记载于“张俊莲,王蒂,张金文等.pBI121载体酶切位点添加及拟南芥Na～+/H～+逆向转运蛋白基因表达载体的构建.分子植物育种,2006年06期”一文，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
农杆菌GV3101：记载于“肖卫民,赵名琛,邹敏等.拟南芥受伤和接种根癌农杆菌GV3101对转录的影响.农业生物技术学报,2013年05期”一文，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
棉花品种柯字312(Coker312)：记载于“倪勇祥.棉花GhHB基因克隆和表达初步分析.华中师范大学,2007年，硕士论文”一文，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
实施例1、密码子优化型草甘膦抗性基因GR79和GAT的获得
由于GR79基因、GAT基因来源于土壤微生物总DNA，外源基因在不同宿主内的表达效率及表达稳定性不同，本发明中的抗性基因GR79、GAT需要进行人工改造。改造的中心原则是在不影响基因所编码的氨基酸组成及氨基酸排列顺序的基础之上，按照棉花宿主偏爱密码子表对两个基因进行核苷酸水平上的编辑，而后通过生物信息学工具进一步对编辑后的序列进行加工，目的是调整基因总体GC水平，优化限制性酶切位点，去除可能抑制性负调控元件及优化mRNA结构提高mRNA稳定性等。
按照以上原则经过密码子优化后得到的草甘膦抗性基因GR79的核苷酸序列为序列表中序列3，编码序列表中序列1所示的蛋白质；经过密码子优化后得到的草甘膦抗性基因GAT的核苷酸序列为序列表中序列4，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
实施例2、GR79基因和GAT基因双价表达载体的构建
为了提高GR79基因(序列3)和GAT基因(序列4)在受体生物中的表达水平，发明人在构建重组表达载体时，在GR79基因和GAT基因的5’端均添加了Ω序列，Ω序列如序列表中序列5的第717-787位或第3579-3649位所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白基因编码区的翻译增强序列。启动子均选用35S启动子，其序列如序列表中序列5的第1-710位或第2863-3572位所示。终止子均选用NosT终止子，其序列如序列表中序列5的第2370-2846位或第4110-4586位所示。另外，为了获得更高更稳定的草甘膦抗性，本发明的发明人在GR79表达盒中5’起始密码子ATG前引入了拟南芥基因叶绿体前导肽序列(CTP-2)。CTP-2的序列如序列表中序列5的第792-1018位所示。
携带有GR79基因和GAT基因的双价重组表达载体pBIGRGAT构建具体程序如下：
(1)扩增改造后的GR79基因(序列3)和GAT基因(序列4)，并通过PCR方法在两基因5’端和3’端分别引入限制性酶切位点PstⅠ和XhoⅠ，然后克隆于T载体p-EASY(北京全式金生物技术有限公司)，分别构建成GR79基因和GAT基因的克隆载体p-EASY/GR79、p-EASY/GAT。如下：
a、以序列表中序列3所示的GR79基因为模板，采用引物GR79-F和GR79-R进行PCR扩增，将所得PCR产物与T载体p-EASY相连，得到重组质粒。将经测序表明在T载体p-EASY上连入外源基因“ggCTGCAGC+序列3+CTCGAGgg”的重组质粒即为p-EASY/GR79。
GR79-F：5'-ggCTGCAGC-ATGTCGCATTCCACTTCGCGGTC-3'(下划线部分为酶切位点PstⅠ的识别序列，-后的序列为序列3的第1-23位)；
GR79-R：5'-ggCTCGAG-CTAATTGTACTCAACGTGGAT-3'(下划线部分为酶切位点XhoⅠ的识别序列，-后的序列为序列3的第1318-1338位的反向互补序列)。
