CN108034637B - Gr79-epsps的单克隆抗体试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一对杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.13482；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.13481本发明还提供了由这2株杂交瘤细胞分泌的一对配对的单克隆抗体和它们在检测GR79‑EPSPS蛋白中的用途；此外，还公开了一种免疫胶体金试纸条。本发明通过免疫胶体金试纸条能够对转基因植物中存在的GR79‑EPSPS蛋白进行定性定量检测，具有特异性强、灵敏度高、简单快速等优点。

Description

GR79-EPSPS的单克隆抗体试纸条及其应用

技术领域

本发明属于转基因植物检测技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞对和相应的单克隆抗体对，还涉及一种单克隆抗体胶体金试纸条。

背景技术

草甘膦(英文名：Glyphosate；商品名为：农达(Roundup))是美国孟山都公司开发的一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，其毒性机制主要是竞争性抑制莽草酸途径中的EPSP合酶，导致莽草酸途径中断，芳香族氨基酸合成受阻，从而扰乱生物体的正常氮代谢，最终导致生物体死亡。草甘膦具有结构简单、生产成本低、除草效果好、低毒无残留等特点，是目前世界上使用面积最广的除草剂品种。但作为一种非选择性除草剂，它对农作物同样具有灭生性作用，这大大限制了草甘膦在农业生产中的应用范围。培育具有草甘膦抗性或降解性质的农作物，成为农业生产中应用草甘膦的前提。

抗草甘膦基因为某些特定物种中天然存在的拮抗草甘膦的基因，该基因编码抗草甘膦酶(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，EPSPS)，从而使草甘膦丧失对含有该类基因的菌类或植物的毒害作用。利用基因工程等手段，将抗草甘膦的Epsps基因转入植物体内培育抗草甘膦植物，是控制杂草的有效方法。

抗草甘膦的基因主要有草甘膦乙酰基转移酶GAT基因、GR79-EPSPS和CP4-EPSPS基因等；其中GR79-EPSPS是中国农业科学院生物技术研究所发现的一种新的抗草甘膦基因(CN103981199A)。目前，我国已有多个抗草甘膦转基因棉花品系进入环境释放和生产试验阶段，如转CP4-EPSPS抗草甘磷棉花、转GR79EPSPS-GAT抗草甘磷棉花等。

对转基因植物的检测是对转基因植物进行有效监管的基础。对转基因植物的鉴定检测方法主要有：(1)蛋白免疫印迹检测；(2)整合位点侧翼序列PCR检测；(3)外源基因特异引物PCR检测；(4)Southern blot分子杂交检测等，其中利用免疫学原理对目的蛋白特异性进行定性定量鉴定的蛋白免疫印迹检测方法，是目前转基因植物最精准的鉴定方法之一。利用外源蛋白抗体可以通过western blot和ELISA方法进行定性定量分析，检测转基因植物中目的蛋白在不同组织器官和不同环境条件下的表达水平(Joarrne等，1987；Nilogu等，1987；Nelson等，1988)。胶体金试纸法将特异的抗体交联到试纸条上,利用胶体金试纸条技术制备的单克隆抗体试纸条，可以对转基因幼苗或者种子进行快速的检测鉴定(Lipton等,2000)。

发明内容

为了对GR79-EPSPS抗除草剂转基因植物进行有效监管和对转基因后代进行快速检测，本发明主要目的在于提供对转GR79-EPSPS基因植物中GR79-EPSPS蛋白的快速灵敏的检测方法。

本发明目的在于提供一种杂交瘤细胞对。

本发明另一目的在于提供一种单克隆抗体对。

本发明第三目的在于提供上述杂交瘤细胞对在检测GR79-EPSPS转基因植物上的用途。

本发明第四目的在于提供上述单克隆抗体对在检测GR79-EPSPS转基因植物上的用途。

本发明第五目的在于提供一种单克隆抗体试纸条。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种杂交瘤细胞对，该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株(命名为：Anti-GR79-1-9E6)和第二杂交瘤细胞株(命名为：Anti-GR79-1-10D5)；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.13482；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.13481。

再一方面，本发明还提供了一种单克隆抗体对，该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述的第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述的第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.13482；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.13481。

再一方面，本发明还提供了上述杂交瘤细胞对在检测GR79-EPSPS转基因植物上的应用。

再一方面，本发明还提供了上述单克隆抗体对在检测GR79-EPSPS转基因植物上的应用。

上述应用中所述的植物是指棉花、玉米、水稻、小麦、大豆或向日葵等。

再一方面，本发明还提供了一种免疫胶体金试纸条，该免疫胶体金试纸条包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述的基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单克隆抗体，所述的金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其中，所述单克隆抗体对为如上所述的单克隆抗体对。

