BRPI0822484B1 - Anticorpo imunorreativo com um polipeptídeo epsps (ácido 5-enolpiruvil-3- fosfoshiquímico sintase) mutante, linhagem de células de hibridomas e método para detectar a presença de um polipeptídeo epsps (ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintase) mutante em uma composição - Google Patents

Abstract

anticorpo imunorreativo com um polipeptídeo epsps (ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintase) mutante, linhagem de células de hibridomas, método para detectar a presença de um polipeptídeo epsps (ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintase) mutante em uma composição, método de produção de um anticorpo e kit para detectar a presença de um polipeptídeo epsps (ácido 55-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintase) mutante em uma composição são fornecidos pela presente invenção, anticorpos imunorreativos ao epsps mutante duplo, e em uma modalidade o epsps mutante duplo é aquele em que o epsps tipo selvagem é substituído no resíduo 102 com isoleucina e no resíduo 106 com serina. também são fornecidos hibridomas produtores de anticorpos, bem commo métodos de produção e uso dos anticorpos.

Description

REFERÊNCIA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido anteriormente depositado e co-dependente USSN 61/033,063, depositado em 3 de março de 2008, cujo conteúdo será incorporado por referência, na sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] O glifosato (N-fosfonometilglicina) é um componente amplamente utilizado em herbicidas. O glifosato inibe o ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintase (EPSP sintetase ou EPSPS), que está envolvido na síntese de aminoácidos aromáticos em células vegetais. Inibição da EPSPS interrompe efetivamente a síntese protéica e, portanto, mata as células vegetais afetadas. Como o glifosato é não-seletivo, ele mata plantas daninhas e plantas de cultura. Assim, é útil com plantas cultivadas em que se pode modificar as plantas cultivadas para serem resistentes ao glifosato, permitindo que as plantas desejáveis sobrevivam à exposição ao glifosato. Assim, há uma necessidade de produzir espécies vegetais transgênicas que são resistentes ao glifosato.

[0003] A tecnologia de DNA recombinante tem sido usada para isolar EPSP sintases mutantes que são resistentes ao glifosato. Esses EPSP sintases mutantes resistentes ao glifosato podem ser transformados em plantas e conferem resistência ao glifosato, em plantas transformadas. A título de exemplo, um gene tolerante ao glifosato foi isolado da cepa CP4 de Agrobacterium, conforme descrito na Patente US N° 5.633.435. Esta referência e todas as referências citadas estão incorporadas através de referências.

[0004] Outros genes tolerantes ao glifosato foram criados através da introdução de mutações. Estes incluem aqueles isolados por Comai e descritos nas Patentes US 5.094.945, 4.769.061 e 4.535.060. Um único mutante tem sido utilizado, conforme descrito na 5.310.667, pela substituição de um resíduo de alanina por um resíduo de glicina entre as posições 80 e 120. Mutantes duplos também são descritos nas Patentes Números 6.225.114 e 5.866.775, nas quais, além da mutação acima, uma segunda mutação (um resíduo de treonina por um resíduo de alanina entre as posições 170 e 210) é introduzida em um gene EPSPS tipo selvagem.

[0005] Outro trabalho resultou na produção de um evento de transformação GA21 de milho EPSPS mutante duplo, através da introdução de um gene EPSPS de milho modificado com mutações no resíduo 102 (mudança de treonina para isoleucina) e no resíduo 106 (mudança de prolina para serina) da sequência de aminoácidos codificada pelo GenBank Acesso No. X63374 e mostrada nas Patentes US Nos. 6.566.587 (ver identificador de sequência número 3 na patente ‘587) e 6.040.497. Na Figura 1 é mostrada a sequência de nucleotídeos número de acesso do GenBank X63374, que é a sequência de nucleotídeos de EPSPS de milho (SEQ ID NO: 1). A sequência de aminoácidos codificada é estabelecida sob a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 2). Note-se que um códon de início ATG implícito não está incluído no início da sequência de nucleotídeos X63374. A sequência do mutante duplo é que, no resíduo 102 da SEQ ID NO: 2 é alterada para isoleucina e o resíduo 106 é alterado para serina, e a proteína mutante duplo resultante é SEQ ID NO: 3.

[0006] Na Patente US Número 7.045.684, um fragmento de EPSPS genômico foi isolado de milho e, posteriormente, duas mutações foram introduzidas no gene EPSPS de milho as quais resultaram na mesma proteína EPSPS mutada como acima, no evento GA21. Usando o gene EPSPS de milho, número de acesso do GenBank X63374, como uma sonda, um fragmento genômico de 6,0 kb foi isolado, esse fragmento mostrado nas Figuras 2A e 2B e na SEQ ID NO: 4. Duas mutações foram introduzidas na sequência de nucleotídeos, a primeira uma citosina para substituição de timina no nucleotídeo 2886, e a segunda uma citosina para substituição de timina no nucleotídeo 2897 (as posições estão em negrito e sublinhadas nas Figuras 2A e 2B e a sequência de nucleotídeos transformada é SEQ ID NO: 5). Isto resultou em um aminoácido mutante codificado o qual é mostrado nas Figuras 3A e 3B e SEQ ID NO: 6 com o resíduo na posição 164 (posição 102 do aminoácido de X63374/SEQ ID NO: 3) modificado de treonina para isoleucina (Thr para Ile) e na posição 168 (posição 106 do aminoácido de X63374/SEQ ID NO: 3) modificado de prolina para serina (Pro para Ser). A sequência de aminoácidos mutada resultante foi resistente ao glifosato.

[0007] A sequência de nucleotídeos mutada da SEQ ID NO: 5 inclui o promotor EPSPS de milho nativo, região codificadora (contendo as duas mutações), íntrons e região 3' terminadora. O evento GA21, supra, por outro lado, usou um promotor da actina do arroz (McElroy et al. (1990), Plant Cell 2:163-171) e um terminador nos (Depicker et al (1982) Mol. and Appl. Genet. 1:561-573). No entanto, ambas as sequências de codificação, essencialmente, produzem a mesma proteína mutada tendo a mudança de treonina para isoleucina na posição 102 da proteína e prolina para serina na posição 106 da proteína.