PCR体系：模板DNA1.0μL(200-300ng)；上下游引物各0.2μL(50pmol/L)；dNTPs2.0μL(2.0mmol/L)；10×Buffer2.0μL；Taq酶0.2μL(2.5U)；ddH2O补充至20μL。以上各组分的浓度或用量均为相应组分在PCR体系中的终浓度或终用量。
PCR程序：94℃预变性10min；94℃变性15s，62℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃补充延伸10min；4℃保存。
b、以序列表中序列4所示的GAT基因为模板，采用引物GAT-F和GAT-R进行PCR扩增，将所得PCR产物与T载体p-EASY相连，得到重组质粒。将经测序表明在T载体p-EASY上连入外源基因“ggCTGCAGC+序列4+CTCGAGgg”的重组质粒即为p-EASY/GAT。
GAT-F：5'-ggCTGCAGC-ATGATTGATGTGAACCCTATTAAC-3'(下划线部分为酶切位点PstⅠ的识别序列，-后的序列为序列4的第1-24位)；
GAT-R：5'-ggCTCGAGTCAAGCAATTCTCTTATACATCAA-3'(下划线部分为酶切位点XhoⅠ的识别序列，其后的序列为序列4的第418-441位的反向互补序列)。
PCR体系：模板DNA1.0μL(200-300ng)；上下游引物各0.2μL(50pmol/L)；dNTPs2.0μL(2.0mmol/L)；10×Buffer2.0μL；Taq酶0.2μL(2.5U)；ddH2O补充至20μL。以上各组分的浓度或用量均为相应组分在PCR体系中的终浓度或终用量。
PCR程序：94℃预变性10 min；94℃变性15s，61℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃补充延伸10 min；4℃保存。
以上a和b中，PCR产物的胶回收采用DNA回收Kit法(Axygen，用于小量回收)：
1) 切下含有目的DNA条带的胶块，置于一个1.5mL微量离心管中。
2) 加入500μL溶胶DE-A(约是胶块体积的3倍)，室温或70℃溶解胶块。
3) 加入250μL溶胶DE-B混匀后，加入柱子中，8000r/min离心45s，弃上清。
4) 加入500μL W1 buffer，8000r/min离心45s，吸弃上清。
5) 加入500μL W2 buffer，8000r/min离心45s，吸弃上清；重复洗涤2次。12000r/min离心2min，去除柱子中多余的液体。置于37℃温箱干燥15～20分钟。
6) 加入60℃预热的30μL无菌ddH2O，60℃水浴5min，12000r/min离心2min，回收上清备用。
以上a和b中，将回收产物与T载体连接方法具体如下：
在一灭菌的1.5mL离心管中，加入0.1μg载体DNA及等摩尔量的外源DNA，再加入1μL10×T4 DNA Ligase buffer和1U的T4 DNA Ligase(MBI公司产品)，加适量超纯水，使总体积为10μL。混匀后，于16℃连接过夜。
以上a和b中，质粒DNA转化大肠杆菌方法具体如下：
1) 用无菌吸头取30μL大肠杆菌DH5α感受态细胞到1.5mL微量离心管中，加入待转化的DNA 10～100ng，轻轻混匀，冰上放置30min。
2) 42℃循环水浴中热激90s。快速将离心管转移到冰浴中1min，使细胞冷却。
3) 每管加500μL LB液体培养基，37℃ 180rpm预表达培养45min。
4) 取200μL上述培养物转移到含相应抗生素的LB固体培养基上(如要检测α-互补，可在菌液中加入适量的X-Gal和IPTG)，用一无菌的涂布器将菌液均匀涂满整个平板表面。
5) 将平板置于37℃培养16h后可出现菌落，挑取单克隆子在含有相应抗生素的5mL LB液体培养基中37℃ 250rpm过夜培养。提取培养物的质粒酶切、PCR和测序鉴定，正确的克隆子用30％甘油 -80℃保存备用。
(2)中间表达载体的构建