上述免疫胶体金试纸条中所述的基膜是指硝酸纤维素膜等。

上述免疫胶体金试纸条在检测GR79-EPSPS蛋白上的应用。

上述免疫胶体金试纸条在检测GR79-EPSPS转基因植物上的应用。

上述应用中所述的植物是指棉花、玉米、水稻、小麦、大豆或向日葵等。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明单克隆抗体对GR79-EPSPS蛋白检测的特异性强，鉴定结果准确、可靠；(2)本发明单克隆抗体灵敏度高，能对GR79-EPSPS转基因植物中不同组织器官中GR79-EPSPS蛋白的表达进行精确的定量检测；(3)用本发明免疫胶体金试纸条检测GR79-EPSPS转基因棉花方法简单、高效，适用于对GR79-EPSPS抗除草剂基因转育过程中获得的中间材料或者杂交后代的选育进行大规模的筛选鉴定；(4)本发明检测方法可以对棉花种子、幼苗及其各个组织器官进行抗除草剂蛋白免疫检测，能够缩短育种进程，加快育种速度，降低育种成本，为GR79-EPSPS抗除草剂转基因棉花新品种培育和推广应用奠定了基础。

生物保藏

本发明的第一杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，命名为Anti-GR79-1-9E6，其保藏编号为CGMCC No.13482，保藏日期为2016年12月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗GR79单克隆抗体杂交瘤细胞株。

本发明的第二杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，命名为Anti-GR79-1-10D5，其保藏编号为CGMCC No.13481，保藏日期为2016年12月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为抗GR79单克隆抗体杂交瘤细胞株。

附图说明

图1.GR79-3的杂交瘤细胞上清(抗体)针对棉花种子的Western blot检测图谱；其中Marker为分子量标准，6E4、9E6、12F7、17F9和19D12为GR79-3肽段免疫获得的不同杂交瘤细胞。

图2.GR79-4的杂交瘤细胞上清(抗体)针对棉花种子的Western blot检测图谱；其中Marker为分子量标准，2D2、9C4、10D5和16C7为GR79-4肽段免疫获得的不同杂交瘤细胞。

图3.胶体金试纸条检测转GR79-EPSPS基因棉花和非转基因棉花图谱；其中14表示第14号转GR79-EPSPS基因棉花材料不同单株检测结果，非转基因棉花为不含有GR79-EPSPS基因的野生型棉花材料。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的解释和说明，但是不对本发明构成任何限制。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件，例如Sambrook等《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述条件，或者依据仪器设备和试剂制造商提供的实验方法所建议的条件。实验中所涉及的试剂和耗材均为市售的常规商品。

实施例1GR79-EPSPS杂交瘤细胞株以及单克隆抗体的筛选

按照如下方法进行：

1、抗原多肽的设计

根据《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(专利号为：CN103981199A)中公开的GR79-EPSPS蛋白序列，利用蛋白质库预测GR79-EPSPS蛋白免疫原性的位点，获得了3个具有免疫原性的抗原多肽，本发明主要针对其中的GR79-3和GR79-4两个具有免疫原性的抗原多肽。GR79-3抗原多肽的氨基酸序列为：

Cys-Ile-Glu-Tyr-Leu-Thr-Glu-His-Pro-Gly-Leu-Pro-Leu-Arg-Val-Lys-Gly-Ala-Gly-Leu-Ser-Gly-Gln；GR79-4抗原多肽的氨基酸序列为Met-Ser-His-Ser-Thr-Ser-Arg-Ser-Pro-Trp-Ser-Lys-Ala-Thr-Glu-Cys。

2、多肽偶联

将GR79-3、GR79-4两个抗原多肽送交北京华大蛋白质研发中心有限公司合成免疫原性肽段以及巯基修饰多肽(通过Cys的侧链)，并与KLH发生共轭反应形成多肽与KLH复合物。

3、动物免疫

按60μg蛋白/只小鼠的量(KLH偶联多肽)，将步骤2中合成的两条多肽分别皮下初次免疫3只SPF Balb/c雌性小鼠，编号为：1、2、3；皮下第一次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只；皮下第二次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只；皮下第三次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。眼眶取血，测血清效价。用免疫原50μg，腹腔冲击待融合小鼠。免疫效价检测：对应的抗原(多肽为BSA偶联的)2μg/mL，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。结果表明两个抗原免疫小鼠获得的抗体效价均达到25000以上。

具体效价信息如表1。

表1.GR79相关免疫原免疫效价检测结果

4、细胞融合及杂交瘤细胞获得

取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行培养。，并对这些杂交瘤细胞系进行亚克隆，筛选获得稳定的杂交瘤细胞株。