[0008] Há uma necessidade de identificar anticorpos que são imunorreativos com as proteínas EPSPS mutantes duplo descritas acima, para que estas plantas contendo essas proteínas EPSPS mutantes possam ser facilmente identificadas. Especialmente útil seria um anticorpo que imunorreage com a proteína EPSPS mutante duplo contendo as mutações no resíduo 102 (Thr para Ile) e na posição 106 (Pro para Ser) e não é reativo com a enzima CP4, uma versão utilizada em vários produtos comerciais resistentes ao glifosato, nem com a proteína EPSPS tipo selvagem. Um método que evite etapas laboratoriais que consumam tempo reduziria custos, permitindo a rápida identificação das plantas transgênicas contendo a proteína mutante, auxiliando no cultivo e seleção. Além disso, anticorpos que são imunorreativos com essas proteínas podem ser úteis no isolamento e purificação de proteínas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A invenção é dirigida a hibridomas e os anticorpos e fragmentos produzidos a partir de hibridomas, que são imunorreativos com a sequência de aminoácidos de um gene EPSPS mutante duplo. A sequência de aminoácidos é aquela que substitui uma isoleucina por treonina na posição 102, e substitui uma serina por prolina na posição 106 da proteína do GenBank número de acesso X63374, que é mostrada na SEQ ID NO: 3, e também com as mutações correspondentes na SEQ ID NO 6. Uso de anticorpos para identificar células vegetais tendo os dito aminoácidos e para isolar e purificar as mesmas também é divulgado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] A Figura 1 é a sequência conforme estabelecida no Genbank número de acesso X63374, que é a sequência de nucleotídeos EPSPS de milho e é a SEQ ID NO: 1; abaixo da sequência de nucleotídeos é indicada a sequência de aminoácido codificada a qual é SEQ ID NO: 2. Resíduos 102 e 106 estão em negrito e sublinhados; substituição de isoleucina por treonina na 102 e substituição de serina por prolina na posição 106 da proteína é o EPSPS mutante duplo e é a SEQ ID NO: 3.

[0011] As Figuras 2A e 2B mostram o fragmento do genoma de milho EPSPS isolado e é a SEQ ID NO: 4. Mutações introduzidas nas posições 2886, na qual timina é substituída por citosina e na posição 2897 na qual timina é substituída por citosina estão em negrito e sublinhadas; a sequência de nucleotídeos mutada é a SEQ ID NO: 5.

[0012] As Figuras 3A e 3B mostram a sequência de aminoácido que é codificada pela sequência de nucleotídeos mutante da SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

[0013] A Figura 4A é um Western blot mostrando a reação imunológica de MAb5E11 com "Jack" uma soja não tendo um EPSPS mutante duplo, com FG74, a soja tendo o EPSPS mutante duplo; com a proteína EPSPS mutante duplo isolada, com 963, o milho não tendo o EPSPS mutante duplo; com B485, o milho tendo o EPSPS mutante duplo; com outro milho tendo o EPSPS mutante duplo, GA21. Esta figura inclui também os padrões de peso molecular na faixa 7. A Figura 4B é um Western Blot mostrando imunoreatividade de MAb5E11 com a soja FG74 tendo o EPSPS mutante duplo, com Jack, a soja não tendo o mutante duplo; com uma soja Roundup-Ready® contendo a enzima EPSPS resistente ao glifosato de Agrobacterium tumefaciens cepa CP4; e EPSPS mutante duplo isolado. A Figura 4C mostra os padrões de peso molecular relevantes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO

[0014] São descritos aqui hibridomas e anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos, preparados a partir desses hibridomas contra a enzima 5-endopiruvilshiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) mutante duplo. Os anticorpos monoclonais imunorreagem com e são úteis para identificar a presença da enzima, e isolar e purificar a enzima. Os anticorpos monoclonais são particularmente úteis na medida em que eles distinguem entre uma enzima EPSPS tipo selvagem (isto é, a EPSPS que seria naturalmente presente nas plantas não transformadas) e uma enzima EPSPS mutante duplo. Termos usados neste documento empregam suas definições comuns; por exemplo, imunorreativo refere-se a reação a determinados antígenos ou haptenos, e tipo selvagem refere-se ao polipeptídeo como ocorre na natureza.

[0015] A enzima EPSPS mutante duplo é aquela em que, em relação ao EPSPS endógeno tipo selvagem, existem duas mutações no aminoácido da enzima. O mutante duplo aqui também é referido como 2mEPSPS. Como mostrado nos exemplos abaixo, o anticorpo monoclonal é imunorreativo à proteína EPSPS contendo isoleucina no resíduo 102 e serina no resíduo 106. Esta sequência é mostrada na Figura 1, com as posições de mutação em negrito e sublinhadas e é a SEQ ID NO: 3. Como pode ser observado na Figura 1, o gene EPSPS de milho está estabelecido e está na SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos que codifica é estabelecida sob a sequência de nucleotídeos e é a SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácidos está com as duas mutações, conforme indicado na SEQ ID NO : 3. As mutações de resíduo da SEQ ID NO: 6 versus SEQ ID NO: 3 ocorrem porque na SEQ ID NO: 3, o aminoácido ou resíduos são mostrados sem o peptídeo de trânsito do cloroplasto N-terminal. A forma da EPSP sintase com o peptídeo de trânsito quando expresso é entregue ao cloroplasto, onde o peptídeo de trânsito é clivado produzindo a versão de EPSP sintase sem o peptídeo. Referência à numeração de resíduos do aminoácido EPSP (sem peptídeo de trânsito líder do cloroplasto) é usada nos exemplos aqui não para limitar a invenção, mas para facilitar a comparação das sequências EPSPS a partir de fontes que tem peptídeos de trânsito do cloroplasto (isto é, plantas e fungos) até fontes que não utilizam um sinal alvo de cloroplasto (ou seja, bactérias). Como usado aqui quando se refere ao “anticorpo” ou “anticorpo monoclonal” (MAb) da invenção entende-se um anticorpo ou fragmento do mesmo que é imunorreativo com uma sequência de aminoácidos EPSPS mutante duplo tendo a dita mutação.