用限制性内切酶PstⅠ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的p-EASY/GR79载体，将切得的目的片段(大小约为1300bp)与经过同样双酶切的pG4ACB载体的骨架大片段相连，得到重组质粒。将经PstⅠ和XhoⅠ双酶切初步鉴定正确(得到大小约为1300bp和3200bp的两个目的条带)的重组质粒送样测序。将经测序表明将pG4ACB载体的酶切位点PstⅠ和XhoⅠ之间的小片段替换为“C+序列3”所示的GR79基因的重组质粒命名为pG4ACGR79。中间载体pG4ACGR79的表达盒图示如图1所示。
其中，pG4ACB载体是在pG4AB载体的基础上通过添加拟南芥叶绿体靶向肽(CTP-2)，经过如下改造获得的：
①人工合成拟南芥叶绿体靶向肽(CTP-2)，其序列来源于Swiss-Prot P05466 (AROA_ARATH，序列5的第792-1018位)，核酸的人工合成由上海生物工程有限公司完成。通过PCR方法分别向CTP-2序列上游添加Nsil酶切位点，下游添加Pst I与 Xho I酶切位点，引物序列如下：
CTP-F：5’-ggATGCATggcgcaagttagcagaatctgc-3’(大写碱基为Nsil的识别序列，该序列的第7-30位为序列5的第792-815位)；
CTP-R：5’-ggCTCGAGggCTGCAG-tccgccgtggaaacagaagacatg-3’(大写碱基依次为Xho I和Pst I的识别序列，-后的序列为序列5的995-1018位的反向互补序列)。
②用限制性内切酶Nsil和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的CTP-2序列PCR产物和中间载体pG4AB，分别获得大小约为230bp的酶切片段与4500bp的载体骨架大片段。
③将步骤2获得的两个片段相连，的到重组质粒中间载体pG4ACB。
重组质粒中间载体pG4ACB的结构描述为：将pG4AB载体的酶切位点Nsil和XhoⅠ之间的小片段替换为“序列5的第794-1018位+CTGCAGcc”所示DNA片段的重组质粒。
用限制性内切酶PstⅠ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的p-EASY/GAT载体，将切得的目的片段(大小约为440bp)与经过同样双酶切的pG4AB载体的骨架大片段相连，得到重组质粒。将经PstⅠ和XhoⅠ双酶切初步鉴定正确(得到大小约为440bp和3000bp的两个目的条带)的重组质粒送样测序。将经测序表明将pG4AB载体的酶切位点PstⅠ和XhoⅠ之间的小片段替换为“C+序列4”所示的GAT基因的重组质粒命名为pG4AGAT。中间载体pG4AGAT的表达盒图示如图1所示。
其中，质粒DNA的小量提取具体如下：
所涉及溶液的配制：
Solution Ⅰ：   50mmol/L  葡萄糖
25mmol/L  Tris·Cl  (pH8.0)
10mmol/L  EDTA   (pH8.0)
Solution Ⅱ：   0.2mol/L   NaOH
1％        SDS
使用前现配现用
Solution Ⅲ：   每100mL含： 5 mol/L KAc     60.0ml
冰乙酸          115mL
蒸馏水          28.5mL
1) 取单菌落于5mL带有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃、250r/min培养过夜(农杆菌在YEB培养基中，于28℃、250r/min振荡培养)。
2) 将1.5mL菌液倒入微量离心管中，用台式冷冻离心机于4℃、12000r/min离心1min，弃上清(可重复一次使菌液总量达到3mL)。
3) 加入100μL用冰预冷的SolutionⅠ，重悬沉淀。
4) 加入200μL新配制的Solution Ⅱ，快速颠倒离心管6次，冰上放置6min。
5) 加入150μL用冰预冷的Solution Ⅲ，轻轻混匀，冰上放置6min。
6) 用台式冷冻离心机于4℃、12000r/min离心10min，将上清转移到另一离心管中。
7) 加等体积酚、酚:氯仿(1:1)、氯仿抽提，振荡混匀，用台式冷冻离心机于4℃、12000r/min离心10min，将上清转移到另一离心管中，重复一次。