结果GR79-3和GR79-4两个抗原多肽均获得了杂交瘤细胞株，其中GR79-3得到19株杂交瘤细胞系；GR79-4得到26株杂交瘤细胞系。

5、单克隆细胞2筛

将GR79-3得到的19株杂交瘤细胞系和GR79-4得到的26株杂交瘤细胞系，分别用“GR79-3-BSA”、“GR79-4-BSA”和多肽包板，采用ELISA方法做第二次筛选，结果GR79-3和GR79-4两种细胞株分别获得16株和19株阳性杂交瘤细胞株。

6、单克隆细胞亚类鉴定

将步骤5中筛选出来16株GR79-3和19株GR79-4阳性细胞株进行亚类鉴定，最后分别得到9株IgG类型的阳性杂交瘤细胞株。

结果GR79-3的阳性杂交瘤细胞株获得15个阳性克隆，GR79-4的阳性杂交瘤细胞株获得17个阳性克隆。分别选择ELISA结果最大的9个细胞株转到6孔大板培养，收集上清冻存备用。

7、利用转基因棉花材料筛选单克隆抗体

收取步骤6所得的杂交瘤细胞株分泌的上清，针对天然转基因材料进行抗体识别特异性的鉴定。

Western blot检测过程如下：

用液氮研磨新鲜转GR79-EPSPS基因棉花(该转基因棉花材料由中国农业科学院生物技术研究所利用农杆菌介导法将专利《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(CN103981199A)构建的载体导入棉花获得)叶片或种子组织至粉末状，分装到预冷离心管中，每300μL粉末加入800μL蛋白质裂解液(62.5mmol/L pH7.4Tris·HCl，10％甘油，2％SDS，20mmol/L NaF，2mmol/L EDTA，1mmol/LPMSF，5％β-巯基乙醇)，迅速混匀并置于冰上，冰水混合物中孵育10min，期间震荡混匀4～5次，4℃，12 000rpm离心15min，取上清，转移到新的1.5mL离心管中，-70℃保存。将提取的棉花蛋白质进行SDS-PAGE，然后电转移到PVDF膜上，用5％脱脂奶粉封闭PVDF膜，用制备的杂交瘤细胞上清液室温孵育3h,TTBS(2mmol/LTris·HCl pH7.6,13.6mmol/LNaCl，0.1％Tween-20)洗膜3次，每次5min，之后加入羊抗兔二抗室温孵育1h，TTBS洗膜3次，每次5min，加ECL Plus检测液检测，暗室曝光5min。

分别对抗原多肽GR79-3和GR79-4的杂交瘤细胞的上清进行Western blot分析，结果(见图1)GR79-3的杂交瘤细胞6E4、9E6、12F7、17F9和19D12上清均杂交出阳性条带，其中GR79-3-9E6杂交瘤细胞上清液能够特异识别转GR79-EPSPS基因棉花中GR79-EPSPS蛋白；GR79-4的杂交瘤细胞2D2、9C4、10D5和16C7上清均杂交出阳性条带，其中GR79-4-10D5杂交瘤细胞上清液能够特异识别转GR79-EPSPS基因棉花中GR79-EPSPS蛋白(见图2)。根据Western blot结果最终选择制备胶体金试纸条的单抗来源于GR79-3-9E6的杂交瘤细胞和来源于GR79-4-10D5杂交瘤细胞，将GR79-3-9E6的杂交瘤细胞命名为Anti-GR79-1-9E6，将GR79-4-10D5杂交瘤细胞命名Anti-GR79-1-10D5，分别送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，Anti-GR79-1-9E6保藏编号为：CGMCC No.13482，Anti-GR79-1-10D5杂交瘤细胞CGMCC No.13481。

实施例2免疫胶体金试纸条制备及GR79-EPSPS转基因棉花检测试验

按照如下方法进行：

1.采用柠檬酸钠还原法制备胶体金

(1)将所有玻璃器皿清洗干净，然后浸泡在洗液(重铬酸钾1000g，浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml)中24h。取出后用自来水冲洗8遍，蒸馏水冲洗3遍，烘干后将玻璃容器浸泡于5％(w/w)的二氯二钾硅烷的氯仿溶液中lmin，然后用去离子水冲洗，干燥备用。

(2)加入0.03％(w/w)氯金酸溶液100mL，在磁力搅拌器上搅拌加热，迅速加入5.0mL1％(w/w)柠檬酸钠溶液，继续加热煮沸5-10min，溶液颜色逐渐由深蓝色转为橙红色，色泽鲜艳，停止煮沸，并回流至原体积100ml，制备的金颗粒直径为20nm左右，4℃密闭避光保存备用。