[0016] Um anticorpo (ou imunoglobulina) é uma proteína sintetizada por um animal em resposta à presença de uma substância estranha que é chamada de um antígeno. Cada molécula de anticorpo tem uma estrutura única que lhe permite ligar-se especificamente ao seu antígeno correspondente, mas todos os anticorpos têm a mesma estrutura geral. Uma molécula de anticorpo é composta de duas regiões distintas. Uma delas é uma região constante e a outra é uma região variável que proporciona a um anticorpo a especificidade de uma grande variedade de diferentes antígenos.

[0017] As cinco principais classes de anticorpos são IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. IgG é a classe mais abundante. IgG, como um exemplo, tem um peso molecular de 150 kDa e é composta de dois tipos diferentes de cadeias polipeptídicas: uma é a cadeia pesada (50 kDa) e a outra é a cadeia leve (25 kDa). Cada molécula de IgG tem duas cadeias pesadas e duas cadeias leves ligadas por pontes dissulfeto. Regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) em conjunto funcionam como a região variável do anticorpo e dão ao anticorpo a possibilidade de se ligar a um antígeno específico.

[0018] Nas sequências de aminoácidos discutidas aqui, a nomenclatura padrão de uma única letra ou três letras é usada. Todas as estruturas de peptídeo representadas na descrição que se segue são apresentadas no formato convencional em que o grupo amino no N-terminal aparece à esquerda e o grupo carboxila no C-terminal à direita. Da mesma forma, a nomenclatura dos aminoácidos para os aminoácidos de ocorrência natural encontrados nas proteínas é a seguinte: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp, D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutâmico (Glu, E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu, L), lisina (Lys; K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr, T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) e valina (Val, V). Um "X" pode ser utilizado quando o resíduo de aminoácido é desconhecido e os parênteses designam que uma atribuição inequívoca não é possível e a designação de aminoácidos dentro dos parênteses é a estimativa mais provável com base em informações conhecidas.

[0019] Ácido desoxirribonucléico (DNA) é um polímero composto por quatro unidades mononucleotídicas, DAMP (2'- Desoxiadenosina-5-monofosfato), dGMP (2'-Desoxiguanosina-5- monofosfato), dCMP (2'-Desoxicitosina-5-monofosfato) e dTMP (2'-Desoxicitosina-5-monofosfato), ligadas em várias sequências por pontes 3',5'-fosfodiéster. O DNA estrutural consiste em vários trios de nucleotídeos chamados "códons" que codificam os aminoácidos. Os códons correspondem aos aminoácidos diferentes da seguinte forma: Arg (CGA, CGC, CGG, CGT, AGA, AGG); Leu (CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG); Ser (TCA, TCC, TCG, TCT, AGC, AGT); Thr (ACA, ACC, ACG, ACT); Pro (CCA, CCC, CCG, CCT); Ala (GCA, GCC, GCG, GCT); Gly (GGA, GGC, GGG, GGT); Ile (ATA, ATC, ATT); Val (GTA, GTC, GTG, GTT); Lys (AAA, AAG); Asn (AAC, AAT); Gln (GAA, CAG); His (CAC, CAT); Glu (GAA, GAG); Asp (GAC, GAT); Tyr (TAC, TAT); Cys (TGC, TGT); Phe (TTC, TTT); Met (ATG); e Trp (UGG). Além disso, devido à redundância do código genético (isto é, mais do que um códon para todos, mas dois aminoácidos), há muitas sequências possíveis de DNA que podem codificar para uma sequência de aminoácido particular.

[0020] O uso de linhagens de células híbridas somáticas como fontes de anticorpos contra antígenos individuais geralmente data dos trabalhos de Kohler e Milstein (Nature 256:495-97 (1975)). Os anticorpos produzidos são bastante diferentes daqueles recuperados de soro de animais imunizados convencionalmente. Cada linhagem de célula híbrida sintetiza uma imunoglobulina homogênea que representa apenas um dos inúmeros tipos de anticorpos que um animal pode sintetizar, em resposta a um antígeno in vivo. Uma vez que cada clone produzindo imunoglobulina é caracterizado pelo tipo único de anticorpo que produz, o termo anticorpo monoclonal tem sido adotado. As vantagens dos anticorpos monoclonais são inúmeras, eles podem ser obtidos em grandes quantidades; a preparação é homogênea no que diz respeito à reatividade do antígeno e assim permanece ao longo do tempo.

[0021] O princípio da tecnologia do hibridoma/monoclonal é baseado na observação de que quando duas células somáticas são fundidas o híbrido resultante apresenta características de ambos os tipos de células parentais. No caso da produção de anticorpo monoclonal, a capacidade para sintetizar o anticorpo específico é derivada de uma célula imunocompetente (normalmente uma célula do baço), proveniente de um animal doador imunizado, enquanto a capacidade de continuar a dividir em cultura de células é contribuída pelo outro parceiro de fusão, uma linhagem celular tumoral (muitas vezes um mieloma). Fusões precoces foram complicadas pelo fato de que a linhagem de células do mieloma também produziu um anticorpo monoclonal, assim o híbrido frequentemente produziu dois tipos de anticorpos monoclonais, um de origem a partir do mieloma e o outro dirigido pela informação genética da célula imunocompetente. Subsequentemente, linhagens de células tumorais incapazes de produzir seus próprios monoclonais têm sido utilizadas, por exemplo, SP2/0-Ag14 ou X63-Ag8.653, simplificando assim a análise dos produtos resultantes da fusão.

