CN116716259B

CN116716259B - 杂交瘤细胞对、单克隆抗体对及其在检测牛筋草epsps蛋白中的应用

Info

Publication number: CN116716259B
Application number: CN202310976913.6A
Authority: CN
Inventors: 陈景超; 李香菊; 崔海兰; 于海燕; 李志玲
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2023-08-04
Filing date: 2023-08-04
Publication date: 2023-10-31
Anticipated expiration: 2043-08-04
Also published as: CN116716259A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了杂交瘤细胞对、单克隆抗体对及其在检测牛筋草EPSPS蛋白中的应用。本发明的杂交瘤细胞对，其包括第一杂交瘤细胞株EP001‑1和第二杂交瘤细胞株EP001‑2；所述第一杂交瘤细胞株EP001‑1的保藏编号为CGMCC NO.45609；所述第二杂交瘤细胞株EP001‑2的保藏编号为CGMCC NO.45610。利用本发明的杂交瘤细胞对制备单克隆抗体对后，形成胶体金试纸可实现现场快速对牛筋草叶片、茎和种子等样品中的EPSPS蛋白的检测。

Description

杂交瘤细胞对、单克隆抗体对及其在检测牛筋草EPSPS蛋白中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及杂交瘤细胞对、单克隆抗体对及其在检测牛筋草EPSPS蛋白中的应用。

背景技术

草甘磷是一种非选择性的广谱除草剂，具有高效、低毒、无残留等优点，尤其是对人畜毒害小，被广泛应用。EPSPS（5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase）是生物体内芳香族氨基酸—色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的关键酶，研究发现，草甘膦通过竞争性结合EPSPS，抑制了EPSPS的活性，从而阻断了芳香族氨基酸的合成，最终导致受试植物死亡。自然界中绝大部分植物体内EPSPS均属于草甘膦敏感型，因此草甘膦可作为理想的广谱型除草剂。同时，目前为了解决其同时非选择性地灭生农作物的问题，已有多种具有草甘膦抗性的转基因作物被成功商业化。

但是草甘膦的长期使用，会引起杂草（牛筋草）对草甘膦产生抗性，使得转基因作物减产。因此，若可有效判定杂草是否具有草甘膦抗性，则可更好地指导除草剂的使用。

经研究发现，杂草对草甘膦的靶标抗性机制分为靶标突变和靶标酶过量表达两种。目前，抗性的分子检测方法主要有：(1)EPSPS序列保守位点PCR检测；(2)EPSPS基因表达量qPCR检测；(3)EPSPS蛋白免疫印迹检测等，其中PCR与qPCR的方法对场地、仪器、技术人员的要求比较高，样本处理复杂，成本较高。蛋白免疫印迹检测方利用免疫学原理对目的蛋白进行定性定量鉴定，利用靶标蛋白抗体可以通过Western blot和ELISA方法进行定性定量分析，检测植株中目的蛋白在不同组织器官和不同环境条件下的表达水平。但WesternBlot及ELISA法需要较繁琐的操作步骤及较长的孵育时间，检测结果需要仪器判读，并不适用于田间现场等应用环境下的快速检测使用。

胶体金试纸法将特异的抗体交联到试纸条上，利用胶体金试纸条技术制备的单克隆抗体试纸条，可以对目的蛋白进行快速的检测鉴定，该方法对场地、仪器、技术人员的要求相对较低，检测时间短，在现场快速检测及大规模筛查上具有理想的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可快速、高效、简便实现牛筋草EPSPS蛋白检测的新方法。

具体方案如下：

本发明提供一组杂交瘤细胞对，其包括第一杂交瘤细胞株EP001-1和第二杂交瘤细胞株EP001-2；所述第一杂交瘤细胞株EP001-1的保藏编号为CGMCC NO.45609；所述第二杂交瘤细胞株EP001-2的保藏编号为CGMCC NO.45610。

本发明的第一杂交瘤细胞株EP001-1和第二杂交瘤细胞株EP001-2，已于2023年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为BALB/c小鼠单克隆杂交瘤细胞，保藏编号分别为CGMCC No. 45609和CGMCC NO.45610。

本发明还提供一组单克隆抗体对，其包括第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No .45609的杂交瘤细胞株EP001-1分泌产生，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No .45610的杂交瘤细胞株EP001-2分泌产生。