8) 向上清中加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温放置5min，用台式冷冻离心机于4℃、13000r/min离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次， DNA沉淀空气中干燥10min；用20μL ddH2O溶解质粒DNA，加入1μL 10mg/mL RNA酶，37℃处理30min后使用或于-20℃贮存。
以上进行PstⅠ和XhoⅠ双酶切，具体如下：
在一灭菌的1.5mL离心管中，加入以下成分：DNA 1.0μg；10×限制酶缓冲液 3 μL；限制性内切酶 PstⅠ 2.5U；限制性内切酶 XhoⅠ 2.5U；超纯水补充至30μL。轻弹管外壁以混匀反应物，置于酶反应适当温度并按所需时间进行温育。反应完成后，直接进行凝胶电泳分析。
(3)GR79基因和GAT基因双价表达载体的构建
a、中间载体pGBIGAT的构建
用限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切步骤(2)获得的中间载体pG4AGAT，将切得的目的片段(大小约为1700bp)与经过同样双酶切的pBI121载体的骨架大片段相连，得到重组质粒。将经Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定正确(得到大小约为1700bp和11000bp的两个目的条带)的重组质粒送样测序。将经测序表明将pBI121载体的酶切位点Hind Ⅲ和EcoRⅠ之间的小片段替换为序列表中序列5的第2861-4586位所示DNA片段的重组质粒命名为pGBIGAT。中间载体pGBIGAT的表达盒图示如图2所示。
以上进行Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切，具体如下：
在一灭菌的1.5mL离心管中，加入以下成分：DNA 1.0μg；10×限制酶缓冲液 3 μL；限制性内切酶 PstⅠ 2.5U；限制性内切酶 XhoⅠ 2.5U；超纯水补充至30μL。轻弹管外壁以混匀反应物，置于酶反应适当温度并按所需时间进行温育。反应完成后，直接进行凝胶电泳分析。
回收DNA片段，与pBI121载体连接并转化大肠杆菌，方法同上。
b、GR79基因和GAT基因双价表达载体pGBIGRGAT的构建
用限制性内切酶Hind Ⅲ酶切步骤(2)获得的中间载体pG4ACGR79，将切得的目的片段(大小约为2860bp)与经过同样酶切的步骤a中获得的pGBIGAT载体的骨架大片段相连，得到重组质粒(重组质粒中GR79基因和GAT基因的表达盒方向相同)。将经Hind Ⅲ酶切初步鉴定正确(得到大小约为2860bp和13000bp的两个目的条带)的重组质粒送样测序。将经测序表明在pGBIGAT载体的酶切位点Hind Ⅲ处插入序列表中序列5的第15810-2846位所示DNA片段的重组质粒命名为pGBIGRGAT。双价表达载体pGBIGRGAT的表达盒图示如图3所示。
其中，回收DNA片段，与pGBIGAT载体连接并转化大肠杆菌，方法同上。
双价表达载体pGBIGRGAT的全序列如序列表中序列5所示。其中，GR79基因(序列3)和GAT基因(序列4)存在于两个方向相同的独立的表达盒中。GR79表达盒为序列5的第1-2846位；自上游到下游依次由35S启动子(序列5的第1-710位)、Ω序列(序列5的第717-788位)、叶绿体前导肽序列(序列5的第792-1018位)、GR79基因(序列5的第1026-2363位，即序列3)和NosT终止子(序列5的第2370-2846位)。GAT表达盒为序列5的第2863-4586位；自上游到下游依次由35S启动子(序列5的第2863-3572位)、Ω序列(序列5的第3579-3649位)、GAT基因(序列5的第3663-4103位，即序列4)和NosT终止子(序列5的第4110-4586位)。
实施例3、GR79和GAT转基因棉花的获得及鉴定
一、转化农杆菌感受态细胞