[0022] Outra consideração técnica envolve a lógica para seleção dos eventos de fusão bem sucedidos (células híbridas) a partir de dois tipos de células parentais. Rotineiramente, um milhão ou mais células de cada tipo são usadas no protocolo de fusão, e uma vez que a fusão não ocorre com frequência de 100%, a tarefa de tentar recuperar os produtos da fusão a partir das experiências avançadas de parentais não fusionados ou auto-fusionados pode ser enorme. Como mencionado hibridomas são formados pela fusão de anticorpos de vida curta produzindo células (baço) e células do mieloma de vida longa. O resultado desejado é uma linhagem de célula de vida longa que produz anticorpos. Como as células do baço têm uma vida finita em uma cultura pode simplesmente esperar um período adequado para todas as células do baço auto-fusionadas ou não fusionadas morrerem, mas ainda é preciso recuperar a população resultante de células produtoras de anticorpos de vida longa a partir de células não produtoras de anticorpo de vida longa. Um meio popular para a seleção de células híbridas é o chamado sistema de seleção HAT. Este sistema envolve o uso da enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil transferase (HGPRT). Esta enzima funciona no caminho de salvamento de purinas em células de mamíferos. Estas células também são capazes de sintetizar purinas de novo. Na maioria das condições, ambas as vias provavelmente funcionam até certo ponto. Se uma célula não tem HGPRT, o caminho de salvamento está bloqueado e as purinas devem ser fabricadas a partir de materiais não-purinas.

[0023] O produto químico 8-azaguanina é um antimetabólito que é capaz de mascarar-se como a purina guanina e substituí- la em algumas de suas reações normais. Azaguanina é incorporada ao DNA, interferindo com o padrão de crescimento normal e levando à morte celular. Uma vez que a azaguanina deve ser recuperada, qualquer célula que não possui atividade de HGPRT não pode utilizar azaguanina e vai crescer na sua presença.

[0024] Um sistema seletivo que opera na mesma enzima, mas no sentido oposto em que células positivas de HGPRT são selecionadas é descrito por JW Littlefield (Science, 145: 709 (1964)). Ele é chamado HAT e contém hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). Aminopterina é um antimetabólito que impede de novo a síntese de purina e metilação de deoxiuridilato para formar timidilato. Hipoxantina pode servir como uma purina recuperável no evento que a aminopterina bloqueia de novo a biossíntese de purinas, enquanto a timidina ignora a necessidade da metilação do timidilato. Assim, na presença de aminopterina, qualquer célula com atividade positiva de HGPRT irá proliferar, enquanto as células com atividade negativa de HGPRT vão morrer.

[0025] I Em um sistema híbrido que pode ser usado para seleção de acordo com a invenção, as células do mieloma são resistentes a azaguanina e suscetíveis a aminopterina, isto é, elas são HGPRT negativas. Assim, elas vão morrer na presença de aminopterina. As células produtoras de anticorpos são HGPRT positivas. Ao fundir as células e cultivá-las em meio HAT sem azaguanina (meio HT), as células fusionadas com sucesso são selecionadas porque as células do mieloma, que constituem a linhagem de proliferação só podem crescer onde a atividade de HGPRT está presente e esta atividade deve ser fornecida pela linhagem celular HGPRT positiva. Os anticorpos produzindo a linhagem celular HGPRT positiva não são mortos neste meio. Eles vão viver por um tempo, mas não vão proliferar.

[0026] Assim, fundindo as células em meio HAT, sistemas são produzidos nos quais as células do mieloma e células produtoras de anticorpos podem crescer o suficiente para produzir células híbridas, mas em que apenas as células híbridas podem sobreviver e proliferar. Após seleção cada clone de hibridoma é, então, selecionado para a capacidade de produzir o anticorpo específico de interesse.

[0027] Uma proteína EPSPS mutante duplo foi purificada e utilizada como antígeno na preparação do anticorpo monoclonal sintase anticorpo específico 2mEPSP. Em uma modalidade, um processo de preparação é caracterizado em que: a) um extrato é feito de partes das plantas que contém uma enzima EPSPS mutante duplo, conservada em temperatura baixa por trituração, centrifugação e filtração, b) o extrato obtido é rico em proteína EPSPS por precipitação em um solvente adequado, centrifugação e solubilização do precipitado obtido em uma solução tampão, c) a proteína ativa assim obtida é purificada por cromatografia e se desejado, d) os hibridomas e anticorpos monoclonais são preparados a partir de uma solução de antígeno obtida a partir de uma das preparações obtidas nas alíneas a), b) e c), acima, e) os hibridomas são selecionados e o anticorpo monoclonal ou anticorpos dirigidos especificamente contra o EPSPS mutante duplo são selecionados.

[0028] Na descrição acima não pretende limitar a produção de anticorpos da invenção de tais sistemas precisos; como outros métodos de produção de tais anticorpos são desenvolvidos e otimizados, eles estão bem dentro do escopo da invenção.

[0029] Os anticorpos monoclonais isolados podem ser usados em uma variedade de caminhos. Como demonstrado abaixo, os anticorpos podem distinguir entre o tecido vegetal que contém o mutante duplo, e aqueles que não contêm o mutante duplo, incluindo a proteína vegetal tipo selvagem e a proteína com a enzima CP4. Assim, os anticorpos podem ser usados para identificar as células vegetais, tecidos e plantas que contêm o mutante duplo, permitindo assim seleção de tais plantas, sem destruir a planta, nem exigir extensos testes de campo.

[0030] Kits úteis com a invenção podem levar qualquer uma de uma variedade de formas e, em geral, prevêem para a obtenção de um aminoácido contendo amostra de tecido vegetal, um suporte tendo afixado a ele o anticorpo da invenção, capaz de formar um complexo binário com o 2mEPSPS que pode estar presente na amostra, e um complexo binário de detecção. As especificidades do kit além de empregar as propriedades imunorreativas do anticorpo ou do fragmento da invenção não são críticas. O método ou meio de obtenção do aminoácido contendo amostra não é crítico, e pode assumir qualquer forma, enquanto uma amostra de planta é obtida; os meios para igualmente detectar podem levar qualquer uma de uma variedade de formas, como é bem apreciado por um técnico no assunto. Meios de detecção foram utilizados por algum tempo, e podem incluir, por exemplo, biotina, um corante fluorescente, um radioisótopo ou uma enzima.