本发明将特定的杂交瘤细胞对生产的单克隆抗体对组合使用，可实现SEQ ID NO:1所示蛋白（牛筋草EPSPS蛋白）的胶体金法检测，可用于判断植物（如牛筋草）对除草剂草甘膦是否存在抗性，从而指导除草剂的使用。

进而，本发明提供上述杂交瘤细胞对或单克隆抗体对在检测含EPSPS蛋白的牛筋草上的应用，以及在制备检测SEQ ID NO:1所示蛋白（牛筋草EPSPS蛋白）的产品上的应用。

本发明的单克隆抗体对组合使用，对牛筋草EPSPS蛋白的检测灵敏度高，特异性强，可对牛筋草不同器官中的EPSPS蛋白进行快速检测。

本发明还提供一种检测牛筋草EPSPS蛋白的胶体金试纸，其T线上包被有第二单克隆抗体，C线包被有上抗鼠IgG二抗，金标垫上含有胶体金标记的第一单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体如上所述。

本发明的胶体金试纸，金标垫上，所述胶体金标记的第一单克隆抗体的浓度为0.2-0.6 mg/mL，优选0.4 mg/mL，每条试纸上的包被量为0.24-0.4 μg。

本发明的胶体金试纸，T线上包被的第二单克隆抗体的浓度为0.5-1.5 mg/mL。优选，每条试纸上的包被量为0.15-0.45 μg。也可以将单抗替换成多抗。

本发明的胶体金试纸，C线上包被的抗鼠IgG二抗的浓度为0.7-1.2 mg/mL，优选1mg/mL。

本发明的胶体金试纸具体可由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成。

优选地，所述样品垫为玻璃纤维素膜。

硝酸纤维素膜可以替换成醋酸纤维素膜。

本发明另提供上述胶体金试纸在检测待检测样品中牛筋草EPSPS蛋白中的应用。

本发明的应用中，所述待检测样品为牛筋草叶片、牛筋草茎或牛筋草种子。

本发明检测牛筋草EPSPS蛋白的胶体金试纸的具体检测步骤及原理如下：

先将试纸垂直插入检测样品中，样品溶液将沿样品垫渗透至胶体金标记抗体的试纸条，如果样品溶液中含有牛筋草蛋白EPSPS，那么EPSPS蛋白将与金标垫上的第一抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体结合，并与NC膜上的第二抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体结合，8-10 min后，可观察到检测区的颜色变化，即出现阳性条带；如果样品溶液中不含牛筋草蛋白EPSPS，那么检测区则观察不到阳性条带。而无论样品溶液中是否含有牛筋草蛋白EPSPS，当样品溶液到达硝酸纤维素膜的质控线时，金标试纸条上的第一抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体均可与质控区包被的抗鼠IgG二抗结合，从而显色。

具体结果判断标准为：阴性结果（-），只出现1条C线；阳性结果（+）：同时出现T线和C线。

本发明的检测牛筋草EPSPS蛋白的胶体金试纸，对叶片、种子和茎组织等复杂基质具有较好的抗干扰效果，可广泛应用于牛筋草蛋白EPSPS的快速检测，且操作简单，无需专门的仪器设备，便于田间等现场直接进行检测；检测时间短，5-8 min即可完成检测，结果判定简便；检测灵敏度高，可检测出样品中痕量（约100 μg/kg）的牛筋草EPSPS蛋白。

附图说明

图1为本发明的牛筋草EPSPS蛋白胶体金试纸的结构示意图；其中，1为质控区（C线），2为检测区（T线），3为加样区。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

实施例1 EPSPS蛋白单克隆抗体的获得、筛选

本发明中，抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的获得方法如下：将编码牛筋草EPSPS蛋白的基因经过优化重组构建到大肠杆菌表达系统中，表达纯化得到重组EPSPS蛋白；用该重组EPSPS蛋白免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体。具体方法如下：

一、EPSPS蛋白的表达纯化

（一）EPSPS蛋白的小试表达

1、序列合成：根据蛋白序列（SEQ ID NO:1），优化密码子，合成基因序列（SEQ IDNO:2，N端为NdeⅠ的酶切位点catatg，C端为Xho I的酶切位点ctcgag）并克隆到载体pET30a上，序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。目标序列信息如下表1。

表1

2、菌种活化：将构建的pET30a-EPSPS阳性质粒转化BL21（DE3），涂布LB固体培养基（卡那霉素浓度50 μg/mL）。次日，挑取单克隆菌落接入5 mL LB液体培养基（卡那霉素浓度50 μg/mL），37℃培养12 h-14 h。