取-70℃保存的农杆菌GV3101于含有50μg/mL利福平的YEB固体培养基平板划线，28℃培养48h。挑单菌落接种于5mL YEB液体培养基中，220rpm，28℃振荡过夜培养。按照1/10(体积比)的接菌量，将菌液转接于100mL YEB液体培养基中(1L三角瓶)，28℃，220rpm，振荡培养至OD600 ＝0.6～0.8。转入无菌500mL的离心管，4500rpm离心15min，弃上清液。加入50mL预冷的10％(体积分数)甘油(高压蒸汽灭菌)，轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。4℃，5000 rpm离心15min，弃上清液，重复甘油悬浮细胞一次。加入200μl预冷的含1M山梨醇(0.24μm过滤除菌)，轻轻悬浮。按照20μl体积分装于灭菌的1.5mL离心管中后，立即用液氮冷冻，-80℃保存备用。
取1μg左右实施例2构建得到的双价表达载体pBIGRGAT加入到20μl GV3101感受态细胞中混匀，冰浴5min；加入2mm电击杯(尽量避免气泡产生)，2500V电击转化；电击后迅速加入800μl YEB液体培养基，28℃，180rpm诱导培养5h；取出后涂在含50μg/mL卡那霉素和利福平的YEB固体培养基平板上，28℃培养到形成单菌落。挑取单克隆接种于5mL含有50μg/mL卡那霉素和利福平的的YEB液体培养基，质粒小量提取后经PCR鉴定正确(采用引物为GR79-F/GR79-R和GAT-F/GAT-R，具体序列见上文，分别得到大小约为1356bp和454bp的目的条带为阳性)的重组农杆菌命名为GV3101/pBIGRGAT。
将重组农杆菌GV3101/pBIGRGAT的单克隆菌液按照1/100的体积比接菌于20mL含有50μg/mL卡那霉素和利福平的YEB液体培养基，过夜培养至OD600＝1.0，30％甘油保存于-80℃备用。
其中，YEB液体培养基的配方为：每升培养基含有牛肉浸膏5g；酵母浸膏1g；蛋白胨5g；蔗糖5g；MgSO4·H2O 0.5g；pH7.0。
YEB固体培养基的配方为：每升YEB液体培养基添加12-15g琼脂粉。
采用同上的方法将pBI121空载体转入农杆菌GV3101，所得重组农杆菌命名为GV3101/pBI121。
二、农杆菌介导转化获得棉花转基因植株
1、农杆菌的培养及转化菌液的准备
挑取步骤一获得的含有pBIGRGAT载体的重组农杆菌GV3101/pBIGRGAT的单克隆子，接种于50mL 含50mg/L卡那霉素以及50mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃ 250rpm过夜培养。吸取过夜培养菌液2mL接种于200mL YEB液体培养基(含卡那霉素50mg/L、链霉素50mg/L)中(置于1L三角瓶中)，28℃ 250rpm过夜培养，直至OD600＝0.8～1。采用同上的方法获得重组农杆菌GV3101/pBI121的转化菌液。
2、植株选择准备与转化
转化受体：棉花品种柯字312(Coker312)。
选取生长至2-4片真叶期的棉花无菌幼苗下胚轴为农杆菌菌液侵染对象，将步骤1获得的重组农杆菌GV3101/pBIGRGAT的转化菌液或重组农杆菌GV3101/pBI121的转化菌液通过根癌农杆菌侵染下胚轴的方法转入棉花品种柯字312(Coker312)无菌幼苗下胚轴。
经侵染过的组织置于愈伤组织诱导培养基中培养至愈伤组织生成，后将愈伤组织转入分化培养基上进行分化培养，最后将分化出的胚性愈伤组织在胚状体萌发成苗培养基上培养至获得再生植株。
其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：；MS+IAA 2.0 mg/L+KT 0.1 mg/L，添加葡萄糖3％(w/v)，琼脂粉5g/L；
分化培养基的配方为：1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖3％(w/v)，添加琼脂粉5g/L；
胚状体萌发成苗培养基的配方为MS+IAA4.0mg/L+KT0.l mg/L，添加葡萄糖3％(w/v)，琼脂5g/L。
3、T0代种子收获及T1代筛选