[0031] Em uma modalidade, por exemplo, o anticorpo monoclonal pode ser aplicado a uma estrutura de suporte, como uma fita de teste. A título de exemplo, sem a intenção de limitar a aplicação da invenção, o anticorpo pode ser usado com uma imunofita. Um anticorpo é conjugado com uma partícula de ouro e aplicado a uma almofada de fibra. Um segundo anticorpo é distribuído como uma linha em uma membrana. Uma fita é montada de tal forma que um bloco de amostra é colocado no extrato da amostra e o antígeno é colocado na fita, entrando em contato com o MAb conjugado e, posteriormente, com o MAb listrado. O MAb listrado "captura" o complexo antígeno- conjugado formando uma linha colorida. Se nenhum antígeno está presente, nenhuma linha é formada. Um kit deve incluir materiais necessários para realizar um teste para 2mEPSPS.

[0032] Ao utilizar esse processo para identificar a presença da proteína 2mEPSPS em uma planta de milho (da qual a 2mEPSPS foi originalmente derivada), a exposição do anticorpo para a proteína e o agente de detecção devem ser tais que os resultados dos testes não são mal interpretados devido ao potencial de reatividade cruzada com o aminoácido conhecido da planta de milho. Por exemplo, um ELISA ou imunoensaio de ligação de enzima pode ser utilizado, um ensaio conhecido desde 1971. Enquanto específicos podem diferir, em geral, antígenos solubilizados em tampão são revestidos sobre uma superfície plástica. Quando soro é adicionado, anticorpos podem se ligar ao antígeno na fase sólida. A presença ou ausência destes anticorpos pode ser demonstrada quando conjugados com uma enzima. Adicionando o substrato adequado irá detectar a quantidade de conjugado ligado que pode ser quantificado. Um teste de ELISA comum é aquele que usa anticorpos policlonais biotinilados anti-(proteína) e um conjugado de fosfatase alcalina. Por exemplo, um teste ELISA utilizado para determinação quantitativa dos níveis de lacase pode ser um ensaio de sanduíche de anticorpos, que utiliza anticorpos policlonais de coelho obtidos comercialmente. O anticorpo é conjugado à fosfatases alcalinas para detecção. Em outro exemplo, um ensaio de ELISA para detectar tripsina ou tripsinogênio usa anticorpos policlonais biotinilados anti- tripsina ou anti-tripsinogênio e um conjugado de fosfatase alcalina-estreptavidina. Assim, em uma modalidade, quando se examina amostras de plantas de milho, o ensaio de ELISA deve continuar até o ponto em que a presença da proteína mutante pode ser determinada, se houver, ainda não muito tempo da presença do gene de milho do tipo selvagem do gene em particular, em qualquer amostra provoca um aumento nos resultados positivos não inteiramente atribuível à presença de 2mEPSPS. Enquanto os anticorpos da invenção podem ser minimamente imunorreativos ao EPSPS de milho tipo selvagem, esses anticorpos são mais fortemente imunorreativos para os EPSPS mutantes, o que pode não precisar mudar para o processo, ou para a maioria dos melhores resultados, os ajustes podem ser desejados quando o milho, ao contrário da soja ou de outros tecidos vegetais, é amostrado. Em um exemplo, o teste de ELISA é permitido a executar em até cerca de 30 minutos, e cerca de 90 minutos em uma modalidade adicional. O tempo não necessita ser preciso, específico e pode ser determinado com antecedência para qualquer situação particular.

[0033] No evento determinações precisas para a presença do mutante são necessárias, outros testes são bem conhecidos para um técnico na arte. A título de exemplo, sem limitação, uma análise de Western blot está entre o tipo de teste que pode ser empregado. Uma análise Western é uma variação da técnica de análise de Southern. Com uma análise de Southern, o DNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado em gel de agarose para separar o DNA por peso molecular e, em seguida, transferir para membranas de nylon. Ele é então hibridizado com o fragmento de sonda que foi radioativamente marcado com 32P e lavado em uma solução de SDS. Na análise de Western, em vez de isolar o DNA, a proteína de interesse é extraída e colocada em um gel de acrilamida. A proteína é então apagada em uma membrana e contactada com uma substância de rotulagem. Ver, por exemplo, Hood et al. “Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification” Molecular Breeding 3:291-306 (1997).

[0034] Outra forma que o MAbs pode ser usado é um ELISA sanduíche de anticorpo duplo. As interações anticorpo-antígeno são semelhantes àquelas da imunofita, mas ocorrem nos poços de uma placa de poliestireno.

[0035] Os anticorpos também podem ser usados na purificação e isolamento de aminoácidos EPSPS mutante duplo. Por exemplo, amostras contendo enzimas EPSPS mutante duplo podem ser transmitidas através de uma coluna de cromatografia contendo os anticorpos monoclonais da invenção de tal forma que as enzimas se ligam e são isoladas de outros aminoácidos presentes na amostra.

[0036] É evidente que os anticorpos da invenção podem ser empregados em uma variedade de usos, alguns dos quais são exemplificados aqui, e que são conhecidos por aqueles com conhecimento na arte.

[0037] Os seguintes são apresentados a título de ilustração e não são destinados a limitar o escopo da invenção.

EXPERIMENTAL Isolamento de Proteína 2mEPSPS his-tag

[0038] Isolamento da proteína 2mEPSPS expressa em bactérias utilizadas em protocolos padrão como fornecidos pela Qiagen, Inc. (The QIA expressionist™: A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins. Quinta Edição, 2003).

[0039] O protocolo utilizado em resumo é como se segue. Primeiro, o lisado foi carregado na coluna em um tampão B.

[0040] Tampão B consiste em (1 litro): 100 mM de NaH2PO4 13.8g de NaH2PO4*H2O (MW 137.99 g/mol) 10 mM de Tris*Cl 1.2 g de base Tris (MW 121.1 g/mol) e 8 M de uréia 480,5 g (MW 60,06 g / mol).