3、小试表达：次日，菌种以1:50比例接入5 mL LB液体培养基（卡那霉素浓度50 μg/mL），37℃培养至OD=0.4-0.6，吸取1 mL菌液离心处理后作为诱前对照。4 mL菌液加入浓度为0.8 mM的IPTG，25℃诱导表达6 h后菌液8000 rpm、4℃离心1 min，收集菌体。SDS-PAGE鉴定蛋白的形式，结果显示有明显目的蛋白的表达。

4、蛋白表达形式的鉴定：将上述表达目的蛋白的菌体加入1 mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件：冰浴、功率40%、超声2 s、间隔2 s、时间30 min。12000 rpm、4℃离心1 min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE鉴定蛋白表达形式，结果显示目的蛋白主要以可溶形式表达。

（二）蛋白的大量表达和纯化

1、菌种活化：固体平板上挑取pET30a-EPSPS单克隆菌落接入5 mL LB液体培养基（卡那霉素浓度50 μg/mL），37℃培养12 h-14 h。

2、小试表达：次日，菌种以1:50接入800 mL LB液体培养基（卡那霉素浓度50 μg/mL），37℃培养至OD=0.4-0.6，加入浓度为1 mM的IPTG，25℃诱导表达6 h后菌液8000 rpm、4℃离心15 min，收集菌体。

3、菌种裂解：加100 mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件：冰浴、功率60%、超声2s、间隔2 s、时间15 min。12000 rpm、4℃离心15 min，收集上清和沉淀。

4、上清纯化：收集的上清利用高亲和性NI树脂进行纯化，收集流穿液、洗脱液。SDS-PAGE检测纯化效果，结果显示200 mM咪唑洗脱时蛋白纯度最佳。将200 mM咪唑洗脱液透析去除咪唑，SDS-PAGE检测透析效果，结果显示蛋白透析后纯度和浓度均可行。经检测，最终目的蛋白纯度大于90%，浓度3 mg/mL，蛋白量12 mg。

（三）结果

pET30a-EPSPS蛋白诱导表达条件为：IPTG浓度1 mM，诱导温度25℃，诱导时间6 h。蛋白主要在上清表达，上清经Ni柱纯化，透析去除咪唑，最终所得EPSPS蛋白的浓度2 mg/mL，纯度大于90%，得到冻干蛋白10 mg。

二、抗体制备

（一）单抗制备

1、免疫原制备：将表达纯化的蛋白与等体积的弗氏佐剂混合乳化均匀，以备免疫小鼠。

2、免疫策略：以蛋白免疫4只Balb/c小鼠，皮下免疫3次，间隔4周，每次免疫剂量50ug，最后一次免疫结束后7天，经间接ELISA检测抗血清效价，血清稀释倍数为100、1K、3K、9K、27K、81K、243K倍。

具体间接ELISA方法如下：

1）用0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释表达纯化的蛋白至1 μg/mL，加入96孔酶标板，每孔100 μL，37℃反应3 h或4℃静置过夜。

2）甩去板孔中液体，加入250 μL洗涤缓冲液，静置30 s，甩去板中液体，重复3次。

3）加入检测样本（梯度稀释后的免疫后小鼠血清），每孔100 μL，同时加入阴性对照（免疫前小鼠血清）37℃反应45 min，

4）重复步骤2）；

5）加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，每孔100 μL，37℃反应45 min。

6）重复步骤2）；

7）加入显色剂，每孔100 μL，室温避光反应15 min。

8）加入终止液，每孔100 μL，使用酶标仪在波长450nm读取OD值。

各检测样本的具体抗血清效价结果见表2。

表2

3、细胞融合：

选择M200128小鼠进行细胞融合（效价最高，同时本底（阴性值）较低）。于最后一次免疫后两周，腹腔注射抗原进行加强免疫（免疫剂量50ug），3天后进行细胞融合。将小鼠断颈处死，70%乙醇浸泡30 min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合，

4、融合筛选：将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液进行培养，3天后换液，改用HT培养液培养。10天后，取细胞培养上清进行检测。

5、克隆化与建株：使用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，10天后检测，将阳性克隆继续有限稀释法进行克隆化，直到得到的克隆都为阳性，可建立阳性细胞株。最终获得阳性细胞株19株。