种子成熟后将T0代种子混收，播种于大田，使用卡那霉素筛选抗性植株。卡那霉素筛选三次，第一次为子叶期，用毛笔将1mg/mL的卡那霉素溶液涂抹于子叶上，于3～4日后检查子叶是否有黄色斑点出现，无黄色斑点的植株即为转基因候选植株。第二次筛选在2～4片真叶时期，对第一次筛选获得的候选植株的真叶涂抹1mg/mL的卡那霉素溶液，无黄色斑点出现的植株即为转基因候选植株。第三次筛选在5～6片真叶时期，对第二次筛选获得的候选植株的真叶涂抹1mg/mL的卡那霉素溶液，无黄色斑点出现的植株即为转基因候选植株。
4、T1代转基因阳性植株PCR检测
对于转入双价表达载体pBIGRGAT的T1代转基因植株的卡那霉素抗性苗，PCR检测GR79基因(序列3)和GAT基因(序列4)。以双价表达载体pBIGRGAT为模板作为阳性对照。实验同时设置转入pBI121空载体的棉花植株，以及未转基因的棉花品种柯字312(Coker312)植株作为对照。
(1)改良CTAB法提取棉花基因组
1)提取缓冲液配制
1L提取缓冲液含：Tris-HCl(pH8.0)0.1M；EDTA(pH8.0)0.1M；NaCl1.5M；PVP40(w/v)2％；CTAB(w/v)2％。
以上溶液各自溶解后混合，定容到1L(121℃高压蒸汽灭菌20min)，临用前加2％β-巯基乙醇。
2)称取0.3g幼嫩棉花叶片放入2mL离心管里，加入4mm直径的钢珠，液氮速冻后，放置于SPEX公司Genegrid geno2000研磨仪上振荡60s，加入1mL预热70℃提取缓冲液，颠倒混匀。
3)将离心管置于70℃水浴中60～120min；加等体积氯仿颠倒混匀，4℃，12000rpm离心10min，将上清转移到另一离心管中。
4)加入0.6倍体积的冰预冷的异丙醇，缓慢颠倒离心管混匀，室温静置30min(-20℃冷冻1h效果更好)。用毛细管将絮状DNA挑出，用体积分数70％的酒精洗涤2次，再用体积分数100％的酒精洗涤1次，室温干燥DNA。
5)加200μL灭菌ddH2O，65℃水浴使DNA完全溶解；
6)加入20μL无DNA酶的RNA酶(10mg/mL)，37℃保温1小时，用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，V/V)抽提1～2次，将上清转移到另一个离心管中；
7)加10％(体积分数)的3M NaAc(pH5.2)，2倍体积的冰预冷的无水乙醇，混匀后放置10分钟。此时将形成一团粘稠透明的絮状DNA沉淀，用毛细管轻轻钩出转移到1.5mL的离心管中。
8)加1mL70％的酒精洗涤絮状DNA沉淀2次，12000rpm离心5 min，去掉上清，再用体积分数70％、100％的酒精各洗沉淀一次，在空气中使核酸沉淀干燥；
9) 加50μL灭菌ddH2O，65℃水浴使DNA完全溶解，电泳检测DNA质量，-20℃保存备用。
(2)PCR扩增目的片段
以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，采用引物1和引物2针对GR79基因进行PCR扩增，采用引物3和引物4针对GAT基因进行PCR扩增。
GR79基因扩增引物：
引物1：5’- CCCTGGAGCAAGGCTACGGAGTAC-3’(序列3的第25-48位)；
引物2：5’- GTGGTCCCCACTGGCTGGCC TGGGT-3’(序列3的第1154-1178位的反向互补序列)。
GAT基因扩增引物：
引物3：5’- GATGTGAACCCTATTAACGCCGA-3’(序列4的第7-29位)；
引物4：5’-AATTCTCTTA TACATCAAAA TATGA-3’(序列4的第411-435位的反向互补序列)。
反应体系(50μl)：Taq酶 0.5μl；10×扩增缓冲液(内含15mM Mg2+) 5.0μl；dNTP(4种dNTP混合物 10mM each) 3.0μl；上下游引物(10μmol/L) 各1.0μl；模板DNA2.0μl；无菌水补充至50μl。
PCR扩增程序：94℃预变性10min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸45s，15个循环，每循环退火温度降1℃；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，25个循环。