[0041] pH foi ajustado para 8,0 com NaOH. Seguiu-se uma lavagem com tampão B até zero de absorção em 280 nm. Uma lavagem adicional com tampão C foi realizada.

[0042] Tampão C consiste em (1 litro): 100 mM de NaH2PO4 13.8 g de NaH2PO4*H2O (MW 137.99 g/mol) 10 mM de Tris*Cl 1.2 g de base Tris (MW 121.1 g/mol) 8 M de uréia 480.5 g (MW 60.06 g/mol).

[0043] pH foi ajustado para 6,3 usando HCl. A coluna foi eluída com o volume mínimo com tampão E.

[0044] Tampão E consiste em (1 litro): 100 mM de NaH2PO4 13.8 g de NaH2PO4*H2O (MW 137.99 g/mol) 10 mM Tris*Cl 1.2 g de base Tris (MW 121.1 g/mol) e 8 M de uréia 480.5 g (MW 60.06 g/mol).

[0045] Ajuste de pH de 4,5 foi realizado utilizando HCl. Ajustar o pH de soluções imediatamente antes da utilização é muito importante.

[0046] O nível de expressão da proteína é estimado em 20 mg / L em uma combinação de frações solúveis e insolúveis. Também é possível resolubilizar a fração insolúvel.

[0047] A proteína EPSPS purificada (fornecida a 1.5 mg / mL) foi precipitada. A concentração de proteína no sobrenadante foi quantificada pelo Kit de Reagentes de Ensaio de Proteína Micro BCA (PIERCE, # 23235) e era 0,121 mg / mL. O precipitado foi salvo por renaturação. Procedimentos de renaturação

[0048] Os procedimentos de renaturação foram realizados com Kit de renaturação de proteína da Novagen (Fisher, NC98068050 #), seguindo o protocolo sugerido. À temperatura ambiente, 1 mL de 10X IB de Tampão de Solubilização foi adicionado a 8,89 mL de água deionizada, em seguida, adicionados com 0,1 mL de 30% de N-lauroilsarcosina e 10 mL de TDT 1M. 1mL de Tampão de solubilização 1X / N-lauroilsarcosina preparado foi adicionado ao precipitado e misturado levemente. A mistura foi incubada por 15 minutos em temperatura ambiente e centrifugada a 10.000 xg por 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi dialisado em 1X de tampão de diálise com 0,1 mM de DTT a 4 ° C durante três horas. O tampão foi alterado e a diálise foi mantida por mais três horas na mesma condição. Então, a diálise foi continuada com o mesmo tampão de diálise sem DTT a 4° C durante três horas com duas alterações adicionais.

[0049] A proteína renaturada foi quantificada usando Kit de Reagentes de Ensaio de Proteína BCA (PIERCE, # 23235) e a concentração foi de cerca de 0,494 mg / mL. Esta proteína foi utilizada para a imunização. Os soros dos camundongos imunizados foram testados contra as duas proteínas originais no sobrenadante (0,121 mg / mL) e a proteína renaturada (0,494 mg/mL), e nenhuma diferença reconhecível entre as suas reatividades foi vista. Produção de anticorpos

[0050] Camundongos Balb/c foram acondicionados e impulsionados três a quatro vezes com a EPSPS de milho purificada a cada 2-4 semanas. Adjuvantes de Freund completos e incompletos foram utilizados para o condicionamento e reforço, respectivamente. Depois de dois turbos, títulos séricos foram monitorados por ELISA. Uma vez que os títulos eram altos o suficiente, esplenócitos foram colhidos de camundongos imunizados e fusionados com células de mieloma (P3/NSI/1-Ag4-1) usando PEG1500 como um agente de fusão. Os produtos resultantes da fusão celular foram diluídos em meio de hibridoma e semeados em placas de 96 poços de cultura de tecidos. Depois de um dia, meio HAT foi adicionado às culturas de hibridomas. O meio foi trocado a cada três ou quatro dias, conforme necessário. Depois de dez a quatorze dias da cultura com seleção, a triagem foi iniciada por ELISA. Duas fusões foram concluídas.

[0051] Os anticorpos foram testados contra o extrato de folha de soja (1:20 em PBS / TWEEN® 20 (monolaurato de polissorbato (20) e sorbitano, um surfactante)), que foi geneticamente modificado para expressar proteínas 2mEPSPS de milho, extrato de folha de soja tipo selvagem (1:20 em PBS / TWEEN® 20), e 6xHis-KLH. Noventa e seis placas Nunc Maxi-sorp Immunoplates™ (# 446612 Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas pela adição de 50 μl por poço de solução dos extratos modificados e folha de soja tipo selvagem e pela adição de 50 μl por poço de 0,5 μg /ml de solução de 6xHis- KLH em tampão de revestimento (BupH. ™. tampão carbonato- bicarbonato, Pierce # 28382, Rockford, IL) por uma hora em temperatura ambiente. O tampão de revestimento foi removido e a placa foi bloqueada pela adição de 250 μl por poço de tampão de bloqueio (1% de Blocker, TM. BSA, Pierce # 37525, em PBS) por duas horas em temperatura ambiente. 50 μl do sobrenadante de hibridoma foram adicionados nos poços e incubados por uma hora em temperatura ambiente. Os poços foram lavados quatro vezes com PBS / TWEEN® 20. 50 μl de HRP conjugado de cabra anti-Ig de rato diluído (1:7,000) (Southern Biotech # 1010 1005) foi adicionado em poços e incubados por uma hora em temperatura ambiente. Os poços foram lavados cinco vezes com PBS / Tween 20. Os anticorpos anti-EPSPS foram detectados pela adição de 50 μl por poço de solução de TMB (tetrametil benzidina) (ImmunoPure ®. Kit de Substrato de TMB, Pierce # 34021) por 5 a 10 minutos. As placas foram lidas espectrofotometricamente a 450 nm utilizando uma microplaca de leitura (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[0052] Após a exibição de dois produtos de fusão por ELISA, anticorpos mostrando ligação específica para 2mEPSPS foram selecionados. Análise de Western blot de anticorpos selecionados