6、扩大培养：将建株的单克隆细胞扩大培养，并进行冻存。

（三）腹水制备与纯化

1、腹水制备：提前一周在Balb/c小鼠腹腔注射矿物油，将一定数量的细胞注射入小鼠腹腔，10天左右收集腹水，4000 rpm离心，得上清即为单克隆抗体腹水。

2、单克隆抗体纯化：腹水离心15 min（4000 rpm，室温），取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30 min，离心30 min（13000 rpm，4℃），弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01 M, pH7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30 min，离心30 min（13000 rpm，4℃），弃上清；沉淀溶于适量PBS（0.01 M，pH7.4），4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5 mL超纯水过柱，再用5 mL 0.4 M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10 mL 0.4 M PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；5 mL 0.1 M甘氨酸-盐酸缓冲液（pH2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入1 M Tris-HCl (pH8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

（四）抗体筛选

1、效价检测

以间接ELISA方法（参见上文）对纯化后的抗体进行效价检测，检测原为EPSPS重组蛋白，其是将牛筋草中的EPSPS基因（SEQ ID NO:2）经过优化后构建入大肠杆菌表达系统，重组表达纯化得到。检测样品由1mg/mL的标准样品稀释，稀释倍数为100、1K、4K、16K、64K、256K倍。具体结果见表3。

表3

2、亚型检测

用小鼠抗体亚型检测试剂盒对抗体进行亚型检测，结果均为IgG类抗体。

3、配对筛选

挑选效价较高（256K的OD值大于1），本底相对OD值较低的8株单抗EP001-40，EP001-14，EP001-17，EP001-1，EP001-22，EP001-26，EP001-32，EP001-2，两两组合，共得到56对组合。每对组合分别标金、划膜，检测抗原（EPSPS重组蛋白）得到10对能检测抗原的抗体对。进一步配对检测阳性样本（含EPSPS蛋白的牛筋草），仅得到4对能检测样本的抗体对。通过对标金、划膜浓度的进一步优化，最终获得一对抗体对（本发明保藏的抗体对），其检测灵敏度能达到1ppm（针对抗原），其他抗体对灵敏度仅达到10ppm。

进一步对筛选出的抗体对进行特异性检测。经实际样本检测，该抗体对仅结合目标EPSPS蛋白（SEQ ID NO:1所示蛋白），不结合CP4、G2、G10、mEPSPS、AM79等其他常见EPSPS转基因品系中的相应蛋白。故最后确定本对抗体为最佳抗体对。

实施例2 牛筋草蛋白EPSPS的胶体金试纸的制作

本实施例提供的牛筋草蛋白EPSPS的胶体金试纸（牛筋草EPSPS蛋白免疫检测卡）包括质控区（C线）1、检测区（T线）2和加样区3，结构示意图见图1。具体由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫（吸收垫）和背板组成；样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在背板上，各部分之间相互叠加2-3 mm；金标垫上包被有胶体金标记的第一抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线（T线和C线），所述检测线包被有第二抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，所述质控线包被有抗鼠IgG二抗。

其中，所述胶体金标记的第一抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体（鼠抗EPSPS单克隆抗体）由保藏编号为CGMCC No. 45609的杂交瘤细胞株EP001-1分泌产生；T线所划的第二抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体（鼠抗EPSPS单克隆抗体）由保藏编号为CGMCC No. 45610的杂交瘤细胞株EP001-2分泌产生。

所述质控线包被的抗鼠IgG二抗的浓度为1 mg/mL。

所述样品垫的大小为4 mm×15 mm，金标垫的大小为3 mm×4 mm，硝酸纤维素膜的大小为4 mm×28 mm，吸收垫的大小为4 mm×19 mm。

所述检测线与质控线之间的间距为6-6.5 mm。

所述背板（底板）为PVC板。

其中，胶体金标记的抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的制备方法如下：

取120 mL胶体金溶液，加入0.1 M的K₂CO₃溶液2400 μL，搅拌5 min后，加入1600 μg第一抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，混合均匀，室温反应40 min。加入终浓度为0.1%的BSA，静置30 min；4℃，9000 rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用4 mL复溶液（含1% BSA、5%蔗糖和5%吐温-20的10 mM PBS液）复溶，即得。

所述胶体金溶液的配制方法如下：取超纯水99 mL于烧杯中，加入1%氯金酸储存液1 mL，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，加热至溶液沸腾，迅速加入现制备的柠檬酸三钠水溶液2.2 mL，继续搅拌加热，溶液沸煮出现透明的橙红色后，继续沸煮15-20 min，自然冷却至室温，加超纯水定容。倒入棕色瓶，4℃避光保存。