结果显示，转入双价表达载体pBIGRGAT的T1代转基因植株的卡那霉素抗性苗，以引物1和引物2进行PCR扩增均可扩增出大小约为1154bp的目的条带，以引物3和引物4进行PCR扩增均可扩增出大小约为429bp的目的条带，与预期结果一致。而转入pBI121空载体的棉花植株，以及未转基因的棉花柯字312(Coker312)植株均未扩增出相应的目的条带。部分植株的鉴定结果如图4所示。
5、T1代转基因阳性植株的Western blot检测
在确定外源抗草甘膦基因稳定整合在棉花基因组后，本发明的发明人进一步对选定的目标植株进行了Western blot分析，目的是确定该外源基因在植物体内能够被正确翻译成蛋白质参与植物代谢调控，使转基因植物表现草甘膦抗性。
提取经步骤4鉴定阳性的T1代转基因植株的总蛋白，进行PAGE电泳，后进行Western blot分析，采用一抗为抗GR79蛋白的多抗(采用序列1所示的GR79蛋白作为免疫原，免疫小鼠后制得的多抗)，二抗为羊抗鼠IgG抗体(美国KPL公司产品，其产品目录号为 01-18-01)。实验同时设置原核表达纯化蛋白(序列1所示的GR79蛋白)为阳性对照；转入pBI121空载体的棉花植株为空载对照，未转基因的棉花品种柯字312(Coker312)作为野生型对照。
结果如图5所示，GR79蛋白预测分子量48KD，经步骤4鉴定阳性的T1代转基因植株在48KD的位置出现了预期的目的杂交条带，说明外源基因GR79在转基因棉花植株内可以被正确翻译为目标蛋白质。而空载对照和野生型对照均未有目的条带出现。
实施例4、GR79和GAT转基因棉花的草甘膦抗性鉴定
从实施例3经PCR和Western blot鉴定均为阳性的T1代GR79和GAT转基因棉花中随机选取10个株系(编号1-10)，将种子全部播种于海南南繁基地。正常培养至4-5片真叶期进行田间草甘膦喷施试验。实验同时设置转入pBI121空载体的棉花植株为空载对照，未转基因的棉花品种柯字312(Coker312)作为野生型对照。每个株系保证样本量不低于60株。
喷施草甘膦异丙胺盐溶液()稀释至1/200(绝对浓度为0.205g/100ml草甘膦异丙胺盐)，喷施量为3升/亩。草甘膦处理7天后，开始观察各株系的植株表型，30天后，统计各样本植株的存活率。
结果在喷施草甘膦后第7天，非转基因棉花(野生型)出现叶片变黄失绿、植株萎蔫、生长缓慢甚至停滞等现象，尤其在植株生长点部位出点坏死，新叶不能生长(图6中B)。随着时间推移，受害程度不断加深直至整株死亡(图6中D，在喷施草甘膦后第30天)。相比较而言，GR79-GAT双价转基因植株中少数植株不同程度出现叶片失绿和植株萎蔫，但总体程度较非转基因植株轻，大部分转基因植株表现出比较好的草甘膦抗性，没有出现明显受害症状(图6中A和C)。而空载对照与野生型对照结果基本一致。
草甘膦处理30天后各样本植株的存活率统计结果如表1所示，非转基因棉花(野生型)全部死亡，而10个T1代GR79和GAT转基因棉花株系，其存活率均在84％以上，远高于野生型对照。空载对照同野生型对照一样，植株全部死亡。
表1 草甘膦处理30天后各样本植株的存活率统计结果

Claims (10)

1.表达载体，其特征在于：所述表达载体为同时表达草甘膦抗性基因1和草甘膦抗性基因2的环形载体；
所述草甘膦抗性基因1编码的蛋白质为下述a1)或a2)：
a1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；
a2)将a1)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质；
所述草甘膦抗性基因2编码的蛋白质为下述b1)或b2)：
b1)氨基酸序列为序列表中序列2所示的蛋白质；