[0053] As atividades de anticorpos selecionados foram confirmadas por Ensaio de Western Blot. 2mEPSPS purificado e o extrato de folha de soja não-transgênica foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecil de sódio (SDS-PAGE) com a redução, manchados na membrana de nitrocelulose e sondados com vinte anticorpos. Em detalhe, 12% de gel bis-tris foi usado (NuPAGE Novex de 1 poço # NP0344BOX) em sistema Mini-Cell SureLock Xcell (Invitrogen # EI0001) e após eletroforese, a proteína é transferida para membrana de nitrocelulose. A membrana manchada foi então incubada com os vinte anticorpos utilizando sistema Mini-PROTEIN II Multiscreen Apparatus (Bio-Rad # 170-4017) e desenvolvida usando conjugado fosfatase alcalina-Ig anti-camundongo de cabra e BCIP/NPT como substrato. Anticorpos foram testados pelo Ensaio Western Blot usando 2mEPSPS purificado, milho não transgênico (963) e milho 2mEPSPS (B485 e GA21). Anticorpos demonstrando especificidade para a proteína 2mEPSPS foram selecionados ainda para a seleção por ELISA (veja abaixo). Triagem por ELISA

[0054] Anticorpos monoclonais derivados dos hibridomas produzidos contra 2mEPSPS foram testados usando um formato de DAS ELISA indireto. Resumidamente, placas foram revestidas com um anticorpo policlonal específico para EPSPS. Extratos de milho não-GMO, milho 2mEPSPS (B485), GA21 e Soja Roundup Ready® (CP4) de soja foram então incubados na placa durante a noite. As placas foram então incubadas com anticorpos monoclonais específicos 2mEPSPS e, em seguida, detectados com IgG anti-camundongo de coelho marcada com fosfatase alcalina. Anticorpos monoclonais demonstrando especificidade para 2mEPSPS (milho EPSPS não nativa) foram escolhidos para estudos mais aprofundados. Nove anticorpos designados 21F2, 12H1, 12E1, 10B9, 10B5, 9E12, 7A9, 7A8, e 5E11 foram finalmente selecionados para o desenvolvimento do ensaio. Subclonagem foi realizada para os clones que expressam os nove anticorpos. Resultados de tal seleção são mostrados abaixo.

[0055] A designação "4 μg/ml de G0268R" refere-se ao anticorpo policlonal EPSPS que foi revestido na placa de 4 μg/ml. A categoria "EPSPS μg/ml" refere-se a uma curva padrão composta de 2mEPSPS que foi expresso em E. coli e purificado.

[0056] Resposta colorimétrica foi registrada como densidade ótica (DO) por um leitor de placas ELISA em um comprimento de onda de 405nM. Este ensaio especial foi lido após 90 minutos de desenvolvimento de substrato. Desenvolvimento maior produz um aumento concomitante no fundo (milho não OGM), bem como maiores leituras de OD para o 2mEPSPS. MAbs 10B5.B4, 10B9.E8, 12H1.B1 e, especialmente, 5E11.11 demonstraram especificidade para 2mEPSPS.

[0057] Especificidade da reatividade dos anticorpos foi confirmada por Ensaio Western Blot. Extratos foram obtidos a partir de plantas de soja não transformadas com EPSPS mutante (identificadas como "Jack") e do milho não transformado com o mutante EPSPS (chamado "963"), bem como linhagens transformadas com as sequências de codificação 2mEPSPS. Essas linhagens transformadas com o mutante incluíram GA21 (ver acima, patentes US 6.566.587 e 6.040.497), B485 (ver patente US 7.045.684) e soja resistente ao glifosato linhagem FG74 que é gerada pela introdução de um gene 2mepsps de milho (similar ao utilizado em GA21) por arma de bombardeamento de partículas. (Descritos geralmente em Klein, TM, Arentzen, R., Lewis, PA e Fitzpatrick-McElligott, S. (1992) Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment. Biotechnology (NY) 10, 286-291.).

[0058] Extratos também foram obtidos a partir de uma planta de soja expressando a proteína EPSPS proporcionando resistência ao glifosato, CP4, acima, patente US 5.633.435. EPSPS de milho purificado e o extrato de plantas identificadas foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecil de sódio (SDS-PAGE), sob redução, manchados para membrana de nitrocelulose e sondados com o anticorpo monoclonal 5E11. Em geral, 8-16% de gel Precise Pierce foi utilizado em aparelhos Bio-Rad Mini Protean 3 em 15mA/gel até as amostras estarem completamente no gel, e depois em 30mA/gel. Os géis foram transferidos para membrana de PVDF. Detecção de proteínas é realizada através do Kit Western Blot Zymed (# 96-9045).

[0059] Uma proteína com um peso molecular aparente de 50kD foi identificada por SDS-PAGE (Ver Figuras 4A-4C) e peso molecular correspondente da sequência da proteína 2mEPSPS. Como pode ser visto na figura 4A, o MAb 5E11 é específico para o 2mEPSPS em soja, e milho e também com o 2mEPSPS extraído. Ele não reage com milho e soja não transformados com o 2mEPSPS. Além disso, a Figura 4B mostra que MAb5E11 é imunorreativo com uma soja 2mEPSPS e com a proteína mutante purificada, mas não reage com a proteína CP4. Modalidades da invenção

[0060] Em uma modalidade da invenção é dirigida a uma linhagem de células de hibridomas selecionada do grupo consistindo de 10B5.B4, 10B9.E8, 12H1.B1 e 5E11.E11 que são depositados como ATCC N°s PTA-8900; PTA-8901, PTA-8902; e PTA- 8903. Uma modalidade é um anticorpo ou fragmento do mesmo produzido por qualquer um desses hibridomas.