其中，柠檬酸三钠水溶液的配制方法如下：将1g柠檬酸三钠溶解于99 mL超纯水中，混匀即得。

检测卡的制作方法如下：在底板上依次粘贴样品垫和固定有胶体金标记的第一抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体的金标垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫。在金标垫上固定0.4mg/mL第一抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的检测线固定1.5 mg/mL第二抗牛筋草EPSPS蛋白单克隆抗体以及在质控线固定抗鼠IgG二抗。然后置于37℃真空干燥30 min，即得。

实施例3 牛筋草EPSPS蛋白胶体金试纸检测效果评价

1、空白样品检测：向样品杯中加入200 μL空白样品液（pH7.4，0.2 mol/L PBS液，配制方法如下：将8 g氯化钠、3.35 g十二水合磷酸氢二钠、0.2 g磷酸二氢钾和0.2 g氯化钾用双蒸水溶解定容至1 L），将胶体金试纸插入样品杯，在室温条件下反应8分钟后观察显色结果。结果表明，T线不显色，C线显色。

2、实际标准品的检测：向样品杯中加入100 μL 0.1 μg/ml的EPSPS蛋白标准品（用上述PBS液进行配制），按照与空白样品同样的操作步骤检测。结果表明，C线、T线同时显色。

EPSPS蛋白标准品为EPSPS重组蛋白，其是将牛筋草中的EPSPS基因（SEQ ID NO:2）经过优化后构建入大肠杆菌表达系统，重组表达纯化得到。

3、实际叶片样本检测：取100 μg牛筋草叶片样品，研磨后加入200 μL缓冲液（0.01M PBS缓冲液，pH7.4），获得牛筋草叶片样本提取液，向样品杯中加入200 μL牛筋草叶片样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤检测。结果表明，控制线C线和检测线T线均显色。

4、实际种子样本检测：取100 μg牛筋草种子样品，研磨后加入200 μL缓冲液（0.01M PBS缓冲液，pH7.4），获得牛筋草种子样本提取液，向样品杯中加入200 μL牛筋草种子样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤检测。结果表明，控制线C线和检测线T线均显色。

5、实际茎组织样本检测：取100 μg牛筋草茎组织样品，研磨后加入200 μL缓冲液（0.01 M PBS缓冲液，pH7.4），获得牛筋草茎组织样本提取液，向样品杯中加入200 μL牛筋草茎组织样本提取液，按照与空白样品同样的操作步骤检测。结果表明，控制线C线和检测线T线均显色。

本发明的牛筋草EPSPS蛋白胶体金试纸可实现现场对叶片、种子和茎部组织等样品中牛筋草EPSPS蛋白的快速、灵敏检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.杂交瘤细胞对，其特征在于，包括第一杂交瘤细胞株EP001-1和第二杂交瘤细胞株EP001-2；所述第一杂交瘤细胞株EP001-1的保藏编号为CGMCC NO.45609；所述第二杂交瘤细胞株EP001-2的保藏编号为CGMCC NO.45610。

2.单克隆抗体对，其特征在于，包括第一单克隆抗体和第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 45609的杂交瘤细胞株EP001-1分泌产生，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 45610的杂交瘤细胞株EP001-2分泌产生。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞对或权利要求2所述的单克隆抗体对在检测含EPSPS蛋白的牛筋草上的应用。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞对或权利要求2所述的单克隆抗体对在制备检测牛筋草EPSPS蛋白的产品上的应用。

5.一种检测牛筋草EPSPS蛋白的胶体金试纸，其特征在于，T线上包被有第二单克隆抗体，C线包被有上抗鼠IgG二抗，金标垫上含有胶体金标记的第一单克隆抗体，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体如权利要求2中所述。

6.根据权利要求5所述的胶体金试纸，其特征在于，金标垫上，所述胶体金标记的第一单克隆抗体的浓度为0.2-0.6 mg/mL。

7.根据权利要求5所述的胶体金试纸，其特征在于，所述T线上包被的第二单克隆抗体的浓度为0.5-1.5 mg/mL。

8.根据权利要求5所述的胶体金试纸，其特征在于，所述C线上包被的抗鼠IgG二抗的浓度为0.7-1.2 mg/mL。

9.权利要求5-8任一项所述的胶体金试纸在检测待检测样品中牛筋草EPSPS蛋白中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述待检测样品为牛筋草叶片、牛筋草茎或牛筋草种子。