b2)将b1)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与具有草甘膦抗性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述草甘膦抗性基因1为如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中a1)所述蛋白质的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1中a1)所述蛋白质的DNA分子；和/或
所述草甘膦抗性基因2为如下4)至6)中任一所述的DNA分子：
4)编码序列为序列表中序列4所示的DNA分子；
5)在严格条件下与4)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中b1)所述蛋白质的DNA分子；
6)与4)或5)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1中b1)所述蛋白质的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体中，所述草甘膦抗性基因1存在于表达盒1中；所述草甘膦抗性基因2存在于表达盒2中；
所述表达盒1中启动所述草甘膦抗性基因1转录的启动子，以及所述表达盒2中启动所述草甘膦抗性基因2转录的启动子均为35S启动子；
所述35S启动子的序列具体为序列表中序列5的第1-710位。
4.根据权利要求1-3中任一所述的表达载体，其特征在于：所述表达盒1中终止所述草甘膦抗性基因1转录的终止子，以及所述表达盒2中终止所述草甘膦抗性基因2转录的终止子均为NosT终止子；
所述NosT终止子的序列具体为序列表中序列5的第2370-2846位。
5.根据权利要求1-4中任一所述的表达载体，其特征在于：所述表达盒1和所述表达盒2中，在所述35S启动子的下游均还包括Ω序列；和/或
所述表达盒1中，在所述Ω序列和所述草甘膦抗性基因1之间还包括叶绿体前导肽序列；
所述Ω序列具体为序列表中序列5的第717-787位；所述叶绿体前导肽序列具体为序列表中序列5的第792-1018位。
6.根据权利要求1-5中任一所述的表达载体，其特征在于：所述表达盒1的序列为序列表中序列5的第1-2846位；和/或
所述表达盒2的序列为序列表中序列5的第2863-4586位。
7.根据权利要求1-6中任一所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体的序列为序列表中序列5。
8.含有权利要求1-7中任一所述表达载体的重组细胞系或转基因微生物。
9.如下(A)中的应用或(B)中的方法：
(A)权利要求1-7中任一所述的表达载体在培育耐草甘膦转基因植物中的应用；
(B)培育耐草甘膦转基因植物的方法，包括如下B1)和B2)的步骤：
B1)向目的植物中导入权利要求1-7中任一所述表达载体，得到同时表达权利要求1-7任一中所述的草甘膦抗性基因1和所述的草甘膦抗性基因2的转基因植物；
B2)从步骤B1)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，草甘膦抗性增强的转基因植物。
10.DNA分子1和/或DNA分子2：
所述DNA分子1为如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)编码序列为序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中a1)所述蛋白质的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1中a1)所述蛋白质的DNA分子；
所述DNA分子2为如下4)至6)中任一所述的DNA分子：
4)编码序列为序列表中序列4所示的DNA分子；
5)在严格条件下与4)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中b1)所述蛋白质的DNA分子；
6)与4)或5)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1中b1)所述蛋白质的DNA分子。
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