[0061] Ainda são necessárias novas modalidades para um anticorpo ou fragmento do mesmo imunorreativo com uma sequência de aminoácidos EPSPS mutante duplo, a dita sequência produzida pela mudança de uma treonina por isoleucina no resíduo 102 e mudança de uma prolina por serina no resíduo 106 da proteína EPSPS. Em uma modalidade o aminoácido com o qual o anticorpo ou fragmento deste é imunorreativo é produzido mediante a criação de tal substituição nos resíduos da SEQ ID NO: 2. Uma modalidade proporciona o anticorpo ou fragmento que é um imunorreativo com o aminoácido mutante da SEQ ID NO: 3. Uma modalidade proporciona o anticorpo ou fragmento que é um imunorreativo com o aminoácido mostrado pelo Genbank número de acesso X63374. Ainda em uma nova modalidade o anticorpo ou fragmento do mesmo é um imunorreativo com um aminoácido codificado pela sequência de nucleotídeos mutante duplo da SEQ ID NO: 5. Uma modalidade prevê um anticorpo ou fragmento do mesmo imunorreativo com a sequência de aminoácido mutante da SEQ ID: 6. Modalidades adicionais prevêem que o dito anticorpo ou fragmento não é imunorreativo com o aminoácido EPSPS tipo selvagem. Modalidades adicionais fornecem o dito anticorpo ou fragmento não são imunorreativos com a enzima CP4.

[0062] Modalidades adicionais fornecem um método para gerar um anticorpo ou fragmento do mesmo, o método compreendendo imunizar um animal com um aminoácido selecionado do grupo consistindo de aminoácidos definidos acima, recuperando esplenócitos do animal imunizado, fusionando os esplenócitos com células do mieloma, recuperação de hibridomas monoclonais, e produção de um anticorpo monoclonal ou fragmentos dos mesmos imunorreativos com o dito aminoácido.

[0063] Outra modalidade da invenção fornece um método para detectar a presença de um aminoácido EPSPS mutante duplo selecionado a partir dos aminoácidos, tal como definidos acima, o método compreendendo contactar uma composição compreendendo o dito aminoácido com um anticorpo ou fragmento do mesmo selecionado do grupo de anticorpos, como definido acima, e determinando se o aminoácido é ligado ao dito anticorpo ou fragmento do mesmo.

[0064] Modalidades ainda fornecem um kit para detecção da presença de um aminoácido mutado EPSPS selecionado do grupo consistindo de aminoácidos como definidos acima, em uma amostra compreendendo um anticorpo ou fragmento do mesmo selecionado do grupo de anticorpos, como definido acima, e um agente de detecção. Modalidades adicionais prevêem que o agente de detecção pode ser selecionado do grupo consistindo de biotina, um corante fluorescente, um radioisótopo e uma enzima.

[0065] No entanto, as modalidades prevêem ainda que o kit ainda compreenda: (i) um meio para a obtenção de um aminoácido contendo amostra de tecido vegetal; (ii) um suporte tendo afixado o dito anticorpo monoclonal que é capaz de formar um complexo binário com o mesmo aminoácido EPSPS mutado que pode estar presente na amostra; e (ii) um método de detecção de complexo binário.

[0066] Uma modalidade prevê um anticorpo monoclonal produzido pela exposição de um animal para um aminoácido EPSPS mutante selecionado do grupo de aminoácidos EPSPS mutantes acima definidos, e obtenção de um anticorpo.

Claims (13)

1. Anticorpo imunorreativo com um polipeptídeo EPSPS (ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintase) mutante caracterizado por dito anticorpo ser selecionado do grupo consistindo em: (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado do grupo consistindo em 10B5.B4 com número de ATCC atribuído PTA- 8900, 10B9.E8 com número ATCC atribuído PTA-8901, 12H1.B1 com número ATCC atribuído 8902, e 5E11.E11 com número ATCC atribuído PTA-8903, e (b) um fragmento de um anticorpo de (a), onde o dito fragmento é imunorreativo com um polipeptídeo EPSPS mutante selecionado a partir do grupo consistindo em um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 3 e um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO: 6.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dito anticorpo ser imunorreativo com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 3.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dito anticorpo ser imunorreativo com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 6.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dito anticorpo não ser imunorreativo com um polipeptídeo EPSPS tipo selvagem de soja endógena.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dito anticorpo não ser imunorreativo com uma enzima CP4 de linhagem de Agrobacterium.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dito anticorpo se ligar com uma afinidade maior ao dito polipeptídeo mutante do que ao polipeptídeo EPSPS tipo selvagem do milho endógeno.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito anticorpo se ligar com uma afinidade maior ao dito polipeptídeo mutante do que a um polipeptídeo tipo selvagem de milho endógeno, não ser imunorreativo com um polipeptídeo tipo selvagem de soja endógena e não ser imunorreativo com uma enzima CP4 de linhagem de Agrobacterium.

8. Linhagem de células de hibridomas caracterizada por ser selecionada do grupo consistindo em 10B5.B4 com número de ATCC atribuído PTA-8900, 10B9.E8 com número de ATCC atribuído PTA- 8901, 12H1.B1 com número de ATCC atribuído 8902, e 5E11.E11 com número de ATCC atribuído PTA-8903.

9. Método para detectar a presença de um polipeptídeo EPSPS (ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintase) mutante em uma composição caracterizado por compreender pôr a dita composição em contato com o anticorpo conforme definido na reivindicação 1, e determinar se o anticorpo é imunorreativo com qualquer um dos ditos polipeptídeos EPSPS mutantes na referida composição.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por dito anticorpo não ser imunorreativo com um polipeptídeo EPSPS tipo selvagem de soja endógena.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por dito anticorpo se ligar com uma afinidade maior ao dito polipeptídeo mutante do que ao polipeptídeo EPSPS tipo selvagem do milho endógeno.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por dito anticorpo não ser imunorreativo com uma enzima CP4 de linhagem de Agrobacterium.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por dito anticorpo ser mais altamente imunorreativo com o dito polipeptídeo mutante do que com polipeptídeo tipo selvagem de milho endógeno, não ser imunorreativo com polipeptídeo tipo selvagem de soja endógena e não ser imunorreativo com uma enzima CP4 de linhagem de Agrobacterium.

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