2.抗体胶体金的标记

(1)将胶体金溶液的pH值调至pH8.5，在避光条件下放到摇床上缓慢震荡，将第二杂交瘤细胞(Anti-GR79-1-10D5)上清(即第二单克隆抗体)逐滴加入至终浓度15ug/ml，继续震荡30min，静置10min，加入1％BSA(w/w)作为稳定剂，再缓慢震荡30min。

(2)将金标抗体溶液以4℃，12000r/min离心60min，可见离心物分为3层，中间呈紫红色的絮状沉淀即为结合良好的金标单抗复合物。

(3)收集紫红色絮状沉淀，0.01M pH8.5PBS(含1％(w/w)BSA)悬浮，4℃避光保存备用。

3.胶体金垫的制备

先将玻璃纤维膜浸泡在含0.01M PBS和0.05％Triton X-100溶液中30min，干燥房干燥，将胶体金标记抗体1：5稀释(稀释液0.01M Tris，0.1％Triton X-100，0.05％PVP40)，2.5ul/cm的量喷涂玻璃纤维膜。

4.硝酸纤维素膜的制备

将第一杂交瘤细胞(Anti-GR79-1-9E6)上清(划线抗体)(即第一单克隆抗体)、山羊抗标记抗体物种IgG的多克隆抗体分别以1.2mg/ml和1.0mg/ml的浓度(包被液为0.01MpH7.2PBS)包被在硝酸纤维素膜上的检测线(T线)和质控线(C线)上，1.0ul/cm的包被量，两条线间隔0.5cm，干燥房干燥备用。

5.样品垫的处理

将样品垫浸到处理液(处理液的组成成分及其比例为：0.01M PBS，1％Triton X-100)中浸泡，干燥备用。

6.试纸条的组装

将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次装配到PVC底板上。用切条机切成3mm宽的试纸，将切好的试纸放入装有干燥剂的包装袋内，备用。

7.试纸条使用

根据样本类型制备样本检测液，将试纸条插入样本检测液(200-400ul)中进行检测，15-20min观察；注意确保样本检测液液面低于样品垫上的样本检测线。

步骤如下：

截取转GR79-EPSPS基因棉花(该转基因棉花材料由中国农业科学院生物技术研究所利用农杆菌介导法将专利《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(CN103981199A)构建的载体导入棉花获得叶片0.1g(大约两倍于1.5mL离心管盖面积的叶片组织)放置于1.5mL离心管内。用玻璃研磨棒直接研碎组织，加入700μL蛋白提取液(62.5mmol/L pH7.4Tris·HCl，10％甘油，2％SDS，20mmol/L NaF，2mmol/L EDTA，1mmol/LPMSF，5％β-巯基乙醇)，迅速混匀后置于离心机内，4000rpm离心5min。待离心结束后，将离心管放置于离心管固定架，打开离心管盖，将步骤6制备的胶体金试纸条插入离心管内，插入深度不要超过试纸条的液面标记线(见图3)，静置5分钟，检测含有GR79-EPSPS蛋白的转基因植物组织研磨液体。结果显现出两条深蓝色条带，上方显色带为质控带(C线)，下方带为GR79-EPSPS蛋白的阳性带(T线)，即同时出现两条带的检测结果，可以证明转基因植物内含有GR79-EPSPS基因并能够表达GR79-EPSPS抗除草剂蛋白。而不含有GR79-EPSPS基因的非转基因植物试纸条检测结果只会出现一条带，即上方质控带。

上述结果说明本发明单克隆抗体对和免疫胶体金试纸条能够特异性地检测GR79-EPSPS蛋白及GR79-EPSPS转基因植物，而且具有检测灵敏度高，简单快速等优点。

Claims (9)

1.一种杂交瘤细胞对，其特征在于该杂交瘤细胞对包括独立存放的第一杂交瘤细胞株和第二杂交瘤细胞株；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.13482；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.13481。

2.一种单克隆抗体对，其特征在于该单克隆抗体对包括独立存放的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述的第一单克隆抗体由第一杂交瘤细胞株产生；所述的第二单克隆抗体由第二杂交瘤细胞株产生；所述第一杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.13482；所述第二杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.13481。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞对在检测GR79-EPSPS转基因植物上的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体对在检测GR79-EPSPS转基因植物上的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述的植物是指棉花、玉米、水稻、小麦、大豆或向日葵。

6.一种免疫胶体金试纸条，其特征在于该免疫胶体金试纸条包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫；所述的基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述T线上包被有第一单克隆抗体，所述的金标垫中含有胶体金标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，其中，所述单克隆抗体对为权利要求2所述的单克隆抗体对。

7.权利要求6所述的免疫胶体金试纸条在检测GR79-EPSPS蛋白上的应用。

8.权利要求6所述的疫胶体金试纸条在检测GR79-EPSPS转基因植物上的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述的植物是指棉花、玉米、水稻、小麦、大豆或向日葵